JP6405322B2 - 方法 - Google Patents
方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6405322B2 JP6405322B2 JP2015558546A JP2015558546A JP6405322B2 JP 6405322 B2 JP6405322 B2 JP 6405322B2 JP 2015558546 A JP2015558546 A JP 2015558546A JP 2015558546 A JP2015558546 A JP 2015558546A JP 6405322 B2 JP6405322 B2 JP 6405322B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- esophagus
- cells
- methylation
- subject
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4748—Details p53
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
a)前記対象からの細胞の試料を提供するステップであって、前記試料が、対象の食道の表面から回収された細胞を含むステップと、
b)前記細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA又はPLK1、好ましくはAURKA;
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化;並びに
(v)非定型性
から選択される少なくとも2つのマーカーについてアッセイするステップと
を含み、
前記マーカーの少なくとも2つの異常レベルの検出が、対象の食道の表面異常の可能性が増加していることを意味する方法を提供する。
a)前記対象からの細胞の試料を提供するステップであって、前記試料が、対象の食道の表面から回収された細胞を含むステップと、
b)前記細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA又はPLK1、好ましくはAURKA;並びに
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化
から選択される少なくとも2つのマーカーについてアッセイするステップと
を含み、
前記マーカーの少なくとも2つの異常レベルの検出が、対象の食道の表面異常の可能性が増加していることを意味する方法に関する。
a)前記対象からの細胞の試料を提供するステップであって、前記試料が、対象の食道の表面から回収された細胞を含むステップと、
b)前記細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA又はPLK1、好ましくはAURKA;並びに
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化;
から選択される少なくとも2つのマーカーについてアッセイするステップと
を含み、
前記マーカーの少なくとも2つの異常レベルの検出が、対象の食道の表面異常の可能性が増加していることを意味する方法を提供する。
a)前記対象からの細胞の試料を提供するステップであって、前記試料が、対象の食道の表面から回収された細胞を含むステップと、
b)前記細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA;並びに
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化
から選択される少なくとも2つのマーカーについてアッセイするステップと
を含み、
参照標準と比較した前記マーカーの少なくとも2つの異常レベルの検出が、対象の食道の表面異常の可能性が増加していることを意味する方法を提供する。
(1)前記細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA;並びに
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化
から選択される少なくとも第1の分子マーカーを検出するための試薬と接触させることと、
(2)前記細胞を、(i)〜(iv)から選択される少なくとも第2の分子マーカーを検出し、及び/又は前記細胞を非定型性についてアッセイするための試薬と接触させることと
を含んでいてもよい。
(1)前記細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA;並びに
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化
から選択される少なくとも第1の分子マーカーを検出するための試薬と接触させることと、
(2)前記細胞を、(i)〜(iv)から選択される少なくとも第2の分子マーカーを検出するための試薬と接触させることと
を含む。
a)前記対象からの細胞の試料を提供するステップであって、前記試料が、対象の食道の表面から回収された細胞を含むステップと、
b)前記細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA;並びに
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化
から選択される少なくとも2つのマーカーについてアッセイするステップと
を含み、
前記マーカーの少なくとも2つの異常レベルが検出された場合、内視鏡検査及び生検の処置レジメンを選択するアッセイに関する。
(a)対象からの食道試料を分析するように構成され、前記分析が、
(b)前記細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA;並びに
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化
から選択される少なくとも2つのマーカーについてアッセイするステップ
を含む装置又はシステムであって、
出力モジュールを含み、
前記マーカーの少なくとも2つの異常レベルが検出された場合、前記出力モジュールが、前記対象についての食道における表面異常の可能性が増加していることを示す装置又はシステムに関する。
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA
のそれぞれの発現レベルを決定するための試薬を含み、MyoD及びRunx3のメチル化を決定するための試薬をさらに含んでいてもよいキットに関する。
(a)前記対象からの細胞の試料を提供し、前記細胞をTFF3についてアッセイするステップであって、前記試料が、対象の食道の表面から回収された細胞を含み、TFF3が試料の細胞において検出された場合、以下のさらなるステップを行うステップと、
(b)前記細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA;並びに
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化
から選択される少なくとも2つのマーカーについてアッセイするステップと
を含み、TFF3の検出に加えて少なくとも1つのマーカーの異常レベルの検出が、前記対象の食道の表面異常の可能性が増加していることを示す方法に関する。TFF3の検出に加えて少なくとも2つのマーカー、好ましくはTFF3の検出に加えて少なくとも3つのマーカー、好ましくはTFF3の検出に加えて少なくとも4つのマーカー、好ましくはTFF3の検出に加えてマーカーのそれぞれの異常レベルの検出が、前記対象の食道の表面異常の可能性が増加していることを示していてもよい。前記細胞は、食道の表面の不偏サンプリングにより回収されていてもよい。前記細胞は、カプセルスポンジを用いて回収されていてもよい。
適切には、本発明の方法は、任意の対象に用いられる。適切には、本発明の方法は、バレット食道を有する疑いがある任意の対象に用いられる。これらの用途は、集団全体をスクリーニングするために有用であり得る。
適切には、試料は、関心のある対象からの細胞を含む。適切には、試料は、対象とする対象からの食道細胞を含む。適切には、試料は、内視鏡検査によらず、すなわち試料は、適切には、内視鏡を用いることなく得られる。
(i)食道の表面から細胞を回収できる研磨性の材料を含む嚥下可能なデバイスを対象に導入するステップと、
(ii)前記デバイスを、食道を通して取り出すことにより取り戻すステップと、
(iii)デバイスから細胞を回収するステップと
を含む。
一実施形態では、適切には、方法は、インビトロでの方法である。一実施形態では、適切には、方法は、体外法である。一実施形態では、適切には、細胞の実際のサンプリングは、本発明の方法の一部でない。適切には、方法は、細胞の回収を含まない。
NCBI参照配列:NM_000546.5
受託番号NM_000546
バージョンNM_000546.5
起源
1 gatgggattg gggttttccc ctcccatgtg ctcaagactg gcgctaaaag ttttgagctt
61 ctcaaaagtc tagagccacc gtccagggag caggtagctg ctgggctccg gggacacttt
121 gcgttcgggc tgggagcgtg ctttccacga cggtgacacg cttccctgga ttggcagcca
181 gactgccttc cgggtcactg ccatggagga gccgcagtca gatcctagcg tcgagccccc
241 tctgagtcag gaaacatttt cagacctatg gaaactactt cctgaaaaca acgttctgtc
301 ccccttgccg tcccaagcaa tggatgattt gatgctgtcc ccggacgata ttgaacaatg
361 gttcactgaa gacccaggtc cagatgaagc tcccagaatg ccagaggctg ctccccccgt
421 ggcccctgca ccagcagctc ctacaccggc ggcccctgca ccagccccct cctggcccct
481 gtcatcttct gtcccttccc agaaaaccta ccagggcagc tacggtttcc gtctgggctt
541 cttgcattct gggacagcca agtctgtgac ttgcacgtac tcccctgccc tcaacaagat
601 gttttgccaa ctggccaaga cctgccctgt gcagctgtgg gttgattcca cacccccgcc
661 cggcacccgc gtccgcgcca tggccatcta caagcagtca cagcacatga cggaggttgt
721 gaggcgctgc ccccaccatg agcgctgctc agatagcgat ggtctggccc ctcctcagca
781 tcttatccga gtggaaggaa atttgcgtgt ggagtatttg gatgacagaa acacttttcg
841 acatagtgtg gtggtgccct atgagccgcc tgaggttggc tctgactgta ccaccatcca
901 ctacaactac atgtgtaaca gttcctgcat gggcggcatg aaccggaggc ccatcctcac
961 catcatcaca ctggaagact ccagtggtaa tctactggga cggaacagct ttgaggtgcg
1021 tgtttgtgcc tgtcctggga gagaccggcg cacagaggaa gagaatctcc gcaagaaagg
1081 ggagcctcac cacgagctgc ccccagggag cactaagcga gcactgccca acaacaccag
1141 ctcctctccc cagccaaaga agaaaccact ggatggagaa tatttcaccc ttcagatccg
1201 tgggcgtgag cgcttcgaga tgttccgaga gctgaatgag gccttggaac tcaaggatgc
1261 ccaggctggg aaggagccag gggggagcag ggctcactcc agccacctga agtccaaaaa
1321 gggtcagtct acctcccgcc ataaaaaact catgttcaag acagaagggc ctgactcaga
1381 ctgacattct ccacttcttg ttccccactg acagcctccc acccccatct ctccctcccc
1441 tgccattttg ggttttgggt ctttgaaccc ttgcttgcaa taggtgtgcg tcagaagcac
