CN105264379B - 测定细胞标志物的试剂盒、装置及用途 - Google Patents

测定细胞标志物的试剂盒、装置及用途 Download PDF

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Abstract

本文涉及一种帮助检测在受试者的食管中的表面异常的方法，其中所述表面异常选自低度发育不良(LGD)、高度发育不良(HGD)、无症状食管腺癌(OAC)和粘膜内癌(IMC)，所述方法包括：a)提供来自所述受试者的细胞样品，其中所述样品包含收集自受试者的食管表面的细胞；b)测定所述细胞至少2个标记物，其中所述标记物选自(i)p53、(ii)c‑Myc、(iii)AURKA或PLK1且优选为AURKA和(iv)MyoD和Runx3的甲基化；其中检测出至少2种所述标记物的异常水平时，则推断受试者具有食管中表面异常的增加的可能性。本发明还涉及某些试剂盒、装置和用途。

Description

测定细胞标志物的试剂盒、装置及用途
技术领域
本发明属于测试或帮助检测食管中的表面异常的领域。
背景技术
食管癌(OAC)目前是全球第八个最常见的癌症类型且其发病率在过去的三十年中上升了近5倍。
巴雷特食管是发展至OAC过程中的第一步，且元测定表明巴雷特食管使每年发展至腺癌的风险增加0.12-0.5％。当正常的食管细胞被腺细胞代替时，产生巴雷特食管，且随时间推移，其可能发展成低度不典型增生(LGD)、高度发育不良(HGD)，并且最终发展成腺癌。
OAC和/或其癌变前的前兆Barrett食管的早期诊断可改善病人的管理和OAC的预后。在已知的一种方法中，已开发出CytospongeTM细胞收集装置，例如在WO 2011/058316中所公开的。
此外，Fitzgerald等人已开发出使用TFF3作为分子标记物的测试，并将其作为检测巴雷特食管的临床筛选工具，例如在US20120009597中所公开的。
使用CytospongeTM(BEST1)的首次研究(Kadri等人，2010)表明，CytospongeTM测试是在初级护理环境下诊断Barrett食管的可行方法。
在本系统中，有症状的患者被送去进行内镜检查。内镜检查是一种侵入性过程，其需要高度训练有素的医师。对于患者而言，这也是一个不舒服的过程且可能需要镇静。当内镜伴随有活检时，患者在此过程中还具有一定程度的风险。在临床环境中，这是目前检测巴雷特食管和/或巴雷特相关的发育不良或癌症的唯一途径。
Rugge等人(2010，Human Pathology，41卷，1380-1386页)公开了巴雷特癌变中的极光激酶A(AURKA)。值得注意的是，TP53突变被认为是巴雷特腺癌的风险增加的标记物。从Barrett食管的长区段获得食管活检样品。10 个巴雷特腺癌中有9个都显示了AURKA的免疫染色。通过mRNA测定和微阵列研究检测AURKA的表达。作者得出结论：AURKA的过表达在巴雷特黏膜发展至癌的进程中发挥显著作用。作者的结论是，在更大的前瞻性研究中，需要进行进一步尝试验证AURKA IHC的表达是巴雷特粘膜患者的潜在的预后标记物。
Liu等人(2008，World Journal of Gastroenterology，14卷，7199-7207页)公开了一种用于不同肿瘤中Tp53、C-myc、CCND1基因过表达的组织阵列。对七种不同的肿瘤类型进行了检查，并基于核酸进行测定。所用样品具有已知的肿瘤。未教导检测方法。样品被福尔马林固定。
Agnese等人(2007，European Society for Medical Oncology，8卷6增刊vill0-vill5)公开了极光-A的过表达作为回流相关的柱状粘膜和Barrett食管的早期标记物。作者在巴雷特黏膜(柱状排列的食管/CLO)以及具有或不具有发育不良和p53阳性免疫染色的Barrett食管(BO)之间未发现AURKA mRNA表达的任何统计学显著的数量差异。
已研究了某些与Barrett食管相关的分子标记物。这些标记物已在纯研究环境中进行了研究。这些研究已经在体外组织样品中进行。这些标记物单独研究。目前，还没有此类分子标记物用于任何的巴雷特相关的异常的临床测试。
本领域有必要改善巴雷特相关的异常的检测。现有的测试昂贵、费力、具有侵入性且对经历测试的受试者具有风险。
本发明试图克服与现有技术相关的问题。
发明概述
某些分子标记物已经证明与巴雷特相关异常有关。已在组织活检中研究了这些标记物。在组织活检上使用分子标记物在实践上几乎不优于当前用于活检形态学检查的临床金标准。这是因为，以这种方式研究标记物仍需要收集活检，从而仍具有与现有技术中侵入性过程相关的每个缺点。更重要的是，在研究环境中所研究的单一标记物已显示出灵敏度不足和/或特异性不足，从而不被认为是有助于检测或诊断的强效标记物。
本发明人研究了大量的候选标记物，还研究了这些标记物的不同组合。 本发明人已获得一个小且明确的标记物组，其在组合测试时获得了临床可用的灵敏度和特异性分数。此外，本发明人研究了这些标记物在表面取样的细胞中的表现。例如，这些标记物的组合可用于测定来自食管的表面采样所收集的细胞，例如使用细胞收集装置如CytospongeTM所获得的细胞。
本发明人所教导的方法涉及之前未在临床试验中使用的标记物的新组合。此外，本发明人证明了当用于从食管的表面采样获得的细胞时，这些标记物可被应用并产生可靠的结果。总之，本发明方法的这些特征的优势包括强力且临床可用的风险评估，以及有利地避免了对通过活检进行的侵入性组织收集的需要。下文将详细描述本发明的这些和其它的优点。
因此，在宽泛的方面中，本发明提供了帮助检测受试者的食管中的表面异常的方法，所述方法包括：
a)提供来自所述受试者的细胞样品，其中所述样品包含收集自受试者的食管表面的细胞；
b)测定所述细胞的至少2个标记物，其中所述标记物选自
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA或PLK1，优选AURKA；
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；和
(v)非典型性，
其中检测出至少2种所述标记物的异常水平时，则推断受试者具有食管中的表面异常的增加的可能性。
在另一个方面中，本发明涉及帮助检测受试者的食管的表面异常的方法，其中所述表面异常选自低度发育不良(LGD)、高度发育不良(HGD)、无症状食管腺癌(OAC)和粘膜内癌(IMC)，所述方法包括：
a)提供来自所述受试者的细胞样品，其中所述样品包含收集自受试者的食管表面的细胞；
b)测定所述细胞的至少2个标记物，其中所述标记物选自
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(ⅲ)AURKA或PLK1，优选AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；
其中检测出至少2种所述标记物的异常水平时，则推断受试者具有食管中的表面异常的增加的可能性。
更合适地，在一个方面中，本发明提供了帮助检测受试者的食管中的表面异常的方法，所述方法包括：
a)提供来自所述受试者的细胞样品，其中所述样品包含收集自受试者的食管表面的细胞；
b)测定所述细胞的至少2个标记物，其中所述标记物选自
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA或PLK1，优选AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；
其中检测出至少2种所述标记物的异常水平时，则推断受试者具有食管中的表面异常的增加的可能性。
本文所述的标记物还提供有对各个标记物绝对打分的指导。这有利于向已经测定过的打分系统中引入参考标准/比较相。然而，如果需要的话，本发明可通过与参考标准相比较来进行，例如与来自健康(无食管异常)受试者的参考标准相比较。因此，在一个方面中，本发明提供了帮助检测受试者的食管中的表面异常的方法，所述方法包括：
a)提供来自所述受试者的细胞样品，其中所述样品包含收集自受试者的食管表面的细胞；
b)测定所述细胞的至少2个标记物，其中所述标记物选自
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(ⅲ)AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；
其中检测出至少2种所述标记物的相比于参考标准的异常水平时，则推断受试者具有食管中的表面异常的增加的可能性。
任选地，步骤(b)包括
(1)使所述细胞与用于检测至少第一分子标记物的试剂接触，其中第一分 子标记物选自：
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(ⅲ)AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；和
(2)使所述细胞与用于检测至少第二分子标记物的试剂接触和/或测定所述细胞的非典型性，其中第二分子标记物选自(i)至(iv)。
更适合地，步骤(b)包括
(1)使所述细胞与用于检测至少第一分子标记物的试剂接触，其中第一分子标记物选自：
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；和
(2)使所述细胞与用于检测至少第二分子标记物的试剂接触，其中第二分子标记物选自(i)至(iv)。
任选地，所述表面异常选自低度发育不良(LGD)、高度发育不良(HGD)、无症状食管腺癌(OAC)和粘膜内癌(IMC)。这些都具有呈“腺状”(“柱状”)的性质。这些都具有“巴雷特”的性质。这些都是发育不良。这些都不是鳞状的。
合适地，本发明不涉及鳞状细胞发育不良。
合适地，本发明不涉及鳞状细胞癌。
合适地，所述表面异常不是鳞状细胞异常。
任选地，所述表面异常选自由低度发育不良(LGD)、高度发育不良(HGD)和粘膜内癌(IMC)组成的组。
任选地，所述表面异常选自低度发育不良(LGD)和高度发育不良(HGD)。
任选地，所述表面异常选自无症状食管腺癌(OAC)和粘膜内癌(IMC)。
任选地，所述表面异常是低度发育不良(LGD)。
任选地，所述表面异常是高度发育不良(HGD)。
任选地，所述表面异常是无症状食管腺癌(OAC)。
任选地，所述表面异常是粘膜内癌(IMC)。
任选地，测定到少3个所述标记物的异常水平。
任选地，测定到少4个所述标记物的异常水平。
任选地，测定到各个所述标记物的异常水平。
任选地，通过食管表面的无偏采样收集所述细胞。
任选地，所述细胞使用胶囊海绵(capsule sponge)收集。
任选地，在与检测分子标记物的试剂相接触之前，通过如下步骤制备细胞：(i)通过离心沉淀细胞，(ii)将细胞重悬在血浆中，和(iii)加入凝血酶并孵育直至形成凝块。任选地，制备进一步包括以下步骤：在福尔马林中孵育所述凝块，加工成石蜡块(paraffinblock)，并切成适合于显微镜检查的切片。
任选地，p53是通过免疫组化进行评估。
任选地，在核酸水平评估p53。任选地，评估(例如检测)p53突变状态。任选地，通过测序评估(例如检测)p53突变。适当地，当在核酸水平检测p53时，“检测到异常水平”是指检测到p53突变。换言之，检测到p53突变本身被认为是异常的p53或p53的异常水平。在核酸水平评估p53具有消除或减少主观性的优势，而主观性可出现在评估染色水平例如p53的蛋白水平时。
适当地，检测p53基因中任何位点的p53突变。这样具有优势的原因在于突变可遍及整个基因。更适当地，检测DNA结合结构域中的突变。这些是最常见的突变。适当地，所述实验能够检测整个基因上的突变。如果需要进一步指导，可详细参见实施例10。
适当地，检测到p53无义突变时，检测到p53突变。适当地，检测到p53错义突变时，检测到p53突变。适当地，检测到p53缺失突变时，检测到p53突变。适当地，检测到p53INDEL变体突变时，检测到p53突变。
适当地，p53突变是实施例10中所提及的一种。
适当地，p53突变在p53的DNA结合结构域中。
任选地，在核酸和蛋白质水平评估p53。这样带来的优势是能捕获不能由蛋白测定检测出的任何突变(例如不影响p53表达/检测的p53突变)，并且还能捕获(即通过蛋白测定)影响p53表达的任何非-p53改变(例如p53之外的基因上的突变)。
适当地，通过检测一个或多个p53突变评估p53。
适当地，通过免疫组化评估p53，还通过检测一个或多个p53突变评估p53。
任选地，通过免疫组化评估cMyc。
任选地，通过免疫组化评估AURKA。
应注意，AURKA是本发明的一个优选的标记物。然而，应当理解的是，标记物PLK1也具有良好的灵敏度(91％)和良好的特异性(88％)。排除这种生物标记物而偏好AURKA的原因是AURKA具有更高的灵敏度(93％)和特异性(94％)数据(参见实施例)。然而，发明人教导，AURKA或PLK1的过表达基本上检测了相同的情况。因此，在本发明的实施方式中，PLK1可以代替AURKA来进行测试(或被额外测定)。因此，适当地，测定AURKA或PLK1，优选AURKA。
任选地，通过MethyLight测定评估MyoD/Runx3的甲基化。
任选地，通过Vienna标准按其形态对细胞进行评分来评估非典型性(atypia)。适当地，Vienna标准示于Schlemper等人2007Gut 2000；47：251-255。
在另一个方面中，本发明涉及一种如上所述的方法，其中所述方法的步骤(b)之前是测定所述细胞的TFF3的步骤。
在另一个方面中，本发明涉及用于选择治疗方案的测定，所述测定包括
a)提供来自所述受试者的细胞样品，其中所述样品包含收集自受试者的食管表面的细胞；
b)测定所述细胞的至少2个标记物，其中所述标记物选自
