CN101042316A

CN101042316A - 肿瘤转移拟态组织芯片

Info

Publication number: CN101042316A
Application number: CN 200710068290
Authority: CN
Inventors: 孙爱静; 苏晶石; 田景琦
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-04-30
Filing date: 2007-04-30
Publication date: 2007-09-26
Anticipated expiration: 2027-04-30
Also published as: CN101042316B

Abstract

本发明公开了一种肿瘤转移拟态组织芯片，是通过如下方法制作的：选择涵盖肿瘤转移进展过程各个阶段的供体石蜡组织标本，经常规HE染色辅助免疫组化染色，定位肿瘤转移过程中各阶段的位点，进行样点标记，采集标记后的组织，构建芯片点阵石蜡后切片，然后将切片置于经挂胶处理过的硅化玻片上而成。本发明在核酸和蛋白水平，大规模检测肿瘤转移进展过程中相关基因的表达及变化状态，筛选预后因素和预测因素，结合临床，直接指导肿瘤个体化治疗和靶向治疗，具有重大的理论和实际意义。

Description

肿瘤转移拟态组织芯片

技术领域

本发明涉及生物学研究领域的肿瘤转移拟态组织芯片，用于大规模检测肿瘤转移进展过程中相关基因的表达及变化动态，筛选预后因素和预测因素，指导个体化治疗和靶向治疗。

背景技术

组织芯片(tissue chip)又称组织微阵列(tissue microarray，TMA)，是一项新兴的生物学研究技术，由Kononen等于1998年首先建立并报道，是将数十至上千个小组织整齐有序地排列在一张载玻片上而形成的缩微组织切片。一个组织芯片蜡块可做100-200张连续切片，这样用同一套组织芯片即可对上百种生物分子标记(如抗原，DNA和RNA)进行分析、检测，如专利号为01128783.7公开的一种组织微阵列生物芯片，可同时比较和分析数十个乃至数千个同一类型或不同类型的不同个体的组织样本的异同及变化，由于其具有的高效或高通量的特点，并有省时、省力、节约经费和实验结果可比性强的优点、已广泛应用于HE常规染色、免疫组化、原位杂交等各种技术。

根据用途的不同，组织芯片在肿瘤研究领域的应用大致可以分为3类：多种肿瘤芯片，肿瘤进展芯片和预后芯片，如多种病理类型病变/癌组合；癌、癌旁、正常组织组合；癌、癌旁及其边缘组织组合；乳腺癌、癌转移淋巴结组合芯片等多种，而涵盖从原发灶到转移灶各个阶段组织的肿瘤转移拟态组织芯片国内外均未见报道。

转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。据统计60％以上的恶性肿瘤患者于初次诊断时已发现有转移。美国每年诊断约80万实体癌患者，最初诊断时发现有肿瘤转移者约50万。我国临床肿瘤患者约有80％-90％以上死于侵袭和转移。肿瘤转移与否以及程度，决定肿瘤的临床分期、治疗方案选择和预后。然而，有关转移的确切机制目前尚不十分清楚。探索肿瘤转移机制，研究针对不同转移途径和过程的有效治疗方法尤为重要。而现有的关于肿瘤转移的研究，大都停留在转移灶与原发灶之间瘤细胞异同对比的水平，没有对肿瘤转移过程各个阶段细胞的生物学状态及相关基因表达的动态变化进行详细的比较研究。开发一种能涵盖转移进展过程各个阶段的肿瘤转移拟态组织芯片，用于大规模检测肿瘤转移进展过程中相关基因的表达及变化动态，筛选预后因素和预测因素，对指导恶性肿瘤的个体化治疗和靶向治疗具有重要意义。

发明内容

为克服现有技术中的不足，本发明的目的在于提供各种肿瘤转移拟态组织芯片，包括涵盖肿瘤转移进展过程各个阶段、连续且相对单一的肿瘤组织，可用于大规模研究、检测肿瘤转移进展过程中相关基因的表达及变化动态，筛选预后因素和预测因素，为个体化治疗和靶向治疗提供强有力的理论基础。