1501 ccaggacttc catttgcttt gtcccggggc tccactgaac aagttggcct gcactggtgt
1561 tttgttgtgg ggaggaggat ggggagtagg acataccagc ttagatttta aggtttttac
1621 tgtgagggat gtttgggaga tgtaagaaat gttcttgcag ttaagggtta gtttacaatc
1681 agccacattc taggtagggg cccacttcac cgtactaacc agggaagctg tccctcactg
1741 ttgaattttc tctaacttca aggcccatat ctgtgaaatg ctggcatttg cacctacctc
1801 acagagtgca ttgtgagggt taatgaaata atgtacatct ggccttgaaa ccacctttta
1861 ttacatgggg tctagaactt gacccccttg agggtgcttg ttccctctcc ctgttggtcg
1921 gtgggttggt agtttctaca gttgggcagc tggttaggta gagggagttg tcaagtctct
1981 gctggcccag ccaaaccctg tctgacaacc tcttggtgaa ccttagtacc taaaaggaaa
2041 tctcacccca tcccacaccc tggaggattt catctcttgt atatgatgat ctggatccac
2101 caagacttgt tttatgctca gggtcaattt cttttttctt tttttttttt ttttttcttt
2161 ttctttgaga ctgggtctcg ctttgttgcc caggctggag tggagtggcg tgatcttggc
2221 ttactgcagc ctttgcctcc ccggctcgag cagtcctgcc tcagcctccg gagtagctgg
2281 gaccacaggt tcatgccacc atggccagcc aacttttgca tgttttgtag agatggggtc
2341 tcacagtgtt gcccaggctg gtctcaaact cctgggctca ggcgatccac ctgtctcagc
2401 ctcccagagt gctgggatta caattgtgag ccaccacgtc cagctggaag ggtcaacatc
2461 ttttacattc tgcaagcaca tctgcatttt caccccaccc ttcccctcct tctccctttt
2521 tatatcccat ttttatatcg atctcttatt ttacaataaa actttgctgc cacctgtgtg
2581 tctgaggggt g
非定型性は、観察により評価される。
ヘマトキシリン及びエオシン染色は、一方は核を染色し、他方は細胞質及び結合組織を染色する2つの別々の色素を用いる。ヘマトキシリンは、濃い紫がかった色素で、核内のクロマチン(核物質)を染色して、濃い紫がかった青にする。エオシンは、オレンジがかったピンク〜赤の色素で、結合組織及びコラーゲンを含む細胞質物質を染色して、オレンジ−ピンクに対比染色する。この対比染色は、核の紫がかった青の核染色と鮮明な対比として作用して、細胞膜(境界)、赤血球及び体液のような組織中のその他の物体を同定する助けとなる。
H&E染色を実行するための2つの方法がある。スライドをヘマトキシリン中に入れ、次いですすぎ、エオシン中に入れる進行的方法と、スライドをより強い型のヘマトキシリン中に入れ、次いで酸アルコール中で、核以外の全てからヘマトキシリンを取り出して区別し、次いでエオシン中に入れる退行的方法である。両方の型の染色では、青み付け溶液(スコットの水道水又はアンモニア水)を用いて、核を濃い紫がかった青色に染色していてもよい。
本発明は、あるマーカーの「異常」レベルの決定を必要とする。「異常」は、参照標準との比較により定義してよい。
数値アドレスを用いて特定のアミノ酸残基に言及する場合、番号付けは、全長アミノ酸配列を参照配列として用いて行われる。対象となる残基を位置付けるために当該技術においてよく理解されていることと同様に、このことが行われる。このことは、常に厳密な計数を行うことではなく、文脈に注意すべきである。例えば、ヒトp53のような対象となるタンパク質がわずかに異なる長さのものである場合、特定の残基に対応するp53配列中の正しい残基の場所は、対象となる配列の同一の番号を有する残基を単に選ぶのではなくむしろ、配列を整列させ、等価又は対応する残基を選び出すことを必要とすることがある。このことは、十分に当業者の範囲内である。
配列相同性は、機能的類似性(すなわち類似の化学的特性/機能を有するアミノ酸残基)の点で考慮することもできるが、本書面の関係では、相同性を配列同一性の点で表すことが好ましい。
Rugge, M., Fassan, M., Zaninotto, G., Pizzi, M., Giacomelli, L., Battaglia, G., Rizzetto, C., Parente, P., and Ancona, E. (2010). Aurora kinase A in Barrett's carcinogenesis. Hum Pathol 41, 1380-1386の主な焦点であるようなmRNA研究は、「正常」レベルを確立することが困難である。カットオフ値を定義することは、挑戦的である。結果を信頼あるものにするためには、非常に大きい標本サイズが必要である。広い範囲の発現レベルが観察される。mRNA発現レベルは、タンパク質発現レベルと相関しないことがある。mRNAは、Cytospongeで回収された試料で分解し得る。タンパク質は、より安定である。Rugge et alは、バレット食道での異形成の診断のためのAURKAの使用について言及していない。プライマリケアの環境では、試料は、回収され、冷蔵庫に貯蔵され、郵便で送られ、やっと実験室に試験のために到着する。本発明の利点は、シグナルがこのような試料処理の間に損なわれないことである。Rugge et alは、IHCによりAKAを測定し、p53とも相関させている。Rugge et alでの主な欠点は、AKAを主要な細胞質染色として報告していることである。このことは、AKAが核内で機能し、よってRugge et alの細胞質染色が信頼できるように見えないので、非常に問題がある。Rugge et alが用いるAbは、Epitomics社からであり、これは、非特異的で信頼できない結果が生じる可能性が高いと考えられる。対照的に、我々は、核染色を示す。例えば、本発明者らは、Millipore社からの抗体を用いる。本発明者らは、抗体の特異性について確認している。
a)前記対象からの細胞の試料を提供するステップであって、前記試料が、対象の食道の表面から回収された細胞を含むステップと、
b)前記細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA又はPLK1、好ましくはAURKA;並びに
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化
から選択される少なくとも2つのマーカーについてアッセイするステップと
を含み、
前記マーカーの少なくとも2つの異常レベルの検出が、対象の食道の表面異常の可能性が増加していることを意味する方法。
(1)細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA又はPLK1、好ましくはAURKA;並びに
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化
から選択される少なくとも第1の分子マーカーを検出するための試薬と接触させることと、
(2)前記細胞を、(i)〜(iv)から選択される少なくとも第2の分子マーカーを検出するための試薬と接触させることと
を含む、段落iに記載の方法。
a)前記対象からの細胞の試料を提供するステップであって、前記試料が、対象の食道の表面から回収された細胞を含むステップと、
b)前記細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA;並びに
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化
から選択される少なくとも2つのマーカーについてアッセイするステップと
を含み、
前記マーカーの少なくとも2つの異常レベルが検出された場合、内視鏡検査及び生検の処置レジメンを選択するアッセイ。
(b)前記細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA;並びに
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化
から選択される少なくとも2つのマーカーについてアッセイするステップ
を含む装置又はシステムであって、
出力モジュールを含み、
前記マーカーの少なくとも2つの異常レベルが検出された場合、前記出力モジュールが、前記対象についての食道における表面異常の可能性が増加していることを示す装置又はシステム。
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA
のそれぞれの発現レベルを決定するための試薬を含み、MyoD及びRunx3のメチル化を決定するための試薬をさらに含んでいてもよいキット。
[実施例]
4つの分子リスク階層化バイオマーカー(と、場合によって5番目の非定型性マーカー)を選択するいくつかの理由があったが、その例を以下に示す。
Cytosponge(商標)で用いるために他の可能性のあるバイオマーカーを排除することについての堅固な理由がある。パネルの設計から排除したマーカーのいくつかの例について、以下に論じる。
カプセルスポンジ検体の処理
Cytosponge(商標)カプセルは、患者により嚥下され、次いで、さらなる処理まで4℃にて保存剤溶液に直ちに入れた。試料を十分にボルテックスし、激しく振とうして、スポンジ材料からいずれの細胞も取り除いた。細胞を含有する保存剤液を1000RPMで5分間遠心分離して、細胞をペレットにした。得られたペレットを500μLの血漿に再懸濁し、トロンビン(Diagnostic reagents社、Oxford、UK)を次いで、10μLの増加量で、血餅が形成されるまで加えた。血餅を、次いで、ホルマリンに24時間入れた後に、処理してパラフィンブロックにした。試料を3.5μmの切片に切断して、スライド1及び2に2つの切片を置いて、スライド1〜15と命名される15枚のスライドを得た。
Cytospongeに由来する試料での非定型性の評価を、顕微鏡検査及びスコア化により行う。
Cytosponge(商標)を用いて得られた試料中の細胞上/中の3つのタンパク質バイオマーカーのそれぞれを、免疫組織化学的染色によりアッセイした。
p53は、0〜3(染色の強度)としてスコア化し、3は、著しい染色、0、1又は2は、著しくない染色と見なした。強い(強度=3)p53染色だけを、著しいと見なした。p53蓄積は、異形成を有するバレット食道と相関し、進行も予測することが示されている(Kaye, P.V., Haider, S.A., Ilyas, M., James, P.D., Soomro, I., Faisal, W., Catton, J., Parsons, S.L., and Ragunath, K. (2009). Barrett's dysplasia and the Viennaclassification: reproducibility, prediction of progression and impact of consensus reporting and p53 immunohistochemistry. Histopathology 54, 699-712;Skacel, M., Petras, R.E., Rybicki, L.A., Gramlich, T.L., Richter, J.E., Falk, G.W., and Goldblum, J.R. (2002). p53 expression in low grade dysplasia in Barrett's esophagus: correlation with interobserver agreement and disease progression. Am J Gastroenterol 97, 2508-2513)。バレット食道中の上皮細胞はp53について頻繁に染色されないので、非存在パターン(Kaye, P.V., Haider, S.A., James, P.D., Soomro, I., Catton, J., Parsons, S.L., Ragunath, K., and Ilyas, M. (2010). Novel staining pattern of p53 in Barrett's dysplasia--the absent pattern. Histopathology 57, 933-935)は、著しいと見なさなかった。
