CN101062947A - 睫状神经营养因子多肽变构体及其应用 - Google Patents

睫状神经营养因子多肽变构体及其应用 Download PDF

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CN101062947A CN 200610078013 CN200610078013A CN101062947A CN 101062947 A CN101062947 A CN 101062947A CN 200610078013 CN200610078013 CN 200610078013 CN 200610078013 A CN200610078013 A CN 200610078013A CN 101062947 A CN101062947 A CN 101062947A
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Abstract

本发明涉及分离的睫状神经营养因子(CNTF)多肽变构体及其编码核酸、包含它们的组合物及它们用于减轻体重或者提供相关益处的用途。

Description

睫状神经营养因子多肽变构体及其应用
                      技术领域
本发明涉及睫状神经营养因子的修饰和应用。具体地涉及分离的具有神经营养活性的睫状神经营养因子(CNTF)多肽变构体及其编码核酸、组合物及用于减轻体重的用途。
                      背景技术
rhCNTF有多种功能，能促使多种神经细胞的存活，是第一个被发现的能维持在体和离体脊髓运动神经元的存活及突起生长的神经营养因子，在神经系统发育、分化和神经损伤修复中有非常重要的作用。
90年代，曾对rhCNTF进行治疗肌萎缩性侧索硬化症的临床试验，发现用药后患者客观指标并未得到改善，但可引起剂量依赖性的厌食和体重下降。在人和啮齿类动物的研究表明，rhCNTF处理可导致摄食量减少，体重下降。作用机理研究显示，rhCNTF可通过血脑屏障，作用于下丘脑食欲调节中枢，激活瘦素样通路，但不诱导恶病质因子如IL-1、IL-6和TNF-α的释放，对瘦素抵抗的营养性肥胖仍然有减肥作用。
睫状神经营养因子(CNTF)为单链的蛋白分子，天然的人CNTF全长200个氨基酸(包括蛋氨酸)。蛋白分子间或分子内没有二硫键相连。前期的研究结果表明，去掉17位的半胱氨酸换成了丙氨酸，第63位的谷氨酰胺换成了精氨酸。使蛋白分子更趋于稳定。Regeneron制药公司在上述的基础上将人CNTF的C端截短了15个氨基酸，成为改型的CNTF，取名Axokine。
但本领域仍然需要提供新的减肥和治疗肥胖症的制剂。本发明满足了这一需求，并满足了其它需求。
                      发明内容
在第一方面，本发明涉及分离的具有神经营养活性的睫状神经营养因子(CNTF)多肽变构体，该变构体相对于睫状神经营养因子多肽而言包含如下任何一种或者多种(优选两种、更优选三种)修饰：
(1)C17A替代；和/或
(2)Q63R替代；和/或
(3)C端截短约10-22个(优选12-20，14-18，如14、15、16、17、18个，更优选16个)氨基酸残基。
在一个具体实施方式中，所述CNTF多肽包含如下任何一种序列：
(1)SEQ ID NO：5；
(2)与SEQ ID NO：5具有至少70％(优选至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更优选至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的氨基酸序列；
(3)在SEQ ID NO：5中存在一个或多个(例如1-20个，优选1-15个、1-10个，更优选1-5个，特别是例如5、4、3、2、1个)插入、缺失和/或替代的氨基酸序列。
在另一个具体实施方式中，所述CNTF多肽变构体包含如下任何一个氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：6、9、11、13、或者15；
(2)与(1)的序列具有至少70％(优选至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更优选至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的氨基酸序列；
(3)在(1)的序列中存在一个或多个(例如1-20个，优选1-15个、1-10个，更优选1-5个，特别是例如5、4、3、2、1个)插入、缺失和/或替代的氨基酸序列。
在特别优选的实施方式中，本发明的CNTF多肽变构体包含或者由如下任何一个氨基酸序列组成：SEQ ID NO：6、9、11、13、或者15；最优选的是SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明涉及编码本发明CNTF多肽变构体的多核苷酸。
在一个优选实施方式中，编码本发明CNTF多肽变构体的多核苷酸具有这样的核苷酸序列，该核苷酸序列经过优化适于在目的宿主(例如细胞，如动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、微生物细胞、真菌、细菌细胞，特别是大肠杆菌)中表达所述CNTF多肽变构体。
在另一个优选实施方式中，编码本发明CNTF多肽变构体的多核苷酸包含如下任何一种序列：
(1)SEQ ID NO：3第1-600位、SEQ ID NO：8第4-555位、SEQID NO：10第4-555位、SEQ ID NO：12第4-555位、或者SEQ ID NO：14第4-561位所示的核苷酸序列；
(2)与(1)的序列具有至少70％(优选至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更优选至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的核苷酸序列；
(3)在(1)的序列中存在一个或多个(例如1-20个，优选1-15个、1-10个，更优选1-5个，特别是例如5、4、3、2、1个)插入、缺失和/或替代的核苷酸序列。
在另一个更优选的实施方式中，编码本发明CNTF多肽变构体的多核苷酸包含或者由如下任何一个核苷酸序列组成：SEQ ID NO：3第1-600位、SEQ ID NO：8第4-555位、SEQ ID NO：10第4-555位、SEQ ID NO：12第4-555位、或者SEQ ID NO：14第4-561位所示的核苷酸序列；特别是SEQ ID NO：8第4-555位所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明还涉及包含上述多核苷酸的载体。本发明还涉及转化或者转染了所述载体的宿主细胞。
本发明还涉及包含本发明的CNTF多肽变构体、或者多核苷酸、或者载体或者宿主细胞的组合物，其可用于减轻体重或者提供相关益处。
本发明还涉及本发明的CNTF多肽变构体、或者多核苷酸、或者载体或者宿主细胞或者组合物在制备用于减轻体重或者提供相关益处的制剂中的用途。
本发明还涉及一种用于减轻体重或者提供相关益处的试剂盒(或称“药剂盒”或者“药盒”，“kit”)，其包括一个或者多个包含本发明的CNTF多肽变构体、或者多核苷酸、或者载体或者宿主细胞或者组合物的容器，任选地还包含使用说明。
下文将结合附图对本发明进行更进详细的说明。在阅读了这些说明后，本发明的上述方面以及其他方面对于本领域技术人员而言将是明显的。应当理解，这些说明用于对本发明进行举例说明的目的。本发明的范围不受具体说明的限制。
                      附图简述
图1显示重组表达载体的构建。该图显示，以合成hCNTF DNA为模板用PCR制备的片段插入到表达载体pET42b中，获得了pCN-2。实施例1的其余几种表达载体按照类似方法构建。
图2显示给药1-21天rhvCNTF(C16)对大鼠体重的影响
Control：第1组：肥胖对照组.Sib-8：第2组：阳性对照组，盐酸西布曲明，8mg/kg，ig.C-0.0125：第3组：rhvCNTF(C16)0.0125mg/kg，sc.C-0.025：第4组：rhvCNTF(C16)0.025mg/kg，sc.C-0.050：第5组：rhvCNTF(C16)0.050mg/kg，sc.C-0.1第6组：rhvCNTF(C16)0.1mg/kg，sc.Standard-0.1，原形rhCNTF标准品0.1mg/kg，sc.。
图3显示给药11天或20天时的量效关系(左图代号同图2，右图点旁的数据为给药剂量mg/kg)。
图4：c16对DIO大鼠体重的影响。
图5：c16对DIO大鼠摄食量的影响。
图6：正常小鼠体重增长曲线。
图7：rhvCNTF不同剂量对小鼠体重的影响。
NS：对照组
C4：rhvCNTF 4μg/kg
C8：rhvCNTF 8μg/kg
C16：rhvCNTF 16μg/kg
C31.25：rhvCNTF 31.25μg/kg
C62.5：rhvCNTF 62.5μg/kg
C125：rhvCNTF 125μg/kg
C250：rhvCNTF 250μg/kg
C500：rhvCNTF 500μg/kg
1日量分2次给予，早晚各1次，腹腔内注射。
图8：rhvCNTF给药5d小鼠体重减少量。
图9：rhvCNTF给药5d ED50＝145μg/kg。
图10：rhvCNTF给药8d小鼠体重减少量。
图11：rhvCNTF给药8d ED50＝136μg/kg。
图12：rhvCNTF给药10d小鼠体重减少量。
图13：rhvCNTF给药10d ED50＝125.5μg/kg。
图14：rhvCNTF不同剂量对小鼠摄食量的影响。
图15：rhvCNTF不同给药途径对小鼠体重的影响(c250，rhvCNTF250μg/kg)。
图16：rhvCNTF不同给药途径对小鼠摄食量的影响(C250，rhvCNTF 250μg/kg)。
图17：大鼠急毒试验各给药组大鼠体重的变化。
图18：大鼠急毒试验各给药组大鼠摄食量的变化。
图19：小鼠急毒试验各给药组小鼠体重的变化。
图20：小鼠急毒试验各给药组小鼠摄食量的变化。
图21：c16小鼠长毒体重变化率曲线图。
                    具体实施方式
CNTF多肽变构体
在第一方面，本发明涉及分离的具有神经营养活性的睫状神经营养因子(CNTF)多肽变构体。该变构体与睫状神经营养因子多肽的区别在于它包含如下任何一种或者多种(优选两种、更优选三种)修饰：
(1)C17A替代；和/或
(2)Q63R替代；和/或
(3)C端截短约10-22个(优选12-20，14-18，如14、15、16、17、18个，更优选16个)氨基酸残基。
“C17A”是指睫状神经营养因子多肽第17位的半胱氨酸换成了丙氨酸，“Q63R”是指第63位的谷氨酸换成了精氨酸。
睫状神经营养因子(CNTF)多肽变构体可以是任何睫状神经营养因子多肽的变构体，只要该变构体包含上述修饰即可。
“睫状神经营养因子多肽”是本领域已知的或者可由本领域技术人员经过适当修饰获得。“睫状神经营养因子多肽”包括天然的睫状神经营养因子多肽，也包括与天然的睫状神经营养因子多肽序列不同但仍然具有神经营养活性的修饰多肽。本领域已知有许多这类修饰多肽。“睫状神经营养因子多肽”可以来源于哺乳动物或者其他温血动物，但优选来源于人。人睫状神经营养因子(CNTF)为单链的蛋白分子，天然的人CNTF全长200个氨基酸(包括蛋氨酸)。蛋白分子间或分子内没有二硫键相连。
本发明所述的‘变构体’是指对原型目标蛋白通过至少改变一个氨基酸或删减或增加了至少一个氨基酸(例如1-20个，如1-10，11-20，优选1、2、3、4、5个氨基酸)，从而改变了原型目标蛋白质氨基酸序列即一级结构的目标蛋白。本发明所述的‘变构体’具有至少与原形目标蛋白相当的(优选更好的)生物活性、或者稳定性、或者安全性、或者本文提到的其它性质。
“神经营养活性”是本领域已知的，可以是例如体外培养的胚背根神经节(DRG)和睫状神经上测试的活性。例如实施例1所测定的活性。
在一个具体实施方式中，所述CNTF多肽包含如下任何一种序列：
(1)SEQ ID NO：5；
(2)与SEQ ID NO：5具有至少70％(优选至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更优选至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的氨基酸序列；
(3)在SEQ ID NO：5中存在一个或多个(例如1-20个，优选1-15个、1-10个，更优选1-5个，特别是例如5、4、3、2、1个)插入、缺失和/或替代的氨基酸序列。所述CNTF多肽具有神经营养活性。本发明的一个具体CNTF多肽是SEQ ID NO：5。
本发明的核酸序列和氨基酸序列中核苷酸和氨基酸残基的编号是指与编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列(如SEQ ID NO：4)或SEQ ID NO：5氨基酸序列相同位置(或编号)对应的核苷酸和氨基酸残基。
“对应”是指本发明核酸分子或者蛋白质的序列在与参考序列如SEQ ID NO：4或者SEQ ID NO：5所示序列最佳比对(alignment)后与该参考序列某位置相对的位置。因此，本发明核酸分子或者蛋白质“对应位置”或者“对应核苷酸”或者“对应氨基酸”不一定是与参考序列编号相同的位置、或者核苷酸或者氨基酸。
在一个具体实施方式中，本发明CNTF多肽变构体包含如下任何一个氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：6、9、11、13、或者15；
(2)与(1)的序列具有至少70％(优选至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更优选至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的氨基酸序列；
(3)在(1)的序列中存在一个或多个(例如1-20个，优选1-15个、1-10个，更优选1-5个，特别是例如5、4、3、2、1个)插入、缺失和/或替代的氨基酸序列。优选地，(2)和(3)的序列包含C17A替代和/或Q63R替代和C端约10-22个氨基酸的截短。
为了本发明的目的，两个氨基酸序列之间的同一性程度采用Clustal法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)和LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR公司，Madison，WI)并使用同一性表和下列多序列对比(multiple alignment)参数来确定：空位罚分为10，空位长度罚分(gap penalty)为10。两两对比(Pairwise alignment)参数是：Ktuple＝1，空位罚分＝3，窗口(windows)＝5，对角线(diagonals)＝5。
在特别优选的实施方式中，本发明的CNTF多肽变构体包含或者由如下任何一个氨基酸序列组成：SEQ ID NO：6、9、11、13、或者15。最优选的本发明的CNTF多肽变构体具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
在本发明中，“蛋白质”和“多肽”可以互换使用，因此，它们并不受限于长度。
突变的核酸分子
第二方面，本发明涉及编码本发明CNTF多肽变构体的多核苷酸。“多核苷酸”和“核酸分子”可以互换使用。
优选地，所述核酸分子或者多核苷酸来源于动物，优选哺乳动物，更优选灵长类动物，最优选人类。
一种“分离的”核酸分子或者多核苷酸是这样一种核酸分子，它从至少一种污染性核酸分子中被鉴别和分离出来，在所述核酸的天然来源中该污染性核酸分子通常与它联系在一起。分离的核酸分子以非天然的形式存在或存在于非天然的环境中。因此分离的核酸分子与存在于天然细胞中的核酸分子可被区别开来。然而，分离核酸分子包括在通常表达CNTF多肽变构体的细胞中含有的CNTF多肽变构体编码核酸分子，在此细胞中，例如，此核酸分子在染色体中的位置不同于其在天然细胞中时的染色体位置。
根据本发明的核酸可包括例如DNA、RNA(如mRNA)、合成核酸、多肽核酸、修饰的核苷酸或它们的混合物。DNA包括cDNA，也包括其对应的基因组DNA。DNA可是单链的也可是双链的。构成核酸的核苷酸可通过各种已知的连接方式连接起来，例如酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等，对这些方法的选择依赖于所要达到的目的，例如抗核酸酶(如RNaseH)、改善体内稳定性等。见例如美国专利5,378,825。
在一个优选实施方式中，编码本发明CNTF多肽变构体的多核苷酸具有这样的核苷酸序列，该核苷酸序列经过优化适于在目的宿主(例如细胞，如动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、微生物细胞、真菌、细菌细胞，特别是大肠杆菌)中表达所述CNTF多肽变构体。
在另一个优选实施方式中，编码本发明CNTF多肽变构体的多核苷酸包含如下任何一种序列：
(1)SEQ ID NO：3第1-600位、SEQ ID NO：8第4-555位、SEQID NO：10第4-555位、SEQ ID NO：12第4-555位、或者SEQ ID NO：14第4-561位所示的核苷酸序列；
(2)与(1)的序列具有至少70％(优选至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更优选至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的核苷酸序列；
(3)在(1)的序列中存在一个或多个(例如1-20个，优选1-15个、1-10个，更优选1-5个，特别是例如5、4、3、2、1个)插入、缺失和/或替代的核苷酸序列。
本发明多核苷酸或多核苷酸区与另一个序列具有某种“序列同一性”百分数(如80％、85％、90％或95％)是指当比对时两个序列比较的相同碱基百分数。这种比对(alignment)和百分数同源性或序列同一性可采用本领域已知的软件程序来确定，所述程序例如当代分子生物学实验方法(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等编著，1987)Supplement 30，section 7.7.18，Table 7.7.1中所述的程序。优选的比对程序是ALIGN Plus(Scientific andEducational Software，Pennsylvania)，优选使用默认参数。
在另一个实施方案中，本发明包括与本发明公开的具体核苷酸序列或其子序列或互补链在低严谨条件，更优选中等严谨条件，更优选中高严谨条件，甚至更优选高严谨条件，最优选极高严谨条件下下杂交并包含所述CNTF多肽变构体的修饰的核苷酸序列(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，分子克隆实验手册(MolecularCloning，A Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor，纽约)。
在另一个更优选的实施方式中，编码本发明CNTF多肽变构体的多核苷酸包含或者由如下任何一个核苷酸序列组成：SEQ ID NO：3第1-600位、SEQ ID NO：8第4-555位、SEQ ID NO：10第4-555位、SEQ ID NO：12第4-555位、或者SEQ ID NO：14第4-561位所示的核苷酸序列；特别是SEQ ID NO：8第-位所示的核苷酸序列。
本发明的蛋白质和核酸分子可以按照本领域已知的方法获得。例如人工合成本发明的核酸分子，并通过重组技术构建表达载体，在适当的宿主细胞中表达本发明的蛋白质(CNTF多肽变构体)。可按照本领域已知的或者实施例中提供的方法从重组宿主细胞培养物分离和纯化本发明蛋白质。
另一方面，本发明还涉及包含上述多核苷酸的载体。所述载体可以是表达载体或者克隆载体。优选地，所述突变核酸分子与控制所述突变核酸分子在目的宿主细胞中表达的调控序列可操作地连接。
本发明还涉及包含本发明的核酸分子或者载体的细胞(包括动物细胞、植物细胞和微生物细胞)或者生物体，例如非人动物，优选哺乳动物，更优选试验动物。
本发明还涉及转化或者转染了所述载体的宿主细胞。
本发明还涉及包含本发明的CNTF多肽变构体、或者多核苷酸、或者载体或者宿主细胞的组合物，其可用于减轻体重或者提供相关益处。
所述“减轻体重”是指为了预防和/或治疗疾病和/或美容等目的而人为地使体重减轻，特别是包括治疗肥胖症(例如普通肥胖症，肥胖合并脂肪肝，糖尿病性肥胖症等)和美容意义上的减肥。
所述减轻体重的“相关益处”是指降低摄食量、降低肥胖指数、抗原性弱、不易产生耐受性、疗效更为持久、降低血清VLDL-C含量、升高血清HDL-C含量、降低血TG、预防或减轻脂肪肝或者安全性好(低毒性)、等。
本发明还涉及本发明的CNTF多肽变构体、或者多核苷酸、或者载体或者宿主细胞或者组合物在制备用于减轻体重或者提供相关益处的制剂中的用途。
本发明还涉及减轻动物个体体重或者提供相关益处的方法，包括给所述个体施用本发明的CNTF多肽变构体、或者多核苷酸、或者载体或者宿主细胞或者组合物。所述“动物个体”包括哺乳动物，特别是人。
本发明还涉及一种用于减轻体重或者提供相关益处的试剂盒，其包括一个或者多个包含本发明的CNTF多肽变构体、或者多核苷酸、或者载体或者宿主细胞或者组合物的容器，任选地还包含使用说明。
本发明多肽可用于多种与肥胖相关疾病的治疗，如普通肥胖症，肥胖合并脂肪肝，糖尿病性肥胖症等。此外，本发明多肽能够降低血脂和血液胆固醇，可以作为治疗心血管疾病的潜在药物。在治疗神经系统疾病(如ALS、AD、HD、Pd等)和眼科疾病(如视网膜炎等)都具有药用潜力。本发明多肽尚有开发与hCNTF体内含量相关疾病的诊断试剂盒的用途，以及开发对本发明多肽和各种方式生产制备的各种CNTF进行定性或定量检测技术的用途。