肿瘤转移一直是肿瘤学研究领域的热点课题，包括有淋巴道、血道和种植性转移三种途径，是指恶性肿瘤细胞脱离其原发部位(原发灶)，通过淋巴道、血道及体腔转运到不连续的靶组织继续增殖生长成同样性质肿瘤(转移灶)的过程，为恶性肿瘤最基本也是最重要的生物学行为。成功地建立转移灶，肿瘤细胞需要经过①原发部位脱出；②间质溶解、浸润、迁移；③消化基膜、管壁(淋巴管、血管、体腔壁)--破坏局部组织浸润的屏障；④向血液、淋巴管或自然腔道中迁移；⑤进入血管、淋巴管、自然腔道系统；⑥在迁移中逃离免疫系统的监控；⑦在新的器官(靶组织：淋巴结、远隔组织器官、体腔)中存活并增殖等过程和相应的能力。如图1所示的肿瘤转移拟态模式图。

本发明为实现上述目的采用的方案为：一种肿瘤转移拟态组织芯片，该芯片是通过如下方法制作的：选择涵盖肿瘤转移进展过程各个阶段的供体石蜡组织标本，经常规HE染色辅助免疫组化染色，定位肿瘤转移过程中各阶段的位点，进行样点标记，采集标记后的组织，构建芯片点阵石蜡后切片，然后将切片置于经挂胶处理过的硅化玻片上而成。

所述的供体石蜡组织标本选自不同临床分期的肿瘤标本，包括的病变有：癌旁组织、原位癌，间质浸润癌，管腔内迁移灶，转移灶这五个阶段。

所述癌旁组织的位点是距肿瘤边缘＞5cm的病灶。

所述的肿瘤为乳腺癌时，选取的原位癌是指导管原位癌，导管原位癌是指发生于乳腺导管，早期局限于导管内形成的肿瘤，其位点是指癌巢周围基底膜染色显示基底膜基本保持完整的病灶，基底膜染色主要成分为IV型胶原的免疫染色，结合HE染色；所述的肿瘤为结直肠原位癌时，其位点是指局限于上皮内或粘膜固有层的病灶，周围无阳性着色内皮细胞，既上皮内或浸润固有层的肿瘤，所述的肿瘤为胃原位癌时，其位点是指局限于上皮内的癌灶。周围无阳性着色内皮细胞。

所述的肿瘤为乳腺癌时，选取的间质浸润癌包括微小浸润癌、浸润性导管癌。

所述的乳腺导管癌微小浸润癌是指随着病情进展，有浸润能力的细胞增生并突破基底膜，微小浸润癌的位点是指原位癌周围基底膜断裂、破碎、缺失的病灶，φ＜1mm的浸润灶的肿瘤。

所述的乳腺浸润性导管癌是指癌细胞在自身的运动能力以及压力等外界相互作用下在间质中浸润的肿瘤，间质浸润性导管癌的位点是指基底膜断裂、破碎、缺失的病灶，φ＞1mm。

所述的肿瘤为胃、结直肠间质浸润癌时，其位点是指粘膜下层以及更深部位的癌组织，周围无阳性着色内皮细胞。

所述的肿瘤为乳腺癌时，选取的淋巴管内迁移灶是指淋巴管内癌栓，淋巴管内癌栓的位点是指淋巴管染色阳性、缺乏基底膜染色、腔内无红细胞的管腔内癌巢；所述的肿瘤为结直肠癌时，其血管内迁移灶是指血管内癌栓，其位点是指周围血管内皮细胞标记阳性，淋巴管标记阴性的管腔内癌巢；所述的肿瘤为胃癌时，其自然管腔内迁移灶是指腹腔内癌栓。

所述的肿瘤为乳腺癌时，选取的转移灶是指淋巴结转移癌，其位点是指淋巴结内的乳腺癌细胞灶；所述的肿瘤为结直肠癌时，其转移灶是指肝内转移癌，其位点是指肝脏内结直肠癌细胞灶；所述的肿瘤为胃癌时，其转移灶是指种植性转移癌，其位点是指腹腔内脏器表面播散的明显癌细胞巢或者癌结节。不同的肿瘤对应选取的不同阶段，如下表所示：

