CN101040896A - 一种黄芪黄酮提取物、其医药用途及药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种黄芪有效部位提取物即黄芪总黄酮提取物，本发明黄芪黄酮提取物具有很强的抗心肌缺血活性。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种黄芪有效部位提取物，该提取物具有很强的抗心肌缺血活性。
背景技术
黄芪为05版《中国药典》的收载品种，蒙古黄芪(A.membranaceus var.monghollcus)和膜荚黄芪(A.membranaceus)为药典黄芪的正品药材。蒙古黄芪为豆科Leguminosae植物，别名：白皮芪(陕西)，混其日(蒙药音译)。拉丁学名Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao，为多年生草本。主根长而粗壮，条较顺直。茎直立，高40～80cm。奇数羽状复叶，小叶12～18对；小叶片小，宽椭圆形、椭圆形或长圆形，长5～10mm，宽3～5mm，两端近圆形，上面无毛，下面被柔毛；托叶披针形。总状花序腋生，常比叶长，具花5～20余朵；花萼钟状，密被短柔毛，具5萼齿；花冠黄色至淡黄色，长18～20mm，旗瓣长圆状倒卵形，翼瓣及龙骨瓣均有长爪；雄蕊10，两体(9+1)；子房光滑无毛。荚果膜质，膨胀，半卵圆形，直径11～15mm，先端有短喙，基部有长子房柄，均无毛。花期6～7月，果期7～9月。 生于向阳草地及山坡。野生或栽培。 主产于山西、内蒙古、黑龙江、河北等省。膜荚黄芪为豆科Leguminosae植物，别名：山爆仗(山东)，箭杆花(陕甘宁)。Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.(A.membranaceus)。多年生草本。高50～80cm。主根深长，条直、粗壮或有少数分枝。奇数羽状复叶，小叶6～13对；小叶片椭圆形至长椭圆形或椭圆状卵形至长圆形卵形，长7～30mm，宽3～12mm，先端钝、圆或微凹，有时具小尖刺，基部圆形，上面近无毛，下面伏生白色柔毛；托叶卵形至披针状线形。长5～15mm。总状花序腋生，通常生花10～20余朵；花萼钟状，被黑色或白色短毛，萼齿5；长为萼筒的1/5～1/4；花冠黄色至淡黄色，或有时稍带淡紫红色，长约16mm，旗瓣长圆状倒卵形，翼瓣及龙骨瓣均具长爪及短耳；子房有柄，被柔毛。荚果膜质，膨胀，半卵圆形，长20～30mm，宽9～12mm，被黑色或黑白相间的短伏毛。花期6～8月，果期7～9月。生于林缘、灌丛、林间草地或疏林下。分布于黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、山西、内蒙古、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆、四川、云南等省区。
医学研究证明黄芪具益气升阳，固表敛汗、利水消肿，托疮生肌等作用。适用于中气下陷、气虚乏力、食少便溏、便血崩漏、表虚自汗，慢性肾炎蛋白尿、糖尿病等。现有报道的黄芪有效部位提取方法一般都是以水或醇提后浓缩制得，多以黄芪多糖和黄芪甲苷等皂苷类报道为主，如CN1539464A公开了一种用超临界萃取方法制备黄芪提取物，其提取物中主要成分是黄芪多糖、黄芪甲甙、黄芪总皂甙和黄芪黄酮。CN1660167A公开了一种黄芪有效部位，它的制备方法是用乙醇提取物，提取物过大孔树脂，再用70-90％乙醇洗脱，洗脱液浓缩即得，这种黄芪有效部位中黄芪总皂甙含50-60％，黄芪黄酮甙含10-20％。CN1560069A公开了一种黄芪黄酮和黄芪皂苷同时提取分离的方法，其主要采用乙醇提取，过三联树脂，丙酮洗脱，洗脱液再过阴离子交换树脂，再洗脱，得黄芪黄酮类提取物，尽管这种方法得到的黄芪黄酮含量很高，达95％，但这种制备方法工艺过于复杂，并且产品得率较低，才0.068％，不适合工业化大生产。
发明内容
本发明公开了一种中药黄芪的有效部位提取物，更具体的是中药黄芪的黄酮类化合物提取物。
本发明的黄芪有效部位提取物由下列方法制备得到：黄芪用热水或乙醇提取，提取液浓缩；浓缩液上大孔树脂柱，用水洗脱，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩；用乙酸乙酯萃取，浓缩萃取液，干燥，即得。
上述制备中，用于提取的溶剂优选乙醇。用于提取用的乙醇浓度优选50-100％。本发明中百分比均为重量百分比。更优选的乙醇浓度是60～80％。
用于洗脱的乙醇浓度优选10～50％，进一步优选45％。
上述制备中大孔树脂优选自D101、AB-8、HPD100、HPD300、D1或D2。
用于萃取的乙酸乙酯优选水饱和用乙酸乙酯。
提取黄芪用的水或乙醇的重量优选黄芪的5～20倍
本发明所述黄芪优选蒙古黄芪。
研究发现，黄芪有效部位的制备方法中，当用水或醇提取，提取液适当浓缩后，用大孔树脂分段，依次用水，10～70％乙醇洗脱，收集每部分洗脱液，浓缩后定容，进高效液相检测，分析结果显示黄酮类成分主要集中在30％～45％乙醇洗脱液中，20％乙醇及50％乙醇均含有少量的黄酮类化合物，10％和70％乙醇洗脱液中未能检测黄酮类化合物，说明50％乙醇已能将大部分黄酮洗脱完全。而用50％乙醇洗脱部分杂质较多，黄酮含量较少。工艺再经优化后，最优的洗脱条件是依次用水及10％醇洗脱除去杂质后，再收集30～45％乙醇洗脱液，最优的洗脱液是45％乙醇，这样提取物中黄酮含量较高。具体图谱见附图1～5。