本发明多肽目前以皮下注射为给药途径，但不排除其他给药方式的可能。本发明包括本领域技术人员能够设想的或者通过有限分析或者试验设计的给药方式和途径。本发明多肽用做与肥胖相关的疾病的治疗时的优选的大致剂量范围为50-300ug(微克)。但也可以是该剂量范围以外的任何适当的范围，例如，0.1-3000ug，例如1-1000、0.1-50、300-1000ug。
以下实施例仅仅是对本发明的举例说明，而不是对本发明造成任何限制。
                     实施例
实施例1人睫状神经营养因子基因水平的改造
材料和方法
1表达载体的构建和目的蛋白的表达
1.1基因来源
本发明的合成人睫状神经营养因子基因是对天然人睫状神经营养因子基因改造而来。天然人睫状神经营养因子基因的核苷酸序列见SEQID NO：1(参见John R.McDonald，Christine Ko，DrzislavMismer*，Darin J.Smith and Frank Collins，Expression andcharacterization of recombinant human ciliary neurotrophicfactor from Escherichia coli.Biocnimica et Biophysica Acta，1090(1991)70-80)和SEQ ID NO：4(全长cDNA)。天然人睫状神经营养因子的氨基酸序列见SEQ ID NO：5。
本发明的人睫状神经营养因子(hCNTF)基因为人工合成，合成的基因序列将第17位的半胱氨酸换成了丙氨酸，第63位的谷氨酰胺换成了精氨酸。为增加在大肠杆菌中表达的产量，其他相关的核苷酸也进行了替换，但没有涉及到氨基酸的改变。同时在基因的上下端分别设计了NdeI和AvrII两个酶切位点。合成基因全长603bp(含终止密码)，装入克隆载体pUC18质粒中，测序结果正确。序列见SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。对应的氨基酸序列见SEQ ID NO：6。
1.2载体的构建
载体质粒pET-42a、大肠杆菌BL21均为Novagen公司产品；限制性内切酶NdeI，AvrII，为New England Biolabs公司产品，Taq DNAPolymerase，T4 DNA Ligase为Progmega公司产品；在此基础上又设计了四套引物，它们的序列如下：
上游引物(EF)33bp，为扩增片段cn-2、cn-3、cn-4、cn-5共用，引入Nde I位点；
5′-CGATTGACCATATGGCTTTCACTGAACACTCTC-3′(SEQ ID NO：16)
下游引物(ER)，引入AvrII位点。下游引物ER-2，ER-3，ER-4，ER-5分别用于扩增cn-2、cn-3、cn-4、和cn-5。
ER-2：5′-GCAGCCTAGGTATTAAGTCTGATGAGAAGAGATG-3′(SEQ IDNO：17)
ER-3：5′-GCAGCCTAGGTATTATTCCTCATGAG-3′(SEQ ID NO：18)
ER-4：5′-GCAGCCTAGGTATTACTTCTTATGAG-3′(SEQ ID NO：19)
ER-5：5′-GTACCCTAGGATTAGTTATGAGAAGAGATG-3′(SEQ IDNO：20)
引物由Takara公司合成。用PCR方法(反应体系：在50微升反应体积中，10mmol/L Tris·HCl(pH8.3)，50mmol/L KCl，1.5mmol/LMgCl2，200umol/L 4×dNTP，1u Taq酶，15pmol引物(每条引物)，pUC18-合成基因质粒模板10ng；扩增条件：变性94℃ 1分钟，退火55℃ 1分钟，延伸72℃ 2分钟，25个循环，最后72℃ 10分钟)扩增目的基因，用Nde I和AvrII双酶切后，将约550bp条带基因回收，插入用同酶处理的表达载体质粒pET-42a中。连接产物转化大肠杆菌菌株BL21，挑选阳性克隆，提取质粒，酶切及测序鉴定。表达载体构建过程如图1所示。该图表明，以Synthetic hCNTF DNA为模板用PCR制备的片段插入到表达载体pET42b中，获得了pCN-2。其余几种表达载体按照类似方法构建。
1.3目的蛋白的表达
将序列分析正确的表达质粒转化BL21菌株，挑单斑接种于含10mg/L卡那霉素的LB(APLB)培养基中，37℃振荡培养至对数生长期，加IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导表达4h，离心收集菌体，用SDS-PAEG对样品进行表达量及表达产物鉴定。
2.目的蛋白的制备
2.1发酵和包涵体提取
将hCNTF重组工程菌在LB培养基中培养并诱导表达，发酵培养基(g/L)成份：蛋白胨20、酵母粉10、氯化钠5
将发酵种子液以1∶30～1∶50(V/V)的比例接入发酵培养基中，发酵培养温度37℃，pH值7.0～7.2，溶氧DO控制在20％，进行发酵培养，每隔一小时取样测OD600的值，当OD600在5～6时，加入IPTG进行诱导，IPTG的终浓度为0.2mmol/L，诱导4小时后结束培养，收集菌体。
收集菌体按如下方法进行超声破碎提取包涵体。菌体湿重按1∶10溶解于50mMTris(pH8.0)，5mM EDTA，超声破碎600W，超声2秒，停3秒，工作时间30分钟。之后12000g离心20分钟。用STE(pH8.0)，2mol/L尿素，0.05％Triton X-100洗涤两次.
2.2蛋白质复性
采用稀释透析复性方法：用7mol/L盐酸胍，20mmol/LTris·HCl(pH8.0)，200mmol/L NaCl溶液溶解包涵体，并将蛋白质浓度调整至0.1、0.3g/L，于室温放置16h后，于8℃用20mmol/LTris·HCl(pH8.0)逐步稀释。缓慢搅拌。当变性剂浓度达0.5mol/L时，于4℃在20mmol/L Tris·HCl(pH8.0)溶液中透析脱盐。
2.3蛋白质纯化
1)离子交换纯化
用0.02mol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA pH8.0平衡Q-FF阴离子交换柱(Amersham产品)，然后上样，有一穿透峰，上样后用同样缓冲液洗至基线，用0.02mol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA、0.2mol/L NaClpH8.0的缓冲液解离目的蛋白，收集目的蛋白峰。
2)凝胶过滤
用20mmol/L Tris·HCl(pH8.0)，200mmol/L NaCl溶液调整蛋白质浓度为10g/L.过Sephacryl S-200(Amersham产品)柱，流速为1ml/min，洗脱液为20mmol/L Tris·HCl(pH8.0)，200mmol/L NaCl，0.05％Tween80，5mmol/L EDTA。收集CNTF蛋白峰，于4℃在20mmol/LTris·HCl(pH8.0)溶液中透析。由此得到纯化样品。
3.检测方法
1)测蛋白质浓度
用BSA作标准曲线，采用考马斯亮蓝染料结合法，测定蛋白质浓度.
2)复性率：用考马斯亮蓝染料结合法测蛋白质浓度，计算复性率.
3)还原与非还原SDS-PAGE  制备浓度为12％的凝胶，凝胶制备同于常规SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。上样缓冲液中还原与非还原SDS-PAGE区别为是否含有DTT或巯基乙醇，电泳凝胶采用常规银染法或考马斯亮兰染色法，蛋白质分子质量标准购自华美公司.
4)目的蛋白的生物活性
选8日龄的鸡胚，剥离背根神经节和分离睫状神经，悬浮于RPMI1640培养液，分种于24孔培养板，将表达的4种CNTF蛋白按如上所述进行纯化并复性后，从1mg开始作10倍系列稀释，加入到24孔板中，72小时后观察神经结发育结果。
结果的判定方法：阴性结果中神经节边缘无突起生长，阳性结果中神经节边缘有突起生长，视野中比较阴性对照突起似有生长判别为+/-，生长的突起稀疏但能区别阴性对照为+，生长的突起明显多于阴性对照为++，生长的突起较旺盛为+++，生长的突起非常旺盛为++++。
阳性对照为复性纯化后全长的CNTF1-200aa段蛋白。
5)稳定性实验
为观察样品的稳定性，将分装的样品在37摄氏度放置，分别在一周，二周，三周，四周取样进行生物活性实验。
结果
1表达菌株检定
1.1插入质粒的鉴定
挑选转化的菌株，提取质粒，用Nde I和BamH I双酶切，通过琼脂糖电泳检定插入的目标DNA的扩增片段。结果表明，按设计方案，将4种不同的CNTF扩增片段成功地插入表达载体质粒pET-42 a中，序列正确的重组质粒命名为pCN-2，pCN-3，pCN-4和pCN-5。
1.2目的DNA序列分析
将带有目的DNA的表达质粒进行序列分析，结果如下。pCN-2中含有的目的DNA的序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。pCN-3、pCN-4和pCN-5中含有的目的DNA的序列分别见SEQ ID NO：10、12和14。
1.3表达产物的鉴定
电泳检定
对于pCN-2，pCN-3，pCN-4和pCN-5，将它们的表达产物用SDS-PAGE分析，显示转化rhvCNTF的菌株在分子量21200的位置上出现重组蛋白条带，与预期分子量相符。表达产量约占菌体总蛋白的30-40％。pCN-2，pCN-3，pCN-4和pCN-5表达的目标蛋白分别命名为rhvCNTF2，rhvCNTF3，rhvCNTF4，rhvCNTF5。也分别简称为CN-2，CN-3，CN-4和CN-5。
2.目标蛋白质制备
CN-2发酵获得湿重菌体21.1g/L；表达水平26.3％；表达量0.97g/L；包涵体1.42g/L。
CN-2蛋白质复性率27.6％；离子交换纯化产物纯度达到95％以上；凝胶过滤纯化产物纯度达到98％以上。
3.生物活性及稳定性
4种rhvCN的生物活性和摄氏37度存放后的活性(稳定性)与全长的hCNTF蛋白相比，结果见下表1。
表1生物活性和稳定性实验
  名称   摄氏37度存放后的生物活性(稳定性实验) 稳定性结论
  0周(活性实验)   一周   二周   三周   四周
 全长hCNTF   +++   +++   ++   +/-   +/-   稳定
 rhvCN 2   ++++   ++++   ++   +/-   +/-   稳定
 rhvCN 3   ++   +   +/-   +/-   +/-   不稳定
 rhvCN 4   +++   +   +/-   +/-   -   不稳定
 rhvCN 5   +++   ++   +/-   +/-   -   不稳定
从上表看出，在改构的4种hCNTF表达产物中，rhvCNTF2的生物活性好于全长的hCNTF对照，稳定性与全长的hCNTF对照相同，因此选rhvCNTF2作为进一步研究的对象。rhvCNTF2在本说明书中亦称为rhvCNTF(C16)，rhvCNTF，rhvCNTF2，C16和CN-2。
讨论
睫状神经营养因子为单链的蛋白分子，天然的人CNTF全长200个氨基酸(包括蛋氨酸)。蛋白分子间或分子内没有二硫键相连。前期的研究结果表明，将17位的半胱氨酸换成了丙氨酸，第63位的谷氨酰胺换成了精氨酸，使蛋白分子更趋于稳定。Regeneron制药公司在上述的基础上将人CNTF的C端截短了15个氨基酸，成为改型的CNTF，取名Axokine。我们设计的一种方案中，在人工合成了人睫状神经营养因子(hCNTF)基因后，将人CNTF的C端截短了16个氨基酸，取名rhvCN2。这种新的变构体在大肠杆菌宿主系统中高效表达，产物经柱纯化后纯度达95％以上；以体外培养的鸡胚背根神经节(DRG)和睫状神经测定生物活性。表达的重组rhvCN2生物活性高于hCNTF，而稳定性同于hCNTF。
ORIGIN hCNTF DNA SEQUENCE(SEQ ID NO：1)
 1 GAGAGTCACA TCTCTTATTT GGACCAGTAT AGACAGAAGT AAACCCAGCT
51 GACTTGTTTC CTGGGACAGT TGAGTTAAGG GATGGCTTTC ACAGAGCATT
 101 CACCGCTGAC CCCTCACCGT CGGGACCTCT GTAGCCGCTC TATCTGGCTA
 151 GCAAGGAAGA TTCGTTCAGA CCTGACTGCT CTTACGGAAT CCTATGTGAA
 201 GCATCAGGGC CTGAACAAGA ACATCAACCT GGACTCTGCG GATGGGATGC
 251 CAGTGGCAAG CACTGATCAG TGGAGTGAGC TGACCGAGGC AGAGCGACTC
 301 CAAGAGAACC TTCAAGCTTA TCGTACCTTC CATGTTTTGT TGGCCAGGCT
 351 CTTAGAAGAC CAGCAGGTGC ATTTTACCCC AACCGAAGGT GACTTCCATC
 401 AAGCTATACA TACCCTTCTT CTCCAAGTCG CTGCCTTTGC ATACCAGATA
 451 GAGGAGTTAA TGATACTCCT GGAATACAAG ATCCCCCGCA ATGAGGCTGA
 501 TGGGATGCCT ATTAATGTTG GAGATGGTGG TCTCTTTGAG AAGAAGCTGT
 551 GGGGCCTAAA GGTGCTGCAG GAGCTTTCAC AGTGGACAGT AAGGTCCATC
 601 CATGACCTTC GTTTCATTTC TTCTCATCAG ACTGGGATCC CAGCACGTGG
 651 GAGCCATTAT ATTGCTAACA ACAAGAAAAT GTAGCAGTTA GTCCCTTCTC
 701 TCTTCCTTGC TTTCTCTTCT AATGGAATAT GCGTAGTTCC CTGGGGCCTC
 751 GCTTTCCCAT CTTAAATTTC TAAAAACAGT TAAGACAACA GGCATTTTCT
 801 TTCTTTTTTC TCTGACCACC TGCAGCCTGT TGAAGGACTA CAGGTATTTT
 851 CATCAAGTAG CGTTGGAGAC ATACACAAAT GGGCATACAA GTTTAGCCTG
 901 GGGGGTGTGA TTTGTGTGCG TGCTTGCATG TGCTGCAGGT GTAAGAGAGT
 951 GGGAGCAGGG ACAACGTCCT TCCACTTCAG GGTTCTAACC TTTCTAACCC
1001 ACTAAGTAAC CTCTACAGGC ATTTAACTGC CTTACAGACA GAATATACAT
1051 ATGTTAATTC TAGTCCTGGA TGACTCGGTC TGAGAAGATT CAATTTAAAA
1101 TCAGACTCTT TAGTTGATTT AAACTCTTAG AGAATAAGAA TAATAATGGC
1151 TAACTTTTAT TATCTTCTAT ATTAAGGCAG TATGCCAAGG GTCTTTATGT
1201 ATATTATGTA CAGCGTTTAC AACCTTGTGA GCAAGGTGGT GTTACTCCCA
1251 TTAGGTAGAT GAGAAAACAG GCTCACAGAG ATTTGGTTAA GCTCACACAG
1301 CTAACAAGTA GCACACTGAG TTTGAACACA GATCATTCTC CTTGTAAAAG
1351 CCTATGTGCC TTTCACTTTA GAGGCTTGAT CATGAATCAC TGCACCTCTT
1401 TGTCACAGGG TGTTGGAAGA TGCATCCATG TAATCTATTC CCATCGCTGG
1451 AAAACAGCTG CTGTTAGATG TCCTCAGAAG TCAGTTGCAA ATTTTAGCGT
1501 TAAAGTCAGG ATTTATTGTT CATACTTGGC GGTGAGGAGG GCAGCTGGAG
1551 ATCTTAAGAT TCCATTTTGG AAAATGATTA GGCCCGCCAA ACTTCTGAAC
1601 TTTGGAAGCT GGGGATGTTT AGTAATACAG CCTGGTTTTC AAGTACTCAC
1651 TAAAAGTTCT CAAATATTGG GTTGGGCACG GCTTATACCA GGTTACCTCA
1701 CTTTTAATTA GTGATGCAGG CAGTGTAACC CAAGCATTTG TGGACAATGA
1751 GTGGAATACT AAAGTTAAAA AGTCAAACTT TCACCTCAGA TTTTCTGGAC
1801 TTAGTCATGA GGAGAGGGTG AGGCCCACTC TGTTCCTACT GGAGATACCA
1851 GAGACTCTGA AACTATAGAA TAAAGCCTCT GTGCTGCACA A
合成DNA序列测序(SEQ ID NO：2)
即shv-cntf(LZS1147)(根据原始核酸序列采用优势密码子合成的，并制造了两处氨基酸突变的基因序列)
AGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTTAGCAGCCTAGGTATTA
CATCTTCTTGTTGTTAGCGATGTAATGGCTACCACGTGCTGGGATACCAG
TCTGATGAGAAGAGATGAAACGCAGGTCATGGATGGATCTTACTGTCCAC
TGAGACAGCTCCTGCAGCACCTTCAGACCCCACAGCTTCTTCTCGAAGAG
ACCACCATCACCAACGTTGATAGGCATACCATCAGCCTCGTTACGAGGGA
TCTTGTATTCCAGGAGTATCATTAACTCCTCGATTTGGTATGCGAAAGCA
GCTACTTGGAGCAGCAGAGTATGGATAGCTTGATGGAAATCACCTTCAGT
AGGAGTGAAATGCACTTGTTGATCTTCTAACAGTCTAGCTAACAAAACAT
GGAAAGTACGGTAAGCTTGAAGGTTCTCTTGGAGACGCTCTGCTTCAGTC
AGTTCACTCCAACGATCAGTACTTGCAACAGGCATACCATCAGCAGAATC
CAGGTTGATGTTCTTGTTCAGACCTTGATGCTTAACGTAAGATTCAGTCA
GAGCAGTCAGATCAGAACGGATCTTTCTTGCCAGCCAGATAGAACGACTA
GCCAGATCTCTACGGTGCGGAGTCAGCGGAGAGTGTTCAGTGAAAGCCAT
上序列反向互补并去头去尾(SEQ ID NO：3)
ATGGCTTTCACTGAACACTCTCCGCTGACTCCGCACCGTAGAGATCTGGCTAGTCGTTCTATCTGGCTGGCAAG
AAAGATCCGTTCTGATCTGACTGCTCTGACTGAATCTTACGTTAAGCATCAAGGTCTGAACAAGAACATCAACC
TGGATTCTGCTGATGGTATGCCTGTTGCAAGTACTGATCGTTGGAGTGAACTGACTGAAGCAGAGCGTCTCCAA
GAGAACCTTCAAGCTTACCGTACTTTCCATGTTTTGTTAGCTAGACTGTTAGAAGATCAACAAGTGCATTTCAC
TCCTACTGAAGGTGATTTCCATCAAGCTATCCATACTCTGCTGCTCCAAGTAGCTGCTTTCGCATACCAAATCG
AGGAGTTAATGATACTCCTGGAATACAAGATCCCTCGTAACGAGGCTGATGGTATGCCTATCAACGTTGGTGAT
GGTGGTCTCTTCGAGAAGAAGCTGTGGGGTCTGAAGGTGCTGCAGGAGCTGTCTCAGTGGACAGTAAGATCCAT
CCATGACCTGCGTTTCATCTCTTCTCATCAGACTGGTATCCCAGCACGTGGTAGCCATTACATCGCTAACAACA
AGAAGATGTAATACCTAGG
hCNTF原始DNA序列(SEQ ID NO：4)
ATGGCTTTCACAGAGCATTCACCGCTGACCCCTCACCGTCGGGACCTCTGTAGCCGCTCTATCTGGCTAGCAAG
GAAGATTCGTTCAGACCTGACTGCTCTTACGGAATCCTATGTGAAGCATCAGGGCCTGAACAAGAACATCAACC
TGGACTCTGCGGATGGGATGCCAGTGGCAAGCACTGATCAGTGGAGTGAGCTGACCGAGGCAGAGCGACTCCAA
GAGAACCTTCAAGCTTATCGTACCTTCCATGTTTTGTTGGCCAGGCTCTTAGAAGACCAGCAGGTGCATTTTAC
CCCAACCGAAGGTGACTTCCATCAAGCTATACATACCCTTCTTCTCCAAGTCGCTGCCTTTGCATACCAGATAG
AGGAGTTAATGATACTCCTGGAATACAAGATCCCCCGCAATGAGGCTGATGGGATGCCTATTAATGTTGGAGAT
GGTGGTCTCTTTGAGAAGAAGCTGTGGGGCCTAAAGGTGCTGCAGGAGCTTTCACAGTGGACAGTAAGGTCCAT
