CN101050444A - 一种具有产氢行为的光合细菌菌株 - Google Patents

Abstract

本发明是一种具有产氢行为的光合细菌菌株，属于红螺菌目、红螺菌科、长命菌属，种名为胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)CJK 02株，保藏号为CGMCC No.1948。该菌株可高效产氢，其产氢速率最高可达到1.05mg·h^－1·l^－1，同时能分解有机物，特别是降低有机废水的COD值，能进一步降低废液中的有机物含量，取得良好的净化性能，充分利用了生物质能，实现了化害为宝，保护环境的目的。

Description

一种具有产氢行为的光合细菌菌株

                        技术领域

本发明涉及一种产氢光合细菌菌株，属于生物能源领域，主要通过从自然环境中进行筛选的方法得到一株以环境中有机废弃物为营养物质，能将太阳光能转换为清洁能源—氢能的光合细菌菌株，达到保护环境，实现资源的可持续利用的目的。

                        背景技术

自进入21世纪以来，能源价格持续上涨，能源短缺日益困扰国家和政府的发展规划，能源问题已成为影响国民经济发展和国家安全的一个重要课题；同时化石能源的使用对环境造成了严重的影响和破坏，温室气体效应、酸雨等问题严重地威胁着地球和人类的可持续发展。而随着城市化和工业化的发展，能源的需求将不断增长，所有这些突出问题促使人们认识到开发环境友好和经济适用的可再生能源已成为当今科技发展的重中之重。

我国是贫油少气的国家，从环境保护和国家能源安全角度考虑，开发太阳能、水能、风能和生物质能等可再生能源已迫在眉睫。在我国的广大西部地区太阳能和生物质能及其丰富，因此开发廉价而环保的太阳能和生物质能对于促进西部大开发战略的实施和能源安全战略具有重要的现实和经济意义。全国人大于2005年2月28日通过的《可再生能源法》充分体现了国家和政府对可再生能源开发的重视。在可再生能源中氢能因具有热值高，燃烧过程中不产生COx、NOx、SOx、CxHx、煤灰、灰尘及其它的有机物的污染物排放，含量丰富，通过合理的技术易于获得等优点而被认为是21世纪的可再生能源之星，并广泛地被认为是化石燃料的潜在替代能源，然而氢气的生产应该是可再生的、大规模的、对环境友好的过程。

西方国家特别重视氢能的开发和利用。美国于2001年5月17日出台了《国家能源政策》，大胆提出了发展氢能、在未来彻底摆脱对进口能源依赖的构想。随后，美能源部便开始着手对这一构想进行可行性和实施政策的研究。作为第一步，同年11月能源部召开了“国家氢能发展展望”研讨会，并形成了题为《美国向氢经济过渡的2030年远景展望》的报告。2002年4月，能源部又组织召开了有220多位各界人士参加的“国家氢能发展蓝图”研讨会，并在此基础上于11月出台了题为《国家氢能发展路线图的》报告。2003年1月28日布什总统国情咨文讲话中正式提出实施《国家氢燃料研究计划》，为发展氢经济提供技术支撑。2004年2月，美国能源部出台了《氢能技术研究、开发与示范行动计划》，并将生物制氢技术作为该计划的重要研发部分。该计划的出台是美国推动氢经济发展的又一重大举措，标志着美国发展氢经济已从政策评估、制定阶段进入到了系统化实施阶段。

光合细菌在分解有机物质，转化和利用太阳光能方面具有独特的优势，即在光能的驱动下以有机物为原料，分解有机物获得氢气，属于光能异养型。其优点是：具有较高的底物转化率、能使用广泛的生物质作为生长和产氢的底物，吸收光谱范围广(400-950nm)，产物中不具有抑制氢酶或固氮酶活性的氧，氢能来自生物质能和光能，能量转化率高，易于大规模生产。同时有效地利用了有机废弃物，实现了有机废物的综合利用和环境保护的目的，因此这对可再生能源的开发和可持续发展战略的实现将是很有前途的处理技术。同时辐射到地球上的太阳光能量是地球上最大的可再生能源，约5.7×10²⁴J/年，比人类消耗的总能量的10000倍还多。我国幅员辽阔、日照时间长，特别是广大的西部地区具有丰富的太阳光能资源，因此合理而高效地转化和利用太阳光能对可持续发展和促进西部大开发战略的实施具有重要的意义。