さらなるスクリーニングを行い、3つの可能性のあるタンパク質バイオマーカーが我々の手においてうまく機能することを確実にするために、p53、c−MYC及びAURKA染色を、我々の自前のバレット食道組織マイクロアレイ(TMA,tissue microarray)で行った。これらのTMAは、54の異形成を有さないバレット食道生検、32の軽度異形成を有するバレット食道生検及び18の高度異形成を有するバレット食道生検で構成された。これらのTMAは、バレット食道生検で構成されたので、Cytosponge(商標)がサンプリングすると考えられる細胞である表面染色だけをスコア化した。このデータセットでは、3つ全てのバイオマーカーは、以下の表から見ることができるように、良好に機能した。
Cytosponge(商標)を用いて回収された細胞に対するメチル化分析は、以下のようにして行う。ゲノムDNAを、処理されたCytosponge(商標)FFPE血餅の8×10μm切片から、脱パラフィン緩衝液(Qiagen社製)及びQIAamp FFPE DNA組織キット(Qiagen社製)を用いて抽出した。プロトコールは、試料を、記載される1時間の代わりに56℃にて24時間インキュベートし、10μlの余剰のプロテイナーゼKを24時間のインキュベーションのほぼ半分が過ぎたところで試料に加えた以外は、製造業者により記載されるとおりに従った。抽出の後に、DNAを、Qubit(商標)dsDNA HSアッセイキット(Invitrogen社製)を用いて定量し、75ngを、EZ DNAメチル化-Gold(商標)キットを(製造業者に記載されるとおりに)用いてバイサルファイトに変換した。試料を25μlの水に溶出し、Eads, C.A., Danenberg, K.D., Kawakami, K., Saltz, L.B., Blake, C., Shibata, D., Danenberg, P.V., and Laird, P.W. (2000). MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation. Nucleic Acids Res 28, E32に記載されるとおりにMethyLight反応あたり2μlを用いた。βアクチンを内部対照として用いて、入力DNAの量を標準化した。用いたプライマー及びプローブの配列は、MYOD1フォワードプライマー:5'-gagcgcgcgtagttagcg-3'、MYOD1リバースプライマー:5'-tccgacacgccctttcc-3'、MYOD1プローブ:5'-6FAM-ctccaacacccgactactatatccgcgaaa-TAMRA-3'、ACTBフォワードプライマー:5'-tggtgatggaggaggtttagtaagt-3'、ACTBリバースプライマー:5'-aaccaataaaacctactcctcccttaa-3'、ACTBプローブ:5'-6FAM-accaccacccaacacacaataacaaacaca-TAMRA-3'(Eads, C.A., Lord, R.V., Wickramasinghe, K., Long, T.I., Kurumboor, S.K., Bernstein, L., Peters, J.H., DeMeester, S.R., DeMeester, T.R., Skinner, K.A., et al. (2001). Epigenetic patterns in the progression of esophageal adenocarcinoma. Cancer Res 61, 3410-3418から)、Meltzer実験室からのRUNX3フォワードプライマー:5'-ggcttttggcgagtagtggtc-3'、RUNX3リバースプライマー:5'-acgaccgacgcgaacg-3'、RUNX3タンパク質:5'-6FAM-cgttttgaggttcgggtttcgtcgtt-TAMRA-3'であった。バイサルファイトに変換した普遍的メチル化DNA(D5010−1、Zymo Research社製)を用いて、プライマー及びプローブセットのそれぞれについて標準曲線を導き出し、校正物質を全ての実験で用いて、全ての試料におけるメチル化レベルの絶対的定量を可能にした。全ての反応について用いた増幅条件は、95℃にて10分、その後、95℃にて15秒及び60℃にて1分を50サイクルであった。
%メチル化=(A/B)/(C/D)
A=対象となる遺伝子のメチル化の値
B=完全メチル化対照における対象となる遺伝子のメチル化の値
C=試料におけるβアクチンの増幅のレベル
D=完全メチル化対照におけるβアクチンの増幅のレベル
113のCytosponge(商標)試料(15のTFF3+バレット食道を有さない対照、54の異形成を有さないバレット食道、20のLGDを有するバレット食道及び24のHGDを有するバレット食道)からなる予備的実験では、5つ全てのメチル化領域(p16、HPP1、RUNX3、ESR1及びMYOD1)を評価して、メチル化領域のどの部分集合が最も良好に機能し、Cytosponge(商標)で異形成を検出するための最良の感度及び特異性を有したかを、以下の表に示すデータを用いて評価した。
本実施例では、我々は、対象の食道の表面異常の検出を補助する方法を実証する。
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA;並びに
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化
から選択される少なくとも2つのマーカーについてアッセイする。
本実施例では、対象の食道の表面異常の検出を補助する方法であって、
a)前記対象からの細胞の試料を提供するステップであって、前記試料が、対象の食道の表面から回収された細胞を含み、
細胞の前記試料が、対象の食道の表面をサンプリングするための嚥下可能な研磨性デバイス(例えばCytosponge(商標))を用いて回収されるステップと、
b)前記細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA;並びに
(iv)MyoD及びRunx3のメチル化
から選択される少なくとも1つのマーカーについてアッセイするステップと
を含み、
前記マーカーの少なくとも2つの異常レベルの検出が、対象の食道の表面異常の可能性が増加していることを意味する方法。
これらのデータは、研磨性表面サンプリング(例えばCytosponge(商標)を用いる)とバイオマーカーのパネルとが一緒に、BE患者をリスク階層化するために用いることができることを示す。このことは、BE患者が必要とする内視鏡検査の数を減らすことができるという利点を有する。このことは、生検に伴うサンプリングの偏りを回避するという利点も有する。我々は、研磨性表面サンプリング(例えばCytosponge(商標)を用いる)試験とリスクバイオマーカーのパネルとが一緒に、現在の臨床プラクティスを変える(そして現在の臨床プラクティスを超える技術的利益をもたらす)と提案する(図3−持続性ディスペプシア又は逆流を有する患者についての現在の臨床的経路を示すフローチャート)。現在のところ、症候性であり持続性ディスペプシア又は逆流を経験する患者は、内視鏡検査を提案される。これらの患者がバレット食道を有すると同定された場合、複数の生検を病理検査のために採取する。診断に応じて、患者は、サーベイランスプログラムに入り、決定された時間間隔にて生検と一緒に内視鏡検査を提案される。高度異形成を有するバレット食道が検出された場合、患者は、処置を提案される。
本実施例では、核酸レベルでのp53変異分析の使用を実証する。さらに、EACのマーカーとしてのSMAD4の使用を実証する。
癌ゲノム配列決定研究は、多数の推定駆動遺伝子を同定したが、癌発生における変異の相対的タイミングは、不明のままである。前癌性バレット食道(BE)から食道腺癌(EAC)までの緩やかな進行は、体細胞突然変異の順序付けを研究するための理想的なモデルを提供する。我々は、反復的に変異する遺伝子を同定し、112のEACの全ゲノム配列決定及びアンプリコン再配列決定を用いてクローン構造を評価した。我々は、次に、悪性病変の進展における2つの重要な移行点、すなわち良性化生未異形成バレット食道(NDBE、n=66)及び高度異形成(HGD、n=43)からの109の生検のコホートをスクリーニングした。予期せぬことに、EACにおいて反復的に変異する遺伝子の大多数は、NDBEにおいても変異された。TP53及びSMAD4だけが段階特異的であり、それぞれHGD及びEACに制限された。最後に、我々は、この知見を用いて、新規な非内視鏡試験において高リスクBEを同定した。結論として、EAC駆動遺伝子における変異は、全般的に、疾患進展において例外的に早期に出現し、診断及び治療戦略と深いつながりを有する。
ほとんどの上皮癌は、前浸潤性病変から徐々に進展し、いくつかの場合では初期の化生転換後に進展する。癌のゲノム的眺望を特徴決定するための研究は、個別化された治療のためのバイオマーカーの開発を目的として、確立された浸潤性疾患に焦点を当てている(Chin, L., Andersen, J.N. & Futreal, P.A. Cancer genomics: from discovery science to personalized medicine. Nat Med 17, 297-303 (2011))。しかし、広範なゲノム不均質性が、進行癌の大多数に存在することが明らかになってきている(Gerlinger, M. et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 366, 883-92 (2012))。よって、最も適切な治療標的は疾患の進展の早期に生じ、結果としての悪性病変においてクローン性であるこれらの変異である。病変形成の早期に生じる原因変異の同定も、臨床的に有用なバイオマーカーを開発するために重要である。この関係では、疾患段階境界、例えば非異形成上皮から異形成、次いで癌への移行にて生じる変異が、最も情報を与えると考えられる。前癌性病変から癌への遺伝子的進化についての現在までの証拠は、変異の蓄積が段階的であることを示唆する(Jones, S. et al. Comparative lesion sequencing provides insights into tumor evolution. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 4283-8 (2008)、Nik-Zainal, S. et al. The life history of 21 breast cancers. Cell 149, 994-1007 (2012)、Vogelstein, B. et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. N Engl J Med 319, 525-32 (1988))。腺腫−異形成−結腸直腸腺癌進行の順序の最もよく研究された例では、比較病変配列決定により限定された数の候補遺伝子についてタイミングを割り当てることが可能であった(Jones, S. et al. Comparative lesion sequencing provides insights into tumor evolution. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 4283-8 (2008))。より最近の研究では、統計的アルゴリズムを用いて、単一試料から腫瘍の生命史(Nik-Zainal, S. et al. The life history of 21 breast cancers. Cell 149, 994-1007 (2012)、Vogelstein, B. et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. N Engl J Med 319, 525-32 (1988))を推論しようとしている。
EACにおける高変異負荷及び通常でない変異サイン
発見コホート(WGSに供した22のEAC)は、雄性優勢(M:F、4.5:1)、68歳の平均年齢(53〜82の範囲)、及び大多数が進行疾患(81.8%(18/22)>ステージI)という疾患の既知の臨床人口統計学的特徴を反映した。22のうち17(77.3%)の症例が、切除検体においてBEの証拠を有した(表1)。