黄芪的黄酮类化合物为黄芪的有效成分之一，但是工业生产上大部分工艺均以皂苷为目标产物，极少涉及黄酮类化合物，未能真正体现黄芪的药用价值，本发明的黄酮提取物富含有黄芪所特有的异黄酮类化合物，具有良好的药理活性，其也可与黄芪皂苷类化合物合并以增加活性并更加体现中药黄芪的整体疗效。黄芪的皂苷纯化工艺一般使用大孔树脂，而收集的一般也只是70-90％醇洗部分，50％以下的醇洗部分一般弃之不用，而本发明的黄酮工艺收集的恰恰是这一部分，为同时纯化黄芪的黄酮与皂苷类成分提供了可能，因此本发明对于充分利用黄芪有效成分具有很高的实用价值，即可节省浪费，又可提高黄芪的药用价值。总黄酮中主要含毛蕊异黄酮7-O-β-D-葡萄糖苷(约35％)，其次分别为芒柄花苷(约10％)，(6aR，11aR)-9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷(约3％)，(3R)-2′-羟基-3′，4′-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-葡萄糖苷(约2％)和毛蕊异黄酮(约3％)。因此，本发明可以以这5个异黄酮类化合物为指标成分研究本发明提取物的制备工艺，并可将这5个化合物作为中间体进行质量控制。以这5个化合物的含量之和计为总黄酮的含量，本发明提取物中5个黄酮类化合物之和占总提取物52％以上。用水提取的提取物含量稍低。本发明提取物制备工艺操作，方便，成本低，无有害溶剂，生产安全性高，适合工业化生产。
药理学试验表明，本发明的提取物具有很好的抗心肌缺血作用。
本发明提取物的抗心肌缺血活性研究试验及结果
材料
药物：A是本发明的黄芪有效部位提取物；B是75％乙醇提取、浓缩的黄芪提取物；C是黄芪的水提物。
实验动物：SD大鼠，雌雄各半，220～280g
心肌缺血模型与给药：
方法1
取体重220-280gSD大鼠110只，雌雄各半，按体重随机分为11组：阳性对照组给予口服丹参片324mg/kg；模型组给予生理盐水；药物组A为本发明的黄芪的总黄酮提取物，B为75％醇提物，C为水提物。计量设置以生药浓度折算，高剂量0.60g生药/ml、中剂量0.30g生药/ml、低剂量0.15g生药/ml设置.研磨后，称取相应的药用0.5％CMC钠充分溶解，配成100ml均匀溶液。
各组给药容积均为1ml/100g。对各组大鼠实行灌胃给药，给药5天，每天一次。手术当天给药20分钟后，进行垂体后叶素注射。手术时，先将大鼠用20％乌拉坦以1.0g/kg的剂量腹腔注射麻醉后，仰卧位固定，分离一侧股静脉，记录一段正常II导心电图，观察J点的高度，T波的幅度，单个R-R的间期的长短。静脉推注脑垂体后叶素量为0.7u/kg，10秒内推完，于注射前(0sec)及注射后5sec、10sec、30sec、1min、2min、5min、10min、20min记录心电图。依据J点的高度T波的幅度，单个R-R的间期，三个不同参数，将每组大鼠注射垂体后叶素后各时间点心电图各项指标减去注射前(0sec)的指标，得相应差值，各药物组对应时间点的差值(给垂体后叶素后各时间点的值-未给垂体后叶素前的值)均与模型对照组的相应时间点的差值进行组间t检验比较，结果见表1。
表1.黄芪三种提取物对垂体后叶素所致大鼠心肌缺血J点(0.1mv)的影响 (
x±s)(n＝10)
| 药物组别 | 组间/内 | 给药前 | 给药后 | |||||||
| 5″ | 10″ | 30″ | 1′ | 2′ | 5′ | 10′ | 20′ | |||
| 模型 | 组内组间 | -0.399±0.0659 | -0.263±0.1041##(0.136±0.0901) | -0.158±0.0746##(0.241±0.0928) | -0.222±0.1389##(0.177±0.1546) | -0.195±0.0891##(0.204±0.1261) | -0.151±0.0681##(0.248±0.1068) | -0.113±0.1399##(0.286±0.1556) | -0.199±0.1421##(0.200±0.1151) | -0.302±0.0878(0.097±0.06343) |
| 丹参(阳) | 组内组间 | -0.338±0.0705 | -0.280±0.0663(0.058±0.0361*) | -0.227±0.0971##(0.111±0.0837**) | -0.329±0.0661(0.009±0.0965**) | -0.234±0.0950#(0.104±0.0775*) | -0.207±0.0794##(0.131±0.0540**) | -0.187±0.0933##(0.151±0.0572*) | -0.268±0.0907(0.07±0.0449**) | -0.310±0.0823(0.028±0.0449*) |
| A高剂量 | 组内 | -0.097±0.06913 | -0.013±0.0516##(0.084±0.0510) | 0.032±0.0809##(0.129±0.0684**) | -0.0290±0.0789(0.068±0.0507*) | -0.0400±0.0884(0.057±0.08744**) | 0.0010±0.0676##(0.098±0.0687**) | 0.0090±0.0874##(0.106±0.0591**) | -0.0150±0.0538##(0.082±0.0429**) | -0.0350±0.0462(0.062±0.0535) |
