CN101055275A - 鉴别呼吸短促的心脏和肺部起因的工具和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴别患有慢性喘气(呼吸困难)个体的(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的呼吸困难的方法，包括步骤：测定个体样品中肺部表面活性剂蛋白的量，测定所述个体样品中利钠肽的量，和通过将a)和b)中测定的量与参照量比较来鉴别(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的慢性呼吸困难。此外，本发明涉及进行所述方法的设备和工具箱。

Description

鉴别呼吸短促的心脏和肺部起因的工具和方法
本发明涉及诊断方法和工具。具体地，涉及一种鉴别患有慢性呼吸短促(呼吸困难)个体的(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的呼吸困难的方法，包括步骤：测定个体样品中肺部表面活性剂蛋白的量，测定所述个体样品中利钠肽(natriuretic peptide)的量，通过在a)和b)中测定的量与参照量比较来鉴别(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的慢性呼吸困难。此外，本发明涉及进行所述方法的设备和工具箱。
心血管并发症，特别是急性心血管事件大多数经常是威胁生命的医学情况，需要立即的行动。然而，通常不能明确地诊断这些情况。具体地，伴随不同类型心脏病的大部分常见症状中的一些，包括急性心血管事件以及慢性心脏功能紊乱如慢性心脏衰竭是其它(非心血管)疾病特征性的症状。因此，鉴别所观察症状的心血管或其它起因经常是困难、麻烦和费时的。所述鉴别也可能需要专家如心脏病专家的帮助。
心血管并发症，特别是急性心血管事件或更严重的慢性心脏衰竭的典型症状是呼吸短促(呼吸困难)。至于其它症状，呼吸困难可以有不同的起因，包括心血管并发症和非心血管肺部疾病。根据症状的潜在心血管起因，正确诊断给定病人如急诊病人的病因是非常可取的。
WO2004/077056公开了表面活性剂蛋白的系统水平可以用作心脏衰竭的标志。然而，该公开的技术没有考虑表面活性剂蛋白上升水平起因的鉴别诊断。特别是知道肺部疾病或损伤也可以导致所述蛋白体系水平的上升(Doyle 1997，Am J Respir Crit Care Med Vol.156：1217-1229)。因此，公开的方法将不可避免地产生错误的阳性诊断结果其依次导致不适当的治疗(Svendstrup Nielsen，2004，The EuropeanJournal of Heart Failure 6：63-70)。
因此，允许鉴别诊断个体的例如呼吸困难和特别是慢性呼吸困难症状的起因的工具和方法是明显长期存在的需要。所述的工具和方法将允许可靠有效的诊断并避免当前技术的缺点。
因而，本发明潜在的技术问题必须被看作顺应前述需要的工具和方法的准备。
通过权利要求表征的实施方案和以下内容来解决技术问题。
因此，本发明涉及一种鉴别患有慢性呼吸短促(呼吸困难)个体的(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的呼吸困难的方法，所述方法包括以下步骤：
a)测定个体样品中肺部表面活性剂蛋白的量；
b)测定所述个体样品中利钠肽的量；和
c)通过将a)和b)中测定的量与参照量比较来鉴别(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的慢性呼吸困难。
本发明的方法优选是体外方法。此外，方法可以包括除上述明确提及之外的步骤例如进一步的样品预处理步骤或评价步骤。
此处所用的术语“鉴别”意指在患有所述疾病的个体基本显示同样症状即慢性呼吸短促的情况下区别患有(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的呼吸困难的个体。此处所用的术语优选包括鉴别诊断肺部疾病、显示肺部症状的心血管并发症、伴随肺部疾病的心血管并发症或没有心血管或肺部起因的慢性呼吸困难。
此处所用的诊断指的是根据个体患有本说明书提及的疾病来评定可能性。如本领域技术人员所理解，这种评定通常不被要求100％地校正被诊断的个体。然而，术语需要个体统计上有意义的部分能被诊断出患有所述疾病(例如，队列研究中的队列)。本领域技术人员使用不同的已知统计评价手段不需进一步费力就能测定部分是否统计上有意义，例如，置信区间的测定、p值测定、Student’s t-检验，Mann-Whitney检验等。详情见Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley & Sons，纽约1983。优选的置信区间是至少90％，至少95％，至少97％，至少98％或至少99％。p值优选0.1，0.05，0.01，0.005或0.0001。
