CN101035810B - 肝细胞生长因子激活剂的调控物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于调控肝细胞生长因子激活剂功能的方法和组合物。

Description

肝细胞生长因子激活剂的调控物
相关申请
此申请是根据37CFR 1.53(b)(1)提交的非临时申请，根据35USC 119(e)要求2004年10月4日提交的临时申请60/615,657的优先权，将其完整内容收入本文作为参考。
技术领域
一般而言，本发明涉及分子生物学和生长因子调节领域。更具体的说，本发明涉及肝细胞生长因子激活剂功能的调控物，及所述调控物的用途。
背景
肝细胞生长因子(HGF)通过激活受体酪氨酸激酶Met促进细胞增殖、迁移、血管发生、存活和形态发生(综述见8，9)。除了它在正常生理学中的重要性之外，HGF/Met途径还涉及侵入性肿瘤生长和肿瘤转移(8)。HGF与丝氨酸蛋白酶纤溶酶原具有高度相似性，而且是由包含N-结构域和4个Kringle结构域的α链及与胰凝乳蛋白酶样蛋白酶具有同源性的β链构成的。它以无活性单链前体(pro-HGF)的形式分泌到胞外基质中，而且需要Arg494-Val495处的活化切割以形成生物学上有能力的二硫键连接的α/β异二聚体(10-13)。这一步是由转变pro-HGF的丝氨酸蛋白酶介导的，诸如肝细胞生长因子激活剂(HGFA)(14)。HGFA受到细胞表面表达的Kunitz型抑制剂，诸如两种肝细胞生长因子激活剂抑制物剪接变体HAI-1(16-17)和HAI-1B(15)及HAI-2(18)的抑制。HAI-2(也称为胎盘双库尼兹抑制剂(bikunin))(19)还强效抑制因子XIa和血浆激肽释放酶(20)，而HAI-1B具有很低的抑制活性或不具有抑制活性(15)。因此，胞外基质中pro-HGF集合的生物利用度受到pro-HGF转变酶诸如HGFA及其抑制剂的调节。
由于pro-HGF的活化需要转变酶诸如HGFA的切割，因此HGFA功能和/或它与其底物相互作用的调控可证明是有效的治疗途径。在这点上，显然需要能够调控HGFA活性和/或特异性与HGFA相互作用的临床相关药剂。本发明满足了这一需求并提供了其它好处。
完整收入本文中引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，作为参考。
发明公开
本发明提供了方法、组合物、试剂盒和制品，用于调控肝细胞生长因子激活剂(HGFA)的功能，由此调控HGFA活性的生理学作用。HGFA功能的调控可通过使用本文所述抗体来实现。
本发明提供了能够用于调控HGFA功能的调控物分子。在一个实施方案中，HGFA的功能是通过HGFA活性(例如蛋白水解活性)的抑制而受到调控的。一般而言，调控物分子包括本文所述抗体。调控物分子能够直接(例如通过与HGFA结合并干扰HGFA的蛋白水解活性)或间接(例如通过使活性剂靶向/定向组织或细胞中的HGFA，其中所述活性剂能够干扰HGFA的蛋白水解活性)影响调控作用。在一个实施方案中，本发明提供了包含与HGFA结合的抗体的拮抗剂分子。在一个实施方案，拮抗剂与HGFA的结合干扰HGFA的蛋白水解活性。在一个实施方案中，拮抗剂与HGFA的结合干扰HGFA对HGF的活化作用。在一个实施方案中，所述抗体结合HGFA的活性位点。在一个实施方案中，所述抗体在HGFA活性位点以外的位置(例如外位点(exosite))结合HGFA。在一个实施方案中，所述抗体在HGFA活性位点以外的位置与HGFA的结合抑制HGFA与其底物分子的相互作用。在一个实施方案中，所述抗体在HGFA活性位点以外的位置与HGFA的结合抑制HGFA的蛋白水解活性。
一方面，本发明提供了破坏HGF/c-met信号途径的拮抗剂。例如，本发明提供了抑制HGFA切割proHGF(例如在R494-V495位置的切割)的分子。所述分子可以许多方式发挥其抑制作用，包括但不限于在其活性位点和/或活性位点以外的位点(例如外位点)结合HGFA，使得HGFA对proHGF的切割受到抑制。所述分子可以复合或非复合形式结合HGFA。所述分子也可通过干扰HGF活化过程的一个或多个方面来发挥其抑制作用。例如，在一个实施方案中，本发明的拮抗剂分子结合HGFA-proHGF复合物，使得proHGF的切割受到抑制。在一个实施方案中，所述分子与proHGF或HGFA的结合(单独的或复合物中的)抑制HGFA切割后HGF子序列的释放。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂分子不抑制HGF结合c-met。例如，在一个实施方案中，本发明的拮抗剂分子不是具有与如下杂交瘤细胞系所生成的抗体相似的抑制和/或结合能力的抗体或其片段，所述杂交瘤细胞系以美国典型培养物保藏中心登录号ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)保藏。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂分子抑制与HGF/c-met活化作用有关的生物学活性。