CCATGACCTTCGTTTCATTTCTTCTCATCAGACTGGGATCCCAGCACGTGGGAGCCATTATATTGCTAACAACA
AGAAAATG
上两序列比较(分别为SEQ ID NO：3和4，不同的碱基用粗体表示)
ATGGCTTTCACTGAACACTCTCCGCTGACTCCGCACCGTAGAGATCTGGCTAGTCGTTCTATCTGGCTG
ATGGCTTTCACAGAGCATTCACCGCTGACCCCTCACCGTCGGGACCTCTGTAGCCGCTCTATCTGGCTA
GCAAGAAAGATCCGTTCTGATCTGACTGCTCTGACTGAATCTTACGTTAAGCATCAAGGTCTGAACAAG
GCAAGGAAGATTCGTTCAGACCTGACTGCTCTTACGGAATCCTATGTGAAGCATCAGGGCCTGAACAAG
AACATCAACCTGGATTCTGCTGATGGTATGCCTGTTGCAAGTACTGATCGTTGGAGTGAACTGACTGAA
AACATCAACCTGGACTCTGCGGATGGGATGCCAGTGGCAAGCACTGATCAGTGGAGTGAGCTGACCGAG
GCAGAGCGTCTCCAAGAGAACCTTCAAGCTTACCGTACTTTCCATGTTTTGTTAGCTAGACTGTTAGAA
GCAGAGCGACTCCAAGAGAACCTTCAAGCTTATCGTACCTTCCATGTTTTGTTGGCCAGGCTCTTAGAA
GATCAACAAGTGCATTTCACTCCTACTGAAGGTGATTTCCATCAAGCTATCCATACTCTGCTGCTCCAA
GACCAGCAGGTGCATTTTACCCCAACCGAAGGTGACTTCCATCAAGCTATACATACCCTTCTTCTCCAA
GTAGCTGCTTTCGCATACCAAATCGAGGAGTTAATGATACTCCTGGAATACAAGATCCCTCGTAACGAG
GTCGCTGCCTTTGCATACCAGATAGAGGAGTTAATGATACTCCTGGAATACAAGATCCCCCGCAATGAG
GCTGATGGTATGCCTATCAACGTTGGTGATGGTGGTCTCTTCGAGAAGAAGCTGTGGGGTCTGAAGGTG
GCTGATGGGATGCCTATTAATGTTGGAGATGGTGGTCTCTTTGAGAAGAAGCTGTGGGGCCTAAAGGTG
CTGCAGGAGCTGTCTCAGTGGACAGTAAGATCCATCCATGACCTGCGTTTCATCTCTTCTCATCAGACT
CTGCAGGAGCTTTCACAGTGGACAGTAAGGTCCATCCATGACCTTCGTTTCATTTCTTCTCATCAGACT
GGTATCCCAGCACGTGGTAGCCATTACATCGCTAACAACAAGAAGATGTAATACCTAGG
GGGATCCCAGCACGTGGGAGCCATTATATTGCTAACAACAAGAAAATGTA
hCNTF原始氨基酸序列(SEQ ID NO：5)
MAFTEHSPLTPHRRDLCSRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTDQWSELTEAERLQ
ENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMPINVGD
GGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHQTGIPARGSHYIANNKKM-
hCNTF合成的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)
MAFTEHSPLTPHRRDLASRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTDRWSELTEAERLQ
ENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMPINVGD
GGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHQTGIPARGSHYIANNKKM-
hCNTF原始氨基酸序列与hCNTF合成氨基酸序列比较
MAFTEHSPLTPHRRDL CSRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTD QWSELTE
MAFTEHSPLTPHRRDL ASRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTD RWSELTE
AERLQENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNE
AERLQENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNE
ADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHQTGIPARGSHYIANNKKM-
ADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHQTGIPARGSHYIANNKKM-
cn-2(LZS1149)扩增DNA序列测序(SEQ ID NO：7)
ACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTTAGCAGCCTAGGTATTAAGTCTGAT
GAGAAGAGATGAAACGCAGGTCATGGATGGATCTTACTGTCCACTGAGAC
AGCTCCTGCAGCACCTTCAGACCCCACAGCTTCTTCTCGAAGAGACCACC
ATCACCAACGTTGATAGGCATACCATCAGCCTCGTTACGAGGGATCTTGT
ATTCCAGGAGTATCATTAACTCCTCGATTTGGTATGCGAAAGCAGCTACT
TGGAGCAGCAGAGTATGGATAGCTTGATGGAAATCACCTTCAGTAGGAGT
GAAATGCACTTGTTGATCTTCTAACAGTCTAGCTAACAAAACATGGAAAG
TACGGTAAGCTTGAAGGTTCTCTTGGAGACGCTCTGCTTCAGTCAGTTCA
CTCCAACGATCAGTACTTGCAACAGGCATACCATCAGCAGAATCCAGGTT
GATGTTCTTGTTCAGACCTTGATGCTTAACGTAAGATTCAGTCAGAGCAG
TCAGATCAGAACGGATCTTTCTTGCCAGCCAGATAGAACGACTAGCCAGA
TCTCTACGGTGCGGAGTCAGCGGAGAGTGTTCAGTGAAAGCCATATGTAT
ATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGGAATTGTTATC
上序列反向互补，去测序引物头尾(cn-2测序序列)(SEQ ID NO：8)
CATATGGCTTTCACTGAACACTCTCCGCTGACTCCGCACCGTAGAGATCTGGCTAGTCGTTCTATCTGGCTGGC
AAGAAAGATCCGTTCTGATCTGACTGCTCTGACTGAATCTTACGTTAAGCATCAAGGTCTGAACAAGAACATCA
ACCTGGATTCTGCTGATGGTATGCCTGTTGCAAGTACTGATCGTTGGAGTGAACTGACTGAAGCAGAGCGTCTC
CAAGAGAACCTTCAAGCTTACCGTACTTTCCATGTTTTGTTAGCTAGACTGTTAGAAGATCAACAAGTGCATTT
CACTCCTACTGAAGGTGATTTCCATCAAGCTATCCATACTCTGCTGCTCCAAGTAGCTGCTTTCGCATACCAAA
TCGAGGAGTTAATGATACTCCTGGAATACAAGATCCCTCGTAACGAGGCTGATGGTATGCCTATCAACGTTGGT
GATGGTGGTCTCTTCGAGAAGAAGCTGTGGGGTCTGAAGGTGCTGCAGGAGCTGTCTCAGTGGACAGTAAGATC
CATCCATGACCTGCGTTTCATCTCTTCTCATCAGACTTAATACCTAGG
CN-2氨基酸序列(SEQ ID NO：9)
MAFTEHSPLTPHRRDLASRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTDRWSELTEAERLQ
ENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMPINVGD
GGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHQT-
cn-3(SEQ ID NO：10)
CATATGGCTTTCACTGAACACTCTCCGCTGACTCCGCACCGTAGAGATCTGGCTAGTCGTTCTATCTGGCTGGC
AAGAAAGATCCGTTCTGATCTGACTGCTCTGACTGAATCTTACGTTAAGCATCAAGGTCTGAACAAGAACATCA
ACCTGGATTCTGCTGATGGTATGCCTGTTGCAAGTACTGATCGTTGGAGTGAACTGACTGAAGCAGAGCGTCTC
CAAGAGAACCTTCAAGCTTACCGTACTTTCCATGTTTTGTTAGCTAGACTGTTAGAAGATCAACAAGTGCATTT
CACTCCTACTGAAGGTGATTTCCATCAAGCTATCCATACTCTGCTGCTCCAAGTAGCTGCTTTCGCATACCAAA
TCGAGGAGTTAATGATACTCCTGGAATACAAGATCCCTCGTAACGAGGCTGATGGTATGCCTATCAACGTTGGT
GATGGTGGTCTCTTCGAGAAGAAGCTGTGGGGTCTGAAGGTGCTGCAGGAGCTGTCTCAGTGGACAGTAAGATC
CATCCATGACCTGCGTTTCATCTCTTCTCATGAGGAATAATACCTAGG
CN-3(SEQ ID NO：11)
MAFTEHSPLTPHRRDLASRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTDRWSELTEAERLQ
ENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMPINVGD
GGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHEE-
cn-4(SEQ ID NO：12)
CATATGGCTTTCACTGAACACTCTCCGCTGACTCCGCACCGTAGAGATCTGGCTAGTCGTTCTATCTGGCTGGC
AAGAAAGATCCGTTCTGATCTGACTGCTCTGACTGAATCTTACGTTAAGCATCAAGGTCTGAACAAGAACATCA
ACCTGGATTCTGCTGATGGTATGCCTGTTGCAAGTACTGATCGTTGGAGTGAACTGACTGAAGCAGAGCGTCTC
CAAGAGAACCTTCAAGCTTACCGTACTTTCCATGTTTTGTTAGCTAGACTGTTAGAAGATCAACAAGTGCATTT
CACTCCTACTGAAGGTGATTTCCATCAAGCTATCCATACTCTGCTGCTCCAAGTAGCTGCTTTCGCATACCAAA
TCGAGGAGTTAATGATACTCCTGGAATACAAGATCCCTCGTAACGAGGCTGATGGTATGCCTATCAACGTTGGT
GATGGTGGTCTCTTCGAGAAGAAGCTGTGGGGTCTGAAGGTGCTGCAGGAGCTGTCTCAGTGGACAGTAAGATC
CATCCATGACCTGCGTTTCATCTCTTCTCATAAGAAGTAATACCTAGG
CN-4(SEQ ID NO：13)
MAFTEHSPLTPHRRDLASRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTDRWSELTEAERLQ
ENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMPINVGD
GGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHKK-
cn-5(SEQ ID NO：14)
CATATGGCTTTCACTGAACACTCTCCGCTGACTCCGCACCGTAGAGATCTGGCTAGTCGTTCTATCTGGCTGGC
AAGAAAGATCCGTTCTGATCTGACTGCTCTGACTGAATCTTACGTTAAGCATCAAGGTCTGAACAAGAACATCA
ACCTGGATTCTGCTGATGGTATGCCTGTTGCAAGTACTGATCGTTGGAGTGAACTGACTGAAGCAGAGCGTCTC
CAAGAGAACCTTCAAGCTTACCGTACTTTCCATGTTTTGTTAGCTAGACTGTTAGAAGATCAACAAGTGCATTT
CACTCCTACTGAAGGTGATTTCCATCAAGCTATCCATACTCTGCTGCTCCAAGTAGCTGCTTTCGCATACCAAA
TCGAGGAGTTAATGATACTCCTGGAATACAAGATCCCTCGTAACGAGGCTGATGGTATGCCTATCAACGTTGGT
GATGGTGGTCTCTTCGAGAAGAAGCTGTGGGGTCTGAAGGTGCTGCAGGAGCTGTCTCAGTGGACAGTAAGATC
CATCCATGACCTGCGTTTCATCTCTTCTCATAACTAATCCTAGG
CN-5(SEQ ID NO：15)
MAFTEHSPLTPHRRDLASRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTDRWSELTEAERLQ
ENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMPINVGD
GGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHN-
cn-2测序序列与原始序列比较
ATGGCTTTCACAGAGCATTCACCGCTGACCCCTCACCGTCGGGACCTCTGTAGCCGCTCTATCTGGCTA
ATGGCTTTCACTGAACACTCTCCGCTGACTCCGCACCGTAGAGATCTGGCTAGTCGTTCTATCTGGCTG
GCAAGGAAGATTCGTTCAGACCTGACTGCTCTTACGGAATCCTATGTGAAGCATCAGGGCCTGAACAAG
GCAAGAAAGATCCGTTCTGATCTGACTGCTCTGACTGAATCTTACGTTAAGCATCAAGGTCTGAACAAG
AACATCAACCTGGACTCTGCGGATGGGATGCCAGTGGCAAGCACTGATCAGTGGAGTGAGCTGACCGAG
AACATCAACCTGGATTCTGCTGATGGTATGCCTGTTGCAAGTACTGATCGTTGGAGTGAACTGACTGAA
GCAGAGCGACTCCAAGAGAACCTTCAAGCTTATCGTACCTTCCATGTTTTGTTGGCCAGGCTCTTAGAA
GCAGAGCGTCTCCAAGAGAACCTTCAAGCTTACCGTACTTTCCATGTTTTGTTAGCTAGACTGTTAGAA
GACCAGCAGGTGCATTTTACCCCAACCGAAGGTGACTTCCATCAAGCTATACATACCCTTCTTCTCCAA
GATCAACAAGTGCATTTCACTCCTACTGAAGGTGATTTCCATCAAGCTATCCATACTCTGCTGCTCCAA
GTCGCTGCCTTTGCATACCAGATAGAGGAGTTAATGATACTCCTGGAATACAAGATCCCCCGCAATGAG
GTAGCTGCTTTCGCATACCAAATCGAGGAGTTAATGATACTCCTGGAATACAAGATCCCTCGTAACGAG
GCTGATGGGATGCCTATTAATGTTGGAGATGGTGGTCTCTTTGAGAAGAAGCTGTGGGGCCTAAAGGTG
GCTGATGGTATGCCTATCAACGTTGGTGATGGTGGTCTCTTCGAGAAGAAGCTGTGGGGTCTGAAGGTG
CTGCAGGAGCTTTCACAGTGGACAGTAAGGTCCATCCATGACCTTCGTTTCATTTCTTCTCATCAGACT
CTGCAGGAGCTGTCTCAGTGGACAGTAAGATCCATCCATGACCTGCGTTTCATCTCTTCTCATCAGACT
GGGATCCCAGCACGTGGGAGCCATTATATTGCTAACAACAAGAAAATG
TAATACCTAGG
CN-2，-3，-4，-5构建氨基酸序列与原始序列比较
(序列从上至下依次为原始序列和CN-2，-3，-4，-5)
MAFTEHSPLTPHRRDL CSRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTD QWSELTE
MAFTEHSPLTPHRRDL ASRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTD RWSELTE
MAFTEHSPLTPHRRDL ASRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTD RWSELTE
MAFTEHSPLTPHRRDL ASRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTD RWSELTE
MAFTEHSPLTPHRRDL ASRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTD RWSELTE
AERLQENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNE
AERLQENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNE
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ADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHQTGIPARGSHYIANNKKM-
ADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHQT-
ADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHEE-
ADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHKK-
ADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHN-
本文中序列SEQ ID NO：序列编号简要说明
  核酸名称/蛋白质名称  核苷酸序列(SEQ ID NO：)   氨基酸序列(SEQ ID NO：)
  天然ORIGIN hCNTF DNA/hCNTF  14   5
  本发明合成shv-cntf/hvCNTF  23   6
  cn-2/CN-2或rhvCNTF2  78   9
  cn-3/CN-3或rhvCNTF3  10   11
  cn-4/CN-4或rhvCNTF4  12   13
  cn-5/CN-5或rhvCNTF5  14   15
  PCR扩增引物  16-20   --
在以下各个实施例中出现的名称rhvCNTF(C16)，rhvCNTF，C16和实施例1中的CN-2或rhvCNTF2均为同一物质在不同实验阶段的不同名称。
实施例2重组人睫状神经营养因子变构体rhvCNTF(C16)对成年大鼠的减肥作用研究
摘要
取成年的雄性SD高营养性肥胖大鼠，rhvCNTF(C16)皮下注射治疗，观察rhvCNTF(C16)对大鼠的减肥作用，并用西布曲明(曲美)和原形rhCNTF作阳性对照。结果，用rhvCNTF(C16)(0.0125-0.1mg/kg)给大鼠皮下注射(sc)，在用药0～9天时明显降低大鼠体重和摄食量，并有明显的量-效关系，最高剂量组(0.1mg/kg)在前9天体重下降明显，9天以后体重开始回升，而0.025、0.05mg/kg剂量组体重进行性下降，21天时减肥作用更加明显，21天时最低剂量组(0.0125mg/kg)大鼠体重一直增长缓慢，但和对照组相比差别仍有显著性。高剂量100μg/kg似有耐受现象。原形rhCNTF在用药初期作用强于rhvCNTF(C16)，但原形rhCNTF长期用药后作用快速减弱，提示rhvCNTF抗原性弱于原形rhCNTF，不易产生耐受性，疗效更为持久。为了研究重组人睫状神经营养因子变构体rhvCNTF(C16)的减肥作用，我们取成年的肥胖雄性大鼠，皮下注射。观察rhvCNTF(C16)对大鼠体重及摄食量的影响，现将实验过程及初步研究结果告如下.