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；
其中如果检测到至少2个所述标记物水平异常，则选择内镜和活检的治疗方案。
在另一个方面中，本发明涉及一种装置或系统，其
(a)经配置用以测定来自受试者的食管样品，其中所述分析包括
(b)测定所述细胞的至少2个标记物，其中所述标记物选自
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；
所述装置或系统包括输出模块，
其中，如果检测到至少2个所述标记物水平异常，则所述输出模块指示在所述受试者的食管中有表面异常的增加的可能性。
在另一个方面中，本发明涉及用于受试者食管中的表面异常的，或者识别、结合某些多肽或某些核酸序列的甲基化或对其具有亲和力的物质的帮助检测的应用的用途，其中所述多肽和/或核酸序列如上所定义，例如p53、c-Myc、AURKA、Runx3/MyoDl的甲基化。在另一个方面中，本发明涉及组合物质的此类用途，其中所述物质均分别识别、结合一种或多种所述多肽或核酸序列或对一种或多种所述多肽或核酸序列具有亲和力。
在另一个方面中，本发明涉及用于帮助检测受试者食管中的表面异常的测定装置，其包含固体基板，所述基板具有含有物质的位置，所述物质识别、结合某些多肽或某些核酸序列的甲基化或对其具有亲和力，其中所述多肽和/或核酸序列如上所定义，例如p53、c-Myc、AURKA、Runx3/MyoDl的甲基化。
在另一个方面中，本发明涉及一种试剂盒，其包含用于测定各个以下物质在生物样品中的表达水平的试剂：
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA；
并且任选地，进一步包含用于测定MyoD和Runx3甲基化的试剂。
在另一个方面中，本发明涉及一种用于帮助检测受试者食管中的表面异常的方法，所述方法包括提供来自所述受试者的细胞样品，其中所述样品包含收集自受试者食管表面的细胞，测定所述细胞的TFF3，其中如果在样品的细胞中检测TFF3，则进行如上所述的方法，其中当除了检测到TFF3之外还检测到至少1个标记物水平异常，则表明所述受试者的食管中表面异常的增加的可能性。
在另一个方面中，本发明涉及用于帮助检测受试者食管中的表面异常的 方法，所述方法包括
(a)提供来自所述受试者的细胞的样品，其中所述样品包含收集自受试者食管表面的细胞，测定所述细胞的TFF3，其中如果在所述样品的细胞中检测到TFF3，则执行如下的额外步骤：
(b)测定所述细胞的至少2个标记物，其中所述标记物选自
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；
其中除了检测到TFF3之外还检测到至少1个标记物水平异常时，则表明受试者的食管中表面异常的增加的可能性。任选地，除了检测到TFF3之外还检测到至少2个标记物水平异常，优选地除了检测到TFF3之外还检测到至少3个标记物水平异常，优选地除了检测到TFF3之外还检测到至少4个标记物水平异常，优选地除了检测到TFF3之外还检测到每个标记物水平异常，则表明所述受试者的食管中表面异常的增加的可能性。任选地，通过食管表面的无偏采样收集所述细胞。任选地，使用胶囊海绵收集所述细胞。
在另一个方面中，本发明涉及收集用于检测食管异常的信息的方法，所述方法包括进行如上所述的步骤。
在另一个方面中，本发明涉及收集用于帮助诊断食管异常的信息的方法，所述方法包括进行如上所述的步骤。
在另一个方面中，本发明涉及包括诊断食管异常的方法，所述方法进行如上所述的步骤。
在另一个方面中，本发明涉及帮助诊断食管异常的方法，所述方法包括进行如上所述的步骤。
在另一个方面中，本发明涉及评估一种食管异常的风险的方法，所述方法包括进行如上所述的步骤。
在另一个方面中，本发明涉及评估多种食管异常的风险的方法，所述方法包括进行如上所述的步骤。
任选地，所述异常是发育不良。任选地，所述异常是LGD、HGD、IMC或无症状OAC。
在另一个方面中，本发明涉及用于帮助检测受试者食管中的表面异常的方法，其中所述表面异常是食管腺癌(OAC)，所述方法包括提供来自受试者的细胞的样品，其中所述样品包含收集自受试者食管表面的细胞，测定所述细胞的SMAD4，其中如果在样品的细胞中检测到SMAD4，则表明在所述受试者的食管中具有食管腺癌(OAC)的增加的可能性。
发明详述
本发明发现了在评估受试者具有发育不良的风险中的具体应用。目前，发育不良的评估仅在收集自受试者的活检中进行。根据本发明，可以通过如本文所述的方法来评估受试者具有发育不良(如LGD、HGD、IMC中的一个或多个；任选地还包括无症状OAC)的风险。这些方法有利地避免了活检。合适地，本发明的方法明确排除了活检。有利地，本发明的方法仅需要食管的表面采样(或来自食管表面的体外样品)，从而避免了活检和/或内镜。
因此，本发明的一个关键部分是使用标记物组来评估受试者具有发育不良(如LGD、HGD或IMC中的一个或多个)的风险。
更通常地，OAC被认为是一种侵入形式的疾病；通常，患有OAC的患者已显示出症状；通常，本发明的方法是用于筛选或监控应用和用于风险评估应用，而不是用于快速诊断(例如)OAC。通常使用不同的算法诊断侵入性OAC，而这不是本发明的一部分。然而，可以通过本发明的方法以与LGD/HGD/IMC(或更准确地LGD/HGD/IMC的升高的风险)相同的方式，来检测无症状OAC(或更准确地无症状OAC的升高的风险)。这已由本发明人实施。本发明以如本文所述的方式应用。所述方法的应用的结果是受试者具有异常/发育不良的更高风险的指示。根据本发明，由于发现更高的风险，受试者被推荐接受内镜/活检。内镜/活检揭示了无症状OAC。随后对患者进行适当的治疗。因此，本发明可用于评估异常/发育不良(其可以包括无症状OAC)的风险，但本发明并非旨在提供OAC的明确诊断的诊断工具。
受试者/患者组
适当地，本发明的方法用于任何受试者。适当地，本发明的方法用于疑似患有巴雷特食管的任何受试者。这些应用可用于筛选整个群体。
更适当地，本发明的方法/组发现了在不知道患有癌但可能被监控或随访巴雷特食管的受试者或患者中的应用。
更适当地，本发明的方法用于患有巴雷特食管的任何受试者。
本发明的方法有助于评估已患有巴雷特食管的受试者中的发展风险或其患有LGD/HGD/IMC的风险，这是本发明的一个重要的益处。
本发明的组并非旨在检测巴雷特食管，但其旨在评估患有发育不良的风险。评估患有巴雷特食管通常使用已确定的巴雷特食管的TFF3标记物来进行，或可以通过用于诊断巴雷特食管的任何合适的方法来进行。
巴雷特食管的一个关键的标记物是TFF3标记物，即表面采样的细胞上TFF3呈阳性，所述细胞来自例如胶囊海绵如CytospongeTM。此类受试者可被证明没有发育不良、具有低度发育不良、高度发育不良或对于发育不良不确定。也有可能是患者可能患有未诊断出的浅表粘膜内癌。然而，本发明的主要益处是从已患有巴雷特食管的起点评估患有发育不良的风险。当然，本发明的组/方法可以作为常规筛选工具用于无症状受试者，但这可能不经济(即使其必然非常有效)。因此，出于经济和实际原因，本发明发现了其最好的应用是在已有发育不良风险的受试者(即已患有巴雷特食管的那些患者)的筛选中。
适当地，受试者患有巴雷特食管。
适当地，在表面采样的食管细胞中，受试者测试为TFF3阳性。
在一个实施方式中，本发明的测试(组)之前可能是针对TFF3的测试。这可作为一种有效的内部对照。如果受试者已知患有巴雷特食管，则其表面采样的细胞应测试呈TFF3阳性。因此，如果已知患有巴雷特食管的受试者的食管的表面样品测试呈TFF3阴性，这将表明此样品是不充足的(例如，细胞不充足，或缺少柱状细胞或一些其它的问题)。推荐对受试者的食管表面重新采样并针对TFF3重新测试，并仅使用本发明的组进行测试，一旦观察到TFF3呈阳性结果，则表明是巴雷特食管患者的可靠的/强力的样品。
除其它事项外，本发明人还设计了BEST2，这是一个目的在于募集1,000名患者的多中心、前瞻性事件和对照研究，用以测试用于诊断巴雷特食管的CytospongeTM的性能特征(与内镜相比较)。此外，在BEST2中，一组风险分层生物标记物在CytospongeTM上进行评价以根据发育不良的内镜等级确定其对 患者风险分层的能力。一组风险分层生物标记物由四个不同的生物标记物组成，即p53蛋白水平、c-Myc蛋白水平、极光激酶A(AURKA)蛋白水平以及Runt相关转录因子3(RUNX3)和成肌分化1(MYOD1)基因的启动子区域的甲基化。任选地，所述组可进一步包括第五个标记物，即非典型性。
样品和样品收集
适当地，样品包括来自目标受试者的细胞。适当地，样品包括来自目标受试者的食道细胞。适当地，样品是非内镜的，即适当地，不使用内镜获得样品。
内镜采样是一种侵入性技术。此外，内镜采样是有针对性的技术，其沿食管间隔采集活检，或病灶由操作者目视确定并专门作为活检靶标。
适当地，本发明不涉及内镜样品，如内镜活检。
本发明的关键原理是提供了一种特异于食管异常的测试。由于不提供来自不相关组织(如正常的鳞状食管或贲门(胃))的细胞的假阳性的可疑水平，该测试是特异性。因此，通过提供具有这些特异性特征的测试，本发明有利地提供了一个检测异常食管细胞的测定。通过这种方式，本发明有利地避免了靶向样品采集的需要。因此，本发明有利地涉及通过非靶向样品收集所获得的样品，如对食管的整个表面采样，而不是仅靶向于可疑病灶区域(巴雷特)。
因此，适当地，样品不包含内镜活检。
适当地，样品可以包括食管刷洗物或表面细胞。可以使用内镜或其它装置来获得食管刷洗物；适当地，当样品包含食管刷洗物时，该食管刷洗物通过非内镜手段获取。
适当地，样品包括来自受试者上肠道表面的细胞。
适当地，样品由来自受试者上肠道表面的细胞组成。
适当地，样品可以包括采集自整个食管腔的细胞。
适当地，样品可以包括食管和非食管的细胞。
适当地，样本可包括食管细胞以及贲门细胞。
适当地，样品可以由食管细胞组成。
适当地，样品包括来自受试者食管表面的细胞。
适当地，样品由来自受试者食管表面的细胞组成。
最适当地，样品可以包括使用胶囊海绵型采样技术所收集的细胞。
特别适当地，采样技术在实施例部分中描述。
合适样品的实例包括食管刷洗物(内镜或非内镜获得)，通过球囊细胞学所获得的样品，通过胶囊海绵采样所获得的样品。最适当地，样品包含经胶囊海绵采样所获得的细胞。
标记物组与腔表面细胞相关。这意味着，待分析的样品仅需要收集自食管腔表面。这有利地避免了活检如内镜活检的需要。此外，这有利地避免了在待测定的样品中保留组织结构的需要。
本发明的标记物的另一个优点是，选择它们可避免由收集自胃粘膜(如贲门/胃)的细胞所产生的假阳性。这具有特定的优势，即如果样品中包括胃粘膜细胞，则所述组仍能作为检测食管异常的模式发挥功能。这是因为在胃粘膜细胞中未找到标记物，因此即使样品中包含胃粘膜细胞也不发生假阳性。
因此，可以理解的是，本发明人对所述组中标记物的选择产生了一定程度的特异性，而筛选食管异常的现有技术的方法均不产生这种特异性。本发明人首次积极探索并成功获得了此种能够集中区分的组。
已经用于先前的临床研究中的非内镜胶囊海绵装置(例如，参考编号：CI/2007/0053(UK))可用于样品收集。实验性的研究表明，该装置(“Cytosponge TM”)可被患者接受并可用于初级护理。该装置由包含在明胶胶囊中的聚氨酯海绵组成，所述明胶胶囊连接有绳索。该胶囊吞服且在3-5分钟后溶解于胃中。
适当地，将收集的细胞学样品处理成粒或团，然后可将其包埋于石蜡中从而保持组织结构。然后进行组织学评估，并且此外，可在单个样品上使用多分子和/或形态学标记物。因此，这种样品收集模式特别适合于本发明。
适当地，使用可吞服的摩擦材料从食管表面采集细胞，该材料从患者取回，并且随后由此分离细胞用于分析从而确定标志物的存在。优选地，基本上在食管的整个表面采样，优选整个表面。
摩擦是指所述材料能够从食管内表面取下细胞。显然地，因为这表示在受试者的食管中使用，因此“摩擦”必须根据应用进行解释。在本发明上下文中，术语“摩擦”具有上述含义，其可以通过以下进行测试：以合适的量/构造(configuration)使材料被传递通过食管并对其进行检验以确定细胞是否 已从食管中取出。
收集装置中使用的材料必须具有足够的摩擦性以便采集食管中存在的任何发育异常的细胞。优选地，所述材料的摩擦性足以采集存在的任何巴雷特或发育异常或腺癌细胞。在最优选的实施方式中，优选地，所述材料的摩擦性足以能够对整个食管进行取样，从而使一些鳞状细胞和可能存在的任何巴雷特和/或柱状和/或腺癌细胞一起收集。这是有利的，因为鳞状细胞比发育不良细胞更难以取出，因此，对它们的取样为操作人员提供了对照，即如果正常鳞状细胞被所述材料取出，则未采集到目的细胞(所述目标细胞比正常鳞状细胞更容易取出，如巴雷特或发育不良细胞，如果存在的话)的机会就小。
优选地，所述可吞咽摩擦材料是可膨胀的。在该实施方式中，优选地，摩擦材料在吞咽时比取出时具有更小的尺寸。可膨胀材料可以简单的是弹性材料，其经过压缩从而使其从压缩中释放时重新膨胀到接近未压缩尺寸的尺寸。或者，所述材料可以是，例如当吸收水性液体时膨胀到超过其原始尺寸的最终尺寸。
换言之，优选地，所述装置的材料在吞咽和取出之间膨胀、变大、充胀或以其它方式增加尺寸。优选地，所述装置是自动膨胀的，即在吞咽和膨胀之间不需要进一步介入。优选地，所述装置不是可充胀的。优选地，所述装置通过吞咽后解除限制然后解折叠、展开、解螺旋或以其它增大尺寸的方式变大。优选地，所述装置的材料是可压缩的，并且在吞咽后返回至接近其未压缩尺寸的尺寸。优选地，所述装置由压缩材料构成，所述压缩材料以可释放的方式被束缚在压缩状态。优选地，所述材料在吞咽后不再受束缚，从而使得装置/材料在取出之前膨胀。
优选地，所述装置包含可压缩材料，该可压缩材料被压缩成胶囊形式。优选地，可压缩材料是海绵材料的形式。优选地，压缩的海绵至少部分地被可溶的和/或可消化的包衣如胶囊包衣所包围。优选地，海绵是不可消化的。优选地，所述胶囊包衣至少部分地由明胶形成。优选地，胶囊包衣完全由明胶形成。