根据本发明的诊断也包括有关疾病、症状或因此的风险的监控、确定、细分类和预测。监控涉及追踪已诊断的疾病或并发症，例如是分析疾病的进行或疾病或并发症进行中特殊治疗的影响。确定涉及使用其他指示剂或标记物加强或证实已进行的诊断。细分类涉及根据诊断疾病不同的细分类进一步定义诊断，例如根据疾病的缓和和严重类型定义。预测涉及在其它症状或标志变明显或较大改变前预测疾病或并发症。
表述“慢性呼吸短促”或“慢性呼吸困难”指的是损伤的呼吸其导致呼吸频率加快和/或呼吸容量加大。因而，呼吸短促可优选导致换气过度。呼吸短促通常发生在至少95％正常氧气饱和水平以下的氧气饱和水平。此处所用的慢性呼吸困难指的是持久或永久发生的呼吸短促(也就是在同样情况下反复发生的呼吸短促)。
术语“肺部疾病”指的是任何引起呼吸短促的疾病。此外，注意根据本发明所指的肺部疾病将导致损伤的肺泡毛细血管膜屏障对表面活性剂蛋白具有增加的通透性，特别是此处特指的肺部表面活性剂蛋白。所述疾病优选是急性和慢性呼吸衰竭、肺部纤维变性、肺部蛋白沉积、肺部水肿、肺部炎症、肺气肿肥胖症、甲状腺疾病，或更优选肺部栓塞。
此处所用术语“心血管并发症”指的是心血管系统的任何急性或慢性病症。心血管系统的急性病症包括急性心血管事件。因而，更优选包括稳定心绞痛(SAP)或急性冠状麻痹性眩晕综合症(ACS)。ACS病人能显示不稳定的心绞痛(UAP)或这些个体已患有心肌梗塞(MI)。MI可以是ST-上升MI或非ST-上升MI。MI的发生可以跟随左心室功能失调(LVD)。术语也包括慢性病症，优选心脏衰竭。术语也理解为包括除前述急性心血管事件之外的引起心脏衰竭的医学情况或疾病，例如先天或后天性瓣膜疾病或病症、心肌炎、心肌病、类淀粉症或血色病。进一步优选的心血管疾病是血栓症、优选动脉血栓症，或引起血管钙化的疾病、优选动脉硬化症和中风。
患有心血管并发症的个体可以显示临床症状(例如，呼吸困难、胸绞痛，也参见下面的NYHA分类)。特别地，心血管疾病症状根据纽约心脏协会(NYHA)归类入功能分类体系。类I的病人没有心血管疾病的明显症状。身体活动性不受限制，及普通身体活动不引起过度疲惫、心悸、或呼吸困难。类II的病人身体活动性轻微受限制。他们休息时是舒适的，但普通身体活动导致疲惫、心悸、或呼吸困难。类III的病人显示身体活动性显著受限制。他们休息时是舒适的，但小于普通的活动引起疲惫、心悸、或呼吸困难。类IV的病人不能舒适地进行任何身体活动。他们在休息时显示心脏机能不全的症状。若采取任何身体活动会增加不适。心血管并发症的另一特征可以是“左心室排出部分”(LVEF)其也称作“排出部分”。具有健康心脏的人通常有未受损伤的LVEF，其一般记作大于50％。大部分有收缩心脏疾病症状的人LVEF一般为40％或更小。
根据本发明患有心血管并发症和显示慢性呼吸困难的个体优选可以是分配入中间的NYHA类，优选NYHA类I、II或III，和更优选NYHA类II。
“伴随肺部疾病的心血管并发症”指个体将患有心血管并发症和肺部疾病。理解为这两种疾病或病症可以独立出现，也就是没有一个引起另一个。然而，此处所指的初期心血管并发症引起继发性肺部疾病和反之亦然的病例也优选包括在上述表达式中。
此外，无论如何，慢性呼吸困难可以在既不患心血管并发症也不患肺部疾病的病人上观察到。对本发明来说，术语“没有心血管或肺部起因的慢性呼吸困难”将包括这种病例。优选的非心血管和非肺部起因的呼吸短促优选是肥胖、高体重、个体未经训练或极少训练的身体情况、例如焦虑状态的心理情况。
此处所用术语“个体”涉及动物，优选哺乳动物，及更优选人。然而，注意本发明中个体将优选显示慢性呼吸短促。
根据本发明测定利钠肽或肺部表面活性剂蛋白的量涉及测量数量或浓度，优选半定量或定量。可直接测量或间接测量。直接测量涉及基于从利钠肽或肺部表面活性剂蛋白本身获得及其强度直接与样品中存在肽的分子数有关的信号测量利钠肽或肺部表面活性剂蛋白的数量或浓度。这种信号-有时此处指信号强度-可以通过如测量利钠肽或肺部表面活性剂蛋白的特有物理或化学性质的强度值来获得。间接测量包括测量从次级组分获得的信号(也就是本身不是利钠肽的组分)或生物读出体系，例如可测的细胞响应、配位体、标记物、或酶反应产物。