材料
1.药品和试剂重组人睫状神经营养因子变构体rhvCNTF(C16)，临用前以无菌生理盐水溶解。重组人睫状神经营养因子(rhCNTF(C16))对照品(原形)，购自Peprotech公司。盐酸西布曲明(曲美胶囊)，为太极集团涪陵制药厂产品，批号0205010，临用前用无菌生理盐水混悬。
2.动物体重为350g SD大鼠，雄性，SPF级，购自上海实验动物中心，生产许可证号：SCXK(沪)2002-0010。
3.饲料
基础饲料1000g中，含玉米面385，麸皮180，标准粉100，鱼粉100，肉骨粉25，豆饼155，骨粉22，食盐3，蛋氨酸1.2，赖氨酸0.5，维生素E 0.12，维生素AD 3.5，奶粉24.28，牧乐维他0.3。
高营养饲料：100g基础饲料中加入下列成份：无糖全脂奶粉(内蒙古伊利实业集团股份有限公司产品，每100g奶粉热量＞2000kJ，蛋白质22g，脂肪25g，批号：20020808)10g，猪油10g，鸡蛋30g，浓鱼肝油(维生素AD滴剂，青岛双鲸药业有限公司产品，批号010108，每g含维生素A 50000单位，维生素D 5000单位)0.34g(维生素A 17000U，维生素D 1700U)。将各成份在饲料机内混匀，成形，晾干。60℃烤箱烤12小时，再次晾干，保存。
方法
1、高营养性肥胖(DIO)大鼠模型制备
从200只成年SD大鼠(350g，雄性)中随机取出20只作为正常对照组，喂以普通饲料，其它大鼠用于制作DIO模型，喂以高营养饲料。从喂高营养饲料前1天开始，每周称体重，将体重增长缓慢的大鼠淘汰，体重合格者纳入实验。以DIO组大鼠比正常对照组体重增加≥20％为造模成功，共造型8周。从造型成功的大鼠中选出肥胖大鼠70只，分为模型对照组、阳性对照组和rhCNTF 4个剂量的受试组和一个rhCNTF原型对照组。
2.分组及给药
选合格肥胖大鼠70只，体重450g左右，雄性，分为对照组、阳性对照组和rhCNTF 4个剂量的受试组。
第1组：肥胖对照组
第2组：阳性对照组，盐酸西布曲明，8mg/kg，ig，
第3组：rhvCNTF(C16)0.0125mg/kg，sc
第4组：rhvCNTF(C16)0.025mg/kg，sc
第5组：rhvCNTF(C16)0.050mg/kg，sc
第6组：rhvCNTF(C16)0.1mg/kg，sc
第7组：rhCNTF(原形，标准品)0.1mg/kg，sc
阳性对照组大鼠用西布曲明灌胃，2ml/kg，1日1次，其余各组大鼠均用等体积生理盐水灌胃，1日1次。rhvCNTF(C16)各组和原形rhCNTF大鼠每天sc注射不同浓度的受试药1次，每次2ml/kg。正常对照组和阳性对照组sc注射等体积赋形剂生理盐水溶液。
2.体重及摄食量测定
各剂量组大鼠于给药前(0天)、给药后每日测定体重和摄食量，连续21天。
3.肥胖指数测定
治疗终点时称大鼠体重，麻醉后测体长(鼻尖至肛门的距离)，按下式计算肥胖指数(Lee’s指数、体质指数)
Figure A20061007801300301
体质指数＝体重(kg)/体长(m)2
4.统计方法
计量资料各组比较用多组均数t检验
结果
1、对大鼠体重的影响
结果见表2、表3、表6。各组大鼠于给药前(0天)、给药后1-21天定时记录体重及摄食量。在整个实验过程中，对照组大鼠体重持续增长。西布曲明组大鼠体重在用药第2天时达到最低(和给药前比，降低了3.8％)，随后缓慢回升，各时点体重与对照组相比P＜0.01，差别有显著性。各剂量受试组大鼠在用药0～9天内，体重降低有明显量-效关系，最低剂量组(0.0125mg/kg组)大鼠体重增长减慢，第9天体重增长率为1.58％，和对照组(4.08％)相比P＜0.05；其它各受试组大鼠体重均呈负增长，在第9天时，最高剂量组大鼠体重开始回升，估计其产生的耐受性，而0.025、0.05mg/kg组体重一直下降，效果明显，到21天时，rhvCNTF(C16)0.05mg/kg的作用强度明显强于原形rhCNTF 0.1mg/kg组，表明rhvCNTF(C16)，不易产生耐受性，作用较原形更加持久。0.0125mg/kg rhvCNTF(C16)也明显抑制大鼠体重增加，和对照组比较，差别有显著性，此剂量相当于最低有效量。
由图2可见，rhvCNTF(C16)12.5-50μg/kg给药21天内大鼠体重持续下降，到21天时50μg/kg剂量组体重下降作用超过了100μg/kg组，提示大剂量产生了耐受性，而低剂量则无此现象。各剂量受试组有明显的量-效关系(如图3)。
表2、rhvCNTF(C16)给药后1-11天体重变化百分率(以给药前为0，表中数据为％)
  Group   0d   1d   2d   3d   4d   5d
  Control   0   0.64926   1.17093   1.68453   2.41938   2.65384
  Sib-8   0   -3.8328   -3.6579   -3.1611   -2.9455   -2.6929
  C-0.0125   0   -0.0128   0.28341   0.37487   0.56204   0.84576
  C-0.025   0   -0.0399   -0.1742   -0.5752   0.09563   -0.4622
  C-0.05   0   -0.0768   -0.6273   -1.376   -1.237   -2.5895
  C-0.1   0   -0.9386   -1.4701   -2.3552   -2.2615   -3.2486
 表2续：
  6d   7d   8d   9d   10d   11d
  Control   3.13156   3.89275   4.06677   3.91107   4.098   4.08425
  Sib-8   -1.9579   -1.6306   -1.3734   -1.043   -1.0005   -0.5403
  C-0.0125   1.29267   1.5239   1.46663   1.58783   1.5767   1.4434
  C-0.025   -0.7194   -0.2071   -0.3609   -0.097   -0.7582   -1.2656
  C-0.05   -2.3623   -2.882   -3.3538   -3.6928   -3.4973   -4.0569
  C-0.1   -3.9904   -3.6429   -4.5382   -4.5055   -4.1673   -4.1694
Control：第1组：肥胖对照组.Sib-8：第2组：阳性对照组，盐酸西布曲明，8mg/kg，ig.C-0.0125：第3组：rhvCNTF(C16)0.0125mg/kg，sc.C-0.025：第4组：rhvCNTF(C16)0.025mg/kg，sc.C-0.050：第5组：rhvCNTF(C16)0.050mg/kg，sc.C-0.1第6组：rhvCNTF(C16)0.1mg/kg，sc.Standard-0.1，原形rhCNTF标准品0.1mg/kg，sc.
表3、给药20天时各组体重与给药前比较的体重变化率(％)
  组别   剂量/μg/kg   体重变化率/％
  对照组西布曲明(mg/kg)rhvCNTF(C16)rhvCNTF(C16)rhvCNTF(C16)rhvCNTF(C16)rhCNTF(标)   0812.52550100100   5.391.131.12-3.73-7.27-1.72-7.30
2.对大鼠摄食量的影响
结果见表4。给药前(0天)各组大鼠的摄食量无显著性差别。在整个实验过程中，对照组大鼠的摄食量稳定在一定范围内。西布曲明组大鼠摄食量在用药第1天后达到最低，随后缓慢回升，与对照组接近，差别无显著性。给药0～7天内，各剂量受试组大鼠的摄食量持续减少，有明显量-效关系。
表4、各组大鼠给药前后摄食量(g)的变化
组别   剂量mg/kg 0d 1d 2d 3d
  正常对照   -   33.82±5.56   29.57±5.54   30.40±5.57   29.41±5.85
  曲美   8   29.85±5.84   14.73±5.44△   14.96±5.94△   19.28±4.44△
  rhvCNTF   0.0125   27.69±7.36*   25.54±5.00   25.79±6.23   26.61±4.30
  rhvCNTF   0.025   25.68±6.57△   24.22±7.38   20.29±8.89△   21.10±5.80△
  rhvCNTF   0.05   29.66±5.87   27.39±8.26   24.22±7.06*   21.88±7.46*
  rhvCNTF   0.10   30.93±4.92   26.26±6.84   22.69±7.32*   21.16±2.90△
  rhCNTF   0.10   29.84±10.25   25.51±5.26   18.70±4.43△   16.59±4.98△
  组别   剂量mg/kg   4d   5d   6d   7d
  正常对照   -   31.10±4.71   29.56±3.73   27.71±2.10   29.01±3.24
  曲美   8   23.08±3.09△   23.54±4.86△   24.79±2.02△   24.73±2.82△
  rhvCNTF   0.0125   26.50±5.70   25.95±4.80   26.50±3.88   26.24±3.06
  rhvCNTF   0.025   23.02±4.88△   23.13±4.96△   21.17±7.00*   24.36±5.30*
  rhvCNTF   0.05   22.51±5.60△   20.06±6.81△   21.67±5.24△   20.30±6.61△
  rhvCNTF   0.10   22.23±3.29△   22.36±3.90△   20.77±3.81△   22.04±2.21△
  rhCNTF   0.10   16.04±5.31△   16.63±4.59△   16.54±4.81△   17.86±4.24△
  组别   剂量mg/kg   8d   9d   13d   14d
  正常对照   -   27.63±3.50   24.81±3.08   24.99±2.77   26.00±3.78
  曲美   8   26.05±4.58   24.36±5.99   24.30±3.24   25.89±3.95
  rhvCNTF   0.0125   23.62±3.80*   23.48±2.87   23.72±4.42   24.01±4.02
  rhvCNTF   0.025   22.68±3.86△   20.30±6.61   23.44±8.30   21.07±7.91
  rhvCNTF   0.05   20.20±6.13△   18.72±6.22*   21.45±6.98   21.41±6.79
  rhvCNTF   0.10   19.89±6.31△   20.52±5.14*   25.34±6.65   22.64±4.50
  rhCNTF   0.10   16.69±3.45△   19.07±3.41△   25.52±5.27   25.53±2.41
续表4、各组大鼠给药前后摄食量的变化(g)
组别   剂量mg/kg 15d 16d 19d 20d
  正常对照   -   23.58±4.77   24.93±3.43   23.85±3.16   22.43±3.72
  曲美   8   27.74±7.05   25.51±3.89   25.63±4.73   26.89±4.10*
  rhvCNTF   0.0125   24.01±4.02   23.32±5.31   22.20±6.08   20.38±6.40
  rhvCNTF   0.025   21.54±6.36   21.36±8.48   17.93±10.06   19.48±8.66
  rhvCNTF   0.05   20.43±8.21   18.90±6.89*   16.47±8.82*   17.56±7.17
  rhvCNTF   0.10   23.61±4.23   23.61±5.38   23.70±4.66   22.79±4.97
  rhCNTF   0.10   20.84±6.99   22.46±6.05   20.26±8.09   18.66±7.69
  组别   剂量mg/kg   21d
  正常对照   -   23.13±3.34
  曲美   8   23.19±5.62
  rhvCNTF   0.0125   20.05±7.30
  rhvCNTF   0.025   17.64±8.01
  rhvCNTF   0.05   17.21±9.04
  rhvCNTF   0.10   24.83±3.75
  rhCNTF   0.10   19.67±7.15
与正常对照组比，*P＜0.05，△P＜0.01。
3.对肥胖脂数的影响
结果见表5。治疗终点时，rhvCNTF 25μg/kg组大鼠的lee’s指数和体质指数与正常对照组相比差异有显著性(P＜0.05)，rhvCNTF50μg/kg组大鼠的lee’s指数和体质指数与正常对照组相比差异有极显著性(P＜0.01)。给药组大鼠的体脂重量与正常对照组相比无显著性差异，但脂肪重量有剂量依赖性的下降倾向。
表5、给药21天时各组肥胖指数
  组别   剂量(μg/kg)   Lee’s指数   体质指数
  对照组西布曲明(mg/kg)rhvCNTF(C16)rhvCNTF(C16)rhvCNTF(C16)rhvCNTF(C16)rhCNTF(标)   0812.52550100100   308.8±8.6303.5±7.4302.4±13.2296.1±11.0*293.4±13.5△303.6±7.7291.4±15.7△   7.61±0.607.18±0.607.22±0.856.70±0.90*6.56±0.89△7.18±0.496.47±1.10△
与正常对照组比，*P＜0.05，△P＜0.01。
讨论
CNTF是一个由200个氨基酸残基组成的蛋白质，无分子内二硫键，无分泌信号，无糖基化位点，能耐受剧烈的化学处理。它与白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素6(IL-6)等具有相似的螺旋框架结构，被认为属于IL-6家族。CNTF具有多种功能，能促使多种神经细胞的存活，是第一个被发现的能维持在体和离体脊髓运动神经元的存活及突起生长的神经营养因子，在神经系统发育、分化和神经损伤修复中具有非常重要的作用。
90年代，曾对rhCNTF进行治疗肌脊萎缩性侧索硬化症的临床试验，发现用药后患者客观指标并未得到改善，但可引起剂量依赖性的厌食和体重下降[4，5，6，7]。在人和啮齿类动物的研究表明，rhCNTF处理可导致摄食量减少，体重下降。作用机理研究显示，rhCNTF可通过血脑屏障，作用于下丘脑食欲调节中枢，激活瘦素样通路，但不诱导恶病质因子如IL-1，IL-6和TNF-α的释放，对瘦素抵抗的营养性肥胖仍然有减肥作用。这些均是利用转基因小鼠作为肥胖模型获得的实验结果。
本实验中观察了rhvCNTF(C16)对大鼠体重及摄食量的影响，结果表明在实验20天内，rhvCNTF(C16)皮下注射，可引起大鼠体重和摄食量下降，各个剂量受试组大鼠体重降低有明显的量-效关系，最低有效剂量为12.5μg/kg。且用药时间愈长，rhvCNTF(C16)作用愈强于原形rhCNTF，表明rhvCNTF(C16)不易产生耐受性。
结论
rhvCNTF(C16)(0.0125-0.1mg/kg)对大鼠皮下注射(sc)，1次/日，明显降低大鼠体重，可使大鼠的摄食量在用药初期(0-9天)明显减少，并有明显的量-效关系，减小食量的作用在用药第7天或第9天后逐渐减弱，因而降低体重的作用最初和减少摄食量有关，后期减肥作用与减少摄食关系较小。
大鼠最低有效量为rhvCNTF(C16)12.5μg/kg，相当于人临床用量为2μg/kg，此剂量和国外rhCNTF减肥III期临床试验用量相当，属安全剂量(rhCNTF＞5μg/kg后可出现恶心、厌恶食等症状)。
由减肥作用的动态变化推测，低剂量rhvCNTF(C16)(12.5-50μg/kg)免疫原性较弱，有开发价值。50μg/kg rhvCNTF(C16)用药时间愈长，减肥作用愈强，显示用药时间愈长，rhvCNTF(C16)作用愈强于原形rhCNTF，表明rhvCNTF(C16)不易产生耐受性。
表6、rhvCNTF(C16)对SD大鼠体重(g)变化的影响
组别   剂量mg/kg 0d 1d 2d 3d 4d 5d 6d
  对照   -   466.9±40.5   470.1±43.2   472.5±42.7   474.6±39.4   478.3±43.1   479.4±43.3   481.5±41.8
  曲美   8   465.9±40.5   447.9±38.3   448.8±38.7   451.1±39.1   452.1±39.5   453.3±38.9   456.8±40.5
  rhvCNTF(C16)   0.0125   467.0±40.1   467.0±41.1   468.4±41.3   468.8±41.2   469.8±42.9   471.2±44.2   473.1±41.8
  rhvCNTF(C16)   0.025   457.4±47.0   457.3±48.4   456.5±48.0   455.0±50.8   457.7±46.9   455.2±47.6   454.2±50.4
  rhvCNTF(C16)   0.05   465.2±45.5   464.8±45.7   462.1±43.6   459.0±48.1   459.3±44.6   453.1±45.5   454.1±46.6
  rhvCNTF(C16)   0.10   467.2±39.6   462.8±38.4   460.3±38.9   456.2±38.5   456.6±37.6   452.1±38.9   448.6±39.0
  rhCNTF   0.10   464.4±48.0   458.1±48.7   452.6±49.1   446.6±48.2   442.7±47.5   434.6±46.2   429.9±45.9*
组别   剂量mg/kg 7d 8d 9d 10d 12d 13d 14d
  对照   -   485.1±42.6   486.0±43.9   485.2±42.7   486.1±43.4   490.5±43.5   490.9±45.1   488.5±44.9
  曲美   8   458.4±42.1   459.5±41.6   460.9±39.3   461.0±38.6   466.3±39.0   465.9±36.8   463.9±38.8
  rhvCNTF(C16)   0.0125   474.4±44.9   474.1±45.0   474.6±43.8   474.5±43.7   475.0±45.2   475.2±47.2   472.8±47.4
  rhvCNTF(C16)   0.025   456.6±51.3   455.8±50.3   456.8±49.7   453.9±50.9   457.8±50.8   457.3±56.8   448.6±58.0
  rhvCNTF(C16)   0.05   451.6±45.7   449.5±47.2   447.9±47.1   448.9±48.3   447.1±52.9   445.8±54.8   442.7±54.7
  rhvCNTF(C16)   0.10   450.1±36.9   446.0±38.1*   446.1±38.0*   447.7±39.1   451.6±40.5   453.3±43.2   449.1±39.4
  rhCNTF   0.10   425.4±44.8*   422.1±42.1△   424.6±43.3*   423.4±44.4*   430.9±45.3*   430.3±50.4*   430.9±48.2*
组别   剂量mg/kg 15d 16d 17d 18d 19d 20d 21d
  对照   -   488.3±44.0   491.3±44.1   492.5±46.9   493.5±49.2   494.5±49.4   492.3±47.2   491.8±45.6
  曲美   8   467.8±38.0   468.1±38.9   469.4±43.1   466.1±45.3   468.3±46.6   472.5±45.5   470.8±46.1
  RhvCNTF(C16)   0.0125   472.0±48.0   473.6±50.6   476.3±50.0   474.8±50.8   475.2±50.6   472.8±52.6   472.6±54.2
  RhvCNTF(C16)   0.025   448.6±59.9   446.8±64.2   446.1±66.1   443.9±65.5   441.3±71.9   441.4±71.1   437.2±76.2
  RhvCNTF(C16)   0.05   443.0±56.9   438.0±60.2*   438.2±63.9*   437.2±66.2*   432.1±69.4*   431.2±70.7*   427.8±75.2*
  RhvCNTF(C16)   0.10   454.1±40.3   453.5±42.1   456.0±44.3   457.5±40.1   458.9±39.9   459.0±41.7   461.7±41.1
  RhCNTF   0.10   429.9±53.3*   430.6±54.0*   432.6±58.0*   431.1±62.7*   429.4±65.4*   431.7±69.5*   431.6±73.0
与对照组比，*P＜0.05，△P＜0.01。
实施例3 C16对发育期DIO大鼠的减肥作用研究
摘要：
用离乳1-3天的雄性SD大鼠，加高营养饲料喂养，制备大鼠高营养性肥胖(DIO)模型，然后用C16(rhvCNTF)0.0125-0.4mg/kg皮下注射治疗，观察C16对DIO大鼠的减肥作用，并用西布曲明作阳性对照。结果，在用药0～9天时C16 0.05-0.4mg/kg明显降低大鼠体重和肥胖指数(Lee’s指数和体质指数)，并有明显的量-效关系，在用药9天后减肥作用不再增加，表现为受试组大鼠与模型对照组大鼠体重平行增加，但各时点与模型对照组比，差别显著，表明减肥作用仍然存在。C16可使DIO大鼠的摄食量在用药初期(0-9天)明显减少，并有明显的量-效关系，此作用在用药第7天或第9天后逐渐减弱，用药大鼠摄食量逐渐接近模型对照组。给药14天后，C16 0.05-0.4mg/kg组DIO大鼠的体脂重量均明显降低，和模型对照组比，C16 0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4mg/kg各组分别降低了1.22％、8.30％、23.15％、21.83％、23.91％和31.41％。C16 0.0125-0.4mg/kg使DIO大鼠血清VLDL-C含量降低，使血清HDL-C含量升高，血TG降低，此作用对肥胖患者十分有利。
材料
1.药品和试剂  重组人睫状神经营养因子变构体rhvCNTF(C16)，临用前以无菌生理盐水溶解。盐酸西布曲明(曲美胶囊)，为太极集团涪陵制药厂产品，批号0205010，临用前用无菌生理盐水混悬。
2.动物  断乳1-3天SD大鼠，雄性，体重85-105g，SPF级，购自上海实验动物中心，生产许可证号：SCXK(沪)2002-0010。
3.饲料
基础饲料1000g中，含玉米面385，麸皮180，标准粉100，鱼粉100，肉骨粉25，豆饼155，骨粉22，食盐3，蛋氨酸1.2，赖氨酸0.5，维生素E 0.12，维生素AD 3.5，奶粉24.28，牧乐维他0.3。高营养饲料：100g基础饲料中加入下列成份：无糖全脂奶粉(内蒙古伊利实业集团股份有限公司产品，每100g奶粉热量＞2000kJ，蛋白质22g，脂肪25g，批号：20020808)10g，猪油10g，鸡蛋30g，浓鱼肝油(维生素AD滴剂，青岛双鲸药业有限公司产品，批号010108，每g含维生素A 50000单位，维生素D 5000单位)0.34g(维生素A 17000U，维生素D 1700U)。将各成份在饲料机内混匀，成形，晾干。60℃烤箱烤12小时，再次晾干，保存。
方法：
1、模型制备
从294只离乳1-3天大鼠中随机取出20只作为正常对照组，喂以普通饲料，其它大鼠用于制作DIO模型，喂以高营养饲料。从喂高营养饲料前1天开始，每周称体重，将体重增长缓慢的大鼠淘汰，体重合格者纳入实验。以DIO组大鼠比正常对照组体重增加≥20％为造模成功，共造型10周。第10周末时，从正常大鼠中选出10只做为正常对照，从造型成功的大鼠中选出肥胖大鼠80只，分为模型对照组、阳性对照组和C16 6个剂量的受试组。
2、分组及给药：
第1组：正常对照组，喂以普通饲料
第2组：模型对照组，喂以高营养饲料
第3组：阳性对照组，盐酸西布曲明，4mg/kg，ig，喂以高营养饲料
第4组：C16 0.0125mg/kg，sc，喂以高营养饲料
第5组：C16 0.025mg/kg，sc，喂以高营养饲料