BEにおけるEACの進展に関与する新規遺伝子を同定するために、我々は、我々の発見コホート(n=22症例)において反復的に変異する標的を同定することを試みた。バックグラウンド率を超えて又は対象とする経路において著しく変異している26遺伝子の最終リストを選択し、より大きいコホート(90のさらなるEAC、表1)において、標的化アンプリコン再配列決定を用いて試験した。成果は、ARID1AのようなSWI/SNF複合体における反復変異の同定を含む、我々の発見コホート及び他者からの以前の研究(Dulak, A.M. et al. Exome and whole-genome sequencing of esophageal adenocarcinoma identifies recurrent driver events and mutational complexity. Nat Genet 45, 478-86 (2013)、Agrawal, N. et al. Comparative genomic analysis of esophageal adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. Cancer Discov (2012)、Streppel, M.M. et al. Next-generation sequencing of endoscopic biopsies identifies ARID1A as a tumor-suppressor gene in Barrett's esophagus. Oncogene (2013))のものを確認して拡張した。298のさらなるEACのコホートにおける免疫組織化学によるARID1Aタンパク質発現の喪失の分析は、41%(122/298)での発現の非存在又は減少を同定した。このことは、下方制御の代替の機構が存在し得ることを示唆するが、我々は、我々の発見コホートからのWGSデータ内でいずれの大規模構造バリアントも同定しなかった(データは示さず)。
変異の段階特異性は、BE癌発生の別々の段階にある患者から導き出すことができる。疾患段階境界で出現する変異は、悪性進行の候補バイオマーカーであり得る。さらに、疾患の進展の早期に出現する変異は、自然史の早期のクローン性増大によるより進行した病変の細胞の大多数にそれらが存在するので、新規な治療介入についての理想的な標的であるはずである。よって、我々は、我々のパネルにおいて26遺伝子の変異状態を、内視鏡サーベイランスを受ける患者の前向きコホートから得られたBE試料において同定することを試みた。これは、79名の患者からの109のBE生検を含んだ(図7)。我々は、異形成又は悪性病変への進行の証拠がない(中央値フォローアップ時間58ヶ月、範囲4〜132)40名のBE患者からの66の未異形成BE試料と、浸潤性EACの進展の直前の段階である病理組織学的に確認された高度異形成(HGD)の43のBE生検試料(39名の患者から)とを選択した(表1)。我々は、軽度異形成を含めなかったが、これは、この病変の病理組織学的等級づけとの一致が乏しいからである(Wang, K. et al. Exome sequencing identifies frequent mutation of ARID1A in molecular subtypes of gastric cancer. Nat Genet 43, 1219-23 (2011))。
疾患進展の最も早期の段階での変異の出現を同定して、我々は、次に、これらの変異が、22のEACの我々の元の発見コホートにおいて完全にクローン性又はサブクローン性であるかを同定することを試みた。我々の拡張コホートからの≧4の試料で変異する15の遺伝子のそれぞれについて、我々は、SNVの高深遠再配列決定とコピー数バリアントデータとLOH分析とを組み合わせて、変異を含有する腫瘍細胞の分率を決定した。変異が疾患進展の最も早期段階、悪性病変のクローン性増大の前に生じる場合、我々は、変異が腫瘍の全ての細胞に存在すると期待する。7/15の遺伝子、SMAD4、TP53、ARID1A、SMARCA4、TLR4、CDKN2A及びPNLIPRP3について、そうであった。その他の8つの遺伝子(MYO18B、TRIM58、CNTNAP5、ABCB1、PCDH9、UNC13C及びCCDC102B)での変異は、主要なクローンに常に存在したわけではなく、これらの遺伝子の変異が、腫瘍形成の複数の段階にて選択され得ることを示唆した(図9d)。
BEの患者についての現在の臨床的戦略は、腺癌への進行のリスクが高い異形成を有する患者を同定しようとするための定期的な内視鏡検査を含む。このアプローチは、異形成病変の正確な同定が本来的に困難であるので非常に物議を醸すものであり、最近のデータは、BEの内視鏡サーベイランスは有効でないことを示唆する(Corley, D.A. et al. Impact of Endoscopic Surveillance on Mortality From Barrett's Esophagus-Associated Esophageal Adenocarcinomas. Gastroenterology 145, 312-319 e1 (2013)、Reid, B.J., Li, X., Galipeau, P.C. & Vaughan, T.L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat Rev Cancer 10, 87-101 (2010))。BEについての内視鏡サーベイランスに関わる困難は、無作為生検プロトコールに固有であるサンプリングの偏りと、異形成の主観的で時間がかかる病理組織学的診断とを含む。よって、我々は、BEサーベイランスのこれらの制限を克服する可能性を有する新規なアプローチを開発した。戦略は、Cytosponge(商標)と呼ばれる内視鏡検査によらないデバイスを含み、これは、プライマリケアの環境で患者に提供できる。このデバイスは、食道粘膜全体から細胞を回収し、よって、サンプリングの偏りを回避し、診断のための客観的バイオマーカーと組み合わせることができる(Kadri, S.R. et al. Acceptability and accuracy of a non-endoscopic screening test for Barrett's oesophagus in primary care: cohort study. BMJ 341, c4372 (2010)、Lao-Sirieix, P. et al. Non-endoscopic screening biomarkers for Barrett's oesophagus: from microarray analysis to the clinic. Gut 58, 1451-9 (2009))。現在までに、我々は、BEを診断するためのバイオマーカーに焦点を当ててきたが、ほとんどのBE患者はEACに進行しないので、このBEバイオマーカーを、高リスク異形成患者を同定するためのバイオマーカー(又はバイオマーカーのパネル)と組み合わせる必要がある。上記の配列決定データから、TP53変異が、良好なリスク階層化候補マーカーの基準に適合する。なぜなら、TP53変異は、治療介入の重要な点である高度異形成を有する患者と有さない患者との間を識別するからである。デバイスは異常組織をサンプリングするが、回収される細胞の大多数は、胃の頂部からの正常胃腺組織及び食道の正常扁平上皮領域からであるので、いずれの変異DNAも理論的には少数派であり、非常に感度が高いアッセイを必要とする(図10a)。この状況は、進行悪性疾患におけるバイオマーカーとしての血液中の腫瘍細胞フリーDNAの検出と類似する。感度が高いアッセイが、正常バックグラウンドに対して非常に低レベルの変異DNAを検出するために開発されている(Forshew, T. et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci Transl Med 4, 136ra68 (2012)、Dawson, S.J. et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N Engl J Med 368, 1199-209 (2013))。よって、我々は、Cytosponge(商標)物質における変異を検出するために類似のアプローチをとった。
BEは、唯一の既知のEACの前駆病変であり、de novoを示す症例の>80%で同時出現する(Theisen, J. et al. Preoperative chemotherapy unmasks underlying Barrett's mucosa in patients with adenocarcinoma of the distal esophagus. Surg Endosc 16, 671-3 (2002))が、BE患者の大多数は、浸潤性疾患に決して進行しない(Bhat, S. et al. Risk of malignant progression in Barrett's esophagus patients: results from a large population-based study. J Natl Cancer Inst 103, 1049-57 (2011))。よって、進行のリスクがある患者を同定できる、感度が高く特異的なバイオマーカーに対する必要性が存在する。ノウェル仮説ほど昔に、ゲノム変異の段階的選択が、癌の進展のために必要であると仮定された(Nowell, P.C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science 194, 23-8 (1976))。体細胞ゲノムバリアントは、よって、疾患段階の感度が高く、高度に特異的なマーカーであるはずである。反復的に変異する遺伝子の我々のパネルについて、異形成に進展したことがないBEの患者のコホートと、HGDを有する患者のコホートとにおいてスクリーニングすることにより、我々は、これらの疾患段階にわたる変異の段階的な蓄積を同定することを望んだ。驚くべきことに、我々は、未異形成BEにおいて検出可能な対立遺伝子分率(>10%)にて生じる多数の変異を同定した。興味深いことに、EACにおける最も一般的な遺伝子変異も、癌関連遺伝子、例えばSWI/SNF複合体のメンバーであるARID1A及びSMARCA4内での変異を含んで、BE及びHGD試料において同様の頻度で存在した。これらのデータは、完全に良性の病理組織学的外観を有する、悪性進行のリスクが非常に低い組織内にさえ存在し得る複雑な変異の眺望を証明する。疾患進展のこのような早期段階でのこれらの変異の厳密な役割は、不明のままである。しかし、クローン性増大がBEで頻繁に生じることが知られており、これらの変異が、上皮構造の破壊を導くことなく、又は浸潤のために必要な細胞特徴を提供することなく、クローンの適応度の増加をもたらすことが可能である。同様の観察結果が、子宮内膜癌で報告されている。正常集団では、およそ35%の女性が子宮内膜組織内にPTEN変異腺を有するが、子宮内膜癌の生涯リスクは、およそ2.5%である(Mutter, G.L. et al. Molecular identification of latent precancers in histologically normal endometrium. Cancer Res 61, 4311-4 (2001))。
試料回収、病態検討及び抽出。
本研究は、施設倫理委員会(REC N 07/H0305/52及び10/H0305/1)により承認され、全ての患者から個別にインフォームドコンセントを得た。発見コホートについて、食道腺癌(EAC)患者を予測的に採用し、試料を、手術による切除又は超音波内視鏡(EUS,endoscopic ultrasound)のいずれかから得た。血液又は腫瘍から少なくとも5cm離れた正常扁平上皮食道試料を、生殖系列参照として用いた。全ての組織試料を、回収の直後に液体窒素中で直ちに凍結し、−80℃にて貯蔵した。DNA抽出の前に、各食道組織試料から1枚の切片を切り取り、H&E染色を行った。癌試料は、2名の熟練病理学者が腫瘍細胞充実性≧70%を確認する合意検討の後にのみ、DNA抽出について適切であると考えた。血液が入手可能でない場合、同じ検討プロセスを正常食道試料に当てはめて、扁平上皮のみが存在することを確実にした。発見コホートについて、127の症例を2つの施設(ケンブリッジ及びサウサンプトン)からスクリーニングした。63の症例は、ICGC基準に合致するために要求される70%細胞充実性を有し、これらのうち、22の腫瘍:正常対は、抽出されたDNAの十分な質及び量(合計収量≧5μg)を有し、これらを全ゲノム配列決定に供した。利用可能な残りの105の症例から、90は>50%細胞充実性を有し、これらの全てはアンプリコン配列決定のために十分なDNAを有した。発見コホート及び検証コホートの全ての症例について、260/280比率は1.8〜2.1であった。前浸潤性疾患コホートについて、我々は、>500名患者の我々の10年予測バレット食道コホート全体をスクリーニングし、凍結物質が入手可能で、凍結切片の検討により、熟練者の組織病理学的検討後に均質グレードの異形成が明らかになった症例を選択した。Cytosponge(商標)試料は全て、進行中の前向き症例対照研究(BEST2)からの一時的分析の一部として利用可能なものであった。