| A中剂量 | 组内组间 | -0.238±0.1114 | -0.185±0.1073(0.053±0.0625*) | -0.092±0.1330#(0.146±0.1066*) | -0.2040±0.1018(0.034±0.0962*) | -0.1560±0.0905(0.082±0.0671*) | -0.1190±0.1063#(0.119±0.0752**) | -0.0890±0.0978#(0.149±0.0690*) | -0.1370±0.1194(0.101±0.0772*) | -0.1940±0.1015(0.044±0.0738) |
| A低剂量 | 组内组间 | -0.103±0.0523 | 0.012±0.0971##(0.115±0.0882) | 0.117±0.2045##(0.22±0.2042) | 0.011±0.1142#(0.114±0.1122) | 0.003±0.1456#(0.106±0.1479) | -0.0470±0.1107##(0.15±0.1101) | 0.0440±0.1244##(0.147±0.1051*) | 0.0090±0.0605##(0.112±0.0561*) | -0.0510±0.0597(0.052±0.0432) |
| B高 | 组内组间 | -0.227±0.0830 | -0.032±0.1180##(0.195±0.1830) | 0.021±0.1249##(0.248±0.1930) | -0.1850±0.1846(0.042±0.2361) | -0.1300±0.1858(0.097±0.2330) | -0.0860±0.1593#(0.141±0.1868) | 0.0060±0.0983##(0.233±0.1050) | -0.1110±0.1103#(0.116±0.0822) | -0.1610±0.0818(0.066±0.0477) |
| B中剂量 | 组内组间 | -0.227±0.1082 | -0.131±0.0915#(0.096±0.0554) | -0.067±0.1323##(0.16±0.0963) | -0.2080±0.1280(0.019±0.0992*) | -0.2070±0.1120(0.02±0.0478**) | -0.1510±0.1077(0.076±0.0604**) | -0.1110±0.0954#(0.116±0.04326**) | -0.1570±0.0925(0.07±0.0231**) | -0.1420±0.1080(0.085±0.0647) |
| B低剂量 | 组内组间 | -0.228±0.0954 | -0.194±0.1420(0.034±0.0617**) | -0.139±0.1343(0.089±0.0662**) | -0.1980±0.1629(0.030±0.0959*) | -0.1670±0.1458(0.061±0.0901**) | -0.1210±0.1538(0.107±0.0780**) | -0.1120±0.1433#(0.116±0.0606**) | -0.1360±0.1805(0.092±0.0991**) | -0.0940±0.2514(0.134±0.1832) |
| C高剂量 | 组内组间 | -0.266±0.0875 | -0.192±0.1204(0.074±0.0975) | -0.072±0.2027##(0.194±0.1681) | -0.2030±0.1679(0.063±0.1260) | -0.1890±0.1215(0.077±0.0775*) | -0.1080±0.1569#(0.158±0.1054) | 0.0170±0.1788##(0.283±0.1426) | -0.1390±0.1248#(0.127±0.0604) | -0.1750±0.0930#(0.091±0.0281) |
| C中剂量 | 组内组间 | -0.165±0.08619 | -0.096±0.106061(0.069±0.0498) | -0.040±0.1009##(0.125±0.0725**) | -0.145±0.1206(0.020±0.1540**) | -0.114±0.1431(0.051±0.1265*) | -0.103±0.1265(0.062±0.1161**) | -0.059±0.1022#(0.106±0.05275**) | -0.076±0.1063(0.089±0.0438*) | -0.090±0.0898(0.075±0.0201) |
| C低剂量 | 组内组间 | -0.239±0.0998 | -0.098±0.1364#(0.141±0.1230) | -0.049±0.1803#(0.19±0.1821) | -0.081±0.1102##(0.158±0.1043) | -0.082±0.0922##(0.157±0.1034) | -0.026±0.1112##(0.213±0.1132) | -0.002±0.0943##(0.237±0.10678) | -0.119±0.1544(0.120±0.1117) | -0.156±0.0983(0.083±0.0643) |
表2.黄芪三种提取物对垂体后叶素所致大鼠心肌缺血T波(0.1mv)的影响(
x±s)(n＝10)
| 药物组别 | 组间/内 | 给药前 | 给药后 | |||||||
| 5″ | 10″ | 30″ | 1′ | 2′ | 5′ | 10′ | 20′ | |||
| 模型 | 组内组间 | 0.150±0.0313 | 0.106±0.0350##(-0.044±0.0378) | 0.057±0.1427(-0.093±0.1300) | -0.039±0.0808##(-0.189±0.0983) | 0.023±0.1098##(-0.127±0.1101) | 0.059±0.1057#(-0.091±0.1063) | 0.102±0.0527#(-0.048±0.0583) | 0.214±0.0890#(0.064±0.0855) | 0.144±0.0568(-0.006±0.0395) |
| 丹参(阳) | 组内组间 | 0.131±0.0300 | 0.156±0.0881(0.025±0.0878*) | 0.089±0.0601(-0.042±0.0510) | 0.041±0.0742##(-0.09±0.0673) | 0.149±0.0831(0.018±0.0872**) | 0.184±0.0753(0.053±0.0811**) | 0.161±0.0396(0.03±0.0437**) | 0.153±0.0538(0.022±0.0405) | 0.132±0.0402(0.001±0.0137) |
| A高剂量 | 组内组间 | 0.111±0.0285 | 0.134±0.0665(0.023±0.0593**) | 0.223±0.1411#(0.112±0.1295**) | 0.168±0.0732#(0.057±0.0757**) | 0.122±0.0784(0.011±0.0787**) | 0.129±0.1320(0.018±0.1235*) | 0.161±0.0652#(0.05±0.0611**) | 0.158±0.0545#(0.047±0.0432) | 0.150±0.0442#(0.039±0.0354*) |
| A中剂量 | 组内组间 | 0.147±0.0730 | 0.155±0.0982(0.008±0.0681*) | 0.280±0.1981(0.133±0.2068**) | 0.113±0.1225(-0.034±0.1047**) | 0.131±0.1039(-0.016±0.1208*) | 0.147±0.1035(-2E-18±0.1194) | 0.162±0.0850(0.015±0.0708*) | 0.162±0.0818(0.015±0.0479) | 0.167±0.0860(0.02±0.0442) |
| A低剂量 | 组内组间 | 0.145±0.0536 | 0.153±0.1280(0.008±0.1482) | 0.173±0.1843(0.028±0.1733) | 0.041±0.1729(-0.104±0.1710) | 0.116±0.1747(-0.029±0.1682) | 0.137±0.1100(-0.008±0.1093) | 0.14±0.1036(-0.005±0.0974) | 0.221±0.0985#(0.076±0.0807) | 0.163±0.0710(0.018±0.0748) |
| B高剂量 | 组内组间 | 0.188±0.0364 | 0.188±0.1002(1.11E-18±0.1124) | 0.140±0.1503(-0.048±0.1653) | 0.030±0.0965##(-0.158±0.1096) | 0.034±0.1148##(-0.154±0.1313) | 0.074±0.1253#(-0.114±0.1484) | 0.150±0.0842(-0.038±0.0763) | 0.214±0.0642(0.026±0.0493) | 0.228±0.0382#(0.040±0.0231**) |
| B中剂量 | 组内组间 | 0.119±0.0448 | 0.150±0.0429(0.031±0.0482**) | 0.174±0.1320(0.055±0.1360**) | 0.088±0.1663(-0.031±0.1394**) | 0.098±0.1184(-0.021±0.1005*) | 0.118±0.1049(-0.001±0.0788*) | 0.145±0.0619(0.026±0.0320**) | 0.156±0.0410(0.037±0.0442) | 0.147±0.0952(0.028±0.0854) |