光合细菌产氢是一种光依耐性的电子传递过程。光子经天线系统的捕获、吸收、传递，被转移到光合作用中心，转变为化学能，经一系列的传递与反应过程转化为储存在氢气中的能量。光合细菌产氢作用主要是一系列酶促反应的过程，可以分为两大系统：物质代谢流系统和能量代谢流系统，物质代谢流系统主要指光合细菌光合作用中物质传输和厌氧产氢中氢气合成过程；光合产氢的能量代谢系统主要指光能的捕获、吸收、传递和转化的过程和一系列电子传递的过程。光合产氢过程中物质传输与能量传输是紧密相连，互不可分的，物质传输中涉及能量的储存与消耗，能量传输过程中含有物质的合成与分解，这样就构成了细胞内传输系统的复杂性。

因此光照强度、氧、吸氢酶活性和气相成分被认为是影响光合细菌产氢的重要因素。其产氢过程中对pH值、温度、光照强度、底物浓度等等因素有特殊的生长要求。本发明内容是在当前背景下根据光合细菌产氢原理通过一系列的步骤获得，目前国内未见在本领域利用光合细菌进行生物制氢的相关专利申请的公开。

国外文献报道，目前利用光合细菌产氢的速率一般为：0.00518-1.58mg·h^-1·l^-1，光合细菌对底物的转换率最高达到80％，这说明目前所获得的光合细菌其产氢效率仍然较低，并且该菌种分解和利用厌氧发酵后的有机废水的能力还不够理想。

                        发明内容

本发明的目的是根据光合细菌的生长和产氢代谢的特殊要求，通过一系列的分离纯化从自然环境中筛选出一株能较好的分解利用有机物质、吸收和转化光能的具有较高产氢能力的光合细菌菌株。

本发明所述的光合细菌菌株是指胶状红长命菌株，该菌株已在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，保藏日期是2007年3月1日，保藏号CGMCC No.1948；具体内容为：胶状红长命菌CJK 02，Rubrivivax gelatinosus CJK 02，CGMCC No.1948。

本发明技术方案是采集自然环境中的淤泥，对菌源进行富集增殖培养，获得大量光合细菌菌种，对培养液进行进行反复筛选和分离纯化，获得一株对人畜无毒性，产氢能力高，能吸收和转化太阳光能，有效分解和利用各种有机物质的光合细菌菌株，对该菌种进行生理生化特性分析和16SrDNA序列分析并与NCBI的BLASTn比对分析，按照《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)关于光合细菌分类的方法进行生理和形态特征鉴定，判定该菌种属于红螺菌目、红螺菌科、长命菌属、种名为胶状红长命菌(Rubrivivaxgelatinosus)CJK 02。

光合细菌Rubrivivax gelatinosus)CJK 02的生物学特性

(1)本产氢光合细菌菌种的形态特征

在形态上该菌株为短杆形，细胞形态很小，长约2.1-1.2μm，革兰氏染色为阴性，鞭毛少而长，极生，细胞运动性强，菌落形态小，较厚，为橙黄色，表面湿润，极易挑取，细胞不易分散，光学显微镜下可见以二等分裂方式繁殖，分裂后的许多细胞连接成长杆形。

(2)Rubrivivax gelatinosus CJK 02的营养及类型

Rubrivivax gelatinosus CJK 02为光能异样型，兼性厌氧生活方式，但在好氧条件下不产生氢气，在厌氧光照条件下能分解各种有机物质产生氢气。

本菌株在产氢过程中对底物的利用类型广泛，能有效分解和利用葡萄糖、酒石酸钠、乙酸钠、丙酸钠等有机物质，表明该菌株利用和代谢这类有机物质的能力较强，其中特别嗜好利用葡萄糖和乙酸钠，这在环境污染治理中处于有利的地位。

