CN101040853B - 一种草乌甲素多泡脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种草乌甲素多泡脂质体及其制备方法，该制备方法包括下列步骤：①将包括中性磷脂、胆固醇和中性脂质的脂质成分溶于有机溶剂中，使中性磷脂含量为20～40mg/ml，以作为脂质相；②将草乌甲素溶于稀酸溶液中使其浓度为20μg/ml～5000μg/ml，以作为内水相；③将等体积的所述内水相加入脂质相上层，混合乳化制得油包水型初乳；④将含有渗透压调节物的外水相加入所述油包水型初乳的上层，搅拌形成水包油包水型复乳；⑤除去复乳中的有机溶剂而制得草乌甲素多泡脂质体。该草乌甲素多泡脂质体具有较高的包封率，并有较佳的缓释作用，而取得更佳的止痛效果。

Description

一种草乌甲素多泡脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种草乌甲素的缓释制剂，特别涉及一种草乌甲索多泡脂质体及其制备方法。

背景技术

草乌甲素(Bulleyaconitine A)是从我国云南乌头属植物滇西嘟拉(Aconitum bulleyanum Diels)中分离得到的一种具有显著镇痛作用的生物碱(即滇西嘟拉碱)，其相对镇痛作用为吗啡的15倍，阿司匹林的1208倍，且连续用药不产生镇痛作用耐受，是一种不同于吗啡类的非成瘾性镇痛剂。该药现有片剂、口服液、胶囊和注射剂。其中片剂、口服液已为现行版中国药典收载。由于草乌甲素半衰期较短，因此现有制剂临床使用均需多次给药，患者依从性差，且镇痛作用短而影响疗效，开发其缓释制剂是临床所需。

另一方面，Kim等人于1983年最先发现并研究了多泡(多囊)脂质体，他们通过复乳法，以磷脂、胆固醇和中性脂质为成膜材料，以氯仿和乙醚为有机溶剂，成功制备了多泡脂质体，并凭借光学显微镜和电镜观察了多泡脂质体的微观结构。在制备过程中，首先将药物溶液和油相在机械作用力下形成油包水(W/O)型初乳，再将初乳与外水相混合制得复乳，通过氮气吹干除去有机溶剂制得多泡脂质体混悬液。多泡脂质体颗粒的平均粒径在5～50μm之间。通过复乳法制备得多泡脂质体具有高包封率(20％～90％)、高载药量、高稳定性(4℃下可保存一年以上)、低渗漏、缓释作用(可延迟释放数天至数周)。因其非同心圆的拓朴结构，使得多泡脂质体在注射部位形成药物“储库”，随着磷脂双分子层的不断代谢，包封在囊泡中的药物逐步释放至血液或病变部位，发挥很好的延迟释放作用。通过调节制备过程中的参数和处方比例，可以轻松控制药物释放时间在几天到数周之间。

然而，目前存在的问题是：由于不同的药物活性成分有不同的理化性质和作用机理，其制备包封率和药物释放有较大差异，因此针对具体药物及其释放要求，需研究采用特定的处方和工艺。

发明内容

本发明要解决的技术问题即为上述课题，提供一种具有缓释作用的草乌甲素多泡脂质体及其制备方法。

本发明的技术方案包括：一种草乌甲素多泡脂质体的制备方法，其可以包括下列步骤：

①将脂质成分溶于有机溶剂中，以作为脂质相，其中该脂质成分包括重量比为2∶1～4∶1的中性磷脂和胆固醇，以及在脂质成分中占摩尔百分比为2～6％的中性脂质，该中性磷脂在脂质相中的浓度为20～40mg/ml；

②将草乌甲素溶于稀酸溶液中使其浓度为20μg/ml～5000μg/ml，以作为内水相；

③将等体积的所述内水相加入脂质相上层，混合乳化制得油包水型初乳；

④将2～6倍体积的外水相加入所述油包水型初乳的上层，搅拌形成水包油包水型(W/O/W)复乳，其中外水相中含有40mM的氨基酸、以及3.2～6g/100ml的渗透压调节物；