各試料について単独ライブラリーを創出し、少なくとも8×カバー率まで既知のゲノムの94%が配列決定される少なくとも50×の典型的深度まで100bpペアエンド配列決定をIllumina社により契約の下で行い、マッピングした塩基の少なくとも80%について少なくとも30のPHREDクオリティを達成した。典型的に、HiSeq-2000(Illumina社製)フローセルの5つのレーンがこれを達成したが、試料を多重化しなかったので、いくつかはこれらの最小限の標準を大きい差で超えた。フィルタにかけた読み取り配列を、バローズ−ホイーラアラインメント(BWA,Burrows-Wheeler Alignment)(Li, H. & Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 25, 1754-60 (2009))を用いてヒト参照ゲノム(GRCh37)にマッピングし、Picard(http://picard.sourceforge.net)を用いて重複に印をつけた。広範な品質保証プロセスの一部として、レーンごとにQC測定基準及びアラインメント統計を計算した。各発見コホート試料についての統合したQCを決定した。QC後に取り除いたフローセル内のいずれのタイルの詳細も決定した。
体細胞一ヌクレオチドバリアント(SNV,single nucleotide variant)を、以下のコマンドで作動するSomaticSniper V1.0.2(Larson, D.E. et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics 28, 311-7 (2012))を用いて予測した:
somaticsniper −q 1 −Q 15 −F vcf −J −r 0.001000 −T 0.850000 −N 2 −s 0.01 −f
1.生殖系列及び腫瘍試料カバー率≧10
2.読み取りにおける平均バリアント位置10位から90位の間
3.各鎖からの支持読み取りのパーセンテージ≧1%及び≦99%
4.全支持読み取り≧4
5.支持読み取りの有効3’端からのバリアント塩基の平均距離≧20bp
6.参照支持読み取りとバリアント支持読み取りとの間の平均マッピングクオリティの差<30
7.参照読み取りとバリアント読み取りとの間のトリミング配列の長さの平均の差<25bp
8.参照読み取りとバリアント読み取りとの間のミスマッチクオリティ合計の差<100
9.隣接ホモポリマー<5bp
10.最も近いindel≧40bp
手動の検討により確認された合計で25のコーディングindelを、確証のために無作為に選択した。プライマー(配列は、依頼に応じて入手可能である)を設計して、予測されるバリアントの場所を増幅した。PCRは、腫瘍及び正常DNAの両方に対して行い、得られた生成物をサンガー配列決定した。全ての痕跡を、Chromas lite 2.01を用いて視覚化し、バリアントの存在について手動で検討した。indelが腫瘍痕跡にのみ存在する場合、そのindelを体細胞性と見なした。
我々のSNVコーリングパイプラインのより大きいベンチマーク評価の実行の一部として、我々は、2007のSNVを確証するために選択した。これらのSNVは、フィルタを通らず、Illuminaパイプライン、ELANDアラインメントとSTRELKAを用いて予測されていたものを含んだ。これらのデータの完全な分析は進行中であり、全体的な目的は、我々のSNVコーリングパイプラインの感度を最適化することである。予備的分析及びICGCベンチマーク評価の実行の比較の後に、我々は、この予備的データセット(上で詳述する)について我々のフィルタの厳密さを増加することを選択した。この原稿における確証データは、これらのさらなるフィルタを通過するSNVについてのみである。推定非同義SNV(合計で1330)は、超高深度標的化配列決定を受けた。8つの試料について、全ての非同義バリアントを確証のために送った。残りの14の症例では、選択したSNVを、1つを超える試料で変異する遺伝子における非同義バリアントに限定した。アンプリコンを作製し、索引をつけ、プールし、Shah et al(Shah, S.P. et al. The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers. Nature 486, 395-9 (2012))に従ってライブラリーを構築した。試料は別々にプールし、HiSeq-2000データの単独レーンをそれぞれについて作製し、13,855のカバー率の典型的な深度(アンプリコンについてIQR:3,408〜39,059)を導いた。これらのうち1086について、≧50倍カバー率を、腫瘍及び正常の両方について作製した。バリアント対立遺伝子頻度がマッチする正常において≦1%であり、腫瘍において≧2%である場合、SNVは体細胞性であることが確認され、1081のSNVがこれらの基準に合致し、1081/1086(99.5%)の確証率が得られた。
変異の検証を、43の病理組織学的に確認されたHGDを有するBE生検及び66の異形成を有さない生検を含む、90のさらなるEAC及び109のBE生検のコホートにおいて行った。Access Array微少流体PCRプラットフォーム(Fluidigm社)と、ハイスループット配列決定(Illumina社)とを一緒に、標的化再配列決定のために用いた。
Cytosponge(商標)カプセルは、患者により嚥下され、次いで、さらなる処理まで4℃にて保存剤溶液に直ちに入れた。試料を十分にボルテックスし、激しく振とうして、スポンジ材料からいずれの細胞も取り除いた。細胞を含有する保存剤液を1000RPMで5分間遠心分離して、細胞をペレットにした。得られたペレットを500μLの血漿に再懸濁し、トロンビン(Diagnostic reagents社、Oxford、UK)を次いで、10μLの増加量で、血餅が形成されるまで加えた。血餅を、次いで、ホルマリンに24時間入れた後に、処理してパラフィンブロックにした。8×10マイクロメートルの切片を切り出し、DNA抽出のためにチューブに入れた。
ゲノムDNAを、処理されたCytosponge(商標)FFPE血餅の8×10μm切片から、脱パラフィン緩衝液(Qiagen社製)及びQIAamp FFPE DNA組織キット(Qiagen社製)を用いて抽出した。プロトコールは、試料を、記載される1時間の代わりに56℃にて24時間インキュベートし、10μlの余剰のプロテイナーゼKを24時間のインキュベーションのほぼ半分が過ぎたところで試料に加えた以外は、製造業者により記載されるとおりに従った。抽出の後に、DNAを、Qubit(商標)dsDNA HSアッセイキット(Invitrogen社製)を用いて定量した。
多重化TP53 PCRアッセイを用いて、TP53遺伝子のコード領域を配列決定した。多重化は、14プライマー対(Forshew, T. et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci Transl Med 4, 136ra68 (2012))からなり、これらの14プライマー対を2つの異なるプールに分割した。プライマーのそれぞれの配列、それらが増幅するゲノム領域(座標は、ヒトゲノムのhg19バージョンについて正しい)及びそれらがどのプールの一部であるかを、表12及び13に記載する。
indelは、バックグラウンド変異率の遺伝子座特異的分布から異常値を選択することによりコールした。各試料における候補挿入及び欠失を、全てのその他の患者からの試料における同じ遺伝子座での挿入及び欠失率と比較して、zスコアによりスコア化した。10以上のzスコア、少なくとも200×のカバー率及び少なくとも5つの支持読み取りを有するindelを保持した。
1. Li, H. & Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 25, 1754-60 (2009)
2. Larson, D.E. et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics 28, 311-7 (2012)
3. Koboldt, D.C. et al. VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res 22, 568-76 (2012)
4. Li, H. et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 25, 2078-9 (2009)
5. Ye, K., Schulz, M.H., Long, Q., Apweiler, R. & Ning, Z. Pindel: a pattern growth approach to detect break points of large deletions and medium sized insertions from paired-end short reads. Bioinformatics 25, 2865-71 (2009)
6. Shah, S.P. et al. The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers. Nature 486, 395-9 (2012)
7. Forshew, T. et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci Transl Med 4, 136ra68 (2012)
1. Chin, L., Andersen, J.N. & Futreal, P.A. Cancer genomics: from discovery science to personalized medicine. Nat Med 17, 297-303 (2011)
2. Gerlinger, M. et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 366, 883-92 (2012)
3. Jones, S. et al. Comparative lesion sequencing provides insights into tumor evolution. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 4283-8 (2008)
4. Nik-Zainal, S. et al. The life history of 21 breast cancers. Cell 149, 994-1007 (2012)
5. Vogelstein, B. et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. N Engl J Med 319, 525-32 (1988)
6. Goh, X.Y. et al. Integrative analysis of array-comparative genomic hybridisation and matched gene expression profiling data reveals novel genes with prognostic significance in oesophageal adenocarcinoma. Gut 60, 1317-26 (2011)
7. Quante, M. et al. Bile acid and inflammation activate gastric cardia stem cells in a mouse model of Barrett-like metaplasia. Cancer Cell 21, 36-51 (2012)
8. Greaves, M. & Maley, C.C. Clonal evolution in cancer. Nature 481, 306-13 (2012)
9. Varghese, S., Lao-Sirieix, P. & Fitzgerald, R.C. Identification and clinical implementation of biomarkers for Barrett's esophagus. Gastroenterology 142, 435-441 e2 (2012)
10. Dulak, A.M. et al. Gastrointestinal Adenocarcinomas of the Esophagus, Stomach, and Colon Exhibit Distinct Patterns of Genome Instability and Oncogenesis. Cancer Res (2012)