根据本发明，测定利钠肽或肺部表面活性剂蛋白的量能通过所有已知测定样品中肽量的手段来完成。所述手段包括可以不同的复合、竞争或其它化验形式利用标记分子的免疫测定设备和方法。所述化验将扩大指示利钠肽或肺部表面活性剂蛋白存在或缺乏的信号。此外，信号强度可优选与样品中存在肽的量直接或间接有关(例如，反比例)。进一步适合的方法包括测量利钠肽特有的物理或化学性质例如它的精确分子量或NMR光谱。所述方法优选包括生物传感器、结合免疫测定的光学设备、生物芯片、例如质谱仪的分析设备、NMR-分析器、或色谱设备。此外，方法包括小平板ELISA基方法、全自动或机器人免疫测定法(可用例ElecsysTM分析器)、CBA(酶的钴结合鉴定法，可用例Roche-HitachiTM分析器)、和乳胶凝集化验法(可用例Roche-HitachiTM分析器)。
一优选实施方案中，测定利钠肽或肺部表面活性剂蛋白量的方法包括步骤(a)将能引出细胞响应其强度指示肽量的细胞与肽接触充分长时间，(b)测量细胞响应。
为了测量细胞响应，优选将样品或处理过的样品加入细胞培养物中并测量细胞内或细胞外的响应。细胞响应可以包括报告基因的可测表达或物质的分泌，例如肽、多肽、或小分子。表达或物质将产生与肽量有关的强度信号。
另一优选的实施方案中，测定利钠肽或肺部表面活性剂蛋白量的方法包括测量从样品中利钠肽或肺部表面活性剂蛋白获得的特有强度信号的步骤。
如上所述，这种信号可以是在利钠肽或肺部表面活性剂蛋白特定质谱仪或NMR光谱中观察到的利钠肽或肺部表面活性剂蛋白特定m/z变量下观察到的信号强度。
另一优选的实施方案中，测定利钠肽或肺部表面活性剂蛋白量的方法包括步骤(a)将肽与特异配位体接触，(b)(可选)除去未结合的配位体，(c)测量结合配位体的量。结合配位体将产生强度信号。根据本发明的结合包括共价和非共价结合。根据本发明的配位体可以是任何结合此处所述利钠肽或肺部表面活性剂蛋白的化合物，例如肽、多肽、核酸、或小分子。优选配位体包括抗体、核酸、肽或多肽例如利钠肽的受体或肺部表面活性剂蛋白结合配偶体和其包括肽结合功能区的片段，和适应配体如核酸或肽适应配体。制备这种配位体的方法是现有技术已知的。例如，合适的抗体或适应配体的鉴别和生产也可由商业供给者提供。本领域技术人员熟悉提高这种配位体衍生物亲和力和特异性的方法。例如，随机突变可被引进核酸、肽或多肽内。这些衍生物能再根据现有技术已知的筛选过程如噬菌体显示来被检验结合。此处所指的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体，及其片段如能结合抗原或半抗原的Fv、Fab和F(ab)2片段。本发明也包括人化杂交抗体其中显示所要抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人受体抗体序列结合。供体序列通常包括至少结合抗原的供体氨基酸残基但也可包括其它结构和/或功能相关的供体抗体氨基酸残基。这种杂交能通过现有技术已知的一些方法来制备。优选配位体或剂特异结合利钠肽。根据本发明的特异结合意指配位体或剂不应充分结合(与之“交叉反应”)被分析样品中存在的另一肽、多肽或物质。优选特异结合的利钠肽结合亲和力应比其它任何有关肽或多肽高至少3倍，更优选至少10倍和甚至更优选至少50倍。非特异结合如果仍能被明确区别和测量如根据蛋白质印迹上它的大小或通过样品中它相对更高的多度，可容许。配位体的结合能通过任何现有技术已知的方法来测量，所述方法是半定量或定量。适合的方法如下所述。
首先，配位体的结合可直接被测量，例如通过NMR、质谱仪或等离振子表面共振。
第二，如果配位体也作为所关心的肽或多肽酶活动的底物，可测量酶反应产物(例如，蛋白酶的量能通过测量所分解底物的量来测量，如在蛋白质印迹上)。换句话说，配位体可显示本身的酶性质，并且配位体/利钠肽复合体或配位体/肺部表面活性剂蛋白复合体或结合利钠肽或肺部表面活性剂蛋白的配位体可各自与适合底物接触从而通过强度信号的产生来被检测。为了测量酶反应产物，优选底物量饱和。底物也可以在反应前用可检测标记物标记。优选样品与底物接触充分长时间。充分长时间指产生可检测优选可测量的量的产物需要的时间。产物所要(例如可检测)量出现的时间能替代产物量的测量被测量。
第三，配位体可与标记物共价或非共价结合从而检测和测量配位体。可通过直接或间接方法进行标记。直接标记包括标记物直接结合(共价或非共价)配位体。间接标记包括第二配位体结合(共价或非共价)第一配位体。第二配位体应特异结合第一配位体。所述第二配位体可与适合标记物结合和/或是结合第二配位体的第三配位体的靶(受体)。第二、第三或甚至更高次序的配位体的使用经常用于增强信号。适合的第二配位体和更高次序配位体可以包括抗体、次级抗体、和众所周知的抗生物素蛋白链菌素-生物素体系(Vector实验室，有限公司)。配位体或底物也可用现有技术已知的一个或多个标记物“标记”。这种标记物再可作为更高次序配位体的靶。适合的标记物包括生物素、digoxygenin、His-Tag、谷胱甘肽-S-移转酶、FLAG、GFP、真菌标记物、流感A病毒血球凝集素(HA)、麦芽糖结合蛋白、和类似物。