⑤除去步骤④得到的复乳中的有机溶剂而制得草乌甲素多泡脂质体。

其中，上述中性磷脂及胆固醇为成膜材料。胆固醇为膜稳定剂，可通过改变磷脂相转变温度调节脂质体膜层的流动性，从而改善脂质体的稳定性，减小贮存过程中因脂质体膜层相变引起的药物渗漏。胆固醇用量过小，其调节作用甚微，当用量过大时难以形成脂质体的磷脂双分子层，研究表明当磷脂与胆固醇重量比在2∶1～4∶1之间时形成的脂质体最稳定。

本发明步骤①中所述的中性磷脂是指处于其等电点时净电荷为零的磷脂，其选自卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、氢化大豆磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等天然和合成磷脂中的一种或几种；本发明优选自卵磷脂、二油酰磷脂酰胆碱和二油酰磷脂酰乙醇胺。

而本发明所说的中性脂质是指本身没有形成囊泡能力的，并且缺少带电荷的或亲水的“头部”基团的油或脂肪，如三油酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三癸酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三己酸甘油酯、维生素E和角鲨烯中的一种或几种。中性脂质在脂质体中主要起支架作用，分布于非同心水性腔室磷脂双分子层节点处，支撑起多泡(多囊)脂质体的拓扑结构；其是形成多泡(多囊)脂质体的决定性因素之一。本发明优选三油酸甘油酯。

该有机溶剂可为能溶解脂质成分的任何溶剂，通常选自乙醚、氯仿、二氯甲烷、异丙基乙醚、四氢呋喃、卤代醚和卤代酯中的一种或几种。本发明优选二氯甲烷或乙醚-氯仿混合物。更佳为二氯甲烷，因二氯甲烷可有效溶解磷脂和类脂，并且毒性低于氯仿，挥干速率更优。

该步骤①的脂质成分中还可以含有带负电荷或正电荷的类脂，带电荷类脂可有效调节脂质体表面电荷，使脂质体带负电或正电，以增强制剂稳定性。该类脂与中性磷脂的重量比可为1∶5～1∶60，类脂用量太少作用不明显，太多则增加成本，本发明优选1∶5～1∶20。本发明所述的带负电荷的类脂选自磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPZ)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPZ)、磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)及二硬脂酰磷脂酸(DSPA)中的一种或几种；而所述带正电荷的类脂选自二酰基三甲胺丙烷、二酰基二甲胺丙烷、硬脂胺(SA)及胶原蛋白中的一种或几种。

草乌甲素为生物碱类，其在水中溶解度较小，而易溶于氢卤酸(如盐酸等)、硫酸、乙酸等酸性溶液中，最常规使用的为0.1M的稀盐酸溶液。由于草乌甲素在酸性溶液中带正电，当脂质体表面带负电荷时更有利于草乌甲素的包封，从而提高草乌甲素脂质体的包封率。因此本发明的类脂优选磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸和二棕榈酰磷脂酰甘油等带负电荷的类脂中的一种或几种。

较佳地，步骤②的内水相中草乌甲素的浓度为500～1000μg/ml。

步骤②的内水相中还可以加入不超过10g/100ml，一般不超过4g/100ml的渗透压调节物，以进一步增强制剂稳定性。

步骤④中的氨基酸可选用赖氨酸、精氨酸等，可增加产品的稳定性。

本发明所述渗透压调节物可为现有技术中常用于调节渗透压的物质，如葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖等碳水化合物类，以及氯化钠等。本发明优选葡萄糖和/或蔗糖。

上述步骤③中所述混合乳化可采用现有技术，如通过搅拌、振荡、声处理、超声波、高速剪切匀浆机等装置和方法来处理；本发明优选采用高速剪切匀浆机。

而上述步骤④中混合形成复乳和步骤⑤中的去除溶剂方法均可采用现有技术，其中去除溶剂方法包括但不仅限于气流吹干、减压蒸发等，通常选用氮气、氦气、氩气等惰性气体及氢气、二氧化碳等气体吹干溶剂，最常用且成本低的是氮气吹干。