在一个实施方式中，可能需要用可消化材料制备整个装置，以便当装置在受试者体内遗失时增加安全性。当然，摩擦材料需要以比胶囊更慢的速度消化，并且绳索需要被类似的缓慢消化。优选地，摩擦材料是不可消化的。 优选地，绳索是不可消化的。
优选地，摩擦材料包括聚氨酯，优选为聚氨酯海绵。
适当地，所述磨料材料是可压缩的。适当地，所述摩擦材料包括网状聚氨酯。
适当地，材料具有均一的形状。
适当地，材料具有均一的直径。
适当地，未压缩形状是圆形，如球形。
适当地，未压缩的直径是3cm。
适当地，所述绳索经在摩擦材料表面之下的绳索环连接到所述摩擦材料上，所述环由固定结(hitch knot)打结。
适当地，所述摩擦材料被压缩，并且其中所述摩擦材料通过可溶性胶囊而被保持在压缩状态。
适当地，所述可溶性胶囊包括明胶胶囊。
适当地，所述胶囊能够溶解，可压缩的摩擦材料能够在浸入30摄氏度的水中5分钟内恢复到其未压缩尺寸。
优选地，所述装置是胶囊海绵。从本说明书中显而易见的是，胶囊海绵是包括可压缩海绵作为摩擦材料的装置，其中海绵被压缩成胶囊形状，该胶囊形状的压缩海绵优选地通过可溶的和/或可消化的物质如明胶的至少一部分包衣而被可逆地束缚在其压缩状态。优选地，装置是如WO 2011/058316中所述的胶囊海绵。
优选地，样品不包括内镜所收集的物质。优选地，样品不包括内镜活检。优选地，样品不包括内镜刷洗物。
本发明的一个特征是取样不定向，例如不通过视觉定向到食管的任何特定部位，而是沿食管的整个表面用海绵刮取，并从食管道获得不均匀的细胞样品。本发明的另一个优点是比现有技术如内镜活检(采样大约1％的表面)或内镜刷洗物取到食管表面的比例更大。
优选地采样至少10％，优选至少20％，优选至少30％，优选至少40％，优选至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％的食管表面。在最优选的实施方式中，优选采样基本上整个食管，优选采样食管的整个内腔。这也同样适用于体外样品，例如当本发明的方法不 包括收集样品时。
适当地，样品是体外样品。
适当地，样品是身体外的样品。
适当地，采样上肠道如食道的细胞表面，其包括以下步骤
(i)将包含能够从食管表面收集细胞的摩擦材料的可吞咽装置导入受试者体内；
(ii)通过经由食管取出而收回所述装置；和
(iii)从所述装置收集细胞。
优选地，步骤(i)包括将包含摩擦材料的可吞咽装置导入受试者的胃，所述摩擦材料能够从食管表面收集细胞。
适当地，样品来自白色高加索人受试者。
适当地，样品来自有回流病史的受试者。
适当地，样品来自男性受试者。
适当地，样品来自肥胖受试者。
本发明的方法
在一个实施方式中，适当地，所述方法是体外方法。在一个实施方式中，适当地，所述方法是身体外的方法。在一个实施方式中，适当地，细胞的实际采样不是本发明的方法的一部分。适当地，所述方法不涉及采集细胞。
适当地，样品是先前收集的样品。适当地，所述方法不要求其细胞要被测试的受试者存在。适当地，样品是体外样品。适当地，所述方法不包括严格意义上的实际的医疗决策；此类严格意义上的决策通常由医师作出。
适当地，本发明的方法在体外进行。适当地，本发明的方法在身体外进行。
本发明中所用的标记物
参考本申请提交日即2013年2月21日时的数据库而提供Genbank登录号。如需进一步的帮助，优选所提供的登录号应参考2013年2月15日的Genbank版本号194.0。
作为示例，提供以下示例性p53序列，来自GenBank：
人类肿瘤蛋白p53(TP53)，转录变体1，mRNA
NCBI参考序列：NM_000546.5
登录号NM_000546
版本号NM_000546.5
来源
非典型性
通过观察评估非典型性。
适当地，细胞在观察前被染色。适当地，用苏木精和曙红(H&E)染色细 胞。这样的优势是根据常规和长期建立的组织学易于相互区分细胞。
使用标准组织学/细胞学区分细胞。
按Vienna标准进行评分。
在本发明的上下文中，根据Vienna标准判断异常。因此，将非典型性作为除了本发明的标记物组之外的任选的额外的标记物进行测定时观察到细胞的这些异常分类中的一个或多个将意味着在该分析中针对非典型性标记物记录了“异常”的发现。
优势在于，任选地，除了本发明的组中的4个标记物之外，还测定了非典型性，这可以获得增加的灵敏度和/或特异性。
在需要进一步指导时，可参考该领域的标准教科书，如Winifred Gray著的Diagnostic Cytopathology(第二版)。此外，或可选地，可以使用教科书如CeciliaM.Fenoglio-Preiser,Amy E.Noffsinger,Grant N.Stemmermann,Patrick E.Lantz,PeterG.Isaacson著的Gastrointestinal Pathology An Atlas and Textbook(第三版)。这些教科书通过引用其中示出的本文所提及的细胞类型的特征的章节而特别地通过引用并入本文。如果需要，还可以使用任何其它的常规细胞学/组织学指南。
苏木精和曙红(H&E)
苏木精和曙红染色使用2个单独的染料，一个染色细胞核，另一个染色细胞质和结缔组织。苏木精是暗紫色染料，其对核内染色质(核物质)染色，留下深的紫蓝色。曙红是橙粉至红色的染料，其染色包括结缔组织和胶原蛋白在内的细胞质物质，留下橙粉色复染色。此复染色充当细胞核的紫-蓝色核染色的鲜明对比，并有助于鉴定组织中的其它实体如细胞膜(边界)、红血细胞和流体。
染色过程包括样品的水合(如果需要的话)；用核染料(苏木精)染色并漂洗，然后用复染色剂(曙红)染色。然后将它们漂洗，并在必要时脱水(例如用水，再用酒精，然后用二甲苯处理)，并通过例如加盖玻片制备以进行观察。
进行性/退行性染色(progressive/regressive straining)
有2种方法进行H&E染色：进行性方法，其中将载玻片置于苏木精中，然后漂洗并置于曙红中；以及退行性方法，其中将载玻片置于更强类型的苏木精中，然后在酸醇中差异化从而使苏木精离开除核之外的所有地方，再置 于曙红中。在这两种类型的染色中，任选使用发蓝溶液(Scott's Tap Water或氨水)使核转变成深的紫蓝色。
在进行性染色中，使用温和形式的苏木精，其仅将细胞核染色，并在水中漂洗时，导致核物质转变为更深的蓝色。用这种方法，技术人员可以简单地染色、漂洗并继续进行下一个步骤。该方法优点在于步骤简单且较少并避免了在酸醇中过度区分化/区分不足的可能性。染色的水平或颜色被均一化且是一致的。进行性染色具有容易自动化的优势。
用于进行性染色的苏木精产品是市售的，如来自Sigma公司(Sigma Aldrich)，并包括：Gill's 1、Gill's 2、Gill's 3和Mayer's苏木精。3种Gill染色的区别是苏木精的强度。Gill's 1主要用于细胞学染色，其中较弱的苏木精是足够的，这是因为是对来自液体悬液而不是组织的单个细胞染色。Gill's 2和3更强，并通常用于组织学染色。他们被开发用于组织结构。对是否使用Gill's 2或3的选择属于本领域技术人员的喜好。
在退行性染色中，使用更强形式的苏木精，即哈里斯苏木精。哈里斯苏木精将载玻片上的所有物质染色并在漂洗时快速固定在组织上。因此，在染色和用水漂洗之后，下一个步骤是进行区分化或从除细胞核之外的所有区域去除过量的苏木精。将载玻片在温和的酸醇溶液中搅动以慢慢除去过量的苏木精。在区分化之后，漂洗载玻片并置于发蓝溶液(Scott's Tap Water或氨水)中，这将导致细胞核转变成深的紫蓝色。
用于退行性染色的苏木精产品是市售的，如来自Sigma公司(Sigma Aldrich)，并包括哈里斯苏木精。
苏木精染色后，漂洗样品并在曙红中染色。如果必要的话，它们可以用梯度强度的醇进行脱水，在二甲苯中清除，并最后使用例如盖玻片和/或永久封固介质进行制备以进行观察。
曙红产品是市售的，例如来自Sigma公司(Sigma Aldrich)，并包括曙红Y、曙红Y醇和有焰红染料的曙红Y。类似于三种类型的Gill's染色剂，曙红通过它们的强度和颜色上的深度来区分。曙红Y是三种中最弱的，并将细胞质和胶原蛋白染色为粉红色。曙红Y醇是更强的染色剂并由于其酒精成分而获得更明亮的橙红色。有焰红染料的曙红Y是最强的染色剂，并由于添加焰红染料而具有压倒性的红色。虽然曙红的选择取决于本领域技术人员，有焰红 染料的曙红Y通常被认为对于标准组织学而言过于红。因此，适当地，所使用的曙红是曙红Y醇。
苏木精和曙红(H&E)的优势在于可以避免特异于细胞类型的分子标记物的使用。
参考标准
本发明需要确定某些标记物的“异常”水平。“异常”可以通过与参考标准相比较来定义。
在本发明的上下文中，参考标准作为比较的对象，使其可以与受试者的样品中所存在的表达水平/甲基化水平/非典型性进行比较。参考标准可包括来自健康受试者的样品，其与目标样品平行测定。或者所述参考标准可包括之前根据取自健康受试者的样品所确定的所述生物标记物的表达水平值，从而获得比较用的所述生物标记物的表达水平的值。这样的优势在于不需要在每次实施方法时都平行测定参考样品。适当地，健康的人是与所考虑的受试者具有相似的人口统计特征(如年龄、性别、体重和任何其它的相关参数)的个体。
参考标准还可以是随时间所测定的作为均值的所述生物标记物的一组表达水平值。这样的优势在于消除了每次实施方法时都从单独的个体获取并测量样品的实际问题。适当地，随时间所测定的作为均值的所述生物标记物表达水平值组将被分成由医学特征(如年龄、性别、体重和其它)所划分的不同的类别，以便为所检查的特定受试者提供更加直接的可比较的数值组。
对于本发明的蛋白质标记物，如本文所述对其染色进行评分。该评分系统中已经考虑了正常/异常。由此，由于通过对染色打分的绝对分类，有利地使得对用于每个分析的直接参考标准的需求变成可任选的。
对于甲基化，当如本文所述(如在实施例部分)进行评估时，MethyLight分数被认为是异常。
所使用的示例性的甲基化截断值是0.02604。这可以根据实施本发明的操作者的需求而变化。对于Methylight测定，示例性的截断值(甲基化截断值)是在0.01-0.31的范围内。再次，这些可以根据实施本发明的操作者的需求而变化。
参考序列
使用数字地址表示特定的氨基酸残基时，使用全长的氨基酸序列作为参考序列进行编号。由于很好理解，使用此种方法对目标残基进行定位。这并不总是一个严格的计数行为，而是一定要注意环境。例如，如果目标蛋白质如人p53的长度稍有不同，则与特定残基对应的p53序列中正确残基的定位可能需要对齐序列并挑取等同或对应的残基，而不是简单地选取目标序列的相同编号的残基。这在有技术的读者的理解范围内。
此外，在本发明的上下文中，是与所描述的那些序列对应的特定多肽序列的检测，这是重要的。用于此类检测的技术和/或试剂可广泛获取和/或可直接获取或生成。在实施例部分提供了示例性的材料和技术。特定多肽例如特定基因的多肽产物的检测适当地被认为是在蛋白检测的水平。这是一个蛋白质表达的问题，而不是特定的或准确100％相同的氨基酸序列的确定。提供示例性氨基酸序列作为检测多肽的指导，并不旨在将本发明限制为仅那些准确的全长100％相同的氨基酸序列的检测。因此，变体如等位变体，不改变多肽的功能特性的突变，如点突变或短的添加或删除，或片段，如剪接变体、切割的或成熟的蛋白，翻译后修饰的蛋白质或其它此类常见形式，都被认为在确定所公开的各种生物标记物蛋白的存在/不存在或表达水平的范围内。
适当地，片段的长度是至少10个氨基酸，适当地，至少25个氨基酸，适当地，至少50个氨基酸，适当地，至少100个氨基酸，适当地，至少200个氨基酸，适当地，是目标多肽的大部分。适当地，片段包括目标多肽的整个基序或整个结构域。
序列同源性/同一性
虽然在功能相似性方面也可以考虑序列同源性(即具有相似的化学特性/功能的氨基酸残基)，在本文的上下文中，优选表示在序列同一性方面的同源性。
实施序列比较可以通过肉眼，或更通常地借助容易获得的序列比较程序。这些公开且可商业获取的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的同源性百分比(如同一性百分比)。
可以在连续序列上计算同一性百分比，即将一个序列与另一个序列比对且一个序列中的每个氨基酸直接与另一个序列中的相应的氨基酸相比较，一次一个残基。这被称为“无缺口”比对。通常，这种无缺口比对仅用于相对少量的残基(例如，小于50个连续的氨基酸)。为了比较更长的序列，使用间隙打分产生最佳比对，以准确地反映相对于彼此具有插入或缺失的相关序列中的同一性水平。实施此类比对的合适的计算机程序是GCGWisconsin Bestfit软件包(Wisconsin大学,U.S.A；Devereux等人，1984,Nucleic AcidsResearch 12:387)。其它的可以进行序列比较的软件的实例包括但不限于，BLAST软件包、FASTA(Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215:403-410)和比较工具的GENEWORKS套装。
在本文的上下文中，认为同源氨基酸序列包括具有至少40、50、60、70、80或90％同一性的氨基酸序列。最适当地，将与目标生物标记物具有至少90％序列同一性的多肽作为存在该生物标记物的指示；更适当地，将氨基酸水平上具有95％或更适当地具有98％同一性的多肽作为该生物标记物存在的指示。适当地，至少在被测定以确定存在或不存在目标生物标记物的多肽或片段的长度上进行比较。最适当地，跨越目标多肽的全长进行比较。核酸的核苷酸序列也适用于相同的考虑。
优势