一方面，本发明提供了包含如下CDR-H1区的抗体，该CDR-H1区包含SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39或42的序列。一方面，本发明提供了包含如下CDR-H2区的抗体，该CDR-H2区包含SEQ ID NO：4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40或43的序列。一方面，本发明提供了包含如下CDR-H3区的抗体，该CDR-H3区包含SEQ ID NO：5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41或44的序列。在一个实施方案中，本发明提供了包含如下CDR-H1区和如下CDR-H2区的抗体，该CDR-H1区包含SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39或42的序列，该CDR-H2区包含SEQ ID NO：4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40或43的序列。在一个实施方案中，本发明提供了包含如下CDR-H1区和如下CDR-H3区的抗体，该CDR-H1区包含SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39或42的序列，该CDR-H3区包含SEQ ID NO：5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41或44的序列。在一个实施方案中，本发明提供了包含如下CDR-H2区和如下CDR-H3区的抗体，该CDR-H2区包含SEQID NO：4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40或43的序列，该CDR-H3区包含SEQ ID NO：5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41或44的序列。在一个实施方案中，本发明提供了包含如下CDR-H1区、如下CDR-H2区和如下CDR-H3区的抗体，该CDR-H1区包含SEQ IDNO：3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39或42的序列，该CDR-H2区包含SEQ ID NO：4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40或43的序列，该CDR-H3区包含SEQ ID NO：5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41或44的序列。
一方面，本发明提供了包含至少一个、至少两个或所有三个如下序列的抗体：
(i)包含SEQ ID NO：3之序列的CDR-H1序列；
(ii)包含SEQ ID NO：4之序列的CDR-H2序列；
(iii)包含SEQ ID NO：5之序列的CDR-H3序列。
一方面，本发明提供了包含至少一个、至少两个或所有三个如下序列的抗体：
(i)包含SEQ ID NO：6之序列的CDR-H1序列；
(ii)包含SEQ ID NO：7之序列的CDR-H2序列；
(iii)包含SEQ ID NO：8之序列的CDR-H3序列。
一方面，本发明提供了包含至少一个、至少两个或所有三个如下序列的抗体：
(i)包含SEQ ID NO：9之序列的CDR-H1序列；
(ii)包含SEQ ID NO：10之序列的CDR-H2序列；
(iii)包含SEQ ID NO：11之序列的CDR-H3序列。
一方面，本发明提供了包含至少一个、至少两个或所有三个如下序列的抗体：
(i)包含SEQ ID NO：12之序列的CDR-H1序列；
(ii)包含SEQ ID NO：13之序列的CDR-H2序列；
(iii)包含SEQ ID NO：14之序列的CDR-H3序列。
一方面，本发明提供了包含至少一个、至少两个或所有三个如下序列的抗体：
(i)包含SEQ ID NO：15之序列的CDR-H1序列；
(ii)包含SEQ ID NO：16之序列的CDR-H2序列；
(iii)包含SEQ ID NO：17之序列的CDR-H3序列。
一方面，本发明提供了包含至少一个、至少两个或所有三个如下序列的抗体：
(i)包含SEQ ID NO：18之序列的CDR-H1序列；
(ii)包含SEQ ID NO：19之序列的CDR-H2序列；
(iii)包含SEQ ID NO：20之序列的CDR-H3序列。
一方面，本发明提供了包含至少一个、至少两个或所有三个如下序列的抗体：
(i)包含SEQ ID NO：21之序列的CDR-H1序列；
(ii)包含SEQ ID NO：22之序列的CDR-H2序列；
(iii)包含SEQ ID NO：23之序列的CDR-H3序列。
一方面，本发明提供了包含至少一个、至少两个或所有三个如下序列的抗体：
(i)包含SEQ ID NO：24之序列的CDR-H1序列；
(ii)包含SEQ ID NO：25之序列的CDR-H2序列；
(iii)包含SEQ ID NO：26之序列的CDR-H3序列。
一方面，本发明提供了包含至少一个、至少两个或所有三个如下序列的抗体：
(i)包含SEQ ID NO：27之序列的CDR-H1序列；
(ii)包含SEQ ID NO：28之序列的CDR-H2序列；
(iii)包含SEQ ID NO：29之序列的CDR-H3序列。
一方面，本发明提供了包含至少一个、至少两个或所有三个如下序列的抗体：
(i)包含SEQ ID NO：30之序列的CDR-H1序列；
(ii)包含SEQ ID NO：31之序列的CDR-H2序列；
(iii)包含SEQ ID NO：32之序列的CDR-H3序列。
一方面，本发明提供了包含至少一个、至少两个或所有三个如下序列的抗体：