在肽或多肽的情况中，标记物优选在N-末端和/或C-末端。适合的标记物是任何可通过适当检测方法检测到的标记物。典型的标记物包括金粒子、乳胶小珠、9，10-二氢化吖啶酯、氨基苯二酰肼、钌、酶活标记物、放射性标记物、磁性标记物(“例如磁性小珠”，包括顺磁性和超顺磁性标记物)、和荧光标记物。酶活标记物包括如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光酶、和其衍生物。适合检测的底物包括二-氨基-联苯胺(DAB)、3，3’-5，5’-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(4-硝基蓝四唑氯化物和5-溴基-4-氯基-3-吲哚基-磷酸盐，可用如来自Roche Diagnostics现成的原料溶液)、CDP-StarTM(Amersham Biosciences)、ECFTM(AmershamBiosciences)。适合的酶-底物组合可导致着色的反应产物、荧光或化学发光，其能根据现有技术已知的方法(例如，使用光敏感胶片或适合的照相系统)被测量。至于测量酶反应，前面所给的标准类似适用。典型的荧光标记物包括荧光蛋白(例如GFP和它的衍生物)、Cy3、Cy5、德州红、荧光素、和Alexa染料(例如Alexa568)。更多的荧光标记物可利用如来自Molcular脯氨酸bes(Oregon)的。量子点作为荧光标记物的使用也被考虑。典型的放射性标记物包括35S、125I、32P、33P和类似物。放射性标记物能通过任何已知的适当方法检测，例如光敏感胶片或磷光体显像。根据本发明适合的测量方法也包括沉淀(特别是免疫沉淀反应)、电化学发光(产生电的化学发光)、RIA(放射免疫测定法)、ELISA(酶耦合的免疫吸收剂化验)、夹层酶免疫检验、电化学发光夹层免疫测定法(ECLIA)、分解增强的氟代镧系元素免疫测定法(DELFIA)、闪烁近似化验(SPA)、比浊法、散射测浊法、乳胶增强的比浊法或散射测浊法、或固相免疫检验。更多的现有技术已知的方法(例如凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹、和质谱仪)能被单独使用或与前述的标记或其它检测方法联合使用。
在另一个优选的实施方案中，测定利钠肽量的方法包括(a)将包括如前所述的利钠肽或肺部表面活性剂蛋白配位体的固体载体与包括利钠肽或肺部表面活性剂蛋白的样品接触和(b)测量结合在载体上的利钠肽或肺部表面活性剂蛋白的量。
优选选自核酸、肽、多肽、抗体和适应配体的配位体优选存在于固体载体上的形式。用于制固体载体的材料是现有技术中众所周知的，其中包括商用柱材料、聚苯乙烯小珠、乳胶小珠、磁性小珠、胶体金属粒子、玻璃和/或硅芯片和表面、硝化纤维带、膜、薄板、包硬铝的铜板、穴和反应盘的壁、塑料管等。配位体或剂可结合许多不同的载体。众所周知的载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改进的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖、和磁铁矿。对发明来说，载体的特性可以是可溶的或不溶的。适合的安装/固定所述配位体的方法是众所周知的，包括但不局限于离子的、疏水的、共价的相互作用及类似作用。根据本发明也考虑使用“悬浮队列”作为队列(Nolan日本，SklarLA.(2002).Suspension array technology：evolution of the flat-arrayparadigm.Trends Biotechnol.20(1)：9-12)。在这种悬浮队列中，载体如微珠或微球体悬浮存在。队列由可标记的不同的微珠或微球体组成运载不同的配位体。生产这种队列的方法，例如基于固相化学和光变保护基团，通常已知(US5,744,305)。
此处所用的术语“量”包括利钠肽或肺部表面活性剂蛋白的绝对量、利钠肽或肺部表面活性剂蛋白的相对量或浓度及此外相关的任何值或参数。这种值或参数包括直接测量到的利钠肽或肺部表面活性剂蛋白的所有特定物理或化学性质的强度信号值，例如质谱或NMR光谱中的强度值。此外包括别处所述的间接测量得到的所有值或参数，例如，响应利钠肽或肺部表面活性剂蛋白的生物读出系统测到的表达水平或从特异结合配位体得到的强度信号。与前述量或参数相关的值也理解为可通过所有的标准数学运算得到。