11. Dulak, A.M. et al. Exome and whole-genome sequencing of esophageal adenocarcinoma identifies recurrent driver events and mutational complexity. Nat Genet 45, 478-86 (2013)
12. Agrawal, N. et al. Comparative genomic analysis of esophageal adenocarcinoma and squamous cell carcinoma. Cancer Discov (2012)
13. Corley, D.A. et al. Impact of Endoscopic Surveillance on Mortality From Barrett's Esophagus-Associated Esophageal Adenocarcinomas. Gastroenterology 145, 312-319 e1 (2013)
14. Shaheen, N.J. & Hur, C. Garlic, Silver Bullets, and Surveillance Upper Endoscopy for Barrett's Esophagus. Gastroenterology 145, 273-6 (2013)
15. Hayes, D.F. et al. Breaking a vicious cycle. Sci Transl Med 5, 196cm6 (2013)
16. Nik-Zainal, S. et al. Mutational processes molding the genomes of 21 breast cancers. Cell 149, 979-93 (2012)
17. Fujimoto, A. et al. Whole-genome sequencing of liver cancers identifies etiological influences on mutation patterns and recurrent mutations in chromatin regulators. Nat Genet 44, 760-4 (2012)
18. Bass, A.J. et al. Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion. Nat Genet 43, 964-8 (2011)
19. Streppel, M.M. et al. Next-generation sequencing of endoscopic biopsies identifies ARID1A as a tumor-suppressor gene in Barrett's esophagus. Oncogene (2013)
20. Curvers, W.L. et al. Low-grade dysplasia in Barrett's esophagus: overdiagnosed and underestimated. Am J Gastroenterol 105, 1523-30 (2010)
21. Wang, K. et al. Exome sequencing identifies frequent mutation of ARID1A in molecular subtypes of gastric cancer. Nat Genet 43, 1219-23 (2011)
22. Jones, S. et al. Frequent mutations of chromatin remodeling gene ARID1A in ovarian clear cell carcinoma. Science 330, 228-31 (2010)
23. Reid, B.J., Li, X., Galipeau, P.C. & Vaughan, T.L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat Rev Cancer 10, 87-101 (2010)
24. Kadri, S.R. et al. Acceptability and accuracy of a non-endoscopic screening test for Barrett's oesophagus in primary care: cohort study. BMJ 341, c4372 (2010)
25. Lao-Sirieix, P. et al. Non-endoscopic screening biomarkers for Barrett's oesophagus: from microarray analysis to the clinic. Gut 58, 1451-9 (2009)
26. Forshew, T. et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci Transl Med 4, 136ra68 (2012)
27. Dawson, S.J. et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N Engl J Med 368, 1199-209 (2013)
28. Theisen, J. et al. Preoperative chemotherapy unmasks underlying Barrett's mucosa in patients with adenocarcinoma of the distal esophagus. Surg Endosc 16, 671-3 (2002)
29. Bhat, S. et al. Risk of malignant progression in Barrett's esophagus patients: results from a large population-based study. J Natl Cancer Inst 103, 1049-57 (2011)
30. Nowell, P.C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science 194, 23-8 (1976)
31. Mutter, G.L. et al. Molecular identification of latent precancers in histologically normal endometrium. Cancer Res 61, 4311-4 (2001)
32. Kinde, I.et al. Evaluation of DNA from the Papanicolaou test to detect ovarian and endometrial cancers. Sci Transl Med 5, 167ra4 (2013)
33. Maley, C.C. et al. Genetic clonal diversity predicts progression to esophageal adenocarcinoma. Nat Genet 38, 468-73 (2006)
ここに、我々は、感度及び特異性に対する異なるバイオマーカーの組合せの効果を示す統計解析を詳細に示す。データは非常に良好であるように見受けられ、4つのバイオマーカーをアッセイすることは、確実に有利である。2つの表が以下にあり、1つは高度異形成のみについてであり、1つは任意の異形成についてである。
LGD=軽度異形成 HGD/IMC=高度異形成/粘膜内癌
Bian, Y.S., Osterheld, M.C., Bosman, F.T., Benhattar, J., and Fontolliet, C. (2001). p53 gene mutation and protein accumulation during neoplastic progression in Barrett's esophagus. Mod Pathol 14, 397-403
Eads, C.A., Danenberg, K.D., Kawakami, K., Saltz, L.B., Blake, C., Shibata, D., Danenberg, P.V., and Laird, P.W. (2000). MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation. Nucleic Acids Res 28, E32
Eads, C.A., Lord, R.V., Wickramasinghe, K., Long, T.I., Kurumboor, S.K., Bernstein, L., Peters, J.H., DeMeester, S.R., DeMeester, T.R., Skinner, K.A., et al. (2001). Epigenetic patterns in the progression of esophageal adenocarcinoma. Cancer Res 61, 3410-3418
Kadri, S.R., Lao-Sirieix, P., O'Donovan, M., Debiram, I., Das, M., Blazeby, J.M., Emery, J., Boussioutas, A., Morris, H., Walter, F.M., et al. (2010). Acceptability and accuracy of a non-endoscopic screening test for Barrett's oesophagus in primary care: cohort study. BMJ 341, c4372
Kastelein, F., Biermann, K., Steyerberg, E.W., Verheij, J., Kalisvaart, M., Looijenga, L.H., Stoop, H.A., Walter, L., Kuipers, E.J., Spaander, M.C., et al. (2012). Aberrant p53 protein expression is associated with an increased risk of neoplastic progression in patients with Barrett's oesophagus. Gut
Kaye, P.V., Haider, S.A., Ilyas, M., James, P.D., Soomro, I., Faisal, W., Catton, J., Parsons, S.L., and Ragunath, K. (2009). Barrett's dysplasia and the Vienna classification: reproducibility, prediction of progression and impact of consensus reporting and p53 immunohistochemistry. Histopathology 54, 699-712
Kaye, P.V., Haider, S.A., James, P.D., Soomro, I., Catton, J., Parsons, S.L., Ragunath, K., and Ilyas, M. (2010). Novel staining pattern of p53 in Barrett's dysplasia--the absent pattern. Histopathology 57, 933-935
Lao-Sirieix, P., Brais, R., Lovat, L., Coleman, N., and Fitzgerald, R.C. (2004). Cell cycle phase abnormalities do not account for disordered proliferation in Barrett's carcinogenesis. Neoplasia 6, 751-760
Lao-Sirieix, P., Lovat, L., and Fitzgerald, R.C. (2007). Cyclin A immunocytology as a risk stratification tool for Barrett's esophagus surveillance. Clin Cancer Res 13, 659-665
Miller, C.T., Moy, J.R., Lin, L., Schipper, M., Normolle, D., Brenner, D.E., Iannettoni, M.D., Orringer, M.B., and Beer, D.G. (2003). Gene amplification in esophageal adenocarcinomas and Barrett's with high-grade dysplasia. Clin Cancer Res 9, 4819-4825