该菌种在液体培养基中能利用亚硫酸盐和硫代硫酸盐作电子供体而进行缓慢生长，但不能利用硫化物作电子供体。

该菌种能利用多种氮源进行生长，但不能代谢利用硝酸盐的无机金属盐进行生长，其中尿素和铵盐是最适氮源类型。

对该菌株的16s rRNA基因序列扩增，获得长度为1432bp的特异序列片段，将该菌种的16S rDNA碱基序列与NCBI上BLASTn中的标准菌株比对，发现CJK-C与Rubrivivax gelatinosus 16S rDNA碱基序列具有同源性，根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)判断该菌种属于红螺菌目、红螺菌科、长命菌属中的胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)，并命名为Rubrivivax gelatinosus CJK 02。

(3)Rubrivivax gelatinosus CJK 02产氢过程中所需要的培养条件

研究后发现，该光合细菌生长所需要的特殊的营养及保证最有利的产氢条件，应适当添加一定比例的微量元素(如锌、钼等)和生长因子。这些元素(铁、钙和镁等)对光合细菌产氢具有较大的促进作用，同时适量的钙盐可在一定程度上提高光合细菌的生长能力和维持细胞活性存在，但这类无机盐浓度必须遵循本培养基配方严格的限制，否则将影响产氢光合细菌的产氢和生长过程。另外，由于该菌种缺乏自身合成生长因子的能力，因此在培养基中需要适当补充适量的生长因子如维生素、烟酸等。

此外该菌种对生长温度要求较高，过高或过低的温度都将影响其产氢能力和生长过程，实验表明在上述培养基中该菌种的生长温度范围为7-42℃，产氢的最适温度范围为25-35℃。

由于该菌种的代谢是一系列酶的催化作用，因此培养基pH值是影响该菌种的重要因素，研究表明该菌种能生长的pH范围为：4-9，其中有利于光合细菌产氢和生长的最适pH范围为：5.8-8.5。

光合细菌产氢过程中需要光的照射，光作为其产氢的驱动力，研究发现该菌种生长和产氢过程中所需的光照强度为：0-13000lx，其中最适的光照强度为：2500-7000lx。研究发现该菌种在黑暗厌氧条件下基本不生长或生长缓慢。

在固体平板培养基表面，接种该菌种后，在厌氧条件下其生长较缓慢，在初期为无色的小菌落，在后期菌落形态变化不大，但色泽逐渐转化为橙黄色，菌落表面很湿润，易于挑取，由于细胞产生粘液使得不易被分散成菌悬液。同时该菌种在好氧条件下也能够生长，表明该光合细菌属于兼性厌氧。该菌种在液体培养基中生长较固体培养基上生长快。

该菌种在液体培养基中进行产氢代谢过程时，培养液pH值将逐渐下降，但一般不低于5.0，同时培养液中产生一种芬芳气味的物质。当培养液中发出酸臭气味的物质时，此时培养液pH值可能降至5.0以下，但产氢行为受到严重影响。

该菌种在产氢代谢过程中产氢速率存在明显的变化过程，当接种后静置厌氧光照培养18h开始产氢，到第28-72h产氢能力达最大，之后产氢能力逐渐下降，但可持续产氢时间达8天左右，视培养基配方特别是底物浓度而定。若在产氢过程中给予适当的振荡，增加营养物质对细胞的传递，则产氢能力可得到提高。

本发明所述菌株Rubrivivax gelatinosus CJK 02在产氢速率方面同国内外产氢光合细菌相比具有一定的优势，目前测定本菌种产氢速率最高可达到1.05mg·h^-1·l^-1，国外文献报道光合细菌产氢速率为：0.00518-1.58mg·h^-1·l^-1，同时本菌种的产氢能力通过基因工程还有进一步改进和提高的潜力。

由于本筛选纯化得到的Rubrivivax gelatinosus CJK 02是以有机底物为碳源、混合多种氮源、无机盐及生长因子等而得到，除在产生氢能方面具有独特的优势外，同时能分解有机物，特别是降低有机废水的COD值，研究发现该菌种对有机物质的分解和利用率最高可达到98％以上，而文献报道光合细菌对底物的转换率最高可达到80％以上，因此本菌种在转化和利用有机底物方面具有很大的优势，同时研究发现本菌种特别适合分解和利用厌氧发酵后的有机废水，能进一步降低废液中的有机物含量，取得良好的净化性能，充分利用了生物质能，实现了化害为宝，保护环境的目的。因此在环境保护和实现资源的可持续利用方面具有广阔的应用前景和社会价值。此外本菌株在产氢过程中吸收太阳光能，充分利用太阳光能进行自身生长的同时通过能量聚集系统收集和转化能量于氢气中，有效地将太阳能及生物质能转化为氢能，为实现利用最经济实惠的可再生能源奠定了基础。同时本菌种的筛选成功和进一步在基因工程、生化工程、化工传递和工程热物理等方面的研究和应用将对实现这一战略奠定良好的基础。

                        具体实施方式

实施例：

(1)采集菌源

采集重庆市周边地区的农田、污水沟等淤泥为菌源，过滤或静置样品，收集上清液，显微镜下初步镜检微生物的种类和数量分布，发现有大量的其它杂菌，如念珠藻菌、绿藻等，光合细菌数量很少。

(2)光合细菌的增殖培养

取上述上清夜适量分别倒入4只干净无菌的250ml的三角瓶中(每个菌源各培养2瓶)，同时加入新鲜灭菌的适量培养基与瓶中，充入氩气排除空气，贴好标签，进行静置厌氧培养，菌种培养中以日光灯为光源，当培养液颜色逐渐变紫红，在瓶壁上有红色菌吸附生长时，取上述培养液适量加于灭菌的干净培养瓶中，加入适量的已灭菌的新鲜培养液，充入氩气创造厌氧环境，在恒温培养箱中再次光照静置转化培养，直到光学显微镜下观察到大量的优势菌种为杆形或椭圆形细菌为止。

培养24h后观察到培养瓶中溶液变浑浊，培养72h后显微镜观察到：活菌碱性美蓝染色后，进行显微镜镜检，发现念珠藻菌株消失，含大量的长杆形非运动性细菌(革兰氏染色不明显)和部分长丝状的多细胞连接的细菌(革兰氏染色阳性)，观察到少量的运动性、细胞呈短杆形的细菌，还含有部分球形、细胞形态很小的细菌(革兰氏染色为阴性)，还具有少量的能快速弯曲变形运动的细菌。在第120h，观察到大量的具有运动性、细胞呈短杆形，革兰氏染色为阴性的细菌出现。其它菌的数量明显减少。

(3)光合细菌的分离纯化

主要采用梯度稀释平板菌落分离法，利用双层平板固体培养基为菌种的生长繁殖提供厌氧环境。首先制作基础营养固体平板，待培养基平板冷却后分别接种光合细菌增殖培养液的各梯度稀释液，待平板表面稍蒸发后，倒入35-45℃左右的覆盖培养基，盖上培养皿皿盖，正置冷却。将接种后含双层固体培养基的培养皿置于30℃的光照恒温培养箱中光照培养4-7天；待长出菌落后，挑选生长快，菌落形态单一而大、菌落颜色为红色者为目的菌种，进行多次的分离转化，直到得到显微镜下观察到细胞形态皆为短杆形或椭圆形的菌落即判定得到纯菌种。

(4)光合细菌的鉴定

对该菌株的16s rDNA基因序列扩增，获得长度为1432bp的特异序列片段，经过NCBI的BLASTn比对分析，发现该菌株与Rubrivivaxgelatinosus 16S rDNA碱基序列具有99％的序列同源性。综合该菌株的菌体形态、生理特性和16SrDNA序列分析，可以将该菌株鉴定为红螺菌目、红螺菌科、长命菌属、胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)，并命名为Rubrivivax gelatinosus CJK02。

(5)本产氢光合细菌菌种的保藏

本菌种可采用多种方法进行保藏，如液体石蜡封藏4℃冰箱保藏、液氮冷冻甘油保藏、砂土保藏等等，一般要求保持厌氧条件以保证该菌种的产氢酶活性。同时使用保藏菌种时，最好将该菌种进行一定时期的复壮或复活，能进一步缩短该菌种在实际应用中的延迟期，提高菌种的活性。

同时利用液体培养基检测其产氢能力，发现在独特的培养基配方中该菌种才具有较高的产氢能力和生长能力。

Claims (1)

1.一种具有产氢行为的光合细菌菌株，其特征为：该菌株是胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)CJK 02株，保藏日期是2007年03月01日，其保藏号为CGMCC No.1948。