| B低剂量 | 组内组间 | 0.150±0.0702 | 0.140±0.0650(-0.01±0.0226) | 0.112±0.0868(-0.038±0.0567) | 0.075±0.1369(-0.075±0.1222*) | 0.035±0.1267#(-0.115±0.0707) | 0.147±0.1117(-0.003±0.0643*) | 0.182±0.0895(0.032±0.0702*) | 0.187±0.0756(0.037±0.0501) | 0.138±0.1104(-0.012±0.1017) |
| C高剂量 | 组内组间 | 0.147±0.0313 | 0.153±0.0923(0.006±0.0833) | 0.129±0.1031(-0.018±0.09841) | 0.049±0.1249#(-0.098±0.1175) | 0.056±0.0967#(-0.091±0.0999) | 0.129±0.1059(-0.018±0.1079) | 0.135±0.0726(-0.012±0.0563) | 0.173±0.0435(0.026±0.0341) | 0.197±0.0501(0.050±0.05375*) |
| C中剂量 | 组内组间 | 0.188±0.0557 | 0.213±0.0773(0.025±0.06916*) | 0.241±0.0733(0.053±0.09274**) | 0.178±0.1605(-0.01±0.1667**) | 0.169±0.2004(-0.019±0.2135) | 0.167±0.1477(-0.021±0.1400) | 0.218±0.0639(0.03±0.0419**) | 0.236±0.0453#(0.048±0.0322) | 0.239±0.0635(0.051±0.0597*) |
| C低剂量 | 组内组间 | 0.101±0.0465 | 0.171±0.0638#(0.07±0.0346**) | 0.255±0.1339##(0.154±0.1285**) | 0.167±0.0702#(0.066±0.0564**) | 0.148±0.1112(0.047±0.0702**) | 0.195±0.0562##(0.094±0.0440*) | 0.188±0.0464##(0.087±0.0368**) | 0.194±0.0474##(0.093±0.0371) | 0.177±0.0556##(0.076±0.0479**) |
表3.黄芪三种提取物对垂体后叶素所致大鼠心肌缺血R-R单个间期(s)的影响
(
x±s)(n＝10)
| 药物组别 | 组间/内 | 给药前 | 给药后 | |||||||
| 5″ | 10″ | 30″ | 1′ | 2′ | 5′ | 10′ | 20′ | |||
| 模型 | 组内组间 | 0.11992±0.0083 | 0.126±0.0088(0.0065±0.00461) | 0.128±0.0100(0.0081±0.00441) | 0.134±0.0092(0.0141±0.01108) | 0.201±0.0689##(0.0810±0.06827) | 0.194±0.0621##(0.0711±0.06343) | 0.160±0.0230##(0.0402±0.02248) | 0.144±0.0155##(0.0243±0.011) | 0.133±0.0088##(0.0126±0.0065) |
| 丹参(阳) | 组内组间 | 0.110±0.0054 | 0.109±0.0116(-0.00033±0.00796*) | 0.118±0.0124(0.00816±0.01180) | 0.120±0.0095(0.0107±0.01087) | 0.147±0.0418(0.0376±0.0440) | 0.148±0.0244##(0.0423±0.02698) | 0.143±0.0165##(0.0330±0.01920) | 0.126±0.0160(0.0167±0.01812) | 0.116±0.0058(0.00605±0.006662) |
| A高剂量 | 组内组间 | 0.136±0.0144 | 0.132±0.0119(-0.00404±0.008034**) | 0.143±0.0173(0.00712±0.007684) | 0.156±0.0143(0.0202±0.00822) | 0.163±0.0142##(0.0269±0.01212*) | 0.186±0.0327##(0.0519±0.03190) | 0.177±0.0139##(0.0407±0.01385) | 0.161±0.0134##(0.0252±0.00711) | 0.153±0.0137#(0.0167±0.01459) |
| A中剂量 | 组内组间 | 0.151±0.0146 | 0.149±0.0130(-0.00168±0.006173**) | 0.160±0.0187(0.00948±0.01058) | 0.168±0.0160(0.0174±0.00995) | 0.207±0.0564##(0.0560±0.06030) | 0.208±0.0292##(0.0577±0.03359) | 0.197±0.0151##(0.0465±0.01967) | 0.171±0.0186#(0.0201±0.02323) | 0.169±0.0208#(0.018±0.0281) |