Rugge, M., Fassan, M., Zaninotto, G., Pizzi, M., Giacomelli, L., Battaglia, G., Rizzetto, C., Parente, P., and Ancona, E. (2010). Aurora kinase A in Barrett's carcinogenesis. Hum Pathol 41, 1380-1386
Rygiel, A.M., Milano, F., Ten Kate, F.J., Schaap, A., Wang, K.K., Peppelenbosch, M.P., Bergman, J.J., and Krishnadath, K.K. (2008). Gains and amplifications of c-myc, EGFR, and 20.q13 loci in the no dysplasia-dysplasia-adenocarcinoma sequence of Barrett's esophagus. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 17, 1380-1385
Schulmann, K., Sterian, A., Berki, A., Yin, J., Sato, F., Xu, Y., Olaru, A., Wang, S., Mori, Y., Deacu, E., et al. (2005). Inactivation of p16, RUNX3, and HPP1 occurs early in Barrett's-associated neoplastic progression and predicts progression risk. Oncogene 24, 4138-4148
Sikkema, M., Kerkhof, M., Steyerberg, E.W., Kusters, J.G., van Strien, P.M., Looman, C.W., van Dekken, H., Siersema, P.D., and Kuipers, E.J. (2009). Aneuploidy and overexpression of Ki67 and p53 as markers for neoplastic progression in Barrett's esophagus: a case-control study. Am J Gastroenterol 104, 2673-2680
Skacel, M., Petras, R.E., Rybicki, L.A., Gramlich, T.L., Richter, J.E., Falk, G.W., and Goldblum, J.R. (2002). p53 expression in low grade dysplasia in Barrett's esophagus: correlation with interobserver agreement and disease progression. Am J Gastroenterol 97, 2508-2513
56.Zhou, H., Kuang, J., Zhong, L., Kuo, W.L., Gray, J.W., Sahin, A., Brinkley, B.R., and Sen, S. (1998). Tumour amplified kinase STK15/BTAK induces centrosome amplification, aneuploidy and transformation. Nat Genet 20, 189-193
Claims (22)
- 対象の食道の表面異常の検出を補助する方法であって、前記表面異常が、軽度異形成(LGD)、高度異形成(HGD)、無症候性食道腺癌(OAC)及び粘膜内癌(IMC)からなる群から選択され、前記方法が、
a)前記対象からの細胞の試料を提供するステップであって、前記試料が、前記対象の食道の表面から回収された細胞を含む、ステップと、
b)前記細胞を、少なくとも以下の(i)〜(iv)のマーカーについてアッセイするステップと
を含み、
前記マーカーの異常レベルの検出が、前記対象の食道の表面異常の可能性が増加していることを意味する、前記方法。
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA又はPLK1;並びに
(iv)MyoD遺伝子のメチル化、及びRunx3遺伝子のメチル化; - ステップ(b)が、
(1)細胞を、
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA又はPLK1;並びに
(iv)MyoD遺伝子のメチル化、及びRunx3遺伝子のメチル化;
から選択される少なくとも第1の分子マーカーを検出するための試薬と接触させることと、
(2)前記細胞を、(i)〜(iv)から選択される少なくとも第2の分子マーカーを検出するための試薬と接触させることと
を含む、請求項1に記載の方法。 - (iii)のマーカーが、AURKAである、請求項1又は2に記載の方法。
- アッセイするマーカーが、(i)〜(iv)のマーカーのみである、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 細胞を非定型性についてアッセイするステップをさらに含み、前記非定型性が、ウィーンスケールに従って細胞をその形態についてスコア化することにより評価される、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 細胞が、食道の表面の不偏サンプリングにより回収される、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 細胞が、カプセルスポンジを用いて回収される、請求項6に記載の方法。
- 細胞が、分子マーカーを検出するための試薬と接触させる前に、(i)前記細胞を遠心分離によりペレットにするステップと、(ii)前記細胞を血漿に再懸濁するステップと、(iii)トロンビンを加え、血餅が形成されるまでインキュベーションするステップとに
より調製される、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 - p53が、免疫組織化学により評価される、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- p53が、1又は2以上のp53変異の検出により評価される、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- p53が、免疫組織化学により評価され、p53が、1又は2以上のp53変異の検出によっても評価される、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 処置レジメンを選択するためのアッセイであって、
a)対象からの細胞の試料を提供するステップであって、前記試料が、前記対象の食道の表面から回収された細胞を含む、ステップと、
b)前記細胞を、少なくとも以下の(i)〜(iv)のマーカーについてアッセイするステップと
を含み、
前記マーカーの異常レベルが検出された場合に、内視鏡検査及び生検の処置レジメンを選択する必要性が高いことを示す、前記アッセイ。
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA;並びに
(iv)MyoD遺伝子のメチル化、及びRunx3遺伝子のメチル化; - アッセイするマーカーが、(i)〜(iv)のマーカーのみである、請求項12に記載のアッセイ。
- (a)対象からの食道試料を分析するように構成される装置又はシステムであって、前記分析が、
(b)細胞を、少なくとも以下の(i)〜(iv)のマーカーについてアッセイするステップを含み、
前記装置又はシステムが出力モジュールを含み、
前記マーカーの異常レベルが検出された場合に、前記出力モジュールが、前記対象につい
ての食道における表面異常の可能性が増加していることを示し、前記表面異常が、軽度異形成(LGD)、高度異形成(HGD)、無症候性食道腺癌(OAC)及び粘膜内癌(IMC)からなる群から選択される、前記装置又はシステム。
(i)p53;
(ii)c−Myc;
(iii)AURKA;並びに
(iv)MyoD遺伝子のメチル化、及びRunx3遺伝子のメチル化; - アッセイするマーカーが、(i)〜(iv)のマーカーのみである、請求項14に記載の装置又はシステム。
- 対象の食道の表面異常の検出の補助に関する用途のための、あるポリペプチド;及びある核酸配列のメチル化;を認識するか、それに結合するか又は親和性を有する物質の使用であって、前記表面異常が、軽度異形成(LGD)、高度異形成(HGD)、無症候性食道腺癌(OAC)及び粘膜内癌(IMC)からなる群から選択され、
前記あるポリペプチドが、少なくとも以下の(i)〜(iii)のマーカーを含み、
前記ある核酸配列のメチル化が、少なくとも以下の(iv)のマーカーを含む、
前記使用。
(i)p53;
(ii)c−Myc;及び
(iii)AURKA又はPLK1;
(iv)MyoD遺伝子のメチル化、及びRunx3遺伝子のメチル化; - 物質が、組み合わせて使用される、請求項16に記載の使用。
- あるポリペプチドが、(i)〜(iii)のマーカーのみであり、ある核酸配列のメチル
化が、(iv)のマーカーのみである、請求項16又は17に記載の使用。 - 対象の食道の表面異常の検出の補助における使用のためのアッセイデバイスであって、前記表面異常が、軽度異形成(LGD)、高度異形成(HGD)、無症候性食道腺癌(OAC)及び粘膜内癌(IMC)からなる群から選択され、前記アッセイデバイスが、あるポリペプチド;及びある核酸配列のメチル化;を認識するか、それに結合するか又は親和性を有する物質を含有する場所を有する固体基材を含み、
前記あるポリペプチドが、少なくとも以下の(i)〜(iii)のマーカーを含み、
前記ある核酸配列のメチル化が、少なくとも以下の(iv)のマーカーを含む、
前記アッセイデバイス。
(i)p53;
(ii)c−Myc;及び
(iii)AURKA又はPLK1;
(iv)MyoD遺伝子のメチル化、及びRunx3遺伝子のメチル化; - あるポリペプチドが、(i)〜(iii)のマーカーのみであり、ある核酸配列のメチル
化が、(iv)のマーカーのみである、請求項19に記載のアッセイデバイス。 - 生体試料中の
少なくとも以下の(i)〜(iii)のマーカーの発現レベルを決定するための試薬と、
少なくとも以下の(iv)のマーカーを決定するための試薬とを含む、
対象の食道の表面異常の検出用キット。
(i)p53;
(ii)c−Myc;及び
(iii)AURKA;
(iv)MyoD遺伝子のメチル化、及びRunx3遺伝子のメチル化; - マーカーが、(i)〜(iv)のマーカーのみである、請求項21に記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1303078.8 | 2013-02-21 | ||
GBGB1303078.8A GB201303078D0 (en) | 2013-02-21 | 2013-02-21 | Methods |
PCT/GB2014/050484 WO2014128460A2 (en) | 2013-02-21 | 2014-02-19 | Methods |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016509228A JP2016509228A (ja) | 2016-03-24 |
JP2016509228A5 JP2016509228A5 (ja) | 2016-08-18 |
JP6405322B2 true JP6405322B2 (ja) | 2018-10-17 |
Family
ID=48091867
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015558546A Active JP6405322B2 (ja) | 2013-02-21 | 2014-02-19 | 方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20160003827A1 (ja) |
EP (1) | EP2959298B1 (ja) |
JP (1) | JP6405322B2 (ja) |
CN (1) | CN105264379B (ja) |
AU (1) | AU2014220484B2 (ja) |