第6组：C16 0.05mg/kg，sc，喂以高营养饲料
第7组：C16 0.1mg/kg，sc，喂以高营养饲料
第8组：C16 0.2mg/kg，sc，喂以高营养饲料
第9组：C16 0.4mg/kg，sc，喂以高营养饲料
阳性对照组大鼠用西布曲明灌胃，5ml/kg，1日1次，其余各组大鼠均用等体积生理盐水灌胃，1日1次。C16各组大鼠每天sc注射不同浓度的受试药1次，每次2ml/kg。正常对照组、模型对照组和阳性对照组sc注射等体积赋形剂生理盐水溶液。共给药14天，然后停药64h后处死，在处死前禁食12h。
结果
1)对DIO大鼠体重变化的影响：DIO大鼠于给药前(0天)、给药后1-14天定时记录体重及摄食量。给药前(0天)模型对照组大鼠体重较正常对照组增加20％以上，与正常对照组相比P＜0.01，说明DIO模型成立。在整个实验过程中，模型对照组大鼠体重持续增长，和实验前比较，实验第9天时体重增长率为4.98％，第14天时体重增长率为7.30％。西布曲明组大鼠体重在用药第2天时达到最低(和给药前比，降低了3.19％)，随后缓慢回升，到实验结束(给药第14天)时，体重增长率为1.93％，各时点体重与模型对照组相比P＜0.05，差别有显著性。C16各组大鼠在用药0～9天内，DIO大鼠的体重降低有明显量-效关系，0.0125、0.025mg/kg组大鼠体重增长减慢，第9天体重增长率分别为3.34％、2.19％，但和模型对照组(4.98％)相比无显著性差异；0.05mg/kg组大鼠体重基本维持在给药前水平，给药第9天时体重增长率为-1.17％，和模型对照组相比P＜0.05；其它各受试组大鼠体重均呈负增长，在第8天时均达到最低(其中，C16 0.1、0.2、0.4mg/kg组分别降低4.63％、9.79％、和12.71％，体重与模型对照组相比均P＜0.01)；随后体重回升，各给药组均与模型对照组大鼠体重成平行增加，到第14天时，C16 0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4mg/kg各组大鼠体重变化率分别为4.58％、4.07％、1.60％、-1.47％、-6.69％和-8.64％，其中0.0125、0.025mg/kg组大鼠体重与模型对照组相比无显著性差异，0.05mg/kg组大鼠体重与模型对照组相比P＜0.05，其它组大鼠体重与模型对照组相比均P＜0.01。结果见表7及图4。
表7.C16对DIO大鼠体重的影响
组别   剂量mg/kg   0d体重/g   1d体重/g   2d体重/g   3d体重/g
  正常对照组   -   382.5±23.1**   382.6±23.3**   385.3±23.4**   386.7±22.3**
  DIO模型组   -   483.0±18.6   484.7±19.0   486.9±21.1   488.0±20.4
  曲美对照组   4.0   481.4±15.8   467.2±15.6*   466.1±16.8*   467.6±18.0*
  C16   0.0125   486.2±20.0   490.1±20.4   491.0±21.3   492.7±23.2
  C16   0.025   484.9±23.1   487.7±23.6   489.9±23.5   490.2±24.2
  C16   0.050   481.2±18.6   481.8±18.5   482.2±16.1   482.6±16.0
  C16   0.100   480.1±15.0   479.6±14.5   477.3±14.1   474.4±14.9
  C16   0.200   481.3±19.6   475.3±20.4   470.8±20.3   467.3±20.8*
  C16   0.400   482.0±17.5   474.4±18.2   468.0±17.8*   462.7±17.2**
组别   剂量mg/kg   4d体重/g   5d体重/g   6d体重/g   7d体重/g
  正常对照组   -   388.4±23.7**   392.8±23.2**   392.7±23.7**   396.3±24.5**
  DIO模型组   -   492.0±20.8   495.8±21.3   497.8±22.4   501.6±23.9
  曲美对照组   4.0   471.5±16.1*   473.1±16.9*   476.7±16.7*   478.9±16.4*
  C16   0.0125   494.6±22.9   495.8±23.1   498.7±21.9   500.8±23.3
  C16   0.025   492.4±24.2   496.5±25.6   495.6±24.3   498.1±24.8
  C16   0.050   481.0±17.8   482.6±17.6   482.1±18.2   481.9±18.2
  C16   0.100   471.4±16.2*   468.5±17.4**   465.0±16.9**   463.6±13.9**
  C16   0.200   459.9±21.5**   453.0±22.8**   445.9±23.0**   441.7±23.9**
  C16   0.400   455.3±16.0**   447.1±14.9**   435.8±14.4**   426.3±14.1**
组别   剂量mg/kg   8d体重/g   9d体重/g   10d体重/g   11d体重/g
  正常对照组   -   397.9±26.3**   399.4±29.6**   398.3±30.3**   396.3±33.2**
  DIO模型组   -   505.3±24.2   507.2±24.9   507.5±26.3   507.3±27.9
  曲美对照组   4.0   480.6±19.0*   482.9±18.8*   481.0±19.5*   483.3±20.5*
  C16   0.0125   502.4±21.9   502.4±22.7   499.9±21.9   500.2±22.1
  C16   0.025   496.5±23.3   495.5±26.0   495.3±29.7   495.9±28.1
  C16   0.050   481.8±20.9*   475.5±19.6**   477.1±22.9*   478.3±21.5*
  C16   0.100   457.8±13.7**   458.9±17.2**   458.9±18.8**   461.0±18.8**
  C16   0.200   434.2±24.4**   434.5±24.8**   437.3±24.2**   435.8±24.9**
  C16   0.400   420.6±12.0**   421.6±13.7**   423.4±14.1**   426.6±15.5**
组别   剂量mg/kg   12d体重/g   13d体重/g   14d体重/g
  正常对照组   -   399.1±24.4**   403.1±32.0**   404.9±34.7**
  DIO模型组   -   511.1±28.7   514.2±28.3   518.5±30.0
  曲美对照组   4.0   485.0±17.9*   487.0±18.8*   490.7±19.4*
  C16   0.0125   505.9±24.7   506.8±22.2   508.3±20.4
  C16   0.025   499.8±27.3   501.8±28.4   504.6±27.0
  C16   0.050   484.0±23.0*   486.2±24.9*   489.0±26.5*
  C16   0.100   465.0±19.8**   470.1±17.9**   473.0±19.6**
  C16   0.200   440.3±27.6**   444.1±26.3**   449.1±27.0**
  C16   0.400   432.1±15.6**   434.6±13.6**   440.2±14.3**
与DIO模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
2)对DIO大鼠肥胖指数的影响：治疗终点时，模型对照组大鼠肥胖指数(Lee’s指数和体质指数)均较正常对照组增加，和正常对照组比较，差别有显著性。西布曲明治疗组和C16 0.05-0.4mg/kg各受试组DIO大鼠肥胖指数均较对照组下降，差别有显著性。结果见表8。
表8.C16对DIO大鼠肥胖指数的影响
组别   剂量mg/kg   体重/g Lee’s指数 体质指数
  正常对照组   -   395.4±34.8**   293.8±4.3**   6.34±0.34**
  DIO模型组   -   509.1±28.3   299.8±3.6   7.18±0.24
  曲美对照组   4.0   479.3±19.7*   293.4±4.4**   6.74±0.29**
  C16   0.0125   495.1±20.0   298.8±3.4   7.06±0.21
  C16   0.025   495.5±24.2   297.6±4.8   7.01±0.28
  C16   0.050   480.4±25.3*   294.7±4.2**   6.80±0.25**
  C16   0.100   467.8±19.9**   293.1±2.3**   6.67±0.18**
  C16   0.200   442.9±24.2**   291.6±6.0**   6.48±0.33**
  C16   0.400   437.5±15.3**   287.1±5.8**   6.26±0.27**
与DIO模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
3)对DIO大鼠体脂重量的影响：给药14天后，西布曲明4mg/kg及C16各受试组DIO大鼠的体脂重量均明显降低，和模型对照组比，西布曲明4mg/kg组降低19.36％，C16 0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4mg/kg各组分别降低了1.22％、8.30％、23.15％、21.83％、23.91％和31.41％。与模型对照组比，C16 0.05、0.1及0.2mg/kg组大鼠体脂重量差别有显著性(P＜0.05)，C16 0.4mg/kg各组大鼠体脂重量差别均极为显著(P＜0.01)。结果见表9。
表9.C16对DIO大鼠右比目鱼肌及体脂重量的影响
组别   剂量mg/kg   右比目鱼肌/g   脂肪/g
  正常对照组   -   0.93±0.06**   12.64±3.33**
  DIO模型组   -   1.17±0.10   30.37±7.01
  曲美对照组   4.0   1.14±0.98   24.49±6.39
  C16   0.0125   1.20±0.11   30.00±6.12
  C16   0.025   1.15±0.09   27.85±5.14
  C16   0.050   1.15±0.07   23.34±4.12*
  C16   0.100   1.14±0.11   23.74±4.99*
  C16   0.200   1.07±0.09*   23.11±5.37*
  C16   0.400   1.03±0.08**   20.83±5.05**
与DIO模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
4)对DIO大鼠摄食量的影响：给药前(0天)0.0125-0.2mg/kg各组大鼠的摄食量无显著性差别，0.4mg/kg组大鼠的摄食量高于模型组大鼠(P＜0.05)。在整个实验过程中，模型组大鼠的摄食量稳定在一定范围内。西布曲明组大鼠摄食量在用药第1天后达到最低(与模型对照组相比P＜0.01)，随后缓慢回升，在第7天时达到稳定状态，与模型对照组接近，差别无显著性。给药0～7天内，C16 0.1、0.2、0.4mg/kg剂量组大鼠的摄食量持续减少，有明显量-效关系，0.05mg/kg组大鼠摄食量在第9天时达到最低点，0.1、0.2mg/kg剂量组大鼠摄食量在第8天时达到最低点，0.04mg/kg剂量组大鼠摄食量在第7天时达到最低点。在给药8天时，C16 0.05、0.1、0.2、0.4mg/kg组与模型对照组比均P＜0.01。第11天后，各C16剂量组大鼠的摄食量回升并达到稳定状态，与模型对照组相比均无显著性差别。结果见表10及图5。
表10.C16对DIO大鼠摄食量的影响
组别   剂量mg/kg   0d摄食量/g   1d摄食量/g   2d摄食量/g   3d摄食量/g
  正常对照组   -   25.3±2.9   23.4±3.5   22.5±2.3   22.1±2.9
  DIO模型组   -   25.6±3.0   24.3±3.1   23.8±3.9   23.0±2.4
  曲美对照组   4.0   28.2±3.1   13.9±2.8**   15.9±3.0**   17.2±2.9**
  C16   0.0125   28.2±3.9   23.6±3.4   24.7±2.5   24.9±3.4
  C16   0.025   28.8±4.3   24.0±3.3   24.8±3.0   24.5±2.8
  C16   0.050   27.0±2.5   23.5±2.5   23.1±2.8   24.2±2.5
  C16   0.100   27.1±4.1   22.8±2.7   20.2±3.0*   18.7±2.9**
  C16   0.200   26.5±3.4   20.5±3.4*   16.4±3.7**   15.6±4.1**
  C16   0.400   29.3±2.9*   21.0±2.0*   15.6±1.8**   14.3±3.0**
组别   剂量mg/kg   4d摄食量/g   5d摄食量/g   6d摄食量/g   7d摄食量/g
  正常对照组   -   21.8±3.3   21.5±2.3*   20.8±1.9**   20.4±2.1**
  DIO模型组   -   23.5±4.1   23.8±2.3   24.1±1.9   24.4±3.0
  曲美对照组   4.0   19.8±3.3*   20.6±2.9*   23.3±3.8   24.1±3.7
  C16   0.0125   24.2±2.6   23.2±1.3   23.7±1.9   25.4±3.1
  C16   0.025   23.2±3.4   24.6±3.6   23.7±2.5   24.1±2.9
  C16   0.050   21.3±2.9   22.4±2.7   23.6±3.0   23.5±3.3
  C16   0.100   18.0±3.2**   18.7±3.6**   17.0±3.1**   17.5±2.6**
  C16   0.200   14.3±4.7**   14.0±4.6**   14.0±4.4**   14.2±4.0**
  C16   0.400   14.8±4.2**   14.4±3.1**   13.6±3.7**   11.6±3.0**
组别   剂量mg/kg   8d摄食量/g   9d摄食量/g   10d摄食量/g   11d摄食量/g
  正常对照组   -   20.5±3.9**   20.1±4.4*   19.1±3.7**   19.5±4.8
  DIO模型组   -   24.8±2.0   24.5±3.4   24.8±4.1   23.9±5.0
  曲美对照组   4.0   24.1±3.8   23.8±3.0   22.9±3.8   24.2±4.9
  C16   0.0125   25.0±2.9   24.2±2.9   23.5±2.3   23.3±3.6
  C16   0.025   22.7±4.4   23.7±3.7   22.8±4.9   24.6±4.3
  C16   0.050   21.2±3.2**   19.9±3.5**   21.9±4.4   25.1±4.6
  C16   0.100   14.9±2.0**   19.5±3.1**   21.4±2.4*   24.6±3.9
  C16   0.200   12.5±5.0**   18.2±4.8**   21.0±5.2   21.8±4.8
  C16   0.400   11.8±3.2**   18.7±3.1**   22.7±4.6   23.6±5.0
组别   剂量mg/kg   12d摄食量/g   13d摄食量/g   14d摄食量/g
  正常对照组   -   18.7±5.1   21.0±4.7   20.2±2.4**
  DIO模型组   -   22.7±3.6   24.0±3.2   26.2±1.8
  曲美对照组   4.0   20.5±4.1   23.0±2.7   25.3±3.1
  C16   0.0125   23.2±2.6   24.3±3.4   24.7±2.6
  C16   0.025   22.6±2.4   23.4±3.8   24.5±2.8
  C16   0.050   24.2±2.6   24.5±4.1   25.8±4.2
  C16   0.100   22.6±3.6   23.7±1.8   24.6±2.8
  C16   0.200   19.3±3.9   23.3±3.6   23.4±3.0*
  C16   0.400   22.4±4.2   23.6±2.7   24.9±3.0
与DIO模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
5)对DIO大鼠空腹血糖、血脂含量的影响：模型对照组大鼠的空腹血糖、血清极低密度脂蛋白含量及甘油三脂含量明显高于正常对照组(P均＜0.01)。给药14天后，西布曲明4mg/kg可以显著降低DIO大鼠的血清甘油三脂含量(P＜0.01)，对其它指标无显著性影响。C160.0125～0.4mg/kg组大鼠血清HDL-C值均有升高趋势，其中0.05mg/kg组与模型对照组相比P＜0.01，0.1～0.4mg/kg组与模型对照组相比P均＜0.05；C16 0.0125～0.4mg/kg组大鼠血清VLDL-C值均有降低趋势，和模型对照组比，0.0125、0.05和0.4mg/kg组差别有显著性(P均＜0.05)；C16 0.0125～0.4mg/kg组大鼠血清TG值亦有降低趋势，和模型对照组比，0.0125、0.05和0.4mg/kg组差别有显著性，其中0.0125mg/kg组与模型对照组比P＜0.01，0.05和0.4mg/kg组与模型对照组比P＜0.05。C16对DIO大鼠的血糖无显著性改变，但是因为大鼠是在给药后76h后处死的，所以，C16能不能降低血糖还待专门实验来说明。结果见表11。
表11.C16对DIO大鼠的影响——血液生化药效学指标检查
组别   剂量mg/kg   GLUmmol/L   CHOmmol/L   HDL-Cmmol/L   VLDL-Cmg/dL   TGmmol/L
  正常对照组   -   6.52±0.57**   1.40±0.18   1.30±0.19   11.10±1.91**   0.61±0.12**
  DIO模型组   -   7.42±0.48   1.25±0.15   0.90±0.18   19.13±5.96   1.07±0.34
  曲美时照组   4.0   7.27±0.91   1.40±0.20   1.08±0.18   16.3±2.5*   0.64±0.17**
  C16   0.0125   7.18±0.33   1.39±0.17   1.07±0.16   12.78±2.44*   0.71±0.13**
  C16   0.025   7.32±0.38   1.38±0.26   1.06±0.22   15.40±2.37   0.87±0.13
  C16   0.050   7.89±0.44*   1.43±0.14*   1.14±0.13**   14.40±3.27*   0.81±0.18*
  C16   0.100   7.57±0.40   1.39±0.16   1.10±0.13*   14.70±2.94   0.82±0.17
  C16   0.200   7.40±0.39   1.41±0.10*   1.11±0.12*   14.80±3.15   0.82±0.18
  C16   0.400   7.57±0.48   1.41±0.20   1.07±0.19   13.70±3.34*   0.78±0.19*
与DIO模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
6)对DIO大鼠骨骼肌重量的影响：模型对照组大鼠的右比目鱼肌重量较正常对照组大鼠重25.81％，二者相比P＜0.01。给药14天后，C16 0.2～0.4mg/kg组DIO大鼠的右比目鱼肌重量明显减轻，和模型对照组比，C16 0.025、0.05、0.1、0.2、0.4mg/kg各组分别降低了1.71％、1.71％、2.56％、8.55％和11.96％。其中，C16 0.2mg/kg组与模型对照组相比P＜0.05，C16 0.4mg/kg组与模型对照组相比差别极为显著(P＜0.01)，但是，各给药组大鼠的右比目鱼肌指数与模型组相比无显著性改变，由此说明在小于0.4mg/kg剂量时，C16不会引起骨骼肌萎缩。曲美4.mg/kg组及C16 0.0125-0.1mg/kg组大鼠右比目鱼肌重量和模型对照组比差别无显著性。结果见表9。
实施例4 rhvCNTF对正常小鼠的减重作用研究
摘要
用正常昆明种小鼠，观察了不同剂量、不同给药途径的rhvCNTF对不同体重小鼠体重增长的影响。结果不同体重小鼠对rhvCNTF减重作用的反应不同，以20g昆明种小鼠的体重降低最为明显，以35g组小鼠脂肪指数降低最多。
RhvCNTF16-500μg/kg ip对小鼠有明显的减重和降低脂肪指数的作用，有明显的剂量依赖性；其中以腹腔内注射作用最强，肌注次之，皮下注射作用较差。对血糖浓度的影响以肌注给药法最为稳定，其它给药途径作用不确定；对小鼠摄食量无显著性影响。
材料和方法
药品来源重组人睫状神经营养因子变构体(rhvCNTF(C16)，下称rhvCNTF)，4℃保存，临用前用无菌生理盐水溶解。
动物  昆明种小鼠，雄性，体重18-20g，购自卫生部兰州生物制品研究所，合格证号14-001。
方法  从首批150只小鼠中随机抽取19-21g小鼠20只，群养(10只/笼)，用以绘制正常小鼠生长曲线；再随机抽取19-20g小鼠24只，为20g组；剩余小鼠饲养至体重达到25g、30g、35g时，各组随机抽取24只，成为25g组、30g组、35g组，均单笼饲养。
从第二批100只小鼠中，抽取88只，随机分为11组，用以研究量效关系和不同给药途径对减重作用的影响。
1.正常小鼠体重增长曲线
检测指标：体重，每日定时用电子天平称小鼠体重。
2.不同体重小鼠对rhvCNTF减重作用的影响
2.1分组及给药
20g组：第一组(NS.ip 0.1ml/10g)
       第二组(rhvCNTF ip 500μg/kg/d)
25g组：第一组(NS.ip 0.1ml/10g)
       第二组(rhvCNTF ip 500μg/kg/d)
30g组：第一组(NS.ip 0.1ml/10g)
       第二组(rhvCNTF ip 500μg/kg/d)
35g组：第一组(NS.ip 0.1ml/10g)
       第二组(rhvCNTF ip 500μg/kg/d)
2.2检测指标
2.2.1体重、摄食量
-1d和给药0-10d每天定时记录小鼠体重及24h摄食量。
2.2.2脂肪指数测定
小鼠处死后取两侧睾丸周围脂肪，称湿重，并计算脂肪指数。脂肪指数(mg/10g)＝脂肪重量(mg)/体重(g)×10
3.rhvCNTF的量效关系研究
3.1分组及给药
第一组：正常对照组(NS.ip 0.1ml/10g)
第二组：rhVCNTF(500μg/kg/d ip 0.1ml/10g)
第三组：rhvCNTF(250μg/kg/d ip 0.1ml/10g)
第四组：rhvCNTF(125μg/kg/d ip 0.1ml/10g)
第五组：rhvCNTF(62.5μg/kg/d ip 0.1ml/10g)
第六组：rhvCNTF(32μg/kg/d ip 0.1ml/10g)
第七组：rhvCNTF(16μg/kg/d ip 0.1ml/10g)
第八组：rhvCNTF(8μg/kg/d ip 0.1ml/10g)
第九组：rhvCNTF(4μg/kg/d ip 0.1ml/10g)
一日量分2次给予，早晚各1次。
3.2检测指标
3.2.1体重、摄食量
给药0-10d每天定时记录小鼠体重及24h摄食量。
3.2.2血糖浓度
给药第10天21:00各组小鼠禁食；第11天7:00给药，9:00眼球采血，血样4℃放置20min，8000r/min低温离心8min，取血清用酶法测定血糖浓度(mmol/L)。
3.2.3脂肪指数
小鼠处死后取两侧睾丸周围脂肪，称湿重，并计算脂肪指数。
脂肪指数(mg/10g)＝脂肪重量(mg)/体重(g)×10