| A低剂量 | 组内组间 | 0.134±0.0184 | 0.140±0.0121(0.00580±0.02053) | 0.148±0.0236(0.0140±0.01930) | 0.171±0.0491(0.0370±0.04915) | 0.235±0.1492#(0.101±0.1575) | 0.233±0.0864##(0.101±0.0888) | 0.204±0.0565##(0.0703±0.05798) | 0.175±0.0334##(0.0410±0.03145) | 0.165±0.0251##(0.0311±0.0205) |
| B高剂量 | 组内组间 | 0.12746±0.004166 | 0.129±0.00988(0.00164±0.008689) | 0.135±0.00788#(0.00704±0.005999) | 0.142±0.00958#(0.0142±0.007091) | 0.174±0.0697#(0.0464±0.06813) | 0.175±0.0121##(0.0487±0.01340) | 0.159±0.00968##(0.0312±0.00992) | 0.144±0.00575##(0.0167±0.00446) | 0.146±0.00578##(0.0180±0.00435) |
| B中剂量 | 组内组间 | 0.12552±0.006954 | 0.130±0.0103(0.00464±0.007337) | 0.145±0.0239#(0.0193±0.02033) | 0.160±0.0392#(0.0345±0.03612) | 0.155±0.0187##(0.0293±0.01404*) | 0.162±0.0148##(0.0355±0.01166) | 0.164±0.0203##(0.0382±0.01783) | 0.161±0.0355##(0.0354±0.03490) | 0.113±0.0641(-0.0127±0.06359) |
| B低剂量 | 组内组间 | 0.137±0.0117 | (0.132±0.0152)(-0.00548±0.009228**) | 0.143±0.01580.00532±0.008998 | 0.158±0.0391(0.0204±0.03139) | 0.219±0.1245(0.082±0.1227) | 0.199±0.0804#(0.0659±0.07393) | 0.186±0.0239##(0.049±0.01636) | 0.168±0.0181##(0.0304±0.01140) | 0.123±0.0749(-0.0142±0.07442) |
| C高剂量 | 组内组间 | 0.13126±0.004964 | 0.130±0.007831(-0.00152±0.008852*) | 0.139±0.006408##(0.00792±0.00385) | 0.150±0.008887##(0.0183±0.007257) | 0.225±0.1409#(0.0942±0.1395) | 0.203±0.06391##(0.0721±0.06437) | 0.181±0.04356##(0.0495±0.04207) | 0.155±0.009909##(0.0238±0.0104) | 0.151±0.008817##(0.0196±0.005398) |
| C中剂量 | 组内组间 | 0.131±0.0052 | 0.136±0.0057(0.00508±0.004744) | 0.140±0.0058##(0.00908±0.002014 | 0.145±0.0084##(0.0140±0.00697) | 0.155±0.0094##(0.0240±0.00874*) | 0.164±0.0074##(0.0327±0.00752) | 0.170±0.0136##(0.0388±0.01385) | 0.155±0.0084##(0.0237±0.00542) | 0.151±0.0100##(0.0201±0.0071) |
| C低剂量 | 组内组间 | 0.135±0.0189 | 0.135±0.0207(-0.0002±0.00663) | 0.142±0.0167(0.00704±0.005236 | 0.153±0.0165(0.0184±0.00693) | 0.243±0.1689(0.109±0.1703) | 0.175±0.0199##(0.0410±0.01043) | 0.168±0.0279##(0.0329±0.01638) | 0.156±0.0200#(0.0213±0.00468) | 0.151±0.0177(0.0163±0.004178) |
##表示P＜0.01，#P＜0.05组内各时间点与给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01，差值进行组间比较。
设计资料以
x±s表示，数据取均值进行组间t检验，P＜0.05有统计学意义。
由表可知：本发明的黄芪黄酮总提物的中、高剂量，75％醇提物与水提物的中剂量在多个时间点均能显著抑制J点抬高(J点抬高是心肌缺血的重要指征)、T波倒置(T波倒置是心肌缺血的重要指征，造模后T波下降是倒置的迹象)和R-R间期延长的趋势(R-R间期延长的趋势是心肌缺血的指征)。
方法2