(i)包含SEQ ID NO：33之序列的CDR-H1序列；
(ii)包含SEQ ID NO：34之序列的CDR-H2序列；
(iii)包含SEQ ID NO：35之序列的CDR-H3序列。
一方面，本发明提供了包含至少一个、至少两个或所有三个如下序列的抗体：
(i)包含SEQ ID NO：36之序列的CDR-H1序列；
(ii)包含SEQ ID NO：37之序列的CDR-H2序列；
(iii)包含SEQ ID NO：38之序列的CDR-H3序列。
一方面，本发明提供了包含至少一个、至少两个或所有三个如下序列的抗体：
(i)包含SEQ ID NO：39之序列的CDR-H1序列；
(ii)包含SEQ ID NO：40之序列的CDR-H2序列；
(iii)包含SEQ ID NO：41之序列的CDR-H3序列。
一方面，本发明提供了包含至少一个、至少两个或所有三个如下序列的抗体：
(i)包含SEQ ID NO：42之序列的CDR-H1序列；
(ii)包含SEQ ID NO：43之序列的CDR-H2序列；
(iii)包含SEQ ID NO：44之序列的CDR-H3序列。
如图1所示，对SEQ ID NO：3-44的氨基酸序列中的各个CDR(即H1、H2或H3)进行了编号，此编号与下文所述Kabat编号系统一致。
在一个实施方案中，对于图1B、1C和1D中所示每个克隆，本发明的抗体包含如下重链可变区CDR序列，其包含H1(SEQ ID NO：71-84)、H2(SEQ ID NO：85-98)和/或H3(SEQ ID NO：99-112)序列中至少一个、至少两个或所有三个的序列。
一方面，本发明提供了包含图1A、B、C和D中所示重链CDR序列的抗体。在有些实施方案中，这些抗体还包含人源化4D5抗体(huMAb4D5-8)(
Figure G200580033803620070406D000061
Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)的轻链可变区(也可参见美国专利6,407,213和Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-93(2004))，如下文SEQ ID NO：45所示。
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr CysArg Ala Ser Gln Asp Val 
Figure G200580033803620070406D000062
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly LysAla Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser GlyVal Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
Figure G200580033803620070406D000063
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile SerSer Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 
Figure G200580033803620070406D000064
Tyr Thr Thr ProPro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr(SEQ ID NO：45)
在一个实施方案中，huMAb4D5-8轻链可变区序列在第30、66和91位(分别是Asn、Arg和His，如上以粗体/斜体指示)中的一个或多个位置受到修饰。在一个实施方案中，经过修饰的huMAb4D5-8序列包含第30位的Ser，第66位的Gly和/或第91位的Ser。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体包含如下轻链可变区，其包含下文SEQ ID NO：54所示序列：
1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr Ile Thr CysArg Ala Ser Gln Asp Val Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln GlnLys ProGly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser GlyVal Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 
Figure G200580033803620070406D000071
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile SerSer Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 
Figure G200580033803620070406D000072
Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107(SEQ ID NO：54)(CDR残基标有下划线)
关于huMAb4D5-8的替代残基在上文中以粗体/斜体指示。