CA (1) | CA2901150C (ja) |
GB (1) | GB201303078D0 (ja) |
HK (1) | HK1218781A1 (ja) |
WO (1) | WO2014128460A2 (ja) |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2001253088A1 (en) * | 2000-03-31 | 2001-10-15 | University Of Southern California | Epigenetic sequences for esophageal adenocarcinoma |
GB0521521D0 (en) * | 2005-10-21 | 2005-11-30 | Medical Res Council | Diagnostic methods and kits |
JP4419990B2 (ja) * | 2006-06-20 | 2010-02-24 | トヨタ紡織株式会社 | 車両室内用照明装置 |
AU2008310704B2 (en) * | 2007-10-11 | 2014-03-20 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of esphageal adenocarcinomas |
EP2382210B1 (en) * | 2008-12-30 | 2017-03-01 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Pyrimidinediamine kinase inhibitors |
GB0920014D0 (en) * | 2009-11-13 | 2009-12-30 | Medical Res Council | Cell sampling device |
US8709736B2 (en) * | 2010-07-09 | 2014-04-29 | Medical Research Council | Biomarker for Barrett's Oesophagus |
AU2012229102B2 (en) * | 2011-03-17 | 2016-02-04 | Cernostics, Inc. | Systems and compositions for diagnosing Barrett's esophagus and methods of using the same |
-
2013
- 2013-02-21 GB GBGB1303078.8A patent/GB201303078D0/en not_active Ceased
-
2014
- 2014-02-19 EP EP14706672.4A patent/EP2959298B1/en active Active
- 2014-02-19 CN CN201480010049.3A patent/CN105264379B/zh active Active
- 2014-02-19 AU AU2014220484A patent/AU2014220484B2/en active Active
- 2014-02-19 WO PCT/GB2014/050484 patent/WO2014128460A2/en active Application Filing
- 2014-02-19 CA CA2901150A patent/CA2901150C/en active Active
- 2014-02-19 US US14/768,740 patent/US20160003827A1/en not_active Abandoned
- 2014-02-19 JP JP2015558546A patent/JP6405322B2/ja active Active
-
2016
- 2016-06-13 HK HK16106771.4A patent/HK1218781A1/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2959298A2 (en) | 2015-12-30 |
CA2901150A1 (en) | 2014-08-28 |
CN105264379A (zh) | 2016-01-20 |
JP2016509228A (ja) | 2016-03-24 |
AU2014220484A1 (en) | 2015-08-13 |
CA2901150C (en) | 2022-07-12 |
WO2014128460A3 (en) | 2014-11-06 |
AU2014220484B2 (en) | 2020-01-30 |
WO2014128460A2 (en) | 2014-08-28 |
GB201303078D0 (en) | 2013-04-10 |
EP2959298B1 (en) | 2018-09-05 |
US20160003827A1 (en) | 2016-01-07 |
HK1218781A1 (zh) | 2017-03-10 |
CN105264379B (zh) | 2017-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Samandari et al. | Liquid biopsies for management of pancreatic cancer | |
Birkenkamp-Demtröder et al. | Genomic alterations in liquid biopsies from patients with bladder cancer | |
Catenacci et al. | Acquisition of portal venous circulating tumor cells from patients with pancreaticobiliary cancers by endoscopic ultrasound | |
Le Calvez-Kelm et al. | KRAS mutations in blood circulating cell-free DNA: a pancreatic cancer case-control | |
US10551392B2 (en) | Biomarker for barrett's oesophagus | |
BR112020023587A2 (pt) | método para determinar um perfil de fragmentação de dna livre de células (cfdna), método para identificar um mamífero como tendo câncer, método de identificação do tecido de origem de um câncer e método para tratar um mamífero com câncer | |
ES2691404T3 (es) | Diagnóstico no invasivo del cáncer | |
Leja et al. | Early detection of gastric cancer beyond endoscopy-new methods | |
CN107034295A (zh) | 用于癌症早期诊断和危险度评价的dna甲基化指标及其应用 | |
JP2023527868A (ja) | 遺伝子マーカー組成物及びその使用 | |
Rose et al. | Circulating and urinary tumour DNA in urothelial carcinoma—upper tract, lower tract and metastatic disease | |
Han et al. | Methods for detection of circulating cells in non-small cell lung cancer | |
Katz‐Summercorn et al. | Application of a multi‐gene next‐generation sequencing panel to a non‐invasive oesophageal cell‐sampling device to diagnose dysplastic Barrett's oesophagus | |
JP6405322B2 (ja) | 方法 | |
US20130260384A1 (en) | Method for determining cancer prognosis and prediction with cancer stem cell associated genes | |
Zhao et al. | Off the fog to find the optimal choice: Research advances in biomarkers for early diagnosis and recurrence monitoring of bladder cancer | |
Sanganeria et al. | Molecular Diagnostics in Renal Cancer | |
ES2820732T3 (es) | Marcadores de metilación de ADN no sesgados que definen un defecto de campo amplio en tejidos de próstata histológicamente normales asociados al cáncer de próstata: nuevos biomarcadores para hombres con cáncer de próstata | |
JP2018139537A (ja) | 食道がんのリンパ節転移可能性のデータ取得方法 | |
Abdulmajed et al. | What are the currently available and in development molecular markers for bladder cancer? Will they prove to be useful in the future? | |
WO2017051542A1 (ja) | 治療法の選択方法およびそれを示すバイオマーカー | |
EP2850208B1 (en) | Method for determining if a subject has an increased likelihood of high grade dysplasia or esophagal adenocarcinoma | |
Ribeiro | The Contribution of Endoscopic Ultrasound and Biomarkers in the Management of Pancreatic Adenocarcinoma and its Precursor Lesions | |
da Rocha | Cell-free DNA methylation as a biomarker for early detecting the four major cancers | |
AHANIDI et al. | ASSESSMENT OF MOLECULAR BIOMARKERS FOR BLADDER CANCER DIAGNOSIS, GRADING AND PROGNOSIS |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160629 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20161205 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20170913 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170925 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171220 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180605 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180802 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180820 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180914 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6405322 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |