CN108680424A - 多组织石蜡块及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多组织石蜡块及其制备方法，制备方法包括：筛选不同组织来源的阳性组织，将至少两种阳性组织包埋于同一块石蜡中得多组织石蜡块；筛选每种阳性组织包括：石蜡包埋组织样本，得单组织石蜡块，切片，将切片HE染色，镜检，找到具有代表性的阳性组织区域；根据代表性阳性组织区域与其来源的单组织石蜡块的相应位置，定位单组织石蜡块中阳性组织区域的部位；将单组织石蜡块融化，将所定位的有代表性阳性组织的区域切割下来，不改变组织之前的包埋面，放在包埋模具中待用。本发明所得多组织石蜡块，携带至少两种抗原，以此制备切片，能够用于至少两种不同抗原的检测，克服了单组织石蜡块使用范围窄、使用过程中制片工作量大的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种多组织石蜡块及其制备方法。
背景技术
免疫组化学技术是在常规HE染色和组织学染色的基础上，根据抗原抗体反 应原理而发展起来的染色技术，广泛用于病理学研究和临床病理诊断，是临床 病理诊断中重要的辅助技术之一，对于判断肿瘤的来源、分类、预后和鉴别诊 断以及指导和评估临床治疗起着重要作用。免疫组化技术具有特异性强，敏感 性高，定位、定性、定量准确，应用范围广等优点，但是由于实验条件的差别 和技术因素的影响，使得免疫组化染色结果差别很大。
正是因为免疫组化染色结果受多种因素的影响，因此在染色过程中，设立 对照非常必要，以确保染色结果的可靠性，加入对照片染色是免疫组化实验室 质量控制的重要手段，对照主要有阳性对照和阴性对照。阳性对照的意义主要 是要证实第一抗体和检测试剂盒效价是否可靠，染色操作是否正确，抗体敏感 性的高低，以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性或者假阳性，确保染色结 果的可靠。阴性对照的意义主要是确保没有非特异性染色的假阳性结果。一般 来说阴性对照和阳性对照应同时进行，其中阳性对照呈阳性时，阴性染色结果 才有意义，在用同一种条件如同一种抗原修复方法、同一种检测试剂盒染色时， 即使对不用的组织进行不同抗原检测，一般都只需要用一张阴性片，而不需要 对每种抗体配多张相应的阴性片。
传统免疫组化操作过程中所采用的组织切片是石蜡切片，主要是将含有携 带一种抗原的组织用石蜡包埋后将所形成的石蜡块切成3～5μm制备而成。传 统情况下，一块石蜡块仅包埋一种病理组织，携带这种组织所带的几种抗原， 用这样的石蜡块制备成的切片仅能作为用于几种抗原的检测，该现状导致免疫 组化检测工作量大、繁琐，并且病理组织样本收集困难。
发明内容
基于此，有必要提供一种包埋多种组织的、集多种抗原于一体的多组织石 蜡块。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种多组织石蜡块的制备方法，包括以下步骤：
筛选不同组织来源的阳性组织，将至少两种阳性组织包埋于同一块石蜡中 获得多组织石蜡块。
在其中一些实施例中，筛选每种阳性组织，包括以下步骤：
(1)石蜡包埋组织样本，得单组织石蜡块，切片，将切片HE染色，镜检， 找到具有代表性的阳性组织区域；
(2)根据该代表性阳性组织区域与其来源的单组织石蜡块的相应位置，定 位单组织石蜡块中阳性组织区域的部位；
(3)将单组织石蜡块融化，将所定位的有代表性阳性组织的区域切割下来， 不改变组织之前的包埋面，放在包埋模具中待用。
在其中一些实施例中，将放在同一包埋模具中不同的所述阳性组织一起进 行重新包埋，即得。
在其中一些实施例中，所述制备方法还包括对多组织石蜡块进行冷冻、切 片、将切片HE染色、镜检，验证至少两种阳性组织均被包埋的步骤。
在其中一些实施例中，所述阳性组织为可表达多种抗原的组织。
在其中一些实施例中，所述可表达多种抗原的组织为阑尾组织。
在其中一些实施例中，所述可表达多种抗原的组织为扁桃体组织。
在其中一些实施例中，所述可表达多种抗原的组织为乳腺癌组织、子宫肌 瘤组织中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述可表达多种抗原的组织为良性前列腺增生组织。
本发明的另一目的还在于提供一种上述制备方法获得的多组织石蜡块。
与现有技术相比，本申请具备如下有益效果：
本发明将至少两种不同组织来源的阳性组织，包埋于同一石蜡块中，获得 多组织石蜡块，该多组织石蜡块由于携带有至少两种组织的抗原，以此制备的 切片，能够用于至少两种不同抗原的检测，克服了单组织石蜡块使用范围窄、 后期使用过程中制片工作量大的缺陷。同时，本发明多组织石蜡块中阳性组织 数多于待检测组织样本数时，所得相应的多组织阳性对照片中，含有待检测抗 原的阳性组织充当阳性对照而其余不含有该抗原的阳性组织则充当阴性对照， 因此兼具阴性对照、阳性对照的双重功能。
进一步地，本发明多组织石蜡块中的阳性组织是从组织样本中筛选出来的 具有代表性的、阳性表达区域集中的组织，特别地，该阳性组织是可表达多种 抗原的组织，能够覆盖到70～90种常用抗体的检测使用，收集并制作一次，便 可以得到大量合格的阳性参照物蜡块，大大的节约了人力和成本。并且，所得 的多组织石蜡块容易保存，并且可以长久保存，具有长久的稳定性。
附图说明
图1至图5是实施例2的应用结果图；
图6是实施例1所得多组织石蜡块的验证结果图；
图7至图13是实施例3的应用结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的多组织石蜡包埋块及其制备、应用作进一 步详细的说明。为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但 是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相 反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术 领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术 语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的 术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1、多组织石蜡块及其制备方法
本实施例提供的多组织石蜡的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：取阑尾1条，长约0.5cm，将阑尾纵剖成等大小两份，分别放进包 埋盒中，按照常规操作，进入全自动脱水机中脱水、浸蜡，石蜡包埋，3μm厚 度切片，得石蜡切片及带有切面的阑尾组织石蜡包埋块，所得石蜡切片经贴片、 烤片、脱蜡、水化后HE染色，显微镜观察定位阳性组织区域，显微镜观察定位， 根据被染色区域与所述切面的对应关系，在阑尾组织石蜡包埋块上定位代表性 的阳性组织；
来源于阑尾的具有代表性的阳性组织所包含的抗原有：CK7、CK20、 CK8/18、CK、EMA、CEA、ALK、MSH6、MLH1、MSH2、PMS2、CD10、 CD3、CD20、Vim等。
步骤2、将以上石蜡包埋块融化，用切割刀将所选取的含有融蜡的代表性的 阳性组织切割下来，不改变石蜡包埋块的包埋面，放在包埋模具中待用。
步骤3、取大小约0.5cm×0.5cm×0.3cm的扁桃体组织多块，按照常规操作， 进入全自动脱水机中脱水、浸蜡，石蜡包埋，3μm厚度切片，得石蜡切片及带 有切面的扁桃体组织石蜡包埋块，所得石蜡切片经贴片、烤片、脱蜡、水化后 HE染色，显微镜观察定位，根据被染色区域与所述切面的对应关系，在扁桃体 组织石蜡包埋块上定位代表性的阳性组织；
来源于扁桃体组织的具有代表性的阳性组织所包含的抗原有：Bcl-2、Bcl-6、CD4、CD38、CD123、CD163、CD43、CD5、CD20、CD23、CD21、CK、CyclinD1、 CD45RO、CD79a、CD68、CD3、CD138、CD61、P40、Ki-67、CD5/6、P63、 MPO、PAX-5、TIA-1、MUM-1、TOPO-II、Vim、CD10等。
步骤4、将该蜡块融化，用切割刀将所选取的有代表性组织的区域切割下来， 不改变组织之前的包埋面，放在包埋模具中待用。
步骤5、取大小约1.5cm×1.5cm×0.3cm的乳腺癌组织多块，按照常规操作， 进入全自动脱水机中脱水、浸蜡，石蜡包埋，3μm厚度切片，得石蜡切片及带 有切面的乳腺癌组织石蜡包埋块，所得石蜡切片经贴片、烤片、脱蜡、水化后 HE染色，显微镜观察定位，根据被染色区域与所述切面的对应关系，在石蜡包 埋块上定位代表性的阳性组织；
来源于乳腺癌组织的具有代表性的阳性组织所包含的抗原有：ER、PR、 Her-2、P120、GCDFP-15、Calponin、C-Myc、Vim等。
步骤6、将该蜡块融化，用切割刀将所选取的有代表性阳性组织的区域切割 下来，不改变组织之前的包埋面，放在包埋模具中待用。
步骤7、取大小约1.5cm×1.5cm×0.3cm的良性前列腺增生组织一堆，按照 常规操作，进入全自动脱水机中脱水、浸蜡，石蜡包埋，3μm厚度切片，得石 蜡切片及带有切面的良性前列腺增生组织包埋块，所得石蜡切片经贴片、烤片、 脱蜡、水化后HE染色，显微镜观察定位，根据被染色区域与所述切面的对应关 系，在石蜡包埋块上定位代表性病变组织；
来源于良性前列腺增生组织的具有代表性的阳性组织所包含的抗原有： P63、PSA、CK-H、CK、Vim等。
步骤8、将该蜡块融化，用切割刀将所选取的有代表性组织的区域切割下来， 不改变组织之前的包埋面，放在包埋模具中待用。
步骤9、取大小约1.5cm×1.5cm×0.3cm的子宫肌瘤组织一块，按照常规操 作，进入全自动脱水机中脱水、浸蜡，石蜡包埋，3μm厚度切片，得石蜡切片 及带有切面的子宫肌瘤组织石蜡包埋块，所得石蜡切片经贴片、烤片、脱蜡、 水化后HE染色，显微镜观察定位，根据被染色区域与所述切面的对应关系，在 石蜡包埋块上定位具有代表性的阳性组织；
来源于子宫肌瘤组织的具有代表性的阳性组织所包含的抗原有：SMA、Des、 Vim、S-100、Actin、Mogenin、CD34、ER、PR、Vim等。
步骤10、将该蜡块融化，用切割刀将所选取的有代表性的阳性组织的区域 切割下来，不改变组织之前的包埋面，放在包埋模具中待用。
步骤11、在不改变步骤1、3、5、7、9的切面的前提下，分别将步骤2、4、 6、8、10切割好的含有融蜡的代表性组织，放在同一包埋模具中，重新进行包 埋得到多组织石蜡块。
以上步骤中，步骤1、3、5、7、9没有先后顺序，可同时进行。本实施例 提供的多组织石蜡块中含有来源于阑尾的具有代表性的阳性组织1块、来源于 扁桃体的具有代表性的阳性组织1块、来源于前列腺的具有代表性的阳性组织1 块、来源于乳腺的具有代表性的组织1块、来源于子宫肌瘤的具有代表性的阳 性组织1块。
步骤12、取步骤11所得多组织石蜡块，冷冻，进行3um切片，HE染色， 显微镜观察，以确定上述具有代表性的阳性组织均被包埋在该蜡块中。验证结 果见图6。图中，1代表来源于阑尾的具有代表性的阳性组织，2代表来源于扁 桃体的具有代表性的阳性组织，3代表来源于前列腺的具有代表性的阳性组织， 4代表来源于乳腺癌的具有代表性的阳性组织，5代表来源于子宫肌瘤的具有代 表性的阳性组织。
表1
实施例2、实施例1的多组织蜡块的具体应用
本实施例涉及多组织石蜡块的应用，主要是对多组织石蜡块切片制备多组 织对照片，并用该多组织对照片对一个待检测的淋巴组织进行检测。具体应用 步骤如下：
步骤1、取实施例1获得的多组织蜡块，切片，获得多组织对照片。
步骤2、取待检测的淋巴组织，按照常规操作，进入全自动脱水机中脱水、 浸蜡，石蜡包埋，得到淋巴组织石蜡包埋块，3μm厚度切片，得待检测石蜡切 片。
步骤3、将步骤1所得1片多组织切片与步骤2所得1片检测石蜡切片贴在 同一个载玻片上，制备共5张制片，对所得的制片进行后续制片处理：经烤片、 脱蜡、水化后免疫染色，具体地：
烤片：68℃，20min；
脱蜡：二甲苯脱蜡，3缸，分别10min/缸；
水化：进入梯度酒精(100％酒精5min，100％酒精5min，95％酒精5min， 80％酒精5min，70％酒精5min)，流水冲洗之后进入蒸馏水浸泡3缸，每缸2min；
抗原修复：用pH为9.0的EDTA高压修复4min后，自然冷却20min以上， 用流水冲洗，流水冲洗之后进入蒸馏水浸泡3缸，每缸2min；
位点封闭：用3％过氧化氢进行阻断灭火内源性过氧化物酶10min，用流水 冲洗，苏木素复染，流水冲洗之后进入蒸馏水浸泡3缸，每缸2min，用PBS冲 洗，冲洗3次，每次5min；
加一抗、二抗：向第1张制片滴加抗CK的一抗，4℃冰箱孵育过夜，PBS 冲洗3次，每次5min，滴加二抗，37℃孵育15min，PBS冲洗3次，每次5min， DAB显色5-8min，流水冲洗，冲洗之后常规脱水，干燥，透明，封片，获得第 ①制片。参照该方法，向第2张制片滴加抗ER的一抗获得第②制片、向第3张 制片滴加抗PSA的一抗获得第③制片、向第4张制片滴加抗Vim的一抗获得第 ④制片、向第4张制片滴加抗CD10的一抗获得第⑤制片。本实施例采用的一抗、 二抗为本领域常用抗体。
对5张制片封片之后即可镜检。判读镜检结果如下(图1至图5)：
第①制片，参见图1(左是待检测淋巴组织，右是多组织对照片)：在多组 织对照片中，因阑尾组织的代表性组织部分携带CK，该代表性组织部分对应的 位置能够镜检显色，充当阳性对照的作用；扁桃体、良性前列腺增生组织中也 具有可表达CK抗体的部分，所以镜检显色；而取自其他种类的携带多种标志物 的代表性组织部分因为没有携带CK，因此在其对应的位置镜检不显色，充当阴 性对照。阳性对照显色而阴性对照不显色，检测结果有意义，待检测淋巴组织 对CK不表达。
第②制片，参见图2(左是待检测淋巴组织，右是多组织对照片)：在多组 织对照片中，因乳腺癌组织的代表性组织部分携带ER，该代表性组织部分对应 的位置能够镜检显色，充当阳性对照的作用；子宫肌瘤组织中也具有可表达ER 抗体的部分，所以镜检显色，而取自其他种类的携带多种标志物的代表性组织 部分因为没有携带ER，因此在其对应的位置镜检不显色，充当阴性对照。阳性 对照显色而阴性对照不显色，检测结果有意义，待检测淋巴组织对ER不表达。
第③制片，参见图3(左是待检测淋巴组织，右是多组织对照片)：在多组 织对照片中，因良性前列腺增生组织的代表性组织部分携带PSA，该代表性组 织部分对应的位置能够镜检显色，充当阳性对照的作用；而取自其他种类的携 带多种标志物的代表性组织部分因为没有携带PSA，因此在其对应的位置镜检 不显色，充当阴性对照。阳性对照显色而阴性对照不显色，检测结果有意义， 淋巴组织对PSA不表达。
第④制片，参见图4(左是待检测淋巴组织，右是多组织对照片)：在多组 织对照片中，因子宫肌瘤组织的代表性组织部分携带Vim，该代表性组织部分 对应的位置能够镜检显色，充当阳性对照的作用；取自其他种类的携带多种标 志物的代表性组织部分因为任携带有Vim可表达的抗原，因此在其对应的位置 镜检也显色，充当阳性对照。检测结果有意义，淋巴组织对Vim表达。
第⑤制片，参见图(左是待检测淋巴组织，右是多组织对照片)：在多组织 对照片中，因阑尾组织的代表性组织部分携带CD10，该代表性组织部分对应的 位置能够镜检显色，充当阳性对照的作用；扁桃体组织中也具有可表达CD10 抗体的部分，所以镜检显色，而取自其他种类的携带多种标志物的代表性组织 部分因为没有携带CD10，因此在其对应的位置镜检不显色，充当阴性对照。阳 性对照显色而阴性对照不显色，检测结果有意义，淋巴组织对CD10表达。
在本实施例检测中，阴性对照显阴性，阳性结果显阳性，淋巴组织对Vim 和CD10的表达检测结果可靠。
实施例3、实施例1多组织蜡块的具体应用
本实施例涉及多组织石蜡块的应用，主要是对多组织石蜡块切片制备多组 织对照片，并用该多组织对照片对多个种类的待检测的病理组织进行检测。具 体应用步骤如下：
步骤1、取实施例1获得的多组织蜡块，切片，获得多组织对照片。
步骤2、获取待检测石蜡切片：
(1)取待检测的骨髓组织，按照常规操作，进入全自动脱水机中脱水、浸 蜡，石蜡包埋，得到骨髓组织石蜡包埋块，3μm厚度切片，得待检测骨髓石蜡 切片；
(2)取待检测的乳腺组织，按照常规操作，进入全自动脱水机中脱水、浸 蜡，石蜡包埋，得到乳腺组织石蜡包埋块，3μm厚度切片，得待检测乳腺石蜡 切片；
(3)取待检测的宫颈组织，按照常规操作，进入全自动脱水机中脱水、浸 蜡，石蜡包埋，得到宫颈组织石蜡包埋块，3μm厚度切片，得待检测宫颈石蜡 切片。
步骤3、制片、免疫染色：
取步骤1所得的1片多组织切片与步骤2中(1)待检测骨髓石蜡切片贴在 同一个载玻片上，获得第一组制片；
取步骤1所得的1片多组织切片与步骤2中(2)待检测乳腺石蜡切片贴在 同一个载玻片上，获得第二组制片；
取步骤1所得的1片多组织切片与步骤2中(3)待检测宫颈石蜡切片贴在 同一个载玻片上，获得第三组制片；
对所得的第一组制片、第二组制片、第三组制片进行后续制片处理：经烤 片、脱蜡、水化后免疫染色，具体地：
烤片：68℃，20min；
脱蜡：二甲苯脱蜡，3缸，分别10min/缸；
水化：进入梯度酒精(100％酒精5min，100％酒精5min，95％酒精5min， 80％酒精5min，70％酒精5min)，流水冲洗之后进入蒸馏水浸泡3缸，每缸2min；
抗原修复：用pH为9.0的EDTA高压修复4min后，自然冷却20min以上， 用流水冲洗，流水冲洗之后进入蒸馏水浸泡3缸，每缸2min；
位点封闭：用3％过氧化氢进行阻断灭火内源性过氧化物酶10min，用流水 冲洗，苏木素复染，流水冲洗之后进入蒸馏水浸泡3缸，每缸2min，用PBS冲 洗，冲洗3次，每次5min；
加一抗、二抗：滴加目标抗原的一抗，4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3次， 每次5min，滴加二抗，37℃孵育15min，PBS冲洗3次，每次5min，DAB显色 5-8min，流水冲洗，冲洗之后常规脱水，干燥，透明，封片。本发明实施例采用 的一抗、二抗均为本领域常规选择。
封片之后即可镜检。本实施例待检石蜡切片镜检显色，镜检结果准确可靠。 判读镜检结果如下(图7至图13)：
本实施例采用多组织对照片，可同时适于对待检测骨髓石蜡切片、待检测 乳腺石蜡切片、待检测宫颈石蜡切片进行检测。
第一组制片：参见图7、图8，被检测到待检测骨髓组织CD20、CD34显色， 多组织对照片中阑尾组织的代表性组织(含CD20)、扁桃体代表性组织(含 CD20)、子宫肌瘤组织(含CD34)显色，充当阳性对照，而其余组织不显色， 充当阴性对照，检测结果可靠，可判断待检测骨髓石蜡切片中含有抗原CD20、 CD34。
第二组制片：参见图9、图10、图11，被检测到待检测乳腺癌组织ER、PR 显色而Her-2不显色，多组织对照切片中乳腺癌组织的代表性组织含有ER、 Her-2、PR，显色，子宫肌瘤组织含有ER、PR，显色，充当阳性对照，而阑尾 组织的代表性组织、良性前列腺增生组织的代表性组织、扁桃体组织的代表性 组织均不含有这三种抗原，检测中不显色，充当阴性对照，检测结果可靠，可 判断待检测乳腺石蜡切片中抗原ER、PR为阳性，Her-2为阴性。
第三组制片：参见图12、图13，被检测到待检测宫颈组织CK、CK5/6显 色，多组织对照切片中扁桃体组织的代表性组织、阑尾组织的代表性组织分别 含有CK5/6、CK，显色，充当阳性对照，而其余组织不含有这两种抗原，不显 色，充当阴性对照，检测结果可靠，可判断待检测宫颈组织石蜡切片中含有抗 原CK、CK5/6。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对 上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技 术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改 进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。
Claims (10)
1.一种多组织石蜡块的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
筛选不同组织来源的阳性组织，将至少两种阳性组织包埋于同一块石蜡中获得多组织石蜡块。
2.根据权利要求1所述的多组织石蜡块的制备方法，其特征在于，筛选每种所述阳性组织包括以下步骤：
(1)石蜡包埋组织样本，得单组织石蜡块，切片，将切片HE染色，镜检，找到具有代表性的阳性组织区域；
(2)根据该代表性阳性组织区域与其来源的单组织石蜡块的相应位置，定位单组织石蜡块中阳性组织区域的部位；
(3)将单组织石蜡块融化，将所定位的有代表性阳性组织的区域切割下来，不改变组织之前的包埋面，放在包埋模具中待用。
3.根据权利要求2所述的多组织石蜡块的制备方法，其特征在于，将放在同一包埋模具中不同的所述阳性组织一起进行重新包埋，即得。
4.根据权利要求1至3任一项所述的多组织石蜡块的制备方法，其特征在于，还包括对多组织石蜡块进行冷冻、切片、将切片HE染色、镜检，验证至少两种阳性组织均被包埋的步骤。
5.根据权利要求1至3任一项所述的多组织石蜡块的制备方法，其特征在于，所述阳性组织为可表达多种抗原的组织。
6.根据权利要求5所述的多组织石蜡块的制备方法，其特征在于，所述可表达多种抗原的组织为阑尾组织。
7.根据权利要求5所述的多组织石蜡块的制备方法，其特征在于，所述可表达多种抗原的组织为扁桃体组织。
8.根据权利要求5所述的多组织石蜡块的制备方法，其特征在于，所述可表达多种抗原的组织为乳腺癌组织、子宫肌瘤组织中的至少一种。
9.根据权利要求5所述的多组织石蜡块的制备方法，其特征在于，所述可表达多种抗原的组织为良性前列腺增生组织。
10.权利要求1至9任一项所述的制备方法获得的多组织石蜡块。
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