取体重220-280gSD大鼠110只，雌雄各半，按体重随机分为11组；阳性对照组给予口服丹参片324mg/kg；模型组给予生理盐水；黄芪三种提取物的剂量设置同方法1，取样研磨后，称取相应的药用0.5％CMC钠充分溶解，配成100ml均匀溶液。
连续灌药六天，空白组灌服同体积生理盐水。第3天开始，给模型组和各给药组大鼠按照0.2mg/kg的剂量腹腔注射异丙肾上腺素，每12小时一次，连续60小时。第六天，灌药1小时后，检测血清中的LDH、SOD、MDA的含量。操作步骤按照试剂说明书进行。结果见表4。
表4黄芪三种提取物对实验性大鼠慢性心肌缺血LDH、SOD、MDA的影响
| LDH | SOD | MDA | |
| 模型组 | 3560.15±97.490 | 66.682±3.4705 | 4.916±0.7952 |
| 阳性组 | 2806.20±78.356** | 101.223±2.4991** | 3.205±0.3185** |
| A高剂量 | 2806.72±187.67** | 93.411±6.0320** | 3.651±0.4008** |
| A中剂量 | 2902.67±140.71* | 90.631±5.4512** | 3.8046±0.6144* |
| A低剂量 | 3169.31±111.26* | 80.148±4.672±* | 4.368±0.7547 |
| B高剂量 | 3211.36±100.3* | 79.134±8.387 | 4.169±0.749* |
| B中剂量 | 2932.47±150.78** | 91.621±4.794* | 3.8916±0.4813** |
| B低剂量 | 3145.23±200.45 | 84.647±6.459* | 4.0152±0.4124 |
| C高剂量 | 3178.15±189.45* | 83.546±6.451* | 4.119±0.6812 |
| C中剂量 | 3231.56±204.68** | 89.587±7.1112* | 4.036±0.6091* |
| C低剂量 | 3189.48±138.41 | 80.451±5.974 | 4.215±0.6897* |
| 正常 | 2600.77±94.079** | 122.297±2.560** | 2.795±0.4651** |
**表示P＜0.01；*表示P＜0.05；正常与模型组P＜0.01，说明造模成功。n＝10
统计学处理：设计资料以
x±s表示，数据取均值进行组间t检验，P＜0.05有统计学意义。
LDH、SOD、MDA是可以反映心肌缺血的重要指征，从表4可以推论黄芪水提、醇提的中剂量，本发明黄芪总黄酮提取物的中、高剂量可以成功地激活机体SOD，提高酶活力，减少MDA的含量，抑制LDH的泄漏，从而减轻心肌缺血的损伤。
以上试验证明，黄芪的三种提取物对垂体后叶素，异丙肾上腺素所致的大鼠心肌缺血有较强的保护作用。但是黄芪水提与醇提只有特定的剂量下(中剂量)才有明显的抗心肌缺血作用，说明黄芪中可能有其它的成分会影响有效成分发挥作用，而提纯后的黄芪总黄酮提取物抗心肌缺血作用则较明显，并且呈一定的剂量依赖性。
本发明的黄芪黄酮提取物可以用于临床，一般的用量为成人每日20～500mg。也可根据不同的疾病严重程度及不同的剂型偏离该范围。
本发明的黄芪总黄酮提取物可单独或与其它中药及中药提取物组配制成药物。
本发明的黄芪总黄酮提取物可与药学上可接受的载体混合，用于制备治疗用药物组合物。可制备成药剂学上通用的剂型，如胶囊、片剂、丸剂、口服液、颗粒剂、酊剂、缓释剂等胃肠道给药剂型及注射剂、外用制剂等胃肠外给药剂型。
附图说明
图1是混合标准品的液相色谱图
图2是药材75％提取液色谱图
图3为大孔树脂10％乙醇洗脱液的液相图
图4为大孔树脂45％乙醇洗脱液的液相图
图5是本发明总黄酮提取物的液相色谱图
上述图中各标识峰的含义：1毛蕊异黄酮7-O-β-D-葡萄糖苷(calycosin-7-O-β-D-glc)，2芒柄花苷(ononin)，3(6aR，11aR)-9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷[(6aR，11aR)-9，10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside]，4(3R)-2′-羟基-3′，4′-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-葡萄糖苷[(3R)-2′-hydroxy-3′，4′-dimethoxyisoflavan-7-O-β-D-glucoside]，5毛蕊异黄酮(calycosin)。
具体实施方式
含量测定方法
仪器与试剂 高效液相色谱仪Aglient1100系列，二元泵G1312A，自动进样器，二极管阵列检测器，Chemstation A.06.01化学工作站，色谱柱：ZORBAX ODS C18 column(4.6×250mm I.D.，5μm)，预柱ZORBAX ODS C18 guard column(4.6×12.5mm I.D.，5μm)，纯水(自制)，甲醇为色谱纯，甲酸为分析纯。