rhvCNTF对小鼠减重作用测定流程
  第天   时间   实验过程
  -1   8:00   称鼠重、筛选、编号，单笼饲养，称饲料投放量
  0   8:00   称鼠重、料前、料后量，按体重随机分组
  9:00△   给药
  17:00   给药
  1↓9   8:00   称鼠重、料前、料后量
  9:00△   给药
  17:00   给药
10   8:00   称鼠重和饲料剩余量
  9:00△*   取睾丸周围脂肪称重
△：根据前一操作完成情况，可提前或推后，但尽量保持每天在同一时间。
*：该步骤可省略。
4.不同给药途径对减重作用的影响
4.1分组及给药
第一组：正常对照组(NS ip 0.1ml/10g)
第二组：rhvCNTF(250μg/kg/d im 0.1ml/10g)
第三组：rhvCNTF(250μg/kg/d sc 0.1ml/10g)
4.2检测指标
4.2.1体重、摄食量
-1d和给药0-10d每天定时记录小鼠体重及24h摄食量。
4.2.2血糖浓度
给药第10天21:00各组小鼠禁食；第11天7:00给药，9:00眼球采血，血样4℃放置20min，8000r/min低温离心8min，取血清测定血糖浓度(mmol/L)。
4.2.3脂肪指数
小鼠处死后取两侧睾丸周围脂肪，称湿重，并计算脂肪指数。脂肪指数(mg/10g)＝脂肪重量(mg)/体重(g)×10
5.数据统计
结果
1.正常昆明种小鼠体重生长曲线(图6)
2.小鼠不同体重对rhvCNTF减重作用的影响
2.1对体重、摄食量的影响
给药0d时，各体重组中空白对照组与给药组体重和摄食量均无差异；给药10d，各体重组中空白对照组与给药组体重均出现显著性差异(P＜0.01)(见表12)，其中以20g组差异最为显著(P＝3.66×10-13)，而摄食量除20g组具有显著性差异(P＝0.0067)外，其他各组均无显著性差异(见表13)。
表12  小鼠不同体重对rhvCNTF减重作用的影响
组别   对照组0d体重(g)   给药组0d体重(g) P   对照组10d体重(g)   给药组10d体重(g) P值   体重减少率(％)
  20g25g30g35g   23.22±0.8725.85±1.0629.92±0.9234.34±1.64   23.23±0.7925.73±1.0229.97±0.8634.33±1.69   0.980.770.890.99   33.53±1.3332.63±2.5834.11±1.9537.29±1.93   23.52±1.8526.27±1.7827.07±2.0831.58±2.10   3.66E-137.36E-078.17E-085.77E-07   29.919.520.615.3
表13  rhvCNTF对不同体重小鼠摄食量的影响
组别   对照组0d摄食量(g)   给药组0d摄食量(g) P   对照组10d摄食量(g)   给药组10d摄食量(g) P   摄食量减少率(％)
  20g25g30g35g   6.80±0.896.51±1.096.02±1.117.31±1.33   6.65±0.895.93±0.756.58±0.937.03±0.87   0.680.150.210.55   7.94±1.246.75±0.767.44±1.487.59±1.79   6.35±1.366.43±1.426.60±2.417.17±1.04   0.00670.510.340.48   20.04.711.35.5
2.2对脂肪指数的影响
各体重组中，空白对照组与给药组脂肪指数均有显著性差异(P＜0.01)，其中以30g组体脂减少最为明显(表14)。
表14  rhvCNTF对不同体重小鼠脂肪指数的影响
组别   对照组脂肪指数(mg/10g)   给药组脂肪指数(mg/10g)   体脂减少百分率/％ P值
  20g25g30g35g   59.8±13.856.9±20.275.3±33.688.1±31.3   29.8±13.234.8±16.034.7±10.736.2±13.7   50.238.853.958.9   ＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01
和对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
3.量效关系
3.1不同剂量rhvCNTF对小鼠体重的影响
给药第二天高剂量组(500μg/kg/d、250μg/kg/d)即出现显著性差异，随着给药天数增加，各剂量受试组体重减少率差别逐渐加大(见图7)。随着剂量逐渐增大，体重增长率呈下降趋势(见表15)。5d时除4μg/kg/d(最小剂量)组显示无效，其他各组和对照组比，差别均有显著性，10d时4μg/kg/d(最小剂量)组仍显示无效，8μg/kg/d组和16μg/kg/d组与空白对照组比较差别不显著，其他各组差别均有显著性意义。给药5d、8d、10d有效率及ED50见图8、图9、图10、图11、图12、图13。
表15  不同剂量rhvCNTF对小鼠体重的影响
组别  剂量(μg/kg/d) 0d体重(g) 5d体重(g)  体重增长率(％) 10d体重(g)  体重增长率(％)
 NSrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTF     -50025012562.5321684     19.29±0.7119.28±0.8919.25±0.8819.45±1.2619.26±0.9519.44±1.1119.29±0.8119.28±0.9119.29±0.83   26.43±1.1821.15±1.56△22.25±1.31△24.33±1.42△24.39±1.40△24.71±1.79*24.68±1.20*24.70±1.29*26.34±1.57     37.179.9315.6725.2626.7427.3227.9328.2036.60     31.98±2.6324.65±1.69△25.45±1.66△28.50±2.24*29.08±2.03*28.36±2.96*29.71±1.6729.24±2.8032.41±2.05     66.1828.0432.3746.9351.2946.1254.2251.6568.23
与对照组比较  *P＜0.05  △P＜0.01
3.2不同剂量rhvCNTF对小鼠摄食量的影响
不同剂量的rhvCNTF在给药全程中对小鼠摄食量无明显影响(见图14、表16)。
表16  不同剂量rhvCNTF对小鼠摄食量的影响
组别   剂量(μg/kg/d)   0d摄食量(g/只)   5d摄食量(g/只)   10d摄食量(g/只)
  NSrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTF   -50025012562.5321684   4.20±0.894.28±1.124.46±0.825.01±1.294.53±1.324.44±0.574.58±0.804.22±0.514.45±0.67   6.50±1.495.46±1.035.66±0.906.35±1.296.58±0.885.86±1.045.44±0.705.71±0.706.91±0.47   6.10±0.556.31±0.555.84±1.296.88±1.086.61±1.176.05±1.676.14±0.985.80±1.237.04±0.65△
与对照组比较△P＜0.01
3.3不同剂量rhvCNTF对小鼠血糖浓度的影响
除32μg/kg/d组外，其他各组与空白对照组均无显著性差异(见表17)，但受试组血糖浓度均低于空白对照组。
表17  不同剂量rhvCNTF对小鼠血糖浓度的影响
  组别   剂量(μg/kg/d)   血糖浓度(mmol/L)
  NSrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTF   -50025012562.5321684   5.14±1.224.57±0.884.63±0.575.21±0.554.03±0.803.86±0.45*4.68±0.794.17±0.664.12±0.68
与对照组比较*P＜0.05
3.4不同剂量rhvCNTF对小鼠脂肪指数的影响
高剂量组(500μg/kg/d、250μg/kg/d、125μg/kg/d)小鼠脂肪指数与空白对照组有显著性差异，其他各组与空白对照组差异虽无显著性，但随着剂量增大，脂肪指数呈下降趋势(见表18)。
表18  不同剂量rhvCNTF对小鼠脂肪指数的影响
  组别   剂量(μg/kg/d)   脂肪指数(mg/10g)
  NSrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTFrhvCNTF   -50025012562.5321684   44.0±11.527.1±15.8*31.0±11.7*28.5±6.5△32.2±31.236.7±19.542.4±12.744.5±21.742.0±14.4
与对照组比较△P＜0.01  *P＜0.05
4.不同给药途径对rhvCNTF减重作用的影响
4.1对小鼠体重的影响
以相同剂量为前提，不同给药途径，sc组与空白对照组无显著性差异，ip组与im组与空白对照组有显著性差异，但im组疗效明显降低(见图15、表19)，该组数据与表15数据比较，疗效降低近50％。
表19  rhvCNTF不同给药途径对小鼠体重的影响
组别   剂量(μg/kg/d)   0d体重(g)   5d体重(g)   体重增长率(％) 10d体重(g)   体重增长率(％)
  NS(ip)ipImsc   -250250250   19.29±0.7119.25±0.8819.29±0.7519.30±0.74   26.43±1.1822.25±1.31△24.01±1.48△25.33±1.07   37.1715.6724.5231.27   31.98±2.6325.45±1.66△28.26±1.46△30.11±1.52   66.1832.3746.6156.29
与对照组比较△P＜0.01
4.2 rhvCNTF对小鼠摄食量的影响
各种给药途径对小鼠摄食量均无明显影响(见图16、表20)。
表20  rhvCNTF不同给药途径对小鼠摄食量的影响
组别   剂量(μg/kg/d)   0d摄食量(g)   5d摄食量(g)   10d摄食量(g)
  NS(ip)ipImsc   -250250250   4.20±0.894.46±0.824.36±0.704.51±0.84   6.50±1.495.66±0.905.49±0.925.39±0.48   6.10±0.555.84±1.295.75±0.886.64±0.79
4.3 rhvCNTF对小鼠血糖浓度的影响
im组小鼠血糖浓度与空白对照组有显著性差异，其他两组差异虽无显著性，但都低于空白对照组(见表21)。
表21  rhvCNTF不同给药途径对小鼠血糖浓度的影响
  组别   剂量(μg/kg/d)   血糖浓度(mmol/L)
  NS(ip)IpImSc   -250250250   5.14±1.224.63±0.573.87±0.64*4.37±0.57
与对照组比较*P＜0.05
4.4 rhvCNTF对小鼠脂肪指数的影响
ip组脂肪指数与空白对照组有显著性差异，im组与空白对照组差异虽无显著性，但明显低于空白对照组，sc组无差异(见表22)。
表22  rhvCNTF不同给药途径对小鼠脂肪指数的影响
  组别   剂量(μg/kg/d)   脂肪指数(mg/10g)
  NS(ip)ipimsc   250250250250   44.0±11.531.0±11.7*32.0±15.440.4±16.4
与对照组比较*P＜0.05
结论
rhvCNTF 16-500μg/kg对正常昆明种小鼠有明显的减重和降低脂肪指数的作用，呈明显的剂量依赖性；降低20g小鼠体重及35g小鼠脂肪指数的作用最为明显。降低血糖浓度的作用在肌注给药时最为明显；减重作用以腹腔注射作用最强，肌注给药次之，皮下注射给药较弱。对小鼠摄食量无显著性影响。
实施例5 C16对大鼠的急性毒性试验
摘要：
为了观察C16对大鼠的急性毒性，我们对C16用大鼠进行急性毒性试验。给药剂量25mg/kg，皮下注射，给药一次，观察14天。结果，所有给药大鼠未死亡一只，除体重减轻外，未出现精神经神经系统症状，无形为学变化，大体病检各器官无明显异常。表明本品急性毒性甚低，测不出LD50，sc最大耐受量＞25mg/kg，此剂量为临床人拟用量的5000倍。
一、分组及给药
Wistar大鼠20只，雌雄各半，体重180-220g，随机分为2组：
第1组：正常对照组，sc生理盐水0.4ml/100g；
第2组，C16 25mg/kg组，sc 0.4ml/100g。
各组动物给药1次。
二、观察方法及指标
给药后连续观察4h，隔2h后再连续观察4h，然后6天每天观察1次，并定时记录体重及摄食量，随后间隔2天观察1次，并记录体重及摄食量，共观察14天。所有动物均大体解剖后观察各脏器的颜色、外观形态及大小。
三、结果
1.一般活动情况：给药后，C16组大鼠始终没有出现任何异常表现，无动物死亡。
2.体重及摄食量变化(见图17和图18)：实验中，正常组大鼠体重持续增长，C16组大鼠体重在给药后1天下降，随后与正常组大鼠处于平行增长状态。给药组摄食量在给药后连续2天持续下降，随后上升，到第9天时，已接近正常对照组。
3.大体解剖情况：实验结束时处死大鼠，解剖后大体观察脏器变化，给药组大鼠各脏器未见任何异常改变。
实施例6 C16对昆明种小鼠的急性毒性试验
摘要：
为了观察C16对小鼠的急性毒性，我们对C16用小鼠进行急性毒性试验。实验分皮下给药组和静脉注射给药，剂量1-50mg/kg，给药一次，观察14天。结果，所有给药小鼠未死亡一只，除体重减轻外，未出现精神经神经系统症状，无形为学变化，大体病检各器官无明显异常。表明本品急性毒性甚低，测不出LD50，sc和iv最大耐受量均＞50mg/kg，此剂量为临床人拟用量的10000倍。
一.分组及给药
昆明种小鼠56只，清洁级，雌雄各半，体重19-22g，随机分为7组：
第1组：正常对照组，sc生理盐水0.1ml/10g；
第2组，C16 1mg/kg组，sc；
第3组，C16 10mg/kg组，sc；
第4组，C16 50mg/kg组，sc；
第5组，C16 1mg/kg组，iv；
第6组，C16 10mg/kg组，iv；
第7组，C16 50mg/kg组，iv；
各组动物给药1次，给药容量0.1ml/10g。
二.观察方法及指标
给药后连续观察4h，隔2h后再连续观察4h，然后7天每天观察1次，并定时记录体重及摄食量，随后间隔3天观察1次，并记录体重及摄食量，共观察14天。所有动物均大体解剖后观察各脏器的颜色、形态及大小，有异常变化时进行病检。
三.结果
1.一般活动情况：给药后，C16组小鼠始终没有出现任何异常表现，无动物死亡。
2.体重变化：实验中，正常组小鼠体重持续增长，C16组小鼠体重在给药后1天呈剂量依赖性下降，随后与正常组小鼠处于平行增长状态。图19显示了小鼠急毒试验各给药组小鼠体重的变化。图20显示了小鼠急毒试验各给药组小鼠摄食量的变化
3.大体解剖情况：实验结束时处死小鼠，解剖后大体观察脏器变化，给药各组小鼠脏器未见任何异常改变。
实施例7 C16对昆明种小鼠的长毒预试
摘要：
为了初步确定C16对动物长期给药的毒性，确定毒性作用靶器官，确定给药剂量，我们对C16用小鼠进行了30天动物长期毒性预试验。昆明种小鼠，体重18-22g，分为对照组，C16低、中、高剂量给药组，每组20只，雌雄各半。C16低、中、高剂量给药组分别皮下注射C16 0.2、0.6、1.8mg/kg，每日1次，连续30天。停药48h时处死全部小鼠，大体病检及组织病理学检查，并取血进行生化检验、血液学检验，结果：
1.对小鼠一般行为的影响
用药期间，各剂量组小鼠均未出现腹泻。未出现躁动不安、竖尾、肌颤、攻击行为等兴奋现象，也未观察到嗜睡、活动减少等抑制现象。各用药组小鼠体重呈剂量依赖性下降，1.8mg/kg组有个别小鼠出现竖毛、过度消瘦、蜷缩、弓背等恶病质现象。各组动物均未死亡。
2.对小鼠体重的影响
给药前各组小鼠的体重均无显著性差异，给药1天后C16 1.8mg/kg组小鼠体重显著下降，与正常对照组比，差别有显著性(P＜0.05)，给药4天后，各给药组小鼠体重均显著下降，且有明显量-效关系，与正常组比，0.2mg/kg组差别显著(P＜0.05)，0.6和1.8mg/kg组差别极为显著(P＜0.01)。给药7天后，各受试组小鼠体重增长均加快，到16天时，0.2mg/kg组体重与正常组比已无显著性，但0.6和1.8mg/kg组与正常组比仍然显著(P＜0.01)，至实验结束(给药31天)，0.6和1.8mg/kg组体重与正常组比仍有显著性差别(P＜0.01)。将每组的每只小鼠体重增长曲线描绘后可见，正常组小鼠的体重始终保持稳步增长，C16 0.2mg/kg组小鼠在给药7天后，体重增长均轻度加快；C16 0.6mg/kg组小鼠在给药7天后，体重增长均明显加快；C16 1.8mg/kg组小鼠在给药7天后，10只雄性小鼠中有2只维持原有趋势(与给药前体重相比，变化不明显)，4只呈上升趋势，4只继续下降，10只雌性小鼠中有6只呈上升趋势，4只继续下降，体重持续下降的小鼠至实验结束时极度消瘦。
3.对小鼠血液学的影响
给药组小鼠WBC均较正常组升高，其中，0.6和1.8mg/kg组与正常组比，差别有显著性(P分别＜0.01和0.05)。0.6和1.8mg/kg组PLT亦高于正常组，但差别无显著性。C16 0.2-1.8mg/kg对小鼠的RBC、HGB、和RET均无显著性影响。
4.对小鼠血液生化的影响
C16 0.6mg/kg可显著降低血清GLU水平，与正常对照组比，差别有显著性(P＜0.01)，C16 0.2、1.8mg/kg可升高血清GLU水平，但与对照组比，无显著性差异。C16 0.2mg/kg组BUN高于正常对照组，二者相比有极显著性差异(P＜0.01)，0.6mg/kg组BUN与正常组比，无显著性改变，1.8mg/kg组BUN明显降低，与正常组比有极显著性差异(P＜0.01)。受试组血CR水平在该剂量范围内的变化与BUN类似，但是，由于0.2mg/kg组小鼠中有2只CR异常升高，所以与正常组比差异无显著性，0.6、1.8mg/kg组CR值均低于正常组，其中，1.8mg/kg组与正常组比，有显著性差异(P＜0.05)。受试组ALB均高于正常组，其中1.8mg/kg组与正常组比，有显著性差异(P＜0.05)。各给药组GLB、TP、A/G及TBIL值与正常组比均无显著性差异。受试组ALP均升高，其中1.8mg/kg组与正常组比有显著性差异(P＜0.05)；受试组AST均降低，且与正常组比，均有极显著性差异(P＜0.01)；受试组ALT除0.2mg/kg组高于正常组外，0.6、1.8mg/kg组均低于正常组，其中，1.8mg/kg组与正常组比有显著性差异(P＜0.01)。结果见表25。
5.对小鼠脏器系数的影响
与正常对照组相比，各给药组小鼠的肝指数呈剂量依赖性的下降，其中0.6mg/kg组与正常组比，有显著性差异(P＜0.05)；右比目鱼肌指数亦呈剂量依赖性的下降，但与正常组比无显著性差异；脾、肾指数呈剂量依赖性的升高，但与正常组比无显著性差异；肺、脑指数亦呈剂量依赖性升高，其中，0.6、1.8mg/kg组与正常组比有显著性差异(P分别＜0.05和0.01)；睾丸指数呈剂量依赖性升高，其中，0.6、1.8mg/kg组与正常组比差异有显著性(P均＜0.05)；C16 0.2mg/kg组肾上腺指数与正常组比无明显改变，而0.6、1.8mg/kg组高于正常组，其中0.6mg/kg组与正常组比，有显著性差异(P＜0.05)；C16 1.8mg/kg组前列腺指数与正常组比无明显改变，而0.2、0.6mg/kg组高于正常组，且与正常组比，均有极显著性差异(P＜0.01)；与正常组相比，各给药组小鼠的心、胸腺及子宫指数均无显著改变。
6.小鼠组织器官病理学变化
各主要脏器未见明显病理学改变。
结论：
低剂量(高于有效剂量)C16除引起小鼠体重减轻外，生化、血液学及组织病理学检查无其它明显异常变化，中、高剂量使小鼠体重减轻、中性白细胞增高，高剂量(1.8mg)部分小鼠体重明显减轻，极度消瘦，但血液生化、血液学及组织病理学检查无其它明显异常病理变化。结果表明，有效治疗剂量范围的C16是安全的，无明显毒性。
方法：
一.分组及给药
昆明种小鼠80只，清洁级，19-23g，雌雄各半，按体重随机分为4组，具体分组如下：
第1组：正常对照组
第2组：C16 0.2mg/kg组
第3组：C16 0.6mg/kg组
第4组：C16 1.8mg/kg组
每天给药1次，正常对照组sc生理盐水0.1ml/10g，受试组小鼠sc不同剂量C16 0.1ml/10g，共给药31天，然后停药64h后处死，在处死前禁食12h。
二.检测指标及结果
1.对小鼠一般行为的影响
用药期间，各剂量组小鼠均未出现腹泻。未出现躁动不安、竖尾、肌颤、攻击行为等兴奋现象，也未观察到嗜睡、活动减少等抑制现象。各用药组小鼠体重呈剂量依赖性下降，1.8mg/kg组有个别小鼠出现竖毛、过度消瘦、蜷缩、弓背等恶病质现象。各组动物均未死亡。
2.对小鼠体重的影响
给药前各组小鼠的体重均无显著性差异，给药1天后C16 1.8mg/kg组小鼠体重显著下降，与正常对照组比，差别有显著性(P＜0.05)，给药4天后，各给药组小鼠体重均显著下降，且有明显量-效关系，与正常组比，0.2mg/kg组差别显著(P＜0.05)，0.6和1.8mg/kg组差别极为显著(P＜0.01)。给药7天后，各受试组小鼠体重增长均加快，到16天时，0.2mg/kg组体重与正常组比已无显著性，但0.6和1.8mg/kg组与正常组比仍然显著(P＜0.01)，至实验结束(给药31天)，0.6和1.8mg/kg组体重与正常组比仍有显著性差别(P＜0.01)。将每组的每只小鼠体重增长曲线描绘后可见，正常组小鼠的体重始终保持稳步增长，C16 0.2mg/kg组小鼠在给药7天后，体重增长均轻度加快；C16 0.6mg/kg组小鼠在给药7天后，体重增长均明显加快；C16 1.8mg/kg组小鼠在给药7天后，10只雄性小鼠中有2只维持原有趋势(与给药前体重相比，变化不明显)，4只呈上升趋势，4只继续下降，10只雌性小鼠中有6只呈上升趋势，4只继续下降，体重持续下降的小鼠至实验结束时极度消瘦。结果见表23及图21。
表23.C16对昆明种小鼠的长期毒性实验预试——对体重的影响
组别   剂量mg/kg   0d体重/g   1d体重/g   4d体重/g   7d体重/g
  正常对照   -   21.80±1.20   22.76±1.39   25.73±2.03   28.64±3.12
  C16   0.2   22.03±1.29   22.24±1.31   24.27±1.89*   25.55±2.53**
  C16   0.6   22.35±1.07   22.25±1.17   23.17±1.49**   23.37±1.82**
  C16   1.8   22.26±1.27   21.72±1.19*   21.45±1.30**   20.80±1.66**
组别   剂量mg/kg   10d体重/g   16d体重/g   22d体重/g   31d体重/g
  正常对照   -   29.87±3.10   31.14±3.64   33.30±4.49   35.16±4.30
  C16   0.2   26.61±2.62**   29.89±3.00   31.56±3.52   33.36±3.62
  C16   0.6   24.95±2.12**   27.75±2.57**   30.26±3.02*   31.98±2.97**
  C16   1.8   21.45±1.79**   22.09±2.65**   23.05±3.53**   22.79±5.13**
与正常对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01。
三.对小鼠血液学的影响
给药组小鼠WBC均较正常组升高，其中，0.6和1.8mg/kg组与正常组比，差别有显著性(P分别＜0.01和0.05)。0.6和1.8mg/kg组PLT亦高于正常组，但差别无显著性。C16 0.2-1.8mg/kg对小鼠的RBC、HGB、和RET均无显著性影响。GR和LP待测。结果见表24。
表24.C16对昆明种小鼠的长期毒性实验预试——对血液学检查的影响
组别   剂量mg/kg   WBC×109/L   RBC×1012/L   HGBg/L   PLT×109/L   RET/％
  正常对照   -   4.66±1.48   10.74±0.77   143.3±11.7   1010.1±144.6   1.69±0.38
  C16   0.2   5.56±2.81   11.00±0.81   146.7±6.7   1000.2±127.5   1.57±0.31
  C16   0.6   8.81±2.52**   10.97±0.58   149.0±9.3   1034.4±108.3   1.60±0.49
  C16   1.8   7.66±3.91*   10.92±0.38   141.5±4.5   1066.1±131.7   1.63±0.44
与正常对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01。
四.对小鼠血液生化的影响