所述的供体石蜡组织标本选自不同临床分期的肿瘤标本：包括癌旁组织、原位癌，间质浸润癌，管腔内迁移灶，转移灶这五个阶段的标本。不同阶段的标本选择如下：乳腺肿瘤选用微小浸润癌标本、无淋巴结转移的浸润性导管癌标本、淋巴结转移阳性的浸润性导管癌标本来标记；结直肠肿瘤选用Tis、T1、T2、T3期有或无肝转移的结直肠腺癌标本来标记，其中Tis是指原位癌，T1是指浸润粘膜下层的肿瘤，T2是指浸润肌层的肿瘤，T3是指浸润穿过肌层至浆膜下层的肿瘤期的细胞；胃肿瘤用Tis、T1、T2、T3、T4期伴腹腔种植转移的胃腺癌标本来标记，其中Tis是指原位癌，T1是指浸润固有层或粘膜下层的肿瘤，T2是指浸润肌层的肿瘤，T3是指浸润浆膜下层未侵及邻近结构的肿瘤以及T4是指浸润邻近结构的肿瘤。

选择不同阶段的标本后，对标本进行连续切片，施行HE染色以及基底膜(如IV型胶原)、血管、淋巴管免疫组化染色。根据染色结果，分析定位转移过程中的相应位点。取样后，按设计好的点阵构建芯片石蜡，切片后即为转移拟态组织芯片。

对组织芯片施行同样的HE以及基底膜、血管、淋巴管免疫组化染色，显微镜检，观察点样的排列、完整性，与供体原切片比较各项着色指标(染色层次，对比度，阳性率等)。

本发明的有益效果是：本发明应用血管、淋巴管标志的最新研究成果同时联合基底膜(IV型胶原)免疫染色，区分定位肿瘤转移进展的不同阶段，包括原位癌、原位癌脱出、间质浸润、血管淋巴管癌栓和转移癌，构建肿瘤转移拟态组织芯片，并与免疫组化染色以及原位杂交技术相结合进行应用该组织芯片。该组织芯片可应用于：1、免疫组化染色应用肿瘤转移以及治疗方案密切相关的一系列可用于石蜡标本的抗体。例如①细胞因子类血管内皮细胞生长因子及其受体(VEGF、VEGF-C、VEGF-D、cerbB-2)，环氧化酶(COX-2)，转化生长因子β1(TGF β1)；②激素与受体类Androgen Receptor(AR)、Estrogen Receptor、Insulin Receptor(IR)、ProgesteroneReceptor、Somatostatin Receptor-1、prolectin Receptor、PTH-R；③细胞耐药产物p-糖蛋白(p-gp)，谷胱甘肽-s-转移酶π亚型(GST-π)，拓朴异构酶(Topo II)，cyclinD1，④转移预后相关类nm23-H1，CD44v6，粘着斑激酶(FAK)，整合素(integrinα5β1、α2β1、)，表皮钙粘蛋白(E-cadherin)，金属蛋白酶(MMP2)；⑤肿瘤基因/肿瘤抑制基因蛋白APC、Bc1-2、BRCA1、BRCA2、C-erbB-2、C-fos、c-jun、c-myb、c-myc、nm23、p21^ras、p21^waF-1、p53、p63、PTEN、Rb GeneProtein；⑥细胞周期、增殖语凋亡Bak、Bax、Bc1-2、Bc-6、Bc1-10、Bc1-x、Cdk1-6、CyclinA(B1、D1、D2、D3、E、G)、DFF45、Ki67、p14、p15、p16、p27^kip1、p57^kip2、PARP、PCNA；各种肿瘤标记等。检测肿瘤转移过程中各项指标的标记状态并分析其临床意义。2、荧光原位杂交采用探针试剂盒。检测肿瘤转移过程中靶基因扩增以及染色体倍数状态并与免疫组化染色结果相对比。统计分析：利用X²检验，比较率的差异，p＜0.05视为差异有统计学意义，用SPSS12.0统计分析软件处理。

并且该组织芯片在核酸和蛋白水平，大规模检测肿瘤转移进展过程中相关基因的表达及变化状态，筛选预后因素和预测因素，结合临床，直接指导肿瘤个体化治疗和靶向治疗，具有重大的理论和实际意义。