色谱条件 流动相：A：0.3％甲酸溶液，B：乙腈，0～12min，18％B，12～20min，18～30％B，20～30min，30％B，30～38min，30～55％B，38～48min，55％B。流速为1.0mL·min-1，检测波长为280nm，柱温25℃。
实施例1
取黄芪药材20g，药材重量12倍体积的70％乙醇，95℃热回流提取三次，每次1.5小时。提取液合并，减压回收溶剂。所得浓缩液经D101大孔树脂分段，先用水洗脱去杂质，再依次用10％、45％乙醇洗脱。浓缩45％洗脱液，用水溶解，用等体积的水饱和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，浓缩真空干燥即得，总黄酮含量为56.14％。
实施例2
取黄芪药材20g，药材重量10倍体积的80％乙醇，95℃热回流提取三次，每次1.5小时。提取液合并，减压回收溶剂。所得浓缩液经HPD100大孔树脂分段，先用水洗脱去杂，再用45％乙醇洗脱。45％乙醇洗脱液浓缩后，用水溶解，用水饱和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，浓缩真空干燥即得，总黄酮含量为52.35％
实施例3
取黄芪药材20g，药材重量8倍体积的60％乙醇，95℃热回流提取二次，每次1小时。提取液合并，减压回收溶剂。所得浓缩液经D101大孔树脂分段，先用水洗脱，再依次用10％、40％乙醇洗脱。40％乙醇洗脱液合并后浓缩，用水溶解，再用水饱和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，浓缩真空干燥即得，总黄酮含量为55.22％。
实施例4
取黄芪药材20g，药材重量10倍体积的70％乙醇，95℃热回流提取二次，每次1小时。提取液合并，减压回收溶剂。所得浓缩液经D101大孔树脂分段，依次10％及40％乙醇洗脱。将40％醇洗脱液浓缩后，用水溶解，再用水饱和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，浓缩真空干燥即得，总黄酮含量为56.29％。
实施例5
取黄芪药材20g，药材重量12倍体积的70％乙醇，95℃热回流提取三次，每次1小时。提取液合并，减压回收溶剂。所得浓缩液经D101大孔树脂分段，先用水洗脱，再45％乙醇洗脱。将45％醇洗脱液浓缩后，用水溶解，再用水饱和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，浓缩真空干燥即得，总黄酮含量为52.54％。
实施例6
取黄芪药材20g，药材重量8倍体积的水，加热回流提取三次，每次1小时。提取液合并，减压回收溶剂。所得浓缩液经HPD300大孔树脂分段，先用水洗脱，再依次用10％、45％乙醇洗脱。将45％醇洗脱液浓缩后，用水溶解，再用水饱和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，浓缩真空干燥即得，总黄酮含量为50.46％。
实施例7
取黄芪药材20g，药材重量10倍体积的水，加热回流提取三次，每次1.5小时。提取液合并，减压回收溶剂。所得浓缩液经D101大孔树脂分段，先用水洗脱，再依次用5％、30％乙醇洗脱。将30％醇洗脱液浓缩后，用水溶解，再用水饱和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，浓缩真空干燥即得，总黄酮含量为53.38％。
实施例8
取黄芪药材20g，药材重量12倍体积的90％乙醇，95℃热回流提取三次，每次1小时。提取液合并，减压回收溶剂。所得浓缩液经D101大孔树脂分段，先用水洗脱，再35％乙醇洗脱。将35％醇洗脱液浓缩后，用水溶解，再用水饱和乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，浓缩真空干燥即得，总黄酮含量为56.54％。
实施例9
取实施例1方法制备的提取物100mg与淀粉100mg，糊精100mg混合，用适量30％乙醇作湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入适量硬脂酸镁混合，制成片剂。
Claims (10)
1、一种黄芪提取物，其特征是由下列方法制备得到：黄芪用热水或乙醇提取，提取液浓缩；浓缩液上大孔树脂柱，用水洗脱，再用10～50％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩；用乙酸乙酯萃取，浓缩萃取液，干燥，即得。
2、权利要求1的黄芪提取物，其中提取溶剂是乙醇。
3、权利要求2的黄芪提取物，其中提取用乙醇浓度是50-100％，为重量百分比。
4、权利要求3的黄芪提取物，其中提取用乙醇浓度是60-80％，为重量百分比。
5、权利要求1的黄芪提取物，其中用于洗脱用的乙醇浓度是30～45％，为重量百分比。
6、权利要求1的黄芪提取物，其中用于提取黄芪用的水或乙醇的重量是黄芪的5～20倍。
7、权利要求1的黄芪提取物，其中大孔树脂选自D101、AB-8、HPD100、HPD300、D1或D2。
8、权利要求1的黄芪提取物，其中黄芪是蒙古黄芪。
9、一种治疗心血管疾病的药物组合物，含有权利要求1至8中任一项的黄芪提取物及药学上可接受的载体。
10、权利要求1至8中任一项的黄芪提取物用于制备抗心肌缺血药物的用途。
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