C16 0.6mg/kg可显著降低血清GLU水平，与正常对照组比，差别有显著性(P＜0.01)，C16 0.2、1.8mg/kg可升高血清GLU水平，但与对照组比，无显著性差异。C16 0.2mg/kg、0.6mg/kg组BUN与正常组比，无显著性改变，1.8mg/kg组BUN明显降低，与正常组比有极显著性差异(P＜0.01)。受试组血CR水平在该剂量范围内的变化与BUN类似，0.6、1.8mg/kg组CR值均低于正常组，其中，1.8mg/kg组与正常组比，有显著性差异(P＜0.05)。受试组ALB均高于正常组，其中1.8mg/kg组与正常组比，有显著性差异(P＜0.05)。各给药组GLB、TP、A/G及TBIL值与正常组比均无显著性差异。受试组ALP均升高，其中1.8mg/kg组与正常组比有显著性差异(P＜0.05)；受试组AST均降低，且与正常组比，均有极显著性差异(P＜0.01)；受试组ALT除0.2mg/kg组高于正常组外，0.6、1.8mg/kg组均低于正常组，其中，1.8mg/kg组与正常组比有显著性差异(P＜0.01)。结果见表25。
表25.C16对昆明种小鼠的长期毒性实验预试——对血液生化学检查的影响
组别   剂量mg/kg   GLUmmol/L   BUNmmol/L   CRMmol/L   TPg/L
  正常对照   -   2.11±0.24   7.81±0.64   17.60±2.63   58.83±3.26
  C16   0.2   2.50±0.66   7.88±1.99   15.4±3.20   58.47±2.73
  C16   0.6   1.51±0.11**   7.64±1.22   16.26±1.44   59.12±4.28
  C16   1.8   2.57±0.84   6.23±0.56**   14.12±3.30*   61.09±2.84
组别   剂量mg/kg   ALBg/L   GLBg/L A/G   TBILμmol/L
  正常对照   -   25.40±1.86   33.33±3.22   0.77±0.11   7.75±1.14
  C16   0.2   25.52±2.64   32.57±2.53   0.79±0.12   7.94±1.33
  C16   0.6   25.66±2.21   34.06±4.48   0.77±0.13   6.87±1.34
  C16   1.8   27.06±1.23*   33.65±3.12   0.81±0.09   7.42±1.31
组别   剂量mg/kg   ALTU/L   ASTU/L   ALPU/L
  正常对照   -   82.7±20.3   310.2±70.7   160.3±39.6
  C16   0.2   85.7±23.1   189.3±32.9**   208.4±63.2
  C16   0.6   78.0±60.9   150.0±19.9**   187.0±17.2
  C16   1.8   50.3±11.2**   131.4±29.8**   193.0±20.5*
与正常对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01。
五.对小鼠脏器系数的影响
与正常对照组相比，各给药组小鼠的肝指数呈剂量依赖性的下降，其中0.6mg/kg组与正常组比，有显著性差异(P＜0.05)；右比目鱼肌指数亦呈剂量依赖性的下降，但与正常组比无显著性差异；脾、肾指数呈剂量依赖性的升高，但与正常组比无显著性差异；肺、脑指数亦呈剂量依赖性升高，其中，0.6、1.8mg/kg组与正常组比有显著性差异(P分别＜0.05和0.01)；睾丸指数呈剂量依赖性升高，其中，0.6、1.8mg/kg组与正常组比差异有显著性(P均＜0.05)；C16 0.2mg/kg组肾上腺指数与正常组比无明显改变，而0.6、1.8mg/kg组高于正常组，其中0.6mg/kg组与正常组比，有显著性差异(P＜0.05)；C16 1.8mg/kg组前列腺指数与正常组比无明显改变，而0.2、0.6mg/kg组高于正常组，且与正常组比，均有极显著性差异(P＜0.01)；与正常组相比，各给药组小鼠的心、胸腺及子宫指数均无显著改变。结果见表26。
表26.C16对昆明种小鼠的长期毒性预试——对脏器系数的影响
组别   剂量mg/kg   心g/100g   肝g/100g   脾g/100g   肺g/100g
  正常对照   -   0.50±0.06   4.31±0.37   0.30±0.09   0.61±0.07
  C16   0.2   0.48±0.05   4.14±0.30   0.31±0.11   0.62±0.07
  C16   0.6   0.51±0.05   4.06±0.29*   0.35±0.09   0.66±0.05*
  C16   1.8   0.50±0.07   4.00±0.62   0.38±0.10   0.76±0.15**
组别   剂量mg/kg   肾g/100g   脑g/100g   肾上腺g/100g   胸腺g/100g
  正常对照   -   1.32±0.18   1.37±0.20   0.028±0.011   0.20±0.10
  C16   0.2   1.33±0.28   1.46±0.16   0.028±0.009   0.22±0.10
  C16   0.6   1.39±0.32   1.51±0.18*   0.035±0.009*   0.22±0.07
  C16   1.8   1.43±0.18   1.93±0.45**   0.035±0.013   0.21±0.10
  组别   剂量   睾丸   前列腺   子宫   右比目鱼肌
  mg/kg   g/100g   g/100g   g/100g   g/100g
  正常对照   -   0.86±0.20   0.25±0.06   0.49±0.32   0.45±0.06
  C16   0.2   0.97±0.13   0.33±0.05**   0.55±0.33   0.45±0.05
  C16   0.6   1.03±0.09*   0.35±0.04**   0.38±0.09   0.44±0.05
  C16   1.8   1.07±0.19*   0.23±0.05   0.41±0.15   0.41±0.08
与正常对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01。
六.小鼠组织器官病理学变化
各主要脏器未见明显病理学改变。
                    序列表
<110>杭州钱潮建材股份有限公司
<120>睫状神经营养因子多肽变构体及其应用
<130>IDC050115
<160>20
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1891
<212>DNA
<213>人
<400>1
gagagtcaca tctcttattt ggaccagtat agacagaagt aaacccagct gacttgtttc      60
ctgggacagt tgagttaagg gatggctttc acagagcatt caccgctgac ccctcaccgt     120
cgggacctct gtagccgctc tatctggcta gcaaggaaga ttcgttcaga cctgactgct     180
cttacggaat cctatgtgaa gcatcagggc ctgaacaaga acatcaacct ggactctgcg     240
gatgggatgc cagtggcaag cactgatcag tggagtgagc tgaccgaggc agagcgactc     300
caagagaacc ttcaagctta tcgtaccttc catgttttgt tggccaggct cttagaagac     360
cagcaggtgc attttacccc aaccgaaggt gacttccatc aagctataca tacccttctt     420
ctccaagtcg ctgcctttgc ataccagata gaggagttaa tgatactcct ggaatacaag     480
atcccccgca atgaggctga tgggatgcct attaatgttg gagatggtgg tctctttgag     540
aagaagctgt ggggcctaaa ggtgctgcag gagctttcac agtggacagt aaggtccatc     600
catgaccttc gtttcatttc ttctcatcag actgggatcc cagcacgtgg gagccattat     660
attgctaaca acaagaaaat gtagcagtta gtcccttctc tcttccttgc tttctcttct     720
aatggaatat gcgtagttcc ctggggcctc gctttcccat cttaaatttc taaaaacagt     780
taagacaaca ggcattttct ttcttttttc tctgaccacc tgcagcctgt tgaaggacta     840
caggtatttt catcaagtag cgttggagac atacacaaat gggcatacaa gtttagcctg     900
gggggtgtga tttgtgtgcg tgcttgcatg tgctgcaggt gtaagagagt gggagcaggg     960
acaacgtcct tccacttcag ggttctaacc tttctaaccc actaagtaac ctctacaggc    1020
atttaactgc cttacagaca gaatatacat atgttaattc tagtcctgga tgactcggtc    1080
tgagaagatt caatttaaaa tcagactctt tagttgattt aaactcttag agaataagaa    1140
taataatggc taacttttat tatcttctat attaaggcag tatgccaagg gtctttatgt    1200
atattatgta cagcgtttac aaccttgtga gcaaggtggt gttactccca ttaggtagat    1260
gagaaaacag gctcacagag atttggttaa gctcacacag ctaacaagta gcacactgag    1320
tttgaacaca gatcattctc cttgtaaaag cctatgtgcc tttcacttta gaggcttgat    1380
catgaatcac tgcacctctt tgtcacaggg tgttggaaga tgcatccatg taatctattc    1440
ccatcgctgg aaaacagctg ctgttagatg tcctcagaag tcagttgcaa attttagcgt    1500
taaagtcagg atttattgtt catacttggc ggtgaggagg gcagctggag atcttaagat    1560
tccattttgg aaaatgatta ggcccgccaa acttctgaac tttggaagct ggggatgttt    1620
agtaatacag cctggttttc aagtactcac taaaagttct caaatattgg gttgggcacg    1680
gcttatacca ggttacctca cttttaatta gtgatgcagg cagtgtaacc caagcatttg    1740
tggacaatga gtggaatact aaagttaaaa agtcaaactt tcacctcaga ttttctggac    1800
ttagtcatga ggagagggtg aggcccactc tgttcctact ggagatacca gagactctga    1860
aactatagaa taaagcctct gtgctgcaca a                                   1891
<210>2
<211>650
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
agcagccaac tcagcttcct ttcgggcttt gtttagcagc ctaggtatta catcttcttg      60
ttgttagcga tgtaatggct accacgtgct gggataccag tctgatgaga agagatgaaa    120
cgcaggtcat ggatggatct tactgtccac tgagacagct cctgcagcac cttcagaccc    180
cacagcttct tctcgaagag accaccatca ccaacgttga taggcatacc atcagcctcg    240
ttacgaggga tcttgtattc caggagtatc attaactcct cgatttggta tgcgaaagca    300
gctacttgga gcagcagagt atggatagct tgatggaaat caccttcagt aggagtgaaa    360
tgcacttgtt gatcttctaa cagtctagct aacaaaacat ggaaagtacg gtaagcttga    420
aggttctctt ggagacgctc tgcttcagtc agttcactcc aacgatcagt acttgcaaca    480
ggcataccat cagcagaatc caggttgatg ttcttgttca gaccttgatg cttaacgtaa    540
gattcagtca gagcagtcag atcagaacgg atctttcttg ccagccagat agaacgacta    600
gccagatctc tacggtgcgg agtcagcgga gagtgttcag tgaaagccat               650
<210>3
<211>611
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atggctttca ctgaacactc tccgctgact ccgcaccgta gagatctggc tagtcgttct     60
atctggctgg caagaaagat ccgttctgat ctgactgctc tgactgaatc ttacgttaag    120
catcaaggtc tgaacaagaa catcaacctg gattctgctg atggtatgcc tgttgcaagt    180
actgatcgtt ggagtgaact gactgaagca gagcgtctcc aagagaacct tcaagcttac    240
cgtactttcc atgttttgtt agctagactg ttagaagatc aacaagtgca tttcactcct    300
actgaaggtg atttccatca agctatccat actctgctgc tccaagtagc tgctttcgca    360
taccaaatcg aggagttaat gatactcctg gaatacaaga tccctcgtaa cgaggctgat    420
ggtatgccta tcaacgttgg tgatggtggt ctcttcgaga agaagctgtg gggtctgaag    480
gtgctgcagg agctgtctca gtggacagta agatccatcc atgacctgcg tttcatctct    540
tctcatcaga ctggtatccc agcacgtggt agccattaca tcgctaacaa caagaagatg    600
taatacctag g                                                         611
<210>4
<211>600
<212>DNA
<213>人
<400>4
atggctttca cagagcattc accgctgacc cctcaccgtc gggacctctg tagccgctct     60
atctggctag caaggaagat tcgttcagac ctgactgctc ttacggaatc ctatgtgaag    120
catcagggcc tgaacaagaa catcaacctg gactctgcgg atgggatgcc agtggcaagc    180
actgatcagt ggagtgagct gaccgaggca gagcgactcc aagagaacct tcaagcttat    240
cgtaccttcc atgttttgtt ggccaggctc ttagaagacc agcaggtgca ttttacccca    300
accgaaggtg acttccatca agctatacat acccttcttc tccaagtcgc tgcctttgca    360
taccagatag aggagttaat gatactcctg gaatacaaga tcccccgcaa tgaggctgat    420
gggatgccta ttaatgttgg agatggtggt ctctttgaga agaagctgtg gggcctaaag    480
gtgctgcagg agctttcaca gtggacagta aggtccatcc atgaccttcg tttcatttct    540
tctcatcaga ctgggatccc agcacgtggg agccattata ttgctaacaa caagaaaatg    600
<210>5
<211>200
<212>PRT
<213>人
<400>5
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu
 1               5                   10                  15
Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr
             20                  25                  30
Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile
         35                  40                  45
Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Gln Trp
     50                  55                  60
Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val
                 85                  90                  95
His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu
            100                 105                 110
Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile
        115                 120                 125
Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile
    130                 135                 140
Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys
145                 150                 155                 160
Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu
                165                 170                 175
Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His
            180                 185                 190
Tyr Ile Ala Asn Asn Lys Lys Met
        195                 200
<210>6
<211>200
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu
 1               5                   10                  15
Ala Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr
            20                   25                  30
Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile
         35                  40                  45
Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Arg Trp
     50                  55                  60
Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val
                 85                  90                  95
His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu
            100                 105                 110
Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile
        115                 120                 125
Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile
    130                 135                 140
Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys
145                 150                 155                 160
Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu
                165                 170                 175
Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His
            180                 185                 190
Tyr Ile Ala Asn Asn Lys Lys Met
        195                 200
<210>7
<211>650
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
actcagcttc ctttcgggct ttgtttagca gcctaggtat taagtctgat gagaagagat     60
gaaacgcagg tcatggatgg atcttactgt ccactgagac agctcctgca gcaccttcag    120
accccacagc ttcttctcga agagaccacc atcaccaacg ttgataggca taccatcagc    180
ctcgttacga gggatcttgt attccaggag tatcattaac tcctcgattt ggtatgcgaa    240
agcagctact tggagcagca gagtatggat agcttgatgg aaatcacctt cagtaggagt    300
gaaatgcact tgttgatctt ctaacagtct agctaacaaa acatggaaag tacggtaagc    360
ttgaaggttc tcttggagac gctctgcttc agtcagttca ctccaacgat cagtacttgc    420
aacaggcata ccatcagcag aatccaggtt gatgttcttg ttcagacctt gatgcttaac    480