肺部表面活性剂蛋白是在生理条件下在个体肺部表面活性剂中发现的蛋白。这些肺部表面活性剂蛋白是表面活性剂蛋白A(SP-A)、表面活性剂蛋白B(SP-B)和/或表面活性剂蛋白D(SP-D)。此处所用术语“肺部表面活性剂蛋白”优选指SP-B。该术语优选包括人蛋白及其变体，优选等位基因变体或种特定同系物、paralog或ortholog。人表面活性剂蛋白在现有技术中已被充分表征和公开，例如在Hawgood，1989，Am J Physiol-Lung细胞和分子生理学，卷257，2期：l3-L22(对于所有表面活性剂蛋白)，Takahashi 2006，Curr PharmDes，12(5)：589-598(对于SP-A和SP-D)，和Kurutz 2002，生化，41(30)：9627-9636，Guttentag 1998，Am J Physiol-Lung细胞和分子生理学，卷275，3期：L559-L566(对于SP-B)中。
也特别设想肺部表面活性剂蛋白的变体氨基酸水平与人肺部表面活性剂蛋白至少60％相同，更优选至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同。蛋白水解作用的降解产物其仍通过诊断手段或直接相对于各自全长肽的配位体来辨认是实质相似并也被想到的。也包括相对人肺部表面活性剂蛋白的氨基酸序列具有氨基酸缺失、替代、和/或增加的变体多肽只要所述多肽具有肺部表面活性剂蛋白的性质。此处所指的肺部表面活性剂蛋白性质是免疫和/或生物性质。优选肺部表面活性剂蛋白的变体相对此处特指肺部表面活性剂蛋白的那些具有免疫性质(也就是抗原决定部位组成)。因而，变体将可通过前述手段或测定肺部表面活性剂蛋白所用的配位体来辨认。变体也包括遗传转译改进的肺部表面活性剂蛋白例如糖基化蛋白。
此外，术语理解为也包括前述特定肺部表面活性剂蛋白或其变体的任意组合。例如，SP-B可与SP-D或SP-A或其两者结合测定。
术语“利钠肽”包括心钠肽(ANP)类型和脑利钠肽(BNP)类型和其具有相同预兆势能的变体。根据本发明利钠肽包括ANP-类型肽和BNP-类型肽和其变体(参见如Bonow，R.O.(1996).心脏利钠肽的新理解.Circulation 93：1946-1950)。
ANP-类型肽包括前脯氨酸ANP、脯氨酸ANP、NT-proANP、和ANP。
BNP-类型肽包括前脯氨酸BNP、脯氨酸BNP、NT-proBNP、和BNP。
前脯氨酸肽(前脯氨酸BNP例中的134个氨基酸)包括短信号肽，其酶解释放出脯氨酸肽(脯氨酸BNP例中的108个氨基酸)。脯氨酸肽进一步分裂成N-末端前肽(N末端-脯氨酸肽，NT-proBNP例中的76个氨基酸)和活性荷尔蒙(BNP例中的32个氨基酸，ANP例中的28个氨基酸)。
根据本发明，优选的利钠肽是NT-proANP、ANP、NT-proBNP、BNP、和其变体。ANP和BNP是活性荷尔蒙并且半衰期短于它们各自的非活性对应物，NT-proANP和NT-proBNP。BNP在血液中被物质替换，但是NT-proBNP作为完整分子在血液中循环并同样地在肾脏中被除去。N末端脯氨酸BNP不活泼的半衰期比BNP的20分钟半衰期长120分钟(Smith MW，Espiner EA，Yandle TG，Charles CJ，RichardsAM.Delayed metabolism of human brain natriuretic peptide reflectsresistance to neutral endopeptidase.J Endocrinol.2000；167：239-46)。
预分析更加强NT-proBNP从而便于样品运输到中心实验室(Mueller T，Gegenhuber A，Dieplinger B，Poelz W，Haltmayer M.Long-term stability of endogenous B-type natriuretic peptide(BNP)and aminoterminal脯氨酸BNP(NT-proBNP)in frozen plasma samples，ClinChem Lab Med 2004；42：942-4)。血液样品能在室温下贮藏几天或可在没有回收损失的情况下邮寄或船运。相反，BNP室温下或4摄氏度下贮藏48小时导致浓度损失至少20％(Mueller T，Gegenhuber A，etal.，Clin Chem Lab Med 2004；42：942-4，supra；Wu AH，Packer M，SmithA，Biiou R，Fink D，Mair J，Wallentin L，Johnston N，FeldcampCS，Haverstick DM，Ahnadi CE，Grant A，Despres N，Bluestein B，Ghani F.心脏衰竭病人的Bayer ADVIA Centaur自动化的B型利钠肽化验的分析和临床价值：多位点研究.Clin Chem 2004；50：867-73.)。因此，依赖时间推进或兴趣的性质，利钠肽活性形式或非活性形式的测量能是便利的。