mRNA研究(如作为Rugge等人2010的主要焦点)在确定“正常”水平方面遭遇困难。具有挑战性的是确立截断值。这需要非常大的样品量来使结果可靠。观察到了宽范围的表达水平。mRNA的表达水平可能与蛋白质表达水平不相关。在Cytosponge采集的样品中mRNA可能降解。蛋白质更为稳定。Rugge等人没有提及在巴雷特食管的发育不良的诊断中使用AURKA。在初级治疗情况下，样品可被收集，储存于冰箱中，邮寄，然后才到达实验室进行检测。本发明的优势在于，在此类样品处理过程中不会损坏信号。Rugge等人通过IHC测量了AKA并且确实还与p53相关。Rugge等人的主要的缺点是，他们报道了AKA作为主要的细胞质染色。其中很大的问题是，由于AKA在细胞核中发挥作用，使得Rugge等人中的细胞质染色似乎并不可靠。Rugge等人所使用的Ab来自Epitomics，似乎这是非特异性的且产生了不可 靠的结果。相比之下，本发明人证明了核染色。作为一个实例，本发明人使用来自Millipore的抗体。本发明人已经检查了抗体的特异性。
适当地，mRNA不用于本发明的分析。
适当地，本文所使用的抗体特异于所测定的蛋白质。
Liu等人(2008)研究了来自中国患者的一组癌症。在中国，大于90％的食管癌症是鳞状细胞癌。因此，作者已经证明了p53在食管的鳞状细胞癌中表达，并不跟随巴雷特至腺癌的发展。
Agnese等人(2007)试图评估极光激酶A和p53是否有助于区分具有肠组织转化的巴雷特食管和具有胃组织转化的巴雷特食管。摘要的结论指出，该研究太小以至于不能产生任何显著的结果。总之，与之相比，本发明涉及检测(例如巴雷特食管中)发育不良/癌症，这相对于Agnese等人区分胃和肠组织转化的尝试而言是一个单独的问题。Agnese等人测量了RNA转录水平，未检查极光激酶A的蛋白水平。由于翻译后修饰，RNA转录水平并不必然翻译成蛋白质。本发明人不依赖于RNA来说明其是一个良好的蛋白水平生物标记物。在这个阶段有很多候选标记物落选，即不是良好的蛋白质生物标记物。
本发明现以编号段落的方式进行描述：
i.一种帮助检测在受试者食管中的表面异常的方法，所述方法包括：
a)提供来自所述受试者的细胞样品，其中所述样品包含收集自受试者的食管表面的细胞；
b)测定所述细胞的至少2个标记物，其中所述标记物选自
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA或PLK1，优选AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；
其中检测出至少2种所述标记物的异常水平时，则推断受试者具有食管中的表面异常的增加的可能性。
ii.如段落i中所述的方法，其中步骤(b)包括
(1)使所述细胞与用于检测至少第一分子标记物的试剂相接触，其中第一分子标记物选自：
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA或PLK1，优选AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；以及
(2)使所述细胞与用于检测选自(i)至(iv)的至少第二分子标记物的试剂相接触。
iii.如段落i或段落ii所述的方法，其中所述表面异常选自低度发育不良(LGD)、高度发育不良(HGD)、无症状食管腺癌(OAC)和黏膜内癌(IMC)。
iv.如段落i或段落ii所述的方法，其中测定至少3个所述标记物的异常水平。
v.如前述任一段落中所述的方法，其中测定至少4个所述标记物的异常水平。
vi.如前述任一段落中所述的方法，进一步包括通过测定所述细胞的非典型性。
vii.如前述任一段落中所述的方法，其中通过食道表面的无偏采样收集所述细胞。
viii.如段落vii所述的方法，其中使用胶囊海绵收集所述细胞。
ix.如前述任一段落中所述的方法，其中在与用于检测分子标记物的试剂相接触之前，通过如下步骤制备细胞：(i)通过离心使细胞沉淀，(ii)使细胞重悬在血浆中，和(iii)加入凝血酶并孵育直至形成凝块。
x.如段落ix所述的方法，进一步包括在福尔马林中孵育所述凝块，加工成石蜡块(block)，并切成适合于显微镜检查的切片的步骤。
xi.如前述任一段落中所述的方法，其中通过免疫组化评估p53。
xii.如前述任一段落中所述的方法，其中通过免疫组化评估cMyc。
xiii.如前述任一段落中所述的方法，其中通过免疫组化评估AURKA。
xiv.如前述任一段落中所述的方法，其中通过MethyLight分析评估MyoD/Runx3的甲基化。
xv.如段落vi所述的方法，其中根据Vienna标准按细胞形态对其进行评分来评估非典型性。
xvi.如前述任一段落中所述的方法，其中所述方法的步骤(b)之前是测定 所述细胞的TFF3的步骤。
xvii.一种用于选择治疗方案的测定，所述测定包括
a)提供来自所述受试者的细胞样品，其中所述样品包含收集自受试者的食管表面的细胞；
b)测定所述细胞的至少2个标记物，其中所述标记物选自
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；
其中如果检测到至少2个所述标记物水平异常，则选择内镜和活检的治疗方案。
xviii.一种装置或系统，其
(a)经配置以分析来自受试者的食管样品，其中所述测定包括
(b)测定所述细胞的至少2个标记物，其中所述标记物选自
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；
所述装置或系统包括输出模块，
其中，如果检测到至少2个所述标记物水平异常，则所述输出模块指示在所述受试者的食管中有表面异常的增加的可能性。
xix.物质用于与帮助检测受试者食管中的表面异常相关的应用的用途，所述物质识别、结合某些多肽或某些核酸序列的甲基化，或者对某些多肽或某些核酸序列的甲基化具有亲和力，其中所述多肽和/或核酸序列如段落i至xv中任一段所限定。
xx.物质的组合如段落xix的用途，其中每个物质各自识别、结合一种或多种所述多肽或核酸序列或对一种或多种所述多肽或核酸序列具有亲和力。
xxi.一种测定装置，用于帮助检测受试者食管中的表面异常，其包含固体基底，所述基底上具有含有物质的位置，所述物质识别、结合某些多肽或 或某些核酸序列的甲基化，或者对某些多肽或某些核酸序列的甲基化具有亲和力，其中所述多肽和/或核酸序列如段落i至xv中任一段所限定。
xxii.一种试剂盒，其包括用于测定生物样品中各个以下物质的表达水平的试剂：
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA；
并且任选地进一步包括用于测定MyoD和Runx3的甲基化的试剂。
xxiii.一种用于帮助检测受试者食管中的表面异常的方法，所述方法包括提供来自所述受试者的细胞样品，其中所述样品包含收集自受试者食管表面的细胞，测定所述细胞的TFF3，其中如果在样品的细胞中检测到TFF3，则实施段落i至xv中任一段所述的方法，其中除了检测到TFF3之外还检测到至少1个标记物水平异常时，则表明受试者的食管中表面异常的增加的可能性。
xxiv.如段落xxiii所述的方法，其中除了检测到TFF3之外还检测到至少2个标记物水平异常，优选除了检测到TFF3之外还检测到至少3个标记物水平异常，优选除了检测到TFF3之外还检测到至少4个标记物水平异常，优选除了检测到TFF3之外还检测到所有5个标记物水平异常时，则表明所述受试者的食管中表面异常的增加的可能性。
xxv.如段落xxiii或段落xxiv所述的方法，其中通过食道表面的无偏采样收集所述细胞。
xxvi.如段落xxv所述的方法，其中使用胶囊海绵收集所述细胞。
附图说明
以下将参考附图进一步描述本发明的实施方式，其中：
图1示出了4个不同染色强度(0、1、2、3)下自CytospongeTM获得的细胞的c-MYC染色的实例。
图2示出了照片和图表。
图3示出了流程图。
图4示出了流程图。
图5示出了流程图。
图6示出了照片。
图7示出了解释研究框架的流程图。给出了每个阶段中所使用的样本数量。用于每个研究阶段的方法示于左手侧。EAC、食管腺癌、BE、巴雷特食管、HGD、高度发育不良。
图8示出了食管腺癌中的突变。顶部柱状图显示了给定基因具有偏差的样品的百分比。粗体数字表示各个基因的突变总数。在我们的EAC发现和验证队列(合并总计112个患者)中具有4个或更多个突变的基因也包括在内。显示了错义、无义/剪接和插入缺失突变的比例。下面的矩阵示出了针对每个可能的基因配对，两个基因中均具有突变的样品的数量。红色高亮框表示显著共同发生的突变(Benjamini-Hochberg校正的p值<0.05)。
图9显示TP53和SMAD4突变准确定义了向癌症发展中的边界，而其它突变的发生似乎独立于疾病阶段。A.柱状图示出了永无-发育不良的BE患者(NDBE)、患有高度发育不良(HGD)的BE患者和在发明人的26个基因组成的组中具有至少1个突变的EAC患者的数量。B.在EAC发现队列和EAC验证队列中所鉴定的，在反复突变的基因(在≥4个样品中突变)中具有突变的永无发育不良BE、具有HGD的BE和EAC样品的百分比。TP53和SMAD4是仅有的基因，突变分隔了永无发育不良BE和发育不良BE(TP53)或癌症(SMAD4)之间的边界(*P<0.05)。C.BE癌变中用于定义边界的突变的提议建模。散列框描述了在疾病的任何阶段中可能发生且提供了选择性优势的多个其他突变。
图10显示TP53突变可以用于在CytospongeTM上诊断具有普遍的高度发育不良的BE。A.该图示出了来自胃顶部、食管的全长和口咽部的细胞的CytospongeTM采样。B.已知TP53突变的等位基因分数，先前在诊断活检中通过TP53测序而鉴定。对于这4个患者而言，也可以在使用CytospongeTM收集的物质中检测突变。患者4在2个不同的时机吞服CytospongeTM，相距8个月，并示出了针对两个CytospongeTM样品的数据。N/A＝因未取样而不适用，AF(allele fraction)＝等位基因分数。C.示出了CytospongeTM样品中所鉴定的TP53突变的等位基因分数，其针对3个患者组：无BE、无发育不良的BE和具有高度发育不良(HGD)的BE。D.在CytospongeTM样品中所鉴定的TP53 突变的位置示于基因图之上，与在EAC和BE HGD活检队列中所发现的相比较。基因轮廓上的虚线表示多重PCR测定没有覆盖的2个小的区域(氨基酸1-27和361-393)。TA，转录激活域；OD，寡聚化结构域。
在随附的独立和从属权利要求中进一步列出了具体的和优选的方面。从属权利要求的特征可以适当地与独立权利要求的特征相结合，并且与权利要求中明确列出的特征之外的特征组合。
当装置特征被描述为是可用以提供功能时，应理解这包括了提供此功能的装置特征或者经改造或经配置而提供此功能的装置特征。
具体实施方式
实施例
实施例1：标记物的选择
选择4个分子的风险分层生物标记物(任选地再加上第5标记物非典型性)有许多原因，例如：
选择p53蛋白积累作为生物标记物是因为p53是表征最佳的肿瘤抑制蛋白之一，且已示出与巴雷特食管中的发育不良相关(Bian等人，2001)，并且与进展到OAC的增加的风险相关(Kastelein等人，2012；Sikkema等人，2009)。
C-MYC(一个表征良好的致癌基因)被纳入的原因是因为其在OAC中被反复扩增(Miller等人，2003；Rygiel等人，2008)，并在本发明人内部的基因表达测定中显示出在具有高度发育不良的巴雷特中增加的基因表达。
选择极光激酶A(AURKA)作为非整倍的替代标记物是因为AURKA过表达、中心体扩增和非整倍体已被证明是相关的。AURKA是有丝分裂开始、中心体成熟和纺锤体组装的关键调节物，并且AURKA的过表达已被证明可导致中心体扩增和染色体不稳定性(Zhou等人，1998)。与无发育不良的巴雷特相比，AURKA蛋白表达也已示出了在具有高度发育不良的巴雷特和OAC中显著上调(Rugge等人，2010)。
对于甲基化生物标记物，测试先前已示出程度增加的发育不良且被甲基化的5个基因。这些基因是p16、ESR1、MYOD1、HPP1和RUNX3(Eads等人，2001；Schulmann等人，2005)。选择最好的2个(MYOD1和RUNX3)。
实施例2：标记物的排除
有充分的理由来排除在CytospongeTM上使用的其它潜在的生物标记物。以下讨论了从设计组中排除的标记物的一些实例：
评估11个其它的潜在生物标记物以确定其是否能与CytospongeTM联用以检测具有发育不良的巴雷特。这11个生物标记物是EGFR、CDNK2A、FGFR2、CCNA1、DDX21、MSLN、PLK1、HER2、DNMT1、MYHFD2和VNN2。EGFR、HER2、CDNK2A、CCNA1和FGFR2选自公开发表的文献，DDX21、MSLN、PLK1、DNMT1、MTHFD2和VNN2选自内部的基因表达分析数据。淘汰VNN2，这是因为对于该蛋白没有可用于染色福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)载玻片的抗体。淘汰FGFR2和CDKN2A，这是因为在还可以通过CytospongeTM采样的胃癌腺组织中检测到了这两种蛋白的表达。排除MTHFD2，这是因为仅染色细胞质且整体太弱。
最初直接在CytospongeTM上测试CCNA1，这是因为细胞周期蛋白A曾在本发明人的实验室作为一个成功的生物标记物使用(Lao-Sirieix等人，2004；Lao-Sirieix等人，2007)。不幸的是，在初步分析中CCNA1在CytospongeTM上表现的并不好(无巴雷特食管的TFF3+阳性对照＝26，NDBE＝44，针对发育不良不确定＝12，LGD＝7，HGD＝7)，并因此终止了BEST2的研究。其最有可能的是，由于正常组织中的增殖以及从CytospongeTM收集的细胞的结构无法确定隔室特异性增殖(表面相对于较深的腺)，使CCNA1表现并不好。