gtaagattca gtcagagcag tcagatcaga acggatcttt cttgccagcc agatagaacg    540
actagccaga tctctacggt gcggagtcag cggagagtgt tcagtgaaag ccatatgtat    600
atctccttct taaagttaaa caaaattatt tctagagggg aattgttatc               650
<210>8
<211>566
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
catatggctt tcactgaaca ctctccgctg actccgcacc gtagagatct ggctagtcgt     60
tctatctggc tggcaagaaa gatccgttct gatctgactg ctctgactga atcttacgtt    120
aagcatcaag gtctgaacaa gaacatcaac ctggattctg ctgatggtat gcctgttgca    180
agtactgatc gttggagtga actgactgaa gcagagcgtc tccaagagaa ccttcaagct    240
taccgtactt tccatgtttt gttagctaga ctgttagaag atcaacaagt gcatttcact    300
cctactgaag gtgatttcca tcaagctatc catactctgc tgctccaagt agctgctttc    360
gcataccaaa tcgaggagtt aatgatactc ctggaataca agatccctcg taacgaggct    420
gatggtatgc ctatcaacgt tggtgatggt ggtctcttcg agaagaagct gtggggtctg    480
aaggtgctgc aggagctgtc tcagtggaca gtaagatcca tccatgacct gcgtttcatc    540
tcttctcatc agacttaata cctagg                                         566
<210>9
<211>184
<212>PRT
<213>人工序列
<400>9
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu
 1               5                   10                  15
Ala Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr
            20                   25                  30
Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile
         35                  40                  45
Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Arg Trp
     50                  55                  60
Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
65                   70                  75                  80
Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val
                 85                  90                  95
His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu
            100                 105                 110
Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile
        115                 120                 125
Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile
    130                 135                140
Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys
145                 150                 155                 160
Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu
                165                 170                 175
Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr
            180
<210>10
<211>566
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
catatggctt tcactgaaca ctctccgctg actccgcacc gtagagatct ggctagtcgt     60
tctatctggc tggcaagaaa gatccgttct gatctgactg ctctgactga atcttacgtt    120
aagcatcaag gtctgaacaa gaacatcaac ctggattctg ctgatggtat gcctgttgca    180
agtactgatc gttggagtga actgactgaa gcagagcgtc tccaagagaa ccttcaagct    240
taccgtactt tccatgtttt gttagctaga ctgttagaag atcaacaagt gcatttcact    300
cctactgaag gtgatttcca tcaagctatc catactctgc tgctccaagt agctgctttc    360
gcataccaaa tcgaggagtt aatgatactc ctggaataca agatccctcg taacgaggct    420
gatggtatgc ctatcaacgt tggtgatggt ggtctcttcg agaagaagct gtggggtctg    480
aaggtgctgc aggagctgtc tcagtggaca gtaagatcca tccatgacct gcgtttcatc    540
tcttctcatg aggaataata cctagg                                         566
<210>11
<211>184
<212>PRT
<213>人工序列
<400>11
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu
 1               5                   10                  15
Ala Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr
            20                   25                  30
Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile
        35                   40                  45
Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Arg Trp
     50                  55                  60
Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val
                 85                  90                  95
His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu
            100                 105                 110
Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile
        115                 120                 125
Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile
    130                 135                 140
Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys
145                 150                 155                 160
Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu
                165                 170                 175
Arg Phe Ile Ser Ser His Glu Glu
            180
<210>12
<211>566
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
catatggctt tcactgaaca ctctccgctg actccgcacc gtagagatct ggctagtcgt     60
tctatctggc tggcaagaaa gatccgttct gatctgactg ctctgactga atcttacgtt    120
aagcatcaag gtctgaacaa gaacatcaac ctggattctg ctgatggtat gcctgttgca    180
agtactgatc gttggagtga actgactgaa gcagagcgtc tccaagagaa ccttcaagct    240
taccgtactt tccatgtttt gttagctaga ctgttagaag atcaacaagt gcatttcact    300
cctactgaag gtgatttcca tcaagctatc catactctgc tgctccaagt agctgctttc    360
gcataccaaa tcgaggagtt aatgatactc ctggaataca agatccctcg taacgaggct    420
gatggtatgc ctatcaacgt tggtgatggt ggtctcttcg agaagaagct gtggggtctg    480
aaggtgctgc aggagctgtc tcagtggaca gtaagatcca tccatgacct gcgtttcatc    540
tcttctcata agaagtaata cctagg                                         566
<210>13
<211>184
<212>PRT
<213>人工序列
<400>13
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu
 1               5                   10                  15
Ala Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr
             20                  25                  30
Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile
        35                   40                  45
Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Arg Trp
     50                  55                  60
Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val
                 85                  90                  95
His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu
            100                 105                 110
Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile
        115                 120                 125
Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile
    130                 135                 140
Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys
145                 150                 155                 160
Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu
                165                 170                 175
Arg Phe Ile Ser Ser His Lys Lys
            180
<210>14
<211>562
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
catatggctt tcactgaaca ctctccgctg actccgcacc gtagagatct ggctagtcgt     60
tctatctggc tggcaagaaa gatccgttct gatctgactg ctctgactga atcttacgtt    120
aagcatcaag gtctgaacaa gaacatcaac ctggattctg ctgatggtat gcctgttgca    180
agtactgatc gttggagtga actgactgaa gcagagcgtc tccaagagaa ccttcaagct    240
taccgtactt tccatgtttt gttagctaga ctgttagaag atcaacaagt gcatttcact    300
cctactgaag gtgatttcca tcaagctatc catactctgc tgctccaagt agctgctttc    360
gcataccaaa tcgaggagtt aatgatactc ctggaataca agatccctcg taacgaggct    420
gatggtatgc ctatcaacgt tggtgatggt ggtctcttcg agaagaagct gtggggtctg    480
aaggtgctgc aggagctgtc tcagtggaca gtaagatcca tccatgacct gcgtttcatc    540
tcttctcata actaatccta gg                                             562
<210>15
<211>183
<212>PRT
<213>人工序列
<400>15
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu
 1               5                   10                  15
Ala Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr
             20                  25                  30
Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile
         35                  40                  45
Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Arg Trp
     50                  55                  60
Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val
                 85                  90                  95
His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu
            100                 105                 110
Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile
        115                 120                 125
Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile
    130                 135                 140
Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys
145                 150                 155                 160
Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu
                165                 170                 175
Arg Phe Ile Ser Ser His Asn
            180
<210>16
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
cgattgacca tatggctttc actgaacact ctc                                 33
<210>17
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
gcagcctagg tattaagtct gatgagaaga gatg                                34
<210>18
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
gcagcctagg tattattcct catgag                                         26
<210>19
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
gcagcctagg tattacttct tatgag                                         26
<210>20
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
gtaccctagg attagttatg agaagagatg                                     30

Claims (13)

1.分离的具有神经营养活性的睫状神经营养因子(CNTF)多肽变构体，该变构体相对于睫状神经营养因子多肽而言包含如下任何一种或者多种(优选两种、更优选三种)修饰：
(1)C17A替代；和/或
(2)Q63R替代；和/或
(3)C端截短约10-22个(优选12-20，14-18，如14、15、16、17、18个，更优选16个)氨基酸残基。
2.权利要求1的CNTF多肽变构体，其中CNTF多肽包含如下任何一种序列：
(1)SEQ ID NO：5；
(2)与SEQ ID NO：5具有至少70％(优选至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更优选至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的氨基酸序列；
(3)在SEQ ID NO：5中存在一个或多个(例如1-20个，优选1-15个、1-10个，更优选1-5个，特别是例如5、4、3、2、1个)插入、缺失和/或替代的氨基酸序列。
3.权利要求1-2任一项的CNTF多肽变构体，其中CNTF多肽变构体包含如下任何一个氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：6[从第1-200位氨基酸序列]、9[从第1-184位氨基酸序列]、11[从第1-184位氨基酸序列]、13[从第1-184位氨基酸序列]、或者15[从第1-186位氨基酸序列]；
(2)与(1)的序列具有至少70％(优选至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更优选至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的氨基酸序列；
(3)在(1)的序列中存在一个或多个(例如1-20个，优选1-15个、1-10个，更优选1-5个，特别是例如5、4、3、2、1个)插入、缺失和/或替代的氨基酸序列。
4.权利要求1-3任一项的CNTF多肽变构体，其中CNTF多肽变构体包含或者由如下任何一个氨基酸序列组成：SEQ ID NO：6、9、11、13、或者15；最优选的是SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
5.编码权利要求1-4任一项的CNTF多肽变构体的多核苷酸。
6.权利要求5的多核苷酸，其核苷酸序列经过优化适于在目的宿主(例如细胞，如动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、微生物细胞、真菌、细菌细胞，特别是大肠杆菌)中表达所述CNTF多肽变构体。
7.权利要求5-6任一项的多核苷酸，其包含如下任何一种序列：
(1)SEQ ID NO：3第1-600位、SEQ ID NO：8第4-555位、SEQID NO：10第4-555位、SEQ ID NO：12第4-555位、或者SEQ ID NO：14第4-561位所示的核苷酸序列；
(2)与(1)的序列具有至少70％(优选至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更优选至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性的核苷酸序列；
(3)在(1)的序列中存在一个或多个(例如1-20个，优选1-15个、1-10个，更优选1-5个，特别是例如5、4、3、2、1个)插入、缺失和/或替代的核苷酸序列。
8.权利要求5-7任一项的多核苷酸，其包含或者由如下任何一个核苷酸序列组成：SEQ ID NO：3第1-600位、SEQ ID NO：8第4-555位、SEQ ID NO：10第4-555位、SEQ ID NO：12第4-555位、或者SEQ ID NO：14第4-561位所示的核苷酸序列；特别是SEQ ID NO：8第4-555位所示的核苷酸序列。
9.包含权利要求5-8任一项的多核苷酸的载体。
10.转化或者转染了权利要求9的载体的宿主细胞。
11.包含权利要求1-4任一项的CNTF多肽变构体、或者权利要求5-8任一项的多核苷酸、或者权利要求9的载体或者权利要求10的宿主细胞的组合物，其可用于减轻体重或者提供相关益处。
12.权利要求1-4任一项的CNTF多肽变构体、或者权利要求5-8任一项的多核苷酸、或者权利要求9的载体或者权利要求10的宿主细胞或者权利要求11的组合物在制备用于减轻体重或者提供相关益处的制剂中的用途。
13.一种用于降低体重或者提供相关益处的试剂盒，其包括一个或者多个包含权利要求1-4任一项的CNTF多肽变构体、或者权利要求5-8任一项的多核苷酸、或者权利要求9的载体或者权利要求10的宿主细胞或者权利要求11的组合物的容器，任选地还包含使用说明。
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