本发明的抗体可进一步包含任何合适的框架和/或轻链可变区序列，只要HGFA结合活性基本上得到保留。例如，在有些实施方案中，这些抗体还包含人亚型III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，所述框架共有序列包含第71、73和/或78位的替代。在这些抗体的某些实施方案中，第71位是A，第73位是T，和/或第78位是A。在一个实施方案中，这些抗体包含人源化4D5抗体(huMAb 4D5-8)(
Figure G200580033803620070406D000073
Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA)的重链可变区框架序列(还可参阅美国专利6,407,213和Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-93(2004))。在一个实施方案中，该人源化4D5-8抗体如美国专利6,407,213中所述。在一个实施方案中，这些抗体还包含人κI轻链框架共有序列。在一个实施方案中，这些抗体包含人源化4D5抗体(huMAb 4D5-8)(
Figure G200580033803620070406D000074
Genentech，Inc.，South SanFrancisco，CA，USA)的轻链可变区序列(SEQ ID NO：45)(也可参阅美国专利6,407,213和Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-93(2004))，或其如SEQ IDNO：54所示的修饰变体。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区，其中框架序列包含SEQ ID NO：46、47、48和49的序列(分别是FR1、2、3和4)，及如图1A、B、C和/或D所示的CDR H1、H2和H3序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区，其中框架序列包含SEQ ID NO：50、51、52和53的序列(分别是FR1、2、3和4)，及如SEQ ID NO：54所示的CDR L1、L2和L3序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区，其中框架序列包含SEQ ID NO：59、60、61和62的序列(分别是FR1、2、3和4)(图1E)，及如图1所示的CDR H1、H2和H3序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区，其中框架序列包含SEQ ID NO：55、56、57和58的序列(分别是FR 1、2、3和4)(图1E)，及如SEQ ID NO：54所示的CDR L1、L2和L3序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区，其中框架序列包含SEQ ID NO：67、68、69和70的序列(分别是FR 1、2、3和4)(图1F)，及如图1A、B、C和/或D所示的CDR H1、H2和H3序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区，其中框架序列包含SEQ ID NO：63、64、65和66的序列(分别是FR 1、2、3和4)(图1F)，及如SEQ ID NO：54所示的CDR L1、L2和L3序列。
一方面，本发明提供了与任何上述抗体竞争结合HGFA的抗体。一方面，本发明提供了结合HGFA上与任何上述抗体所结合表位相同的表位的抗体。在一个实施方案中，本发明抗体是亲和成熟的、人源化的、嵌合的或人的。在一个实施方案中，本发明的抗体是抗体片段(如本文所述)或基本上全长的抗体。在一个实施方案中，本发明抗体包含野生型Fc区或其变体。在一个实施方案中，本发明抗体是IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgE或IgD。
一方面，本发明的拮抗剂分子与毒素诸如细胞毒剂连接。这些分子/物质可与添加剂/增强剂联合配制或施用，诸如放射和/或化疗剂。
本发明还提供了可用于调控与HGF/c-met信号轴调节异常有关的疾病状态的方法和组合物。因此，一方面，本发明提供了调控受试者中c-met活化的方法，所述方法包括对受试者施用抑制HGFA切割proHGF的本发明调控物分子，由此使c-met的活化受到调控。一方面，本发明提供了治疗受试者中与c-met活化有关的病理状况的方法，所述方法包括对受试者施用抑制HGFA切割proHGF的本发明调控物分子，由此使c-met的活化受到抑制。在一个实施方案中，本发明的调控物分子是结合HGFA的抗体。
HGF/c-met信号途径涉及多种生物学和生理学功能，包括例如细胞生长刺激(例如细胞增殖、细胞存活、细胞迁移、细胞形态发生)和血管发生。因此，另一方面，本发明提供了抑制c-met激活的细胞生长(例如增殖和/或存活)的方法，所述方法包括使细胞或组织接触本发明的拮抗剂，由此使与c-met活化有关的细胞增殖受到抑制。另一方面，本发明提供了抑制血管发生的方法，所述方法包括对具有异常血管发生相关状况的细胞、组织和/或受试者施用本发明的拮抗剂，由此使血管发生受到抑制。
一方面，本发明提供了本发明的调控物分子在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱。
一方面，本发明提供了本发明的核酸在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱。
一方面，本发明提供了本发明的表达载体在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱。
一方面，本发明提供了本发明的宿主细胞在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱。
一方面，本发明提供了本发明的制品在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱。
一方面，本方面提供了本发明的试剂盒在药物制备中的用途，所述药物用于疾病的治疗性和/或预防性处理，所述疾病诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱。
一方面，本发明提供了抑制c-met激活的细胞增殖的方法，所述方法包括使细胞或组织接触有效量的本发明调控物分子，由此使与c-met活化有关的细胞增殖受到抑制。
一方面，本发明提供了治疗受试者中与c-met活化的调节异常有关的病理状况的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的本发明调控物分子，由此使所述疾病得到治疗。
一方面，本发明提供了抑制表达c-met或肝细胞生长因子或二者的细胞生长的方法，所述方法包括使所述细胞接触本发明的调控物分子，由此引起所述细胞的生长抑制。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF(例如通过旁分泌作用)。
一方面，本发明提供了治疗性处理患癌性肿瘤的哺乳动物的方法，该肿瘤包含表达c-met或肝细胞生长因子或二者的细胞，所述方法包括对所述哺乳动物施用有效量的本发明调控物分子，由此有效治疗所述哺乳动物。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF(例如通过旁分泌作用)。
一方面，本发明提供了用于治疗或预防与HGFA的表达或活性增加有关的细胞增殖性紊乱的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用有效量的本发明调控物分子，由此有效治疗或预防所述细胞增殖性紊乱。在一个实施方案中，所述增殖性紊乱是癌症。
一方面，本发明提供了用于治疗或预防与c-met或肝细胞生长因子或二者的表达或活性增加有关的细胞增殖性紊乱的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用有效量的本发明调控物分子，由此有效治疗或预防所述细胞增殖性紊乱。在一个实施方案中，所述增殖性紊乱是癌症。
一方面，本发明提供了用于抑制细胞生长的方法，其中所述细胞的生长至少部分依赖于HGFA的生长强化作用，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明调控物分子，由此抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF(例如通过旁分泌作用)。
一方面，本发明提供了用于抑制细胞生长的方法，其中所述细胞的生长至少部分依赖于c-met或肝细胞生长因子或二者的生长强化作用，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明调控物分子，由此抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF(例如通过旁分泌作用)。
一方面，本发明提供了治疗性处理哺乳动物中肿瘤的方法，其中所述肿瘤的生长至少部分依赖于HGFA的生长强化作用，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明调控物分子，由此有效治疗所述肿瘤。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF(例如通过旁分泌作用)。
一方面，本发明提供了治疗性处理哺乳动物中肿瘤的方法，其中所述肿瘤的生长至少部分依赖于c-met或肝细胞生长因子或二者的生长强化作用，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明调控物分子，由此有效治疗所述肿瘤。在一个实施方案中，所述细胞接触由不同细胞表达的HGF(例如通过旁分泌作用)。
本发明的方法可用于影响任何合适的病理状态，例如与HGF/c-met信号途径调节异常有关的细胞和/或组织，例如通过与HGFA对HGF的活化作用有关的HGF活性增加。在一个实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是癌细胞。例如，癌细胞可选自乳癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、乳头状癌细胞(例如甲状腺的)、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、中枢神经系统癌细胞、骨源性肉瘤细胞、肾癌细胞、肝细胞癌细胞、膀胱癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞、头和颈鳞状癌细胞、黑素瘤细胞和白血病细胞。在一个实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是过度增殖的和/或过度增生的细胞。在一个实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是发育异常的细胞。在另一实施方案中，本发明方法中所靶向的细胞是转移的细胞。