在一些CytospongeTM样品上测试HER2染色，但由于已知HER2仅在约15％的具有高度发育不良的巴雷特中扩增或过表达，这样由于不是足够灵敏的生物标记物而中断染色。
排除其余5个生物标记物，这是因为其不够灵敏或不够特异-见下表：
表：在本发明人的内部TMA中染色但不足以进入最终的组中的5个生物标记物的灵敏度和特异性。TMA包括54个无发育不良的巴雷特活检组织，32个具有低度发育不良的巴雷特活检组织和18个具有高度发育不良的巴雷特活检组织。
排除MSLN，这是因为其表达于无发育不良的巴雷特中，并因此不足以特异性的检测具有发育不良的巴雷特。DNMT1看起来很有希望，因为其是非常特异性的(98％)，然而当我们试图使用不同的DNMT1抗体验证数据时，数据不符。因此，本发明人没有继续将DNMT1作为生物标记物，因为本发明人对该抗体失去了信心。
排除EGFR，因为灵敏度(72％)和特异性(77％)整体上太低。排除DDX21，因为即使敏感度和特异性可以接受，存在大量的具有低DDX21表达的无发育不良的巴雷特案例，且本发明人正在寻找没有染色对抗染色的更清晰的生物标记物。PLK1具有良好的灵敏度(91％)和良好的特异性(88％)，但排除了此生物标记物，这是因为AURKA有更好的灵敏度(93％)和特异性(94％)数据，并且因为AURKA和PLK1过表达将检测基本相同的情况，本发明人仅选择了所述标记物中的一种并且因为产生更好的数据而选择了AURKA。
实施例3：样品处理和制备
胶囊海绵试样的处理
使患者吞下CytospongeTM胶囊，然后将其直接置于4℃的保存溶液中直至进一步处理。将样品剧烈涡旋并用力振荡以从海绵物质中去除任何的细胞。将包含细胞的保存液体于1000RPM离心5分钟以沉淀细胞。将所得的沉淀重悬于500μL的血浆中，然后加入10μL增量的凝血酶(Diagnostic reagents，牛津，英国)直到形成凝块。然后在加工成石蜡块前将凝块置于福尔马林中24小时。将样品切成3.5μm的片以获得15个载玻片，命名为载玻 片1至15，载玻片1和2上放置两片。
实施例4：测定任选的进一步的标记物-非典型性
通过显微镜检查和打分在来自Cytosponge的样品上进行非典型性评估。
用H&E染色包含2个片的第一载玻片，并由病理学专家(Dr Maria O'Donovan)评估非典型性。
根据Vienna标准进行评分。
实施例5：测定标记物-蛋白质生物标记物
通过免疫组化染色分析利用CytospongeTM获得的样品中的细胞上/中的3个蛋白质标记物中的每一个。
对于每个蛋白质生物标记物，使用免疫组化(IHC)染色1个载玻片以评估各个样品中的蛋白表达。载玻片4用于p53、载玻片8用于c-MYC，载玻片10用于AURKA。
用带有Leica Bond Polymer Detection试剂盒的BondMax自动染色仪染色所有载玻片。所用条件和抗体示于下表中：
表：所用的IHC染色条件和抗体：
对于c-MYC染色，初级抗体孵育60分钟
染色方案MRC+E
值得注意的是，适当地，使用MRC+E方案染色cMYC，但抗体孵育60分钟；适当地，使用MRC+E方案染色AURKA，但初级抗体仅孵育15分钟。
免疫组化染色的评分
用0-3(染色强度)对p53进行评分，3被认为是显著染色，0、1或2是非显著染色。仅有强的(强度＝3)的p53染色被认为是显著的。p53积累已显示与具有发育不良的巴雷特相关并还预测发展(Kaye等人，2009；Skacel等人，2002)。缺失模式(Kaye等人，2010)不被视为显著，这是因为巴雷特食管中的上皮细胞经常不能针对p53染色。
用0-3(染色强度)对c-MYC进行评分，0和1被认为是非显著染色，2和3被认为是显著染色。选择这一截断值，因为其对于无发育不良的巴雷特和有任何发育不良的巴雷特之间的区分最有用。不同强度的c-MYC染色的实例示于图1。
用0或1对AURKA进行评分，0是未染色，1是任意的阳性染色。未染色和阳性染色的实例示于图2。
适当地，AURKA染色细胞核。适当地，在对AURKA进行评分时仅评估细胞核染色。适当地，忽略细胞质染色(如果有的话)。适当地，本发明的AURKA染色是非细胞质的。
3种蛋白质生物标记物的初步测试
为了进一步筛选并确保所述3种潜在的蛋白质生物标记物会在发明人手中成功地发挥作用，在本发明人内部的巴雷特组织芯片(TMA)上进行p53、c-MYC和AURKA染色。这些TMA由54个无发育不良的巴雷特活检组织、32个具有低度发育不良的巴雷特活检组织和18个具有高度发育不良的巴雷特活检组织组成。由于这些TMA包括巴雷特活检组织，仅对表面染色进行评分，因为这些是CytospongeTM可采样的细胞。从下表中可以看出，在该数据组中，所有3种生物标记物均表现良好：
在本发明人的内部巴雷特TMA中p53、c-MYC和AURKA的灵敏度和特异性表格。TMA包含54个无发育不良的巴雷特活检、32个具有低度发育不良的巴雷特活检和18个具有高度发育不良的巴雷特活检：
蛋白生物标记物 灵敏度(％) 特异性(％)
p53 54 100
c-MYC 79 96
AURKA 93 94
因此，采用这些经确认的标记物用于在利用CytospongeTM收集的细胞样品上评价。
实施例6：测定标记物-甲基化标记物
对使用CytospongeTM收集的细胞进行甲基化测定，如下：使用脱蜡缓冲液(Qiagen)和QIAamp FFPE DNA组织试剂盒(Qiagen)，从经处理的CytospongeTM FFPE凝块的8×10μm切片中提取基因组DNA。按制造商描述的方案实施，不同之处在于将样品于56℃孵育24小时而不是所描述的1小时，并且在24小时孵育的约半程时加入10μl的额外的蛋白酶K。提取后，使用QubitTM dsDNA HS测定试剂盒(Invitrogen)量化DNA并使用EZ DNA Methylation-GoldTM试剂盒对75ng进行亚硫酸氢盐转化(如制造商所述)。样品洗脱在25μl的水中且每个MethyLight反应使用2μl(如Eads等人，2000中所述)。使用β肌动蛋白作为内部对照以将输入DNA的量进行归一化。所使用的引物和探针的序列是：MYOD1正向引物：5'-gagcgcgcgtagttagcg-3'，MYOD1反向引物：5'-tccgacacgccctttcc-3'，MYOD1探针：5'-6FAM-ctccaacacccgactactatatccgcgaaa-TAMRA-3'，ACTB正向引物：5'-tggtgatggaggaggtttagtaagt-3'，ACTB反向引物：5'-aaccaataaaacctactcctcccttaa-3'，ACTB探针：5'-6FAM-accaccacccaacacacaataacaaacaca-TAMRA-3'(来自Eads等人，2001)，RUNX3正向引物：5'-ggcttttggcgagtagtggtc-3'，RUNX3反向引物：5'-acgaccgacgcgaacg-3'，RUNX3蛋白：5'-6FAM-cgttttgaggttcgggtttcgtcgtt-TAMRA-3'，来自Meltzer实验室。使用经亚硫酸氢盐转化的普遍甲基化的DNA(D5010-1，Zymo Research)用于针对各个引物和探针组产生标准曲线，并在所有实验中使用校准以允许绝对定量所有样品中的甲基化水平。用于所有反应的扩增条件是：95℃10分钟，然后 50个循环的95℃15秒和60℃1分钟。
使用如下公式计算各个基因的甲基化程度：
％甲基化＝(A/B)/(C/D)
A＝目标基因的甲基化的值
B＝在完全甲基化的对照中目标基因的甲基化的值
C＝样品中β肌动蛋白的扩增水平
D＝在完全甲基化的对照中β肌动蛋白的扩增水平
然后，将2个基因的甲基化百分比加在一起以获得甲基化值。
甲基化区域的初步测试
在由113个CytospongeTM样品(15个无巴雷特食管的TFF3+对照，54个无发育不良的巴雷特、20个具有LGD的巴雷特和24个具有HGD的巴雷特)组成的预实验中，评估所有5个甲基化区域(p16、HPP1、RUNX3、ESR1和MYODl)以查看哪个甲基化区域亚组性能最好且具有最佳的灵敏度和特异性来在CytospongeTM上检测发育不良，数据示于下表中：
表格示出了5个不同的甲基化生物标记物的曲线下面积(AUC)。(15个无巴雷特食管的TFF3+对照，54个无发育不良的巴雷特、20个具有LGD的巴雷特和24个具有HGD的巴雷特)：
当比较任何发育不良和无发育不良时，RUNX3和MYOD1一起获得最佳的曲线下面积并因此进一步用于评估CytospongeTM样品。
实施例7：检测表面异常
在此实例中，本发明人证明了一种帮助检测受试者食管中的表面异常的 方法。
提供来自受试者的细胞样品。样品包括收集自受试者食管表面的细胞。在本实施例中，通过吞咽并回收摩擦性细胞收集装置来收集细胞。在该实例中，所述装置是CytospongeTM。因此，从受试者食管的表面对细胞进行采样。
测定细胞的至少2个标记物，所述标记物选自：
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；
证明了在BEST2CytospongeTM样品中风险分层生物标记物的性能。在该实例中，在如在前实例中所述选择3种蛋白质生物标记物和两个基因的甲基化组之后，在BEST2CytospongeTM样品上测试所有4个风险分层生物标记物，任选地包括第五个标记物非典型性。
本实施例中所提供的数据来自18个对照患者、95个无发育不良的巴雷特患者、25个具有LGD的巴雷特患者和30个具有HGD的巴雷特患者。
图2中示出了在无发育不良的巴雷特中缺少p53、c-MYC和AURKA染色以及在具有发育不良的巴雷特中的显著的深色染色的实例。图2示出了用于在收集自食道表面(如通过使用CytospongeTM)的样品上检测发育不良的标记物组。所述标记物组包括3个蛋白质标记物(p53、c-MYC和极光激酶A)和由RUNX3和MYOD1组成的两个基因的甲基化组。
当比较无发育不良的巴雷特与具有HGD的巴雷特时，p53、c-MYC和AURKA分别有57％、60％和73％的灵敏度且分别有97％、89％和85％的特异性。当加在一起时，RUNX3和MYOD1的甲基化百分比获得了0.815的曲线下面积和分别为83％和80％的灵敏度和特异性，其示于表中的“MethyLight”下：
当比较具有高度发育不良的巴雷特与无发育不良的巴雷特时，风险分层标记物组的灵敏度和特异性的表：
p53 c-MYC AURKA MethyLight
灵敏度 57 60 73 83
特异性 97 89 85 80
为了评估该风险分层标记物组在CytospongeTM样品中检测发育不良的能力，使用了至少2个阳性生物标记物的截断值。使用这些标准，检测出27/30(90％)的具有高度发育不良的患者和16/25(64％)的具有低度发育不良的患者(见下表A)。
表A示出了各个风险分层生物标记物如何单独发挥作用以及该组何时一起使用以在CytospongeTM上检测发育不良：
当比较高度发育不良与无发育不良(即无发育不良的巴雷特和对照)时，这些数据获得了87％的特异性。
因此，可以证明，检测到至少2个所述标记物的异常水平时，即可推断出受试者在食管中具有表面异常的增加的可能性。
实施例8：可选方法-Cytosponge加单标记物
在此实施例中，一种帮助检测受试者食管中表面异常的方法，其包括：
a)提供来自所述受试者的细胞样品，其中所述样品包含收集自受试者的食管表面的细胞；
其中使用可吞咽摩擦装置(如CytospongeTM)收集细胞样品，以对受试者食管的表面进行采样。
b)测定所述细胞的至少1个标记物，其中所述标记物选自
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；
其中检测出至少2种所述标记物的异常水平时，则推断受试者具有食管中的表面异常的增加的可能性。
在此实施例中，方法步骤如实施例7，但仅需要所述组中的一个标记物是异常的。因此，这表示摩擦装置/Cytosponge方法与所公开的标记物组的组合。
当放宽标准并使用一个阳性生物标记物的截断值时，检测出29/30的高度患者(97％)和23/35的低度患者(92％)(参见上述表A)。在该截断值时，特异性是59％。高灵敏度对于用于监视以不遗漏处于浸润性癌症风险中的患者的生物标记物组而言是重要的。即使特异性较低，其仍然有用，因为这使显著比例的患者免于不必要的内镜。
实施例9：进一步应用
这些数据表明，摩擦性表面采样(如使用CytospongeTM)连同生物标记物组可用于对BE患者风险分层。这样的优势在于能减少BE患者所需的内镜数量，优势还在于避免了与活检相关的采样偏差。本发明人提出，摩擦性表面采样(如使用CytospongeTM)测试与风险生物标记物组一起将改变目前的临床实践(并提供技术益处)(图3-流程图示出了具有持续消化不良或回流的患者目前的临床程序)。目前，将为有症状和经历持续消化不良或回流的患者提供内镜检查。如果这些患者确诊患有巴雷特食管，将采用多个活检组织用于病理学。根据诊断，患者将进入监测程序并以确定的时间间隔提供内镜和活检。如果检测出具有高度发育不良的巴雷特，则为他们提供治疗。
由于大多数患有巴雷特的患者将永不发展和永不形成具有发育不良的巴雷特，这些患者将不得不每两年经受一次内镜，尽管其发展的风险很低。
本发明人提出，根据本发明，使用摩擦性表面采样(如使用CytospongeTM)测试和本文所述的风险生物标记物组可有利地代替这些监视内镜和活检。例如，这将通过参考图4进行解释。
图4示出了所提出的临床/筛选途径的流程图，其包括摩擦性表面采样(如使用CytospongeTM)和生物标记物组。模性数字也包括在其中，以证明通过使用CytospongeTM作为筛选和/或本发明的风险分层工具将避免的内镜数量。这 些数字是基于10,000人的筛选群，并认为该风险人群中的6.5％将具有巴雷特食管。这些数字还认为，10％的患有巴雷特的患者将患有发育不良。各个阶段的患者数量取决于标记物的准确性(灵敏度和特异性)。