根据本发明最优选的利钠肽是NT-proBNP或其变体。如前面简单讨论的，根据本发明所指的人NT-proBNP是优选包括相应于人NT-proBNP分子N-末端部分的76个氨基酸长度的多肽。人BNP和NT-proBNP的结构已在现有技术中被详细描述了，例如，WO02/089657，WO02/08913，Bonow1996，心脏利钠肽的新理解。Circulation93：1946-1950。优选此处所用的人NT-proBNP是EP0648228B1公开的人NT-proBNP。关于那里公开的NT-proBNP和其变体的特定序列，这些现有技术文献由此结合参考。
根据本发明所指的NT-proBNP进一步包括前面讨论的人NT-proBNP所述特定序列的等位基因变体和其它变体。特别设想变体多肽的氨基酸水平与人NT-proBNP至少60％相同，更优选至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％相同。蛋白水解作用的降解产物其仍通过诊断手段或直接相对于各自全长肽的配位体来辨认是实质相似并也被想到的。也包括相对人NT-proBNP的氨基酸序列具有氨基酸缺失、替代、和/或增加的变体多肽只要所述多肽具有NT-proBNP的性质。此处所指的NT-proBNP性质是免疫和/或生物性质。优选NT-proBNP的变体相对NT-proBNP的那些具有免疫性质(也就是抗原决定部位组成)。因而，变体将可通过前述手段或测定利钠肽量所用的配位体来辨认。生物和/或免疫的NT-proBNP性质能通过Karl et al.(Karl 1999.低检测限制下新N末端-脯氨酸BNP(NT-proBNP)化验的进展。Scand J Clin Invest 59：177-181)、Yeo et al.(Yeo2003。Roche NT-proBNP化验的多中心性价值及与Biosite Triage化验的比较。Clinica Chimica Acta 338：107-115)、和下面实施例1中所述的化验来检测。变体也包括遗传转译改进的利钠肽例如糖基化肽。
根据本发明的变体也是样品收集后改进的肽或多肽，例如与肽通过标记物共价或非共价的附着，特别是放射性或荧光标记物。
此外，术语理解为也涉及前述特定利钠肽的任意组合。
术语“样品”指身体液体的样品，分离细胞的样品或来自组织或器官的样品。身体液体的样品能通过众所周知的技术得到并优选包括血液、血浆、血清或尿的样品。组织或器官的样品可通过如活组织检查从任何组织或器官中得到。分离细胞可通过分离技术例如离心或细胞分选从身体液体或组织或器官中得到。
此处所用的比较包括将被分析样品所含利钠肽或肺部表面活性剂蛋白的量与下面内容所说明的适合的参考源的量。此处所用的比较理解为指相应参数或值的比较，例如，当浓度与参考浓度比较或检验样品得到的强度信号与参考样品同类型的强度信号比较时绝对量与绝对参照量比较。本发明方法的步骤(b)中所指的比较可以人工完成或计算机协助。至于计算机协助的比较，所测定量的值可通过计算机程序与数据库所存的适合参考对应的值比较。计算机程序可进一步评价比较的结果，也就是以适合的输出格式自动提供此处所指疾病的鉴别诊断。
此处所用的术语“参照量”指允许通过前面所指的比较来评定个体是否患有前述疾病或病症中的任意一种的量。因此，参考也可以来自患有(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的慢性呼吸困难即相对于心血管并发症和肺部疾病健康的个体。理解为如果使用来自患有疾病或疾病组合的个体的参考，本质同于所述参照量的检验个体样品中的肽或蛋白量将指示相应疾病或疾病组合。如果使用来自健康个体的参考，显著区别于参考(也就是此处所指的表面活性剂蛋白和利钠肽的正常值)的检验个体样品中的肽或蛋白量将指示疾病。应用于个体的参照量可依据不同的生理参数如年龄、性别或亚种群变化。因而，适合的参照量可通过本发明方法从与检验样品一起即同时或随后分析的参考样品中被测定。已发现利钠肽的量大于正常范围(80至150pg/ml，并优选125pg/ml)并且血液肺部表面活性剂蛋白的量大于正常范围(12,000至20,000ng/ml，并优选20,000ng/ml)指示伴随肺部疾病的心血管并发症而不是肺部疾病或显示肺部症状引起呼吸困难的心血管并发症。理解为前述量可由于统计学和测量误差而变化。因而，如果测到肺部表面活性剂蛋白的量提高而未测到利钠肽的量提高，个体将仅患有肺部疾病。如果利钠肽和表面活性剂蛋白的测得量相对正常范围都提高，个体将患有伴随肺部疾病的心血管并发症。如果利钠肽的量单独提高，个体将患有心血管并发症。最后，如果测得的量相对参考均未提高，个体将显示别处所说明的非心血管、非肺部起因的慢性呼吸困难。