本发明还提供一种草乌甲素多泡脂质体，其是由上述制备方法制得。

本发明的草乌甲素多泡脂质体具有高的包封率，在体内、外试验中均显示有良好的缓释作用，从而较现有制剂有更佳的止痛效果，并由此降低了用药次数及总用药量。

附图说明

图1为本发明草乌甲素多泡脂质体的体外释放-时间曲线图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

下面实施例中草乌甲素多泡脂质体粒径采用显微镜检测；包封率测定方法为：

取0.5mL本发明草乌甲素多泡脂质体混悬液，加入4.5mL生理盐水，混和均匀，600×g离心5分钟，分离上清液和沉淀。依据已建立的分析方法(中国药典2005版二部)检测上清液中游离草乌甲素浓度；将沉淀用10％的Triton X-100溶液破膜溶解，依法测定包封的草乌甲素的浓度，用以下公式计算草乌甲素多泡脂质体的包封率：

包封率(％)＝被包封的草乌甲素量/混悬液中草乌甲素总量×100

实施例1

步骤1：精密称取卵磷脂200mg、胆固醇50mg、磷脂酰甘油40mg和三油酸甘油酯17.4mg，用5ml二氯甲烷溶解，作为脂质相；

步骤2：精密称取5mg草乌甲素和蔗糖100mg，用适量盐酸溶液(0.1mol/L)超声溶解，并定容至5ml，作为内水相，缓慢加入脂质相上层；

步骤3：用高速剪切匀浆机(Fluko，ATS工业系统有限公司)将步骤2所得混合物在10000rpm的转速下作用9分钟，制得W/O型初乳；

步骤4：为制得二氯甲烷微球混悬液，将20mL含有3.2％(g/ml)葡萄糖和40mM赖氨酸的外水相加在W/O型初乳的上层，以4500rpm的转速作用15秒钟，形成二氯甲烷微球的混悬液；

步骤5：为制得多泡脂质体，将上述混悬液注入盛有30mL外水相的1000mL锥形瓶中，通以氮气(8L/min)，37℃水浴20分钟缓慢除去二氯甲烷；向锥形瓶中加入60mL生理盐水，在600×g条件下离心5分钟分离脂质体，弃上清液，用生理盐水洗涤沉淀三次，将所得沉淀再分散在5～10ml生理盐水中，得多泡脂质体混悬液。

测得草乌甲素多泡脂质体粒径为5～50μm；包封率为95.7％。

实施例2

步骤1：精密称取卵磷脂200mg、胆固醇50mg、磷脂酸10mg和三油酸甘油酯15.6mg，用5ml二氯甲烷溶解，作为脂质相；

步骤2：精密称取5mg草乌甲素和蔗糖200mg，用适量盐酸溶液(0.1mol/L)超声溶解，并定容至5ml，作为内水相，缓慢加入脂质相上层；

步骤3：同实施例1；

步骤4：为制得二氯甲烷微球混悬液，将20mL含有6.0％(g/ml)葡萄糖和40mM赖氨酸的外水相加在W/O型初乳的上层，以4500rpm的转速作用15秒钟，形成二氯甲烷微球的混悬液；

步骤5：同实施例1。

测得草乌甲素多泡脂质体粒径为5～50μm；包封率为79.1％。

实施例3

步骤1：精密称取二油酰磷脂酰胆碱100mg、胆固醇50mg、磷脂酰丝氨酸20mg和三油酸甘油酯3.4mg，用5ml氯仿-乙醚混合物(体积比为1∶1)溶解，作为脂质相；

步骤2：精密称取2.5mg草乌甲素，用适量盐酸溶液(0.1mol/L)超声溶解，并定容至5ml，作为内水相，缓慢加入脂质相上层；

步骤3：同实施例1；

步骤4：为制得氯仿-乙醚微球混悬液，将60mL含有3.2％(g/ml)葡萄糖和40mM赖氨酸的外水相加在W/O型初乳的上层，以4500rpm的转速作用15秒钟，形成氯仿-乙醚微球的混悬液；

步骤5：同实施例1。

测得草乌甲素多泡脂质体粒径为5～50μm；包封率为87.9％。

实施例4

步骤1：精密称取二油酰磷脂酰乙醇胺150mg、胆固醇50mg、磷脂酰甘油15mg和三油酸甘油酯7.5mg，用5ml氯仿-乙醚混合物(体积比为1∶1)溶解，作为脂质相；