图5示出了所提出的巴雷特监视途径的流程图，其包括摩擦性表面采样(如使用CytospongeTM)和生物标记物组。模性数字也包括在其中，以证明通过使用CytospongeTM作为风险分层工具将避免的内镜数量。这些数字还认为，10％的患有巴雷特的患者将患有发育不良。各个阶段的患者数量取决于标记物的准确性(灵敏度和特异性)。
图6示出了p53染色强度的实例。
处于患巴雷特食管的高风险中的患者(即具有持续回流或消化不良的患者)将接受本文所述的测试(例如，通过表面采样，如通过吞咽CytospongeTM)作为筛选程序的一部分。
在一个方面中，可以预测试样品的标记物TFF3。如果测试对于TFF3(巴雷特生物标记物)是阴性，患者将以所定义的时间间隔再次参加预测试。两次阴性CytospongesTM意味着受试者患有巴雷特食管的风险极其低(约0.2％)，并因此在临床上没有原因让患者进行内镜检查。在这种情况下，然后，任选地针对患者的CytospongeTM样品将不测定风险生物标记物(即本发明的测试/组)。患者可以在将来进行重新测试。
然而，在另一个方面中，如果预测试为TFF3阳性，则根据本发明使用摩擦性表面样品(如使用CytospongeTM所获得的)实施(测定)风险生物标记物组。如果在所述组中没有风险生物标记物是阳性的，则患者患有任何发育不良的几率非常低(0.6％)，这样可以在2-5年的时间内为他们提供重测试作为监视程序的一部分。如果一个或多个生物标记物是阳性的，则患者具有发育不良的几率会高得多(11.3％，比没有阳性生物标记物的相对风险高19倍)，为他们提供内镜检查以及活检。这些数字表明，摩擦性表面采样(如使用CytospongeTM)结合风险生物标记物组节省了56％(665/1184)的没必要的内镜检查。
因此，本发明提供了如本文所列的大量的技术和经济益处。
实施例10-在食管癌变的浸润前疾病阶段中的突变排序
在本实施例中，证明了p53突变分析在核酸水平的应用。此外，证明了使用SMAD4作为EAC的标记物。
概述
癌症基因组测序研究已经确定了大量的推测的驱动基因，但在癌变中突变的相对时间节点仍不清楚。从癌变前的巴雷特食管(BE)到食管腺癌(EAC)的逐步发展为研究体细胞突变排序提供了理想的模型。本发明人鉴定了反复突变的基因并使用112个EAC的全基因组测序和扩增子测序评估克隆结构。接着，本发明人筛选了来自恶性病发展中的两个关键转变点的109个活检组织的队列：良性化生的永不发育不良的巴雷特食管(NDBE，n＝66)，和高度发育不良(HGD，n＝43)。意外地，大多数的EAC中反复突变的基因也在NDBE中突变。仅有TP53和SMAD4是阶段特异性的，分别局限于HGD和EAC。最后，本发明人应用这些知识在新的非内镜测试中鉴定高风险的BE。总之，在EAC驱动基因中的突变通常在疾病发展中发生格外地早，这对诊断和治疗策略有深远影响。
简介
大多数的上皮癌是从浸润前病变逐步发展而来的，在某些情况下是在初始化生转化后。表征癌症的基因组前景的研究集中于确定浸润性疾病，目标是开发个性化治疗的生物标记物1。然而，越来越明确的是，在大多数的晚期癌症中存在广泛的基因组异质性2。因此，最合适的治疗目标是发生在疾病发展早期并在所产生的恶性肿瘤中是纯系的那些突变。在发病早期出现的致病突变的鉴定对于开发临床上有用的生物标记物也是关键的。在这种情况中，在疾病阶段边界所发生的突变，例如从未发育不良的上皮细胞到发育不良然后发展至癌症所发生的突变，是信息量最大的。迄今为止，从癌前病变遗传演化至癌症的遗传证据表明，突变的积累是步进式的3-5。在最充分研究的实例—腺瘤-发育不良-结直肠腺癌的进展顺序中，可以通过比较病变测序为有限数量的候选基因分配时间节点。更多的近期研究已试图利用统计学算法来从单个样品中推断肿瘤的生活史4-5。
在继发于接触酸和胆汁的慢性炎症的情况下，食管腺癌(EAC)来源于化生的巴雷特食管(BE)6,7。BE自身适于遗传演化的研究，原因在于在治疗介入前的临床监测过程中对黏膜的反复采样8。EAC和BE的在先研究普遍使用 了候选基因法，目的是鉴定临床生物标记物以补充组织学检查，这是一项充满困难的方法8,9。来自高密度单核苷酸多态性(SNP)阵列和外显子组测序研究的数据现已积累了在许多不同基因中鉴定的过量的突变10,11。然而，几乎没有工作集中于在患有癌前病变且有临床随访数据的患者的大队列中对这些改变的精确排序。
近期，Agrawal等人在11个EAC样品和2个临近癌症的BE样品中进行外显子组测序。有趣的是，发现大多数突变甚至存在于明显正常的BE12中，这与结直肠腺癌中的观察结果相似。这就提出了一种可能性，即在发展至恶性肿瘤之前，预测进展风险的突变在细胞学良性组织中是可检测的。然而，还不清楚在多大程度上相同突变可能存在于未发展到癌症的患者的BE组织中。这个问题很重要，原因是大多数BE患者不会发展至癌症，在发育不良之前早期发生的体细胞改变不可能提供临床上的区别性生物标记物。在该领域中生物标记物研究是重要的，这是因为现有内镜监测策略越来越多地被认为是无效的13，并因此需要新的方法14,15。
这项研究的目的是：1)在EAC中鉴定候选的、新的、反复突变的基因的清单；2)准确解析突变发生的疾病阶段，从而便于理解这些反复突变在癌症发展中的作用，以及3)测试其在临床应用中的效用，即使用非侵入性、非内镜的细胞采样装置CytospongeTM。
结果
EAC中的高突变负担和不寻常的突变签名
所述发现队列(22个EAC接收WGS)反映了已知的疾病的临床-人口特征：男性居多(M：F，4.5：1)，平均68岁(范围从53至82)，且大多数患有晚期疾病(81.8％(18/22)>第一阶段)。在22例中，有17例(77.3％)在切除标本中具有BE的证据(表1)。
表1：患者队列的人口统计学
*所示数据反映了年龄和BE长度的平均值(范围)、阶段数量(百分比)和EAC诊断的随访的中值(范围)以及总的BE监测。性别比四舍五入到最接近的整数。
测序的样品分别在肿瘤样品和正常样品中有63-和67-倍的平均覆盖率。
本发明人针对每个样品鉴定了平均值为16994个的体细胞SNV(范围：4,518-56,528)和994个小片段插入缺失(范围262-3,573)。从这一最终数据组中，作为较大的流水试验台标记研究的一部分，对总共1086个编码区突变进行了证明。本发明人使用超深靶向重测序，实现了>13,000倍的中值覆盖率，并确认了1081个(99.5％)为体细胞。利用Sanger测序，23/25(92％)的插入缺失被证实为真的和体细胞的。如自我们的研究开始在间隔时间Dulak等人观 察的11，在发现队列中最常见的突变类型是T：A>G：C转换且在CTT三核苷酸显著富集。对于T：A>G：C转换的这种富集使EAC区别于其它WGS所研究的癌症，包括乳腺癌、结直肠癌和肝癌16-18。
在EAC的验证队列中的靶向扩增子重测序
为了鉴定BE中参与EAC发展的新基因，本发明人试图在本发明人的发现队列(n＝22例)中鉴定反复突变的目标。选择或者突变显著高于背景率或者在目标通路中的26个基因的一个最终清单，并使用靶向扩增子重测序在较大的队列(90个额外的EAC，表1)中进行测试。研究结果证实并扩展了本发明人的发现队列的那些和其他人之前的工作11,12,19，这包括在SWI/SNF复合物中的反复突变的鉴定，如ARID1A。在298个附加EAC的队列中通过免疫组化对ARID1A蛋白表达缺失的分析确定了在41％(122/298)中表达缺失或下降。这表明存在可选的下调机制，虽然本发明人未在本发明人的发现队列的WGS数据内确定任何大规模的结构变体(数据未显示)。
本发明人接着将来自发现和验证队列的数据组合，并鉴定了在4个或更多个样品中突变的15个基因(图8)。这些包括以前鉴定为EAC候选基因的那些和数个新的候选者：MY018B、SEMA5A和ABCB1。在大多数情况下，TP53是突变的；然而，31％的案例是野生型TP53。虽然本发明人没有足够力量去检测本发明人队列中的互斥突变，但本发明人可以检测显著的共同发生的突变。在同一肿瘤中，与偶然预期相比，SEMA5A和ABCB1突变的发生更常见(Benjamini-Hochberg-校正的p值＝0.0021)，尽管此关联的原因尚不清楚。
跨巴雷特食管疾病阶段的类似突变频率
突变的阶段特异性可来源自处于BE癌变的离散阶段的患者。在疾病阶段边界发生的突变将是恶性进展的候选标记物。此外，在疾病发展早期发生的突变应代表新型治疗干预的理想目标，这是因为其由于在自然史早期的克隆扩增而在更晚期病灶的大多数细胞中存在。因此，本发明人试图鉴定从接受内镜监测的前瞻性队列中的患者所获得的BE样品中，本发明人的组中的26个基因的突变状态。这包括来自79个患者的109个BE活检(图7)。本发明人选择了来自40个BE患者(其没有发展成发育不良或恶性肿瘤的证据，随访时间中值是58个月，范围4-132)的66个永无发育不良的BE样品，以 及经组织病理学证实为高度发育不良(HGD)的43个BE活检样品(来自39个患者，该阶段仅在浸润性EAC的发展之前)(表1)。本发明人未包括低度发育不良，这是由于此病变在组织病理学分级上一致性较差20。
结果是显著且意外的。对于永无发育不良的BE队列，21/40(53％)的患者在他们的BE段中发现具有突变(图9a)，其中数个活检包含多个突变。总之，本发明人在此队列中鉴定了29个SNV和7个插入缺失。重要的是，在永无发育不良的BE中所鉴定的突变发生在之前在EAC11,19和其它癌症21,22中鉴定为驱动的数个基因中，包括SMARCA4、ARID1A和CNTNAP5(图9b)。有趣的是，这29个SNV中有7个都突变在T：A碱基对。其中，5/7(71％)发生在TT二核苷酸序列，这是一个在EAC WGS数据中被鉴定为高度富集的突变环境。因此，在疾病的最早阶段，这种突变过程很可能是有活性的。在43个HGD活检样品中，发现有39个样品(91％)在本发明人的组中的至少一个基因上有突变，总计67个SNV和7个插入缺失。因此，并非特定基因中的突变频率跨疾病阶段增加，本发明人观察到对于绝大多数基因而言，在永不发育不良的BE，HGD和EAC之间，突变频率并未显著不同(对于多重检验的具有Benjamini-Hochberg校正的费舍尔精确检验，图9b)。仅TP53(P<0.0001)和SMAD4(p＝0.0061)(图9b和图c)表现出了在疾病阶段之间可区分的突变频率，从而确定了向恶性肿瘤的发展。发现TP53在HGD(72％)和EAC(69％)样品中反复突变，但仅在永不发育不良的BE的单个案例(2.5％)中反复突变。SMAD4以较低频率(13％)突变且有趣的是仅发现于EAC(疾病的浸润阶段)中。
反复突变的克隆分析
已鉴定了在疾病发展的最早阶段的突变发生，本发明人接着试图鉴定这些突变在本发明人最初的22个EAC的发现队列中是否是全克隆或亚克隆的。对于在来自本发明人扩大的队列的≥4个样品中突变的15个基因中的每一个，本发明人结合本发明人的SNV高深度重测序、拷贝数变异数据和LOH分析，以确定包含突变的肿瘤细胞数。如果突变发生于疾病发展的最早阶段，在恶性肿瘤的克隆扩张之前，本发明人希望突变存在于肿瘤的所有细胞中。对于7/15的基因：SMAD4、TP53、ARID1A、SMARCA4、TLR4、CDKN2A和PNLIPRP3，的确如此。其它8个基因(MY018B、TRIM58、CNTNAP5、ABCB1、 PCDH9、UNC13C和CCDC102B)中的突变并不总是存在于主要克隆中，这表明可以选择这些基因的突变，用于肿瘤发生的多个阶段中(图9d)。
突变排序上的知识在诊断测试中的应用
针对BE患者当前的临床策略包括有规律的内镜检查，以尝试并鉴定处于发展至腺癌的高风险中的发育不良患者。由于在准确鉴定发育不良病变中存在固有的困难，这一方法有高度争议，且最近的数据表明BE的内镜监测并不是有效的13,23。BE的内镜监测中存在的困难包括在随机活检方案中固有的采样偏差以及主观且费时的发育不良的组织病理学诊断。因此，本发明人开发了一种新的方法，其具有克服BE监测的这些限制的潜能。该策略包括非内镜装置(被称为CytospongeTM)，其可以提供给在初级治疗环境中的患者。该装置从整个食管黏膜收集细胞，从而避免了采样偏差，并可以结合用于诊断的客观的生物标记物24,25。迄今为止，本发明人关注用于诊断BE的生物标记物，然而，由于大多数BE患者不会发展到EAC，这一BE生物标记物需要结合生物标记物(或生物标记物组)以鉴定高风险的发育不良患者。根据上述测序数据，TP53突变符合良好的风险分层候选标记物的标准，原因是TP53突变在具有和不具有高度发育不良的患者之间进行区分，这是治疗性干预的关键点。虽然所述装置采集异常组织，但大部分所收集的细胞来自胃的顶部的正常胃腺体组织以及食管的正常鳞状区域，并且因此任何突变DNA在理论上都是少数的，这就需要非常一个敏感的测试(图10a)。这种情况类似于血液中不含肿瘤细胞的DNA的检测，作为晚期恶性肿瘤疾病的生物标记物：已开发了灵敏的测定用以在正常背景下检测极低水平的突变DNA26,27。因此，本发明人采取了类似于在CytospongeTM物质上检测突变的方法。
为了确定CytospongeTM所收集的物质中是否能检测到BE病变中的突变，本发明人首先测试了以前在内镜BE活检中所鉴定的突变。4个具有HGD发育不良的患者具有TP53突变且还吞咽了CytospongeTM(患者4中是两倍)。对于所有的4个患者，检测到特异TP53突变的等位基因分数(变体比例的读数)在0.04和0.24之间(图10b)。