附图说明

图1为本发明的肿瘤转移拟态模式图；

图2为本发明的淋巴转移组织芯片排列示意图；

图3为本发明的淋巴转移组织芯片排列示意图；

图4为本发明的血道转移组织芯片排列示意图；

图5为本发明的血道转移组织芯片排列示意图；

图6为本发明的种植转移组织芯片排列示意图。

具体实施方式

实施例1：乳腺导管癌淋巴转移拟态组织芯片

(1)供体石蜡组织标本收集：

根据WHO(2003)乳腺肿瘤组织学新分类标准，选择微小浸润导管癌以及浸润性导管癌(包括淋巴结转移阳性和阴性)病例，收集近年间手术切除标本。

选择微小浸润癌和浸润型导管癌(包括淋巴结转移阳性和阴性)的依据：乳腺导管癌发生于乳腺导管，早期局限于导管内形成导管原位癌，随着病情进展，有浸润能力的细胞增生并突破基底膜，形成微小浸润癌，进而，浸润的癌细胞在自身的运动能力以及压力等外界相互作用下在疏松水肿的间质中浸润，形成浸润型导管癌，根据癌组织是否浸润淋巴管转移至引流淋巴结的有无，浸润型导管癌可分为淋巴结转移阳性和阴性。

因此，本实施例选用微小浸润癌标本，标记癌旁组织、导管原位癌和微小浸润癌即原发灶脱出位点；用无淋巴结转移标本，标记非浸润性导管癌、间质浸润癌和淋巴管癌栓位点；用淋巴结转移阳性标本，标记非浸润性导管癌、间质浸润癌、淋巴管内癌栓和淋巴结转移癌位点。

(2)对上述供体石蜡组织标本进行免疫组化染色：

每个标本进行连续切片，分别施行HE常规染色、基底膜染色(如IV型胶原等)、淋巴管染色(如血管内皮细胞生长因子受体3，vascularendothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3；淋巴管内皮透明质酸受体-1，lymphatic vessel endothelial hyaluronanrceptor-1，LYVE-1；podoplanin；Prox1等用于识别淋巴管的标记物的免疫组化染色)，显微镜检。

评片标准：

HE染色结合免疫组化染色分别对微小浸润导管癌和浸润性导管癌标本进行阅片，评价。

①、微小浸润导管癌标本：癌巢周围基底膜染色显示基底膜基本保持完整的病灶—导管原位癌；基底膜断裂、破碎、缺失的病灶φ＜1mm--微小浸润癌。

②、浸润性导管癌标本：癌巢周围基底膜染色显示基底膜基本保持完整的病灶—非浸润导管癌；基底膜断裂、破碎、缺失的病灶φ＞1mm--间质浸润癌；淋巴管染色阳性、缺乏基底膜染色、腔内无红细胞的管腔内癌巢—淋巴管内癌栓；淋巴结内明显癌细胞巢—淋巴结转移癌。

(3)样点定位、标记：

选择具有所需典型病灶的微小浸润导管癌16例，确认导管原位癌、微小浸润癌、癌旁组织(距肿瘤边缘＞5cm)位点；无淋巴结转移浸润性导管癌以及淋巴结转移阳性的浸润性导管癌各32例，确认非浸润性癌、间质浸润癌、淋巴管内癌栓和淋巴结转移癌各病灶。标记各靶点部位。

位点选择的原理及过程：

①、对于微小浸润癌，重要的是确定癌细胞增生灶是否突破了基底膜，因而，本实施例选择基底膜的主要成分如IV型胶原的免疫染色，结合HE染色，判定标准为：癌巢周围IV型胶原染色显示基底膜基本保持完整的病灶—导管原位癌；基底膜断裂、破碎、缺失的病灶φ＜1mm—微小浸润灶。

②、对于浸润型导管癌，除了确定原位癌灶和浸润癌灶以外，更重要的是正确鉴别浸润癌灶和淋巴管癌栓，选择淋巴管内皮细胞特异性标志物的免疫染色，结合HE染色，判定标准为：癌巢周围IV型胶原染色显示基底膜基本保持完整的病灶—非浸润导管癌；基底膜断裂、破碎、缺失的病灶φ＞1mm—间质浸润癌；淋巴管内皮细胞特异性标志物阳性、缺乏基底膜染色、腔内无红细胞的管腔内癌巢—淋巴管内癌栓。