本发明的方法可进一步包括另外的处理步骤。例如，在一个实施方案中，该方法还包括其中将靶细胞和/或组织(例如癌细胞)暴露于放射处理或化疗剂的步骤。
如本文所述，HGF/c-met的活化是重要的生物学过程，它的调节异常导致许多病理状况。因此，在本发明方法的一个实施方案中，所靶向的细胞(例如癌细胞)是其中HGF/c-met的活化与相同组织起源的正常细胞相比增强的细胞。在一个实施方案中，本发明的方法引起靶细胞的死亡。例如，与本发明调控物分子的接触可导致细胞不能通过c-met途径发信号，这导致细胞死亡。
c-met活化(及由此信号传导)的调节异常可源自许多细胞变化，包括例如HGF(c-met的关联配体)和/或HGFA的过表达，和/或HGFA对HGF的活化作用增加。因此，在有些实施方案中，本发明的方法包括靶向这样的组织，与相同起源的正常组织相比，其中表达和/或存在的HGFA、c-met和肝细胞生长因子中的一种或多种更丰富(例如癌)。表达HGF或c-met的细胞可受到来自多种来源的HGFA调节，即以自分泌或旁分泌的方式。例如，在本发明方法的一个实施方案中，使靶细胞受到被不同细胞所表达的HGFA活化的肝细胞生长因子的接触/结合(例如通过旁分泌作用)。所述不同细胞可以是相同或不同组织起源的。在一个实施方案中，使靶细胞受到被靶细胞自身所表达的HGFA活化的HGF的接触/结合(例如通过自分泌作用/环)。
一方面，本发明提供了包含本发明的一种或多种调控物分子及载体的组合物。在一个实施方案中，所述载体是药学可接受的。
一方面，本发明提供了编码本发明调控物分子的核酸。在一个实施方案中，本发明的核酸编码调控物分子，其是或者包含抗体或其片段。
一方面，本发明提供了包含本发明核酸的载体。
一方面，本发明提供了包含本发明核酸或载体的宿主细胞。载体可以是任何类型的，例如重组载体，诸如表达载体。可使用多种宿主细胞中的任一种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
一方面，本发明提供了制备本发明调控物分子的方法。例如，本发明提供了制备调控物分子的方法，该调控物分子是或者包含抗体(或其片段)，所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码所述抗体(或其片段)的本发明重组载体，并回收所述抗体。
一方面，本发明提供了包括容器及该容器内所装有的组合物的制品，其中所述组合物包含本发明的一种或多种调控物分子。在一个实施方案中，所述组合物包含本发明的核酸。在一个实施方案中，包含调控物分子的组合物还包含载体，它在有些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，本发明的制品还包括关于对受试者施用所述组合物(例如调控物分子)的说明书。
一方面，本发明提供了包括第一容器和第二容器的试剂盒，其中第一容器装有包含本发明的一种或多种调控物分子的组合物，而第二容器装有缓冲剂。在一个实施方案中，所述缓冲剂是药学可接受的。在一个实施方案中，包含调控物分子的组合物还包含载体，它在有些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，试剂盒还包括关于对受试者施用所述组合物(例如调控物分子)的说明书。
一方面，本发明提供了诊断疾病的方法，包括通过使样品接触本发明的抗体来测定组织细胞待测样品中的HGFA水平，由此被所述抗体结合的HGFA指示样品中HGFA的存在和/或量。另一方面，本发明提供了测定个体是否有患病风险的方法，包括通过使待测样品接触本发明的抗体来测定组织细胞待测样品中的HGFA水平，由此测定样品中存在的HGFA的量，其中与包含与待测样品细胞起源相同的正常组织的对照样品相比，待测样品中HGFA水平较高指示该个体有患病风险。在本发明方法的一个实施方案中，HGFA水平是基于HGFA多肽的量测定的，而后者由待测样品中抗体所结合的HGFA量指示。所述方法中所采用的抗体可任选进行可检测标记，附着于固相支持物，等等。
一方面，本发明提供了使本发明抗体与体液例如血液中存在的HGFA结合的方法。
另一方面，本发明致力于使本发明抗体与表达和/或响应HGFA的细胞结合的方法，其中所述方法包括在适于所述抗体与HGFA结合且允许它们之间结合发生的条件下使所述细胞接触所述抗体。在一个实施方案中，所述抗体与细胞上的HGFA的结合抑制HGFA的生物学功能。在一个实施方案中，所述抗体不抑制HGFA与其底物分子的相互作用。在一个实施方案中，所述抗体与细胞上的HGFA分子结合并抑制另一分子(诸如pro-HGF)与HGFA分子结合。
一方面，本发明提供了使治疗剂靶向宿主中的HGFA相关组织的方法，所述方法包括对宿主施用与本发明抗体连接形式的所述治疗剂，由此使所述药剂靶向于宿主中的HGFA相关组织。在一个实施方案中，结合HGFA的抗体能够特异性结合位于细胞上的HGFA(在体外或在体内)，例如在HGFA存在于细胞表面上的情形中。
附图简述