然后，本发明人测试了本发明人是否可以如临床测试所需，在使用CytospongeTM收集的物质中检测未知的TP53突变。本发明人通过多重PCR扩增了TP53的编码区的大部分(1019/1182bp(86％))并通过大规模并行测序 对扩增的DNA进行测序。在来自对照患者(无BE)、无发育不良的BE患者以及具有高度发育不良的BE患者的样品中，TP53突变被称为使用TAm-Seq26从头测序。如本发明人所预期，在来自对照患者或无发育不良的BE患者的样品中未鉴定出TP53突变(图10c)，这证明了在患有HGD的患者和无发育不良的患者之间的区分有100％的特异性。相比之下，在19/22(86％)的HGD患者中鉴定出TP53突变。TP53突变的等位基因分数变化很大(在0.006至0.357之间)，但在此范围中就可以被认为是成功的，且如所预期，突变大多数集中于DNA结合结构域中(图10d)。
讨论
BE是唯一已知的EAC的癌前病变，其共同发生于呈现从头测序的病例的>80％的病例中28，然而，大多数的BE患者将永远不会发展成浸润性疾病 29。因此，需要能够鉴别那些处于发展风险中的患者的灵敏性和特异性的生物标记物。早在Nowell假说时，已经认为逐步检测基因突变对于癌症发展是必需的30。体细胞基因变异因此应该是疾病阶段的高度灵敏且特异的标记物。通过在患有永不发展成发育不良的BE患者的队列中以及患有HGD的患者的队列中筛选本发明人的反复突变的基因组，本发明人希望鉴定出跨这些疾病阶段的步进式突变积累。惊奇的是，本发明人以可检测的等位基因分数(>10％)鉴定出在永不发育不良的BE中发生的大量突变。有趣的是，EAC中最普遍的基因突变也以相同频率存在于BE和HGD样品中，这包括在癌症相关基因(如ARID1A和SMARCA4，其是SWI/SNF复合物的成员)中的突变。这些数据证明了甚至可以存在于具有完全良性的肿瘤组织病理学外观和非常低的恶性肿瘤进展风险的组织中的复合物突变情况。这些突变在这种疾病发展早期阶段中的确切作用仍然不清楚。然而，已知的是克隆扩长经常发生于BE中，并且可能这些突变使克隆的拟合度提高而不导致上皮结构受损或为浸润提供必要的细胞特征。类似的观察结果已报道于子宫内膜癌中。在正常人群中，约35％的女性在其子宫内膜组织中含有PTEN突变腺体，但子宫内膜癌的终身风险是约2.5％31。
本发明的结果对于测试的特异性(目的是对恶性肿瘤的早期诊断使用高灵敏度的突变检测)具有显著意义32。预测处于癌症风险中的个人的生物标记 物需要具有显著的预测能力，以区分将发展成癌症的个人和不会发展成癌症的个人。在本发明人的研究中，排除了EAC中几乎所有的反复突变基因(包括ABCB1、CNTNAP5、MYO18B及其它)用于作为发展风险的监测工具。仅TP53和SMAD4中的突变准确限定了疾病状态的边界。SMAD4的突变仅发现于EAC中这一事实在EAC和HGD之间提供了明显的遗传差异。然而，SMAD4突变的低频率(13％)使其成为生物标记物开发的次佳候选物。此外，由于内镜治疗的出现，HGD而不是EAC现在是临床干预的理想点。因此，本发明人专注于TP53用于原理验证的CytospongeTM研究。测序技术现在已经被引入到常规临床使用中，且可以迅速且异常灵敏地对目标基因进行测序，这产生了定量读数26。
我们使用简单的临床上可应用的测试在86％的HGD CytospongeTM样品中检测到了突变。为了提高任何早期检测方案的灵敏度，在少数无可检测的TP53突变的患者中鉴定驱动HGD和EAC的遗传或表观遗传变化也至关重要。此外，由于已经显示遗传多样性用于预测向BE进展，实施着眼于基因的组中突变的存在和相对比例的体细胞突变测试，用以鉴定具有高风险疾病的患者，这是可能的33。
总之，永不发育不良的BE具有在EAC中影响反复突变的基因的频繁突变。鉴于在永不发育不良的BE中进展至恶性疾病的低速率，这些突变在通向恶性肿瘤的道路上的作用还不清楚。普遍认为，肿瘤中所观察到的突变在线性发展中增加，其中每一步都使克隆更接近于浸润终点。本发明人在未继续发展恶性肿瘤的患者的组织中的几乎所有的反复突变的基因中对突变的观察结果反驳了这些突变在发展至癌症中的作用。虽然它们的反复性质表明了在癌前病变阶段在克隆扩张中的作用，但其似乎并没有提供恶性肿瘤进展的可能性的任何长期的增加。
从临床角度，由于EAC中大多数的反复突变的基因在疾病的癌前病变和恶性肿瘤阶段之间没有区分，因此其不能在简单的二元测试(即突变或非突变)中作为恶性肿瘤进展的生物标记物进行应用。CytospongeTM提供了整个食管粘膜的代表性样品并结合高通量测序，可以灵敏且客观地检测HGD。这种方法可根据本发明人对该疾病所涉及的遗传基础的理解而被简单的改造。此外，本发明人的用于鉴别在区分浸润性疾病和浸润前疾病的步骤中涉及的关 键突变的系统分子方法，可适用于可接受早期检测的其它的上皮细胞癌。
方法
样品收集、病理学回顾和提取
研究经机构伦理委员会(REC Ns 07/H0305/52和10/H0305/1)批准，并且所有患者获得个人知情同意书。对于发现队列，前瞻性募集食管腺癌(EAC)患者，并从手术切除物或内镜超声(EUS)中获得样品。将血液或正常鳞状食管样品(与肿瘤至少相距5cm)用作种系参考。收集之后立即将所有的组织样品在液氮中速冻并储存于-80℃。提取DNA之前，从各个食管组织样品中切下一片并进行H&E染色。仅在两位病理学专家共同确认肿瘤细胞数≥70％之后，才认为癌症样品适合于提取DNA。不能获得血液时，将相同的审查程序应用于正常的食管样品中以确保仅存在鳞状上皮细胞。对于发现队列，从2个中心(剑桥和南安普敦)筛选127个案例。63个案例具有满足ICGC标准所需的70％的细胞数，其中22个肿瘤：正常配对具有足够质量和数量的DNA提取物(总产率≥5μg)，并进行全基因组测序。从剩余的105个可用的案例中，90个具有>50％的细胞数且所有的这些都有足够的DNA用于扩增子测序。对于发现和验证队列中的所有案例，具有260/280比值1.8-2.1。对于浸润前疾病队列，本发明人筛选了本发明人的>500个患者的完整10年的前瞻性巴雷特队列，其中具有可用的冰冻物质，且对冰冻切片的检查揭示了发育不良的均一等级，这在专家的组织病理学检查后。CytospongeTM样品全部都是作为正进行的前瞻性案例-对照研究(BEST2)的中期分析的一部分而可获得的那些。
根据制造商的说明，使用DNeasy试剂盒(Qiagen)从冰冻食管组织中提取DNA并使用NucleonTM基因组提取试剂盒(Gen-Probe)从血液样品中提取DNA。为了验证，根据制造商的说明，使用AllPrepDNA/RNA Mini试剂盒(Qiagen)提取DNA。
全基因组测序
为每个样品创建单个文库，并根据合同由Illumina实施100bp的配对-末端测序至至少50×的典型深度，94％的已知基因组被测序至至少8×的覆盖率，而对于至少80％的定位碱基(mapping base)达到至少30的PHRED品质。 通常，5道的HiSeq-2000(Illumina)流动室实现这一点，但样品未多重化，所以一些大幅度地超过这些最低标准。使用Burrows-Wheeler比对(BWA)1，过滤的读取序列定位到人参考基因组(GRCh37)上，并使用Picard标记重复(http://picard.sourceforge.net)。作为全面的质量保证流程中的一部分，在每道基础上计算QC指标和比对统计。确定每个发现队列样品的汇总QC。确定QC后被移除的流动室内的任何小区(tile)的细节。
使用FastQC软件包(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)来评估测序读数的质量得分分布，并能实现由于在测序的较晚循环中质量下降而需要整理的三道测序的鉴定。
WGS突变调取(calling)
使用SomaticSniper V1.0.22运行如下命令来预测体细胞单核苷酸变异(SNV)：
somaticsniper-q 1-Q 15-F vcf-J-r 0.001000-T 0.850000-N 2-s 0.01-f
然后使用如下标准过滤来自SomaticSniper的输出，其中标准来自应用于SomaticSniper和VarScan 23的启发式过滤的比较，并使用Koboldt等人3所提供的脚本和自定义脚本(均聚物过滤)来实施。
1.种系和肿瘤样品覆盖≥10
2.在读数中的平均变异位置在位置10和90之间
3.各个链的支持读取的百分比≥1％且≤99％
4.总支持读数≥4
5.支持读数从有效的3'端的变异碱基的平均距离≥20bp
6.参考和变异支持读数之间的平均定位质量差异<30
7.参考和变异读数之间的整理序列长度上的平均差异<25bp
8.参考和变异读数之间的不匹配质量总和差异<100
9.相邻的均聚物<5bp
10.最近的插入缺失≥40bp
此外，将所有的变异与dbSNP129相比较，且如果与预测的种系SNP相重叠则删除。可定位的基因组的99.7％的中值在肿瘤中被覆盖至少10倍的覆 盖率并匹配种系样品，并因此则被定义为可调取的(callable)。
将候选体细胞插入缺失作为SAMtools4和Pindel5之间的共识，过滤以排除那些存在于22个样品中任一个的匹配的正常基因组中的插入缺失(包括非共有的插入缺失调取)。人工检查落入编码区和剪接位点的插入缺失以生成调取的最终清单。用序列本体论术语(ontology term)标注变异以描述相对于Ensembl基因注释的结果和位置。还用UniSNP中的匹配或最接近的特征标注SNV和插入缺失。
通过PCR验证插入缺失变体
随机选择通过人工检查确认的总计25个编码插入缺失用于验证。设计引物(依需求可用的序列)以扩增预测的变体位置。在肿瘤和正常DNA中进行PCR并将所得的产物进行桑格测序。使用Chromas lite 2.01将所有痕迹可视化并人工检查变体的存在。如果插入缺失仅存在于肿瘤痕迹中，则插入缺失被认为是体细胞的。
通过靶向重测序验证单核苷酸变体
作为本发明人SNV调取流线的较大台式标记的一部分，本发明人选择了2007个SNV进行验证。这些SNV包括那些未能过滤的和那些利用Illumina管道、ELAND比对加STRELKA所预测的。这些数据进行全面测定，整体目的在于优化本发明人的SNV调取流线(callingpipeline)的灵敏度。在初步分析并与ICGC台式标记比较后，本发明人选择增加本发明人的过滤对于这一试点数据组的严谨性(如上详述)。在本文中的验证数据仅针对通过这些额外过滤的那些的SNV。假定的非同义的SNV(总计1330)经历超高深度的靶向测序。对于8个样品，将所有的非同义变体(synonymous variant)送去验证。在剩余的14个案例中，所选择的SNV被限制在在多于一个样品中突变的基因中的非同义变异。生成、索引和汇总扩增子，并构建文库(如Shah等人6)。分别汇总样品，并为各个样品生成单个道的HiSeq-2000数据，形成的覆盖的典型深度为13855(IQR：3408至39059，对于扩增子而言)。对于这些中的1086个，针对肿瘤和正常细胞都生成≥50倍的覆盖。如果在匹配的正常样品中变体等位基因频率为≤1％且在肿瘤中≥2％，则SNV被确认是体细胞的，并且1081个SNV符合这些标准，产生1081/1086(99.5％)的验证率。
独立样品中的突变验证
在90个额外的EAC和109个BE活检的队列中进行突变验证，在所述109个BE活检中包括43个组织病理学证实为HGD的BE活检和66个无发育不良的BE活检。使用Access Arraymicrofluidics PCR平台(Fluidigm)结合高通量测序(Illumina)用于靶向重测序。
使用Fluidigm内部软件(依需求可用的引物)7设计具有180bp中值大小(范围为100-200bp)的扩增子。在引物设计的2次迭代之后，一个基因没有被合适的扩增子(DIRC3)所覆盖，将其从进一步的分析中移除。因此，选择了总计26个基因。用附加在5'端的通用序列(被称为CS1和CS2)合成所有的引物。
使用制造商的标准多重方案(Fluidigm，Access Array User Guide)进行目标扩增和样品条码化。引物被合并成具有1至12个引物对的多个多重池。使用Access Array系统将PCR试剂(FastStart High Fidelity PCR System,Roche)与47个DNA样品(50ng)加单个阴性对照以及48组多重引物组合，形成2,304个独特的35nL的PCR反应。然后应用热循环以通过PCR扩增所选的所有目标。PCR后，使用收集试剂通过样品入口针对每个样品收集48个多重反应的扩增产物(每个样品)，以用于随后的测序。通过PCR的另外的15个循环，连接Illumina测序衔接子和10bp样品特异性条码。在将PCR产物条码化后，使用Agilent 2100生物分析仪分析来自少量样品和水对照的PCR产物，以确保获得所预期的扩增子大小并确保没有跨PCR反应的污染。然后将其合并在一起，并使用1.8:1.0的珠与扩增子之比，使用AMPure XP珠进行纯化。文库使用Agilent生物分析仪定量并进行Illumina簇生成。根据制造商推荐，使用针对读数1、读数2(索引读数)和读数3的靶向CS1和CS2标签的自定义测序引物，在具有10-碱基索引(条码)读数的aHiSeq 2000或MiSeq上进行100至150bp配对末端测序。
先前已报道了用于分析使用TAm-Seq产生的靶向测序数据的方法7。使用允许零错配的已知条码列表使读取去多重化。以配对末端模式使用BWA单独将各组读数与hg19参考基因组相比对1。使用所期望的基因组位置，各组比对读数被进一步分离成其组成型扩增子。使用SAMtools v1.174为每个扩增子生成堆叠(pileup)。使用截断值为30的碱基质量和定位质量，计算所观察到的跨所有的扩增子和条码的每个测序的基因座的非参考等位基因的频 率。对于每个基因座和碱基，将非参考背景等位基因频率/读数的分布模型化，并计算获得所观察到的读数的频率/数量(或更大)的可能性。基于0.9995的截断值(置信边界)的可能性鉴定推定的取代。放弃已知的来自1000个基因组的项目的SNP、dbSNP版本135和覆盖扩增引物的区域。放弃在多于半数的测序样品中所观察到的>5％的等位基因频率的任何的取代。使用GATK预测序列的小的插入和删除。用序列本体论术语标注剩余的所有推定的突变，以描述相对于Ensembl基因注释的结果和位置。在最终列表中，保留了在至少100倍覆盖的基因座上具有10％或更高的等位基因频率的所有的无义或错义外显子突变和剪接突变。