(4)芯片点阵石蜡的构建；

点阵设计：三组分别为16×3，16×6(144)和16×8(128)共272点组织阵列排列在两个3.5cm×2.2cm×1cm受体石蜡模块上。模块1包括16×3和16×6两个点阵共144点，模块2为一个16×8点阵共128点。模块边缘空白3mm，组织芯直径1mm，相邻样本间距0.8mm，阵间距1.1mm。如图2至图3所示的淋巴转移组织芯片排列示意图。

实施例2：结直肠腺癌血道转移组织芯片

(1)供体石蜡组织标本收集：

根据WHO(2000)结直肠肿瘤组织学和TNM分类标准，收集近年间Tis(原位癌：上皮内或浸润固有层)、T1(肿瘤浸润粘膜下层)、T2(肿瘤浸润肌层)、T3(肿瘤浸润穿过肌层至浆膜下层)腺癌手术切除病例(包括肝转移阳性和阴性)来选择癌旁组织、浸润不同深度癌组织(浸润癌和血管内癌栓)、以及肝转移癌组织的蜡块标本。

(2)对上述供体石蜡组织标本进行免疫组化染色：

T1、T2、T3标本进行连续切片，分别施行HE常规染色、淋巴管染色(如血管内皮细胞生长因子受体3，vascular endothelial growthfactor receptor-3，VEGFR-3；淋巴管内皮透明质酸受体-1，lymphatic vessel endothelial hyaluronan rceptor-1，LYVE-1；podoplanin；Prox1等用于识别淋巴管的标记物的免疫组化染色)，血管染色(如CD31(PECAM)、CD144(VE-Cadherin)、vWF因子、CD34等用于血管标记物的免疫组化染色)，显微镜检。

评片标准：

HE染色结合免疫组化染色分别阅片，评价。

①癌旁组织：距肿瘤边缘＞5cm范围的“正常”肠粘膜上皮组织。

②原位癌：局限于粘膜层内的癌组织，周围无阳性着色内皮细胞。

③间质浸润癌：位于粘膜下层以及更深部位的癌组织，周围无阳性着色内皮细胞。

④血管内癌栓：位于粘膜下层以及更深部的管腔内癌巢，周围内皮细胞血管标记阳性，淋巴管标记阴性。

(3)样点定位、标记：

选择具有所需典型病灶的各期结直肠腺癌16例，确认Tis原位癌、癌旁组织(距肿瘤边缘＞5cm)位点；无血道转移以及肝转移阳性的T1，T2，T3，按上述标准定位间质浸润癌、血管内癌栓和肝转移癌各病灶。标记各靶点部位。

(4)芯片点阵构建；

点阵设计：两组分别为16×8(128)，16×9(144)共272点组织阵列排列在两个3.5cm×2.2cm×1cm受体石蜡模块上。模块1为16×8点阵共128点，模块2为16×9点阵共144点。模块边缘空白3mm，组织芯直径1mm，相邻样本间距0.8mm，阵间距1.1mm。如图3至图4所示的血道转移组织芯片排列示意图。

实施例3：胃癌肿瘤种植转移组织芯片

(1)供体石蜡组织标本收集：

根据WHO(2000)胃肿瘤组织学和TNM分类标准，收集近年间Tis(原位癌：局限于上皮层内)、T1(肿瘤浸润固有层或粘膜下层)、T2(肿瘤浸润肌层)、T3(肿瘤浸润浆膜下层未侵及临近结构)以及T4伴种植转移的腺癌手术切除病例来选择癌旁组织、浸润不同深度肿瘤组织、以及种植转移癌组织的蜡块标本。

(2)对上述供体石蜡组织标本进行免疫组化染色：

T1、T2、T3、T4标本进行连续切片，分别施行HE常规染色、淋巴管染色(如血管内皮细胞生长因子受体3，vascular endothelialgrowth factor receptor-3，VEGFR-3；淋巴管内皮透明质酸受体-1，lymphatic vessel endothelial hyaluronan rceptor-1，LYVE-1；podoplanin；Prox1等用于识别淋巴管的标记物的免疫组化染色)，血管染色(如CD31(PECAM)、CD144(VE-Cadherin)、vWF因子、CD34等用于血管标记物的免疫组化染色)，显微镜检。