图1(A)抗HGFA抗体的重链CDR环序列。该图显示了重链CDR序列H1、H2和H3。轻链序列是人源化4D5序列(参见Lee et al.，见上文)。序列编号如下：克隆33(CDRH1是SEQ ID NO：3；CDRH2是SEQ ID NO：4；CDRH3是SEQ ID NO：5)；克隆35(CDRH1是SEQ ID NO：6；CDRH2是SEQ ID NO：7；CDRH3是SEQ ID NO：8)；克隆37(CDRH1是SEQ IDNO：9；CDRH2是SEQ ID NO：10；CDRH3是SEQ ID NO：11)；克隆39(CDRH1是SEQ ID NO：12；CDRH2是SEQ ID NO：13；CDRH3是SEQ IDNO：14)；克隆42(CDRH1是SEQ ID NO：15；CDRH2是SEQ ID NO：16；CDRH3是SEQ ID NO：17)；克隆49(CDRH1是SEQ ID NO：18；CDRH2是SEQ ID NO：19；CDRH3是SEQ ID NO：20)；克隆58(CDRH1是SEQID NO：21；CDRH2是SEQ ID NO：22；CDRH3是SEQ ID NO：23)；克隆61(CDRH1是SEQ ID NO：24；CDRH2是SEQ ID NO：25；CDRH3是SEQID NO：26)；克隆74(CDRH1是SEQ ID NO：27；CDRH2是SEQ ID NO：28；CDRH3是SEQ ID NO：29)；克隆75(CDRH1是SEQ ID NO：30；CDRH2是SEQ ID NO：31；CDRH3是SEQ ID NO：32)；克隆86(CDRH1是SEQID NO：33；CDRH2是SEQ ID NO：34；CDRH3是SEQ ID NO：35)；克隆90(CDRH1是SEQ ID NO：36；CDRH2是SEQ ID NO：37；CDRH3是SEQID NO：38)；克隆91(CDRH1是SEQ ID NO：39；CDRH2是SEQ ID NO：40；CDRH3是SEQ ID NO：41)；克隆95(CDRH1是SEQ ID NO：42；CDRH2是SEQ ID NO：43；CDRH3是SEQ ID NO：44)。氨基酸位置依照下无所述Kabat编号系统编号。最后(右边)一栏还显示了IC50值。
(B)、(C)和(D)抗HGFA抗体的重链CDR环序列。
(E)和(F)例示的框架区序列。(E)HuMAb4D5-8框架区序列。(F)包含修饰的HuMAb4D5-8框架区序列。
图2抗HGFA抗体对HGFA介导的proHGF活化的抑制。将HGFA与125I标记的proHGF和抗HGFA抗体在37℃保温4小时。反应物浓度是50μg/mlproHGF、2nM HGFA和0.1mg/ml(0.67μM)抗体。通过SDS-PAGE在还原条件下分析等分试样。将终浓度1μM的可溶性HAI-1B(sHAI-1B)用作对照抑制剂。A.泳道1：(t＝0)是反应开始时采集的等分试样，泳道2：无抑制剂，泳道3：sHAI-1B(1μM)，泳道4：#33，泳道5：#35，泳道6：#39，泳道7：#49，泳道8：#74，泳道9：#61。B.泳道1：#42，泳道2：#91，泳道3：58，泳道4：#37，泳道5：#75，泳道6：#90，泳道7：#86，泳道8：#95。
图3抗体#58对HGFA介导的proHGF转变的强力抑制。将三种不同浓度的抗体#58和非阻断性抗体#49用于如图1所示进行的125I标记proHGF转变实验。泳道1：(t＝0)是反应开始时取的等分试样，泳道2：无抑制剂，泳道3：sHAI-1B(1μM)，泳道4：0.67μMAb#49，泳道5：0.13μMAb#49，泳道6：0.03μM Ab#49，泳道7：0.67μM Ab#58，泳道8：0.13μM Ab#58，泳道9：0.03μM Ab#58。
图4抗HGFA抗体#58和#75对HGFA酰胺分解活性的浓度依赖性抑制作用。将多种浓度的抗体与HGFA(终浓度5nM)在HBSA缓冲液中室温保温20分钟。加入
Figure G200580033803620070406D000141
(终浓度200μM，KM＝200μM)后，在动力学微量板读数仪上测量底物活化的线性速率。酶活性的抑制表示为未受抑制活性的相对活性(fractional activity)(vi/vo)。
图5IV-49C和小分子活性位点结合物/抑制剂对HGFA酰胺分解活性的抑制作用。将多种浓度的抑制剂与HGFA(分别是2.5nM用于IV-49C和5nM用于所述小分子)在HBSA缓冲液中室温保温20分钟。如图4所示测量
Figure G200580033803620070406D000142
活化作用的酶抑制。A.Kunitz结构域抑制剂IV-49C(实心圆)与特异性因子XIIa抑制剂玉米胰蛋白酶抑制剂(空心圆)相比较的抑制作用。B.小分子抑制剂的抑制作用(实心三角形)。
图6HGFA与抗HGFA抗体#58和#75结合的表面等离振子共振测量。将抗HGFA抗体(全长IgG1)固定在BIAcore芯片上，收集来自多种HGFA浓度的结合数据。为了竞争性结合研究，将HGFA(70nM)与多种浓度的sHAI-1B、IV-49C或小分子活性位点结合物一起预保温。A-D：HGFA与抗体#58的结合，(A)在缺乏抑制剂的情况下，或者在存在(B)sHAI-1B、(C)IV-49C和(D)小分子活性位点结合物的情况下。E-H：HGFA与抗体#75的结合，(E)在缺乏抑制剂的情况下，或者在存在(F)sHAI-1B、(G)IV-49C和(H)小分子活性位点结合物的情况下。
图7人(顶行；SEQ ID NO：1)和鼠(底行；SEQ ID NO：2)HGFA蛋白序列的序列。
图8显示多种抗HGFA抗体对HGFA酶活性的抑制作用的有关数据的表。