在此阶段，去除3个在所有样品中的序列覆盖率差的基因：TLR1、TLR7和TLR9，留下总计23个基因用于进一步分析。
为了验证所调取的突变，使用靶向于原始样品的所述区域和DNA的CS1-/CS2-标记的引物对重新扩增由Fluidigm Access Array测序所鉴定的所有非同义突变。在可用情况下，使用相同的标记的引物对还扩增来自匹配的正常样品(血液、十二指肠或正常鳞状上皮细胞)的DNA。在5μl反应物(0.1 高保真DNA聚合酶(New England Biolabs)，1×Phusion缓冲液，4.5mM MgCl2，5％的DMSO，0.2mM dNTP，1μM正向和反向引物，25ng基因组DNA)中进行扩增。PCR循环条件如下：50℃2分钟，70℃20分钟，95℃10分钟，然后10个循环的95℃15秒、60℃30秒、72℃1分钟，然后2个循环的95℃15秒、80℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟，然后8个循环的95℃15秒、60℃30秒和72℃1分钟，然后2个循环的95℃15秒、80℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟，以及8个循环的95℃15秒、60℃30秒、72℃1分钟，然后5个循环的95℃15秒、80℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟。扩增后，每个PCR反应各收集2μL并合并12个反应的批次，使得各个池中仅包含唯一的独特扩增子。此后，将5μL的合并反应混合物加入到2μL的 (Affymetrix)中。于37℃孵育样品15分钟，随后80℃孵育15分钟。将所得的产物1：100稀释在无菌水和Illumina测序衔接子中，并且使用另外的15个循环的PCR，将10bp的条码结合至各个池(PCR体系为：0.1单位的高保真DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)，1×Phusion缓冲液，4.5mM MgCl2，5％的DMSO，0.2mM dNTP，1μM的正向和反向条码引物， 1μL的处理的PCR产物(1：100稀释度))。循环条件如下：95℃热激活2分钟，然后15个循环的95℃15秒、60℃30秒和72℃1分钟，然后72℃3分钟的最终延伸步骤。
如上，使用Agilent 2100生物分析仪首先分析条码化后的PCR产物，以确保获得所预期的扩增子大小。然后将其合并，使用1.8:1.0的珠与扩增子之比，使用AMPure XP珠进行纯化。文库使用KAPA文库定量试剂盒(KAPA Biosystems)在480(Roche)上定量，稀释至2nM，并进行Illumina簇生成和在Illumina MiSeq(150bp配对末端)上的测序。使用允许零错配的已知条码列表使读取去多重。以配对末端模式，使用BWA将各组读数与hg19参考基因组独立比对1。使用Samtoolsmpileupv1.174针对推定体细胞突变的位置上的各个核苷酸产生计数。将突变等位基因频率≥3％且覆盖深度≥50的样品认为是经验证的突变。此外，匹配的正常样品(matched normal)中的突变等位基因频率要求<1％。此外，本发明人从没有正常匹配的那些样品中移出所有突变，所述样品在具有测序的正常匹配的样品队列中被认为是种系。
胶囊海绵样本的处理
CytospongeTM胶囊被患者吞咽，然后直接放入4℃的保存溶液中直至进一步处理。将样品剧烈涡旋并用力振荡以从海绵材料中去除任何的细胞。1000RPM离心包含细胞的保存液5分钟以沉淀细胞。将所得的沉淀重悬于500μL的血浆中，然后加入10μL增量的凝血酶(诊断试剂，Oxford，英国)直至形成凝块。然后将凝块置于福尔马林中24小时，加工成石蜡块。切下10微米的切片(8次)并置于管中用于提取DNA。
从Cytosponge样品中提取DNA
使用脱蜡缓冲液(Qiagen)和QIAamp FFPE DNA组织试剂盒(Qiagen)从经处理的CytospongeTM FFPE凝块的8×10μm切片提取基因组DNA。按制造商描述的方案实施，不同之处在于将样品于56℃孵育24小时，而不是所描述的1小时，并且在24小时孵育的约半程时，加入10μl的额外的蛋白酶K。提取后，使用QubitTM dsDNA HS测定试剂盒(Invitrogen)定量DNA。
TP53突变的测序
使用多重TP53PCR实验对TP53基因的编码区进行测序。所述多重由14个引物对7组成，这14个引物对被分成2个不同的池。表12和13描述了 各个引物的序列、其扩增的基因组区域(针对人类基因组的hg19版本校正坐标)以及其所属的池。
使用Q5Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix(New England Biolabs)一式两份进行所有的p53多重PCR。首先使用PCR混合物扩增TP53基因的编码区，其中所述PCR混合物由1×Q5master mix、5％的DMSO、终浓度为50nM的各个引物对和达到70ng的Cytosponge样品中提取的FFPE DNA。PCR的循环条件是：95℃30秒进行初始变性，然后30个循环的95℃10秒、60℃10秒和72℃15秒。还包括72℃2分钟的最终延伸以确保所有PCR产物的延长。
在第一轮PCR后，将2.5μL的池1和2.5μL的池2合并在一起。将2微升的IllustraExostar 1-Step(GE Healthcare UK Ltd)加入到所合并的5μL的PCR产物中，并进行Exostar反应(37℃15分钟，然后80℃15分钟)以降解第一反应的引物。然后将1微升的合并的经Exostar处理的产物加入到条码PCR中，以添加独特的条码以及添加测序引物至PCR产物。该第二次PCR所用的条码来自Forshew等人7，并且条码(barcode)引物的核心序列列于表14。使用Fluidigm条码引物，这是因为其包含结合存在于第一p53引物中的CS1和CS2序列以及Illumina衔接子。条码PCR混合物由1×Q5master mix、5％的DMSO、终浓度为400nM的各个条码引物对和1μL的未稀释的经Exostar处理的DNA。PCR的循环条件是：98℃30秒进行初始变性，然后14个循环的98℃10秒、60℃10秒和72℃30秒。还包括72℃2分钟的最终延伸以确保所有PCR产物的延长。
在CytospongeTM样品上用于检测TP53突变的TAm-seq SNV和插入缺失调取
通过从背景突变率的基因座特异性分布中选择离群值来调取插入缺失。将各个样品中的候选的插入和删除与其它每个患者样品中相同基因座上的插入和删除率相比较，并由z得分的平均值进行评分。保留z得分大于或等于10、至少200×覆盖和至少5个支持读数的插入缺失。
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实施例11：统计分析
本文中，本发明人示出了详细的统计分析，其显示不同的生物标记物组合对灵敏度和特异性的效果。数据看起来很好且测定4个生物标记物确实具有优势。如下列出2个表：一个仅用于高度发育不良，一个用于任意的发育不良。
表格示出了来自任意发育不良的结果(低度、高度和不确定)：
该表格显示仅高度发育不良的结果：
最后列中的分数是灵敏度和特异性的总和。分别看待它们并考虑方差仍是重要的。
因此，可以选择标记物组合以最大化灵敏度并最小化特异性的损失。
实施例12
在该实施例中，本发明人示出了风险分层生物标记物检测CytospongeTM上的发育不良的效果。
LGD＝低度发育不良，HGD/IMC＝高度发育不良/粘膜内癌。
#生物标记物阳性 ≥1 ≥2
灵敏度 95 90
特异性 53 87
实施例13
在此实施例中，本发明人示出了单独或一起时的p53IHC和核酸(通过测序)的数据。
虽然本文已经参考附图详细公开了本发明的示例性实施方式，可以理解的是，本发明并不限于这些准确的实施方式且本领域技术人员可以进行各种变化和修饰而实现，而不脱离本发明由权利要求和其等同物所限定的范围。
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Claims (17)

1.测定来自受试者的细胞样品中至少4种标记物的试剂在制备用于帮助检测在受试者的食管中的表面异常的试剂盒中的用途，其中所述表面异常选自低度发育不良(LGD)、高度发育不良(HGD)、无症状食管腺癌(OAC)和粘膜内癌(IMC)，其中所述样品包含收集自受试者的食管表面的细胞；
其中所述标记物选自：
(i)p53，
(ii)c-Myc，
(iii)AURKA或PLK1，和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；
其中检测出至少4种所述标记物的异常水平时，则推断受试者具有食管中的表面异常的增加的可能性，其中所述细胞是使用胶囊海绵通过无偏采样收集的。
2.如权利要求1所述的用途，其中测定包括：
(1)使所述细胞与用以检测至少第一分子标记物的试剂相接触，其中第一分子标记物选自：
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA或PLK1；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；和
(2)使所述细胞与用于检测至少第二分子标记物的试剂相接触，所述第二分子标记物选自(i)至(iv)。
3.如权利要求1所述的用途，其中标记物(iii)是AURKA。
4.如权利要求2所述的用途，其中标记物(iii)是AURKA。
5.如前述权利要求1至4中任一项所述的用途，所述测定进一步包括测定所述细胞的非典型性，其中根据Vienna标准按其形态对细胞进行评分来评估非典型性。
6.如前述权利要求1至4中任一项所述的用途，其中通过食道表面的无偏采样收集所述细胞。
7.如权利要求6所述的用途，其中使用胶囊海绵收集所述细胞。
8.如前述权利要求1至4中任一项所述的用途，其中在与用于所述检测分子标记物的试剂相接触之前，通过如下步骤制备细胞：(i)离心使细胞沉淀，(ii)在血浆中重悬所述细胞，和(iii)加入凝血酶并孵育直至形成凝块，在福尔马林中孵育所述凝块，加工成石蜡块，并切成适合于显微镜检查的切片的步骤。
9.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中通过免疫组化评估p53。
10.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中通过检测一个或多个p53突变来评估p53。
11.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中通过免疫组化评估p53，并且其中还通过检测一个或多个p53突变来评估p53。
12.用于测定来自受试者的细胞样品中至少4种标记物的试剂在制备用于选择治疗方案的试剂盒中的用途，其中所述样品包含收集自受试者的食管表面的细胞，
其中所述标记物选自：
(i)p53，
(ii)c-Myc，
(iii)AURKA，和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；
其中如果检测到至少4种所述标记物的异常水平，则选择内镜和活检的治疗方案，其中所述细胞是使用胶囊海绵通过无偏采样收集的。
13.一种装置或系统，其
(a)经配置以分析来自受试者的食管样品，其中所述分析包括
(b)测定所述样品的至少4种标记物，其中所述标记物选自
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA；和
(iv)MyoD和Runx3的甲基化；
所述装置或系统包括输出模块，
其中，如果检测到至少4种所述标记物的异常水平，则所述输出模块指示在所述受试者的食管中有表面异常的增加的可能性，其中所述表面异常选自低度发育不良(LGD)、高度发育不良(HGD)、无症状食管腺癌(OAC)和黏膜内癌(IMC)，其中所述样品是使用胶囊海绵通过无偏采样收集的。
14.物质在制备用于帮助检测受试者食管中的表面异常的药剂中的用途，所述物质识别、结合至少四种蛋白或核酸序列的甲基化，或者对至少四种蛋白或核酸序列的甲基化具有亲和力，其中所述表面异常选自低度发育不良(LGD)、高度发育不良(HGD)、无症状食管腺癌(OAC)和粘膜内癌(IMC)，所述蛋白和/或核酸序列如权利要求1至11中任一项所限定。
15.如权利要求14的用途，其中每个所述物质均识别、结合一种或多种所述蛋白或核酸序列，或者对一种或多种所述蛋白或核酸序列具有亲和力。
16.一种测定装置，用于帮助检测受试者食管中的表面异常，所述装置包括固体基底，所述基底上具有含有物质的位置，所述物质识别、结合至少四种蛋白或核酸序列的甲基化或者对至少四种蛋白或核酸序列的甲基化具有亲和力，其中所述表面异常选自低度发育不良(LGD)、高度发育不良(HGD)、无症状食管腺癌(OAC)和粘膜内癌(IMC)，其中所述蛋白和/或核酸序列如权利要求1至11中任一项所限定。
17.一种试剂盒，其包括用于测定在生物样品中以下各个物质的表达水平的试剂：
(i)p53；
(ii)c-Myc；
(iii)AURKA；
并且进一步包括用于测定MyoD和Runx3的甲基化的试剂。
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