评片标准：

HE染色结合免疫组化染色分别阅片，评价。

③间质浸润癌：浸润粘膜固有层以及更深部位的癌组织，周围无阳性着色内皮细胞。

④种植转移癌：腹腔内播散癌结节，排除淋巴结转移。

(3)样点定位、标记：

选择具有所需典型病灶的各期胃腺癌16例，确认Tis原位癌、癌旁组织(距肿瘤边缘＞5cm)位点；T1，T2，T3，T4按上述标准定位间质浸润癌病灶。标记各靶点部位。

(4)芯片点阵构建；

点阵设计：一组16×8(128)点组织阵列排列在3.5cm×2.2cm×1cm受体石蜡模块上。模块边缘空白3mm，组织芯直径1mm，相邻样本间距0.8mm，阵间距1.1mm。如图6所示的种植转移组织芯片排列示意图。

上述实施例1-3点阵设计中的模块制备

莱卡石蜡与蜂蜡1∶1混合，制成受体蜡块。用组织芯片仪(阵列空心针)按上述实施例1-3点阵设计在受体蜡块上打孔，制备受体模块。

取样点样：将供体蜡块置45℃温箱中烘5分钟，用组织芯片仪(组织挖取套管针)从供体蜡块标记靶点部位采集直径1mm，高4mm的组织芯(柱)，转移至受体模块相应孔位内。

二次包埋：将上述模块面朝下放在铜板上，于55℃放置30钟，轻压模块使组织柱在模块中排平，既得到构建好的芯片点阵石蜡(列阵石蜡)。根据应用要求制成切片，即可用于研究。

将上述实施例1-3中的芯片石蜡制备组织芯片

玻片处理：①硅化：将玻片，浸于2％APES/丙酮(v/v)溶液中浸泡5分钟，丙酮冲洗3次，自然干燥，4℃保存(APES，3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)。②挂胶：浸于1∶10的多聚赖氨酸(PLL，)液5分钟，自然干燥。

切片：对芯片点阵石蜡进行4um连续切片，37℃-39℃纯净水浴中捞片后，裱于上述硅化载波片上。

Claims

1、一种肿瘤转移拟态组织芯片，其特征在于，该芯片是通过如下方法制作的：选择涵盖肿瘤转移进展过程各个阶段的供体石蜡组织标本，经常规HE染色辅助免疫组化染色，定位肿瘤转移过程中各阶段的位点，进行样点标记，采集标记后的组织，构建芯片点阵石蜡后切片，然后将切片置于经挂胶处理过的硅化玻片上而成。

2、根据权利要求1所述的肿瘤转移拟态组织芯片，其特征在于：所述的供体石蜡组织标本选自肿瘤的癌旁组织、原位癌，间质浸润癌，管腔内迁移灶，转移灶这五个阶段。

3、根据权利要求1或2所述的肿瘤转移拟态组织芯片，其特征在于：所述的肿瘤为乳腺癌时，选取癌旁组织的位点是指距肿瘤边缘＞5cm的病灶。

4、根据权利要求1或2所述的肿瘤转移拟态组织芯片，其特征在于：所述的肿瘤为乳腺癌时，选取的原位癌是指导管原位癌，其位点是指癌巢周围基底膜染色显示基底膜基本保持完整的病灶；基底膜染色主要成分为IV型胶原的免疫染色，结合HE染色。

5、根据权利要求1或2所述的肿瘤转移拟态组织芯片，其特征在于：所述的肿瘤为乳腺癌时，选取的间质浸润癌包括微小浸润癌和浸润性导管癌。

6、根据权利要求5所述的肿瘤转移拟态组织芯片，其特征在于：所述的微小浸润癌的位点是指原位癌周围基底膜断裂、破碎、缺失的病灶，φ＜1mm的病灶。

7、根据权利要求5所述的肿瘤转移拟态组织芯片，其特征在于：所述的浸润性导管癌的位点是指基底膜断裂、破碎、缺失、φ＞1mm的病灶。

8、根据权利要求1或2所述的肿瘤转移拟态组织芯片，其特征在于：所述的肿瘤为乳腺癌时，选取的管腔内迁移灶是指淋巴管内癌栓，其位点是指淋巴管染色阳性、缺乏基底膜染色、腔内无红细胞的管腔内癌巢。

9、根据权利要求1或2所述的肿瘤转移拟态组织芯片，其特征在于：所述的肿瘤为乳腺癌时，选取的转移癌是指淋巴结转移癌，其位点是指淋巴结内明显的癌细胞巢。