步骤2：精密称取3.75mg草乌甲素、100mg蔗糖，用适量盐酸溶液(0.1mol/L)超声溶解，并定容至5ml，作为内水相，缓慢加入脂质相上层；

步骤3：同实施例1；

步骤4：为制得氯仿-乙醚微球混悬液，将40mL含有5.7％(g/ml)葡萄糖和40mM赖氨酸的外水相加在W/O型初乳的上层，以4500rpm的转速作用15秒钟，形成氯仿-乙醚微球的混悬液；

步骤5：同实施例1。

测得草乌甲素多泡脂质体粒径为5～50μm；包封率为81.8％。

实施例5

步骤1：精密称取卵磷脂200mg、胆固醇100mg、二棕榈酰磷脂酰甘油40mg和三油酸甘油酯20.4mg，用5ml二氯甲烷溶解，作为脂质相；

步骤2：精密称取5mg草乌甲素和蔗糖100mg，用适量盐酸溶液(0.1mol/L)超声溶解，并定容至5ml，作为内水相，缓慢加入脂质相上层；

步骤3：同实施例1；

步骤4：为制得二氯甲烷微球混悬液，将20mL含有3.2％(g/ml)葡萄糖和40mM赖氨酸的外水相加在W/O型初乳的上层，以4500rpm的转速作用15秒钟，形成二氯甲烷微球的混悬液；

步骤5：同实施例1。

测得草乌甲素多泡脂质体粒径为5～50μm；包封率为89.3％。

实施例6

步骤1：精密称取卵磷脂120mg、胆固醇30mg和三油酸甘油酯1.6mg，用5ml二氯甲烷溶解，作为脂质相；

步骤2：精密称取5mg草乌甲素和葡萄糖200mg，用适量乙酸溶液(0.1mol/L)超声溶解，并定容至5ml，作为内水相，缓慢加入脂质相上层；

步骤3～5：同实施例1。

测得草乌甲素多泡脂质体粒径为5～50μm；包封率为72.8％。

实施例7

步骤1：精密称取卵磷脂200mg、胆固醇100mg、磷脂酰甘油40mg和三油酸甘油酯20.4mg，用5ml二氯甲烷溶解，作为脂质相；

步骤2：精密称取25mg草乌甲素和蔗糖100mg，用适量盐酸溶液(0.1mol/L)超声溶解，并定容至5ml，作为内水相，缓慢加入脂质相上层；

步骤3：同实施例1；

步骤4：为制得二氯甲烷微球混悬液，将20mL含有4％(g/ml)蔗糖和40mM精氨酸的外水相加在W/O型初乳的上层，以4500rpm的转速作用15秒钟，形成二氯甲烷微球的混悬液；

步骤5：同实施例1。

测得草乌甲素多泡脂质体粒径为5～50μm；包封率为78.3％。

实施例8

步骤1：精密称取卵磷脂200mg、胆固醇100mg、硬脂胺40mg和三油酸甘油酯20.4mg，用5ml二氯甲烷溶解，作为脂质相；

步骤2：精密称取5mg草乌甲素和蔗糖100mg，用适量盐酸溶液(0.1mol/L)超声溶解，并定容至5ml，作为内水相，缓慢加入脂质相上层；

步骤3：同实施例1；

步骤4：为制得二氯甲烷微球混悬液，将20mL含有4％(g/ml)蔗糖和40mM精氨酸的外水相加在W/O型初乳的上层，以4500rpm的转速作用15秒钟，形成二氯甲烷微球的混悬液；

步骤5：同实施例1。

测得草乌甲素多泡脂质体粒径为5～50μm；包封率为60.9％。

上述实施例中所用卵磷脂为德固赛公司产品；二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸和二棕榈酰磷脂酰甘油购于Sigma公司；硬脂胺购于Fluka公司；胆固醇购于上海蓝季科技发展有限公司；三油酸甘油酯购于广州化学试剂厂；其余试剂均为常规市售产品。

试验实施例1草乌甲素多泡脂质体的体外释放测定

取实施例1的草乌甲素多泡脂质体混悬液20ml，用80ml生理盐水稀释，将所得混悬液置于37℃恒温摇床(转速为15rpm)中，在预定的时间点取出等量的样品，以600×g离心分离上清液和沉淀，依法测定上清液中草乌甲素的量，每个时间点的药物释放百分比用以下公式计算：

药物释放百分比(％)＝上清液中游离草乌甲素的量/多泡脂质体中包封的草乌甲素原始量×100

结果表明在第6天(144小时)时，药物释放达到了80％以上，包封的草乌甲素基本释放完全(如图1所示)。说明本发明草乌甲素的多泡脂质体具有明显的缓释效果。

试验实施例2草乌甲素多泡脂质体药效试验

取昆明种小鼠若干，雌雄各半，随机分成3组，每组10只。一组给生理盐水作为对照(对照组)，一组给草乌甲素注射液(试验组1)，剂量0.04mg/kg，一组给实施例1制得的草乌甲素多泡脂质体(试验组2)，剂量以草乌甲素计为0.04mg/kg。首先，每组每只动物分别腹腔注射0.6％醋酸0.2ml致痛，5分钟后分别皮下注射给予上述药物，观察动物扭体情况；其次于第2、3、4、5、6、7天再分别腹腔注射0.6％醋酸0.2ml致痛，观察每组动物扭体情况。结果如下表1[抑制率＝(生理盐水组小鼠扭体数-试验组小鼠扭体数)/生理盐水组小鼠扭体数×100％]。

表1草乌甲素多泡脂质体对小鼠化学致痛的抑制率(％)

	第1天	第2天	第3天	第4天	第5天	第6天	第7天
								对照组1	0	0	0	0	0	0	0
对照组2	52	25	7	0	0	0	0
								试验组	48	49	50	51	47	48	46

Claims (10)

1.一种草乌甲素多泡脂质体的制备方法，其包括下列步骤：

①将脂质成分溶于有机溶剂中，以作为脂质相，其中该脂质成分包括重量比为2∶1～4∶1的中性磷脂和胆固醇，以及在脂质成分中占摩尔百分比为2～6％的中性脂质，该中性磷脂在脂质相中的浓度为20～40mg/ml；

②将草乌甲素溶于稀酸溶液中使其浓度为20μg/ml～500μg/ml，以作为内水相；

③将等体积的所述内水相加入脂质相上层，混合乳化制得油包水型初乳；

④将2～6倍体积的外水相加入所述油包水型初乳的上层，混合形成水包油包水型复乳，其中外水相中含有40mM的氨基酸、以及3.2～6g/100ml的渗透压调节物；

⑤除去步骤④得到的复乳中的有机溶剂而制得草乌甲素多泡脂质体。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于该步骤①中所述的脂质成分中还含有带负电荷或正电荷的类脂，该类脂与中性磷脂的重量比为1∶5～1∶20。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述带负电荷的类脂选自磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰肌醇、磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸及二硬脂酰磷脂酸中的一种或几种；所述带正电荷的类脂选自二酰基三甲胺丙烷、二酰基二甲胺丙烷、硬脂胺及胶原蛋白中的一种或几种。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于该类脂为选自磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸和二棕榈酰磷脂酰甘油中的一种或几种带负电荷的类脂。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤①中的中性磷脂选自卵磷脂、大豆磷脂、氢化大豆磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂、鞘磷脂中的一种或几种；该中性脂质选自三油酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三癸酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三己酸甘油酯、维生素E和角鲨烯中的一种或几种；该有机溶剂选自乙醚、氯仿、二氯甲烷、异丙基乙醚、四氢呋喃、卤代醚和卤代酯中的一种或几种。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于该中性磷脂选自卵磷脂、二油酰磷脂酰胆碱和二油酰磷脂酰乙醇胺，该中性脂质为三油酸甘油酯，该有机溶剂为二氯甲烷或乙醚-氯仿混合物。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤②中所述的草乌甲素的浓度为500～1000μg/ml。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤②中所述的内水相中还加入＞0g/100ml，且≤4g/100ml的渗透压调节物。

9.如权利要求1或8所述的制备方法，其特征在于所述渗透压调节物为葡萄糖和/或蔗糖。

10.如权利要求1～8任一项所述的制备方法制得的草乌甲素多泡脂质体。

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