有利地，已发现显示肺部症状特别是呼吸短促的个体的样品中存在的肺部表面活性剂蛋白量及NT-proBNP量顾及关于所述症状起因的鉴别诊断。由于本发明，个体及特别是急诊病人能根据所述鉴别诊断的结果被更容易更可靠地诊断及接着治疗。
上文及这里以下的术语的解释和定义因而适用于说明书所表征的所有实施方案和权利要求书。
以下实施方案是本发明方法的特别优选实施方案。
本发明方法的一优选实施方案中，伴随肺部疾病的心血管并发症中的肺部疾病(参见(iii)，上文)由心血管并发症引起。
在发明方法的一个选实施方案中，(iii)中的心血管并发症由肺部疾病引起。
本发明方法的另一优选实施方案中，(iii)中的肺部疾病不依赖于心血管并发症。
本发明方法进一步的优选实施方案中，少于125pg/ml的利钠肽参照量和大于20,000ng/ml的肺部表面活性剂蛋白参照量表示(i)肺部疾病。
本发明方法进一步的优选实施方案中，大于125pg/ml的利钠肽参照量和少于20,000ng/ml的肺部表面活性剂蛋白参照量表示(ii)心血管并发症。
本发明方法进一步的优选实施方案中，大于125pg/ml的利钠肽参照量和大于20,000ng/ml的肺部表面活性剂蛋白参照量表示(iii)伴随心血管并发症的肺部疾病。
本发明方法的另一优选实施方案中，少于125pg/ml的利钠肽参照量和少于20,000ng/ml的肺部表面活性剂蛋白参照量表示(iv)没有心血管或肺部起因的呼吸困难。
并且，本发明方法的一优选实施方案中，所述样品是血液、血浆、血清或尿。
本发明方法的另一优选实施方案中，所述利钠肽是NT-proBNP。
此外，本发明方法的一优选实施方案中，所述个体是人。
此外，本发明涉及一种鉴别显示慢性呼吸困难个体的(i)肺部疾病、(ii)显示肺部症状的心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的呼吸困难的设备，包括
a)用来测定个体样品中肺部表面活性剂蛋白浓度的工具；
b)用来测定个体样品中利钠肽或其变体的量的工具；和
c)用来将所测定的量与合适的参照进行比较的工具，借此鉴别(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的慢性呼吸困难。
此处所用的术语“设备”涉及至少包括前述的允许预测的操作上互相链接的工具的系统。优选测定利钠肽或肺部表面活性剂蛋白量的工具和进行比较的工具是前面与发明方法有关的内容所公开的。如何以操作方式链接工具将依赖于设备所包括的工具的类型。例如，在应用自动测定肽量的工具的情况下，通过所述自动操作工具得到的数据就能通过如计算机程序处理从而在此处所指的疾病之间诊断或区别。优选这种情形下简单设备包括这些工具。因而所述设备可以包括测量样品中肽的量的分析构件和为了鉴别诊断处理结果数据的计算机构件。作为选择，在使用例如检验带的工具测定肽量的情况下，诊断工具可以包括给已知的对应(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的慢性呼吸困难或健康对照个体的量分配测得量的对照带或台。优选检验带结合特异结合利钠肽或肺部表面活性剂蛋白的配位体。带或设备优选包括检测所述肽与所述配位体结合的工具。优选的检测工具在前面涉及发明方法的实施方案中公开了。这种情形下，工具操作上链接因为系统的使用者根据手册所给的指示和解释将量的测定结果和其诊断值集合。这种实施方案中工具可作为独立设备出现并优选包装起来作为工具箱。本领域技术人员将不难知道如何链接工具。优选的设备是在没有专门临床医师的特别知识的情况下能被应用的那些设备，例如仅需装载样品的检验带或电子设备。结果可作为诊断的原始数据输出被给出，其需要临床医师解释。然而，设备的输出优选是处理过的诊断的原始数据其解释不需要专门的临床医师。根据发明的方法，进一步优选的设备包括上文所指的分析构件/设备(例如，生物传感器，阵，结合特异识别利钠肽的配位体的固体载体，等离振子表面共振设备，NMR分光计，质谱仪等)或评价构件/设备。
此外，本发明涉及进行本发明方法的工具箱，其中所述工具箱包括
a)用来测定个体样品中肺部表面活性剂蛋白浓度的工具；
b)用来测定个体样品中利钠肽或其变体的量的工具；和
c)用来将所测定的量与合适的参考比较的工具，借此能鉴别(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的慢性呼吸困难。
此处所用的术语“工具箱”指前述工具的集合，优选分别被提供或在一个容器中被提供。容器也优选包括进行本发明方法的说明书。
通过参照全部公开的内容和本说明书特别提及的公开内容来引入本说明书中引用的所有参考文献作为参考。
附图显示：
图1：附图显示为有心脏衰竭(HF)、肺部疾病(LD)或两者(HF+LD)均有的病人群测量的NT-proBNP浓度的箱线图。N表示病人的数目。此外，所示的是中值和第75、95、5及25的百分点。
图2：附图显示为有心脏衰竭(HF)、肺部疾病(LD)或两者(HF+LD)均有的病人群测量的SP-B浓度的箱线图。N表示病人的数目。此外，所示的是中值和第75、95、5及25的百分点。
以下的实施例只是说明了本发明。无论如何，不解释为限制本发明的范围。
实施例：慢性呼吸困难病人的远景研究
214位患有慢性呼吸困难的病人的群组被临床研究心脏衰竭、肺部疾病或两病结合的存在。将病人分配进三个疾病组已通过临床检查、ECG和超声波心动描记法确认。为了SP-B量病人的血液样品已通过原型SP-B ELISA(Flinders化验法)被分析并且为了NT-proBNP浓度病人的血液样品通过Elecsys NT-proBNPTM化验(Roche诊断学)被分析。
NT-proBNP浓度的测定结果在图1中所示。两病均患的病人(心脏衰竭和肺部疾病)显示NT-proBNP水平升高，心脏衰竭患者也显示强烈升高的NT-proBNP水平。然而，肺部疾病患者仅显示正常的NT-proBNP水平。
图2显示不同病人组的SP-B量的测定结果。心脏衰竭患者与肺部病症(肺部疾病)患者或肺部病症和心脏衰竭均患的病人相比仅具有更低的SP-B水平(正常SP-B水平)。

Claims (13)

1.一种鉴别患有慢性呼吸短促(呼吸困难)个体的(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的呼吸困难的方法，所述方法包括以下步骤：
a)测定个体的样品中SP-B的量；
b)测定所述个体的样品中利钠肽的量；和
c)通过将a)和b)中测定的量与参照量比较来鉴别(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的慢性呼吸困难。
2.权利要求1的方法，其中(iii)中的肺部疾病由心血管并发症引起。
3.权利要求1的方法，其中(iii)中的心血管并发症由肺部疾病引起。
4.权利要求1的方法，其中(iii)中的肺部疾病不依赖于心血管并发症。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中少于125pg/ml的利钠肽参照量和大于20,000ng/ml的SP-B参照量表示(i)肺部疾病。
6.权利要求1至4中任一项的方法，其中大于125pg/ml的利钠肽参照量和少于20,000ng/ml的SP-B参照量表示(ii)心血管并发症。
7.权利要求1至4中任一项的方法，其中大于125pg/ml的利钠肽参照量和大于20,000ng/ml的SP-B参照量表示(iii)伴随心血管并发症的肺部疾病。
8.权利要求1至4中任一项的方法，其中少于125pg/ml的利钠肽参照量和少于20,000ng/ml的SP-B参照量表示(iv)没有心血管或肺部起因的呼吸困难。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述样品是血液、血浆、血清或尿。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述利钠肽是NT-proBNP。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述个体是人。
12.一种鉴别患有慢性呼吸困难个体的(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的呼吸困难的设备，所述设备包括
a)用来测定个体样品中SP-B浓度的工具；
b)用来测定个体样品中利钠肽或其变体的量的工具；和
c)用来将所测定的量与合适的参照进行比较的工具，借此鉴别(i)肺部疾病、(ii)心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)显示肺部症状的没有心血管或肺部起因的慢性呼吸困难。
13.进行权利要求1至11中任一项方法的工具箱，其中所述工具箱包括进行所述方法的说明书和
a)用来测定个体样品中SP-B浓度的工具；
b)用来测定个体样品中利钠肽的量的工具；和
c)用来将所测定的量与合适的参照进行比较的工具，借此可以相互鉴别(i)肺部疾病、(ii)显示肺部症状的心血管并发症、(iii)伴随肺部疾病的心血管并发症或(iv)没有心血管或肺部起因的慢性呼吸困难。
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