图9显示HGFA与抗HGFA抗体结合的有关数据的表。
实施本发明的模式
本发明提供了包含肝细胞生长因子激活剂功能的调控物的方法、组合物、试剂盒和制品。
本文提供了这些方法、组合物、试剂盒和制品的细节。
通用技术
除非另有说明，本发明的实行将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。文献中充分解释了这些技术，诸如“Molecular Cloning：ALaboratory Manual”，second edition(Sambrook et al.，1989)；“OligonucleotideSynthesis”，(M.J.Gait，ed.，1984)；“Animal Cell Culture”，(R.I.Freshney，ed.，1987)；“Methods in Enzymology”，(Academic Press，Inc.)；“Current Protocols inMolecular Biology”，(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，and periodic updates)；“PCR：The Polymerase Chain Reaction”，(Mullis et al.，ed.，1994)；“A PracticalGuide to Molecular Cloning”，(Perbal Bernard V.，1988)；“Phage Display：ALaboratory Manual”，(Barbas et al.，2001)。
定义
术语“肝细胞生长因子激活剂”或“HGFA”在用于本文时涵盖能够以与野生型HGFA相似的方式切割proHGF的天然序列多肽、多肽变体及天然序列多肽和多肽变体的片段(在本文中有进一步的定义)。本文所述的HGFA多肽可以是从多种来源分离的，诸如来自人组织类型或来自另一来源，或是通过重组或合成方法制备的。术语“HGFA”、“HGFA多肽”、“HGFA酶”和“HGFA蛋白”还包括本文所公开的HGFA多肽的变体。
“天然序列HGFA多肽”包括与衍生自自然界的相应HGFA多肽具有相同氨基酸序列的多肽(例如图7所示的序列)。在一个实施方案中，天然序列HGFA多肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列(见图7；顶部的序列)。此类天然序列HGFA多肽可从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列HGFA多肽”明确涵盖天然发生的截短或分泌形式的特定HGFA多肽(例如胞外结构域序列)、所述多肽的天然发生变体形式(例如可变剪接形式)和天然发生等位基因变体。
“HGFA多肽变体”或其变异意指HGFA多肽，通常是活性HGFA多肽，如本文所定义的与本文所公开的任一天然序列HGFA多肽序列具有至少约80％的氨基酸序列同一性。此类HGFA多肽变体包括例如其中天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或删除了一个或多个氨基酸残基的HGFA多肽。通常，HGFA多肽变体与本文所公开的天然序列HGFA多肽序列具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。通常，HGFA变体多肽的长度为至少约10个氨基酸长，或者长度为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600个氨基酸或更多。任选的是，HGFA变体多肽与天然HGFA多肽序列相比具有不超过一个的保守氨基酸替代，或者与天然HGFA多肽序列相比具有不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸替代。
关于肽或多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本文的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列对比计算机程序ALIGN-2而获得的，其中下文表A中提供了ALIGN-2程序的全部源代码。ALIGN-2序列对比计算机程序由Genentech，Inc.编写，且下文表A中所示源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(WashingtonD.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech，Inc.(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可从下文图8中提供的源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(任选可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可预料到若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。
除非另有具体说明，本文所用的所有％氨基酸序列同一性值均是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
表A
/*
  *
  *C-C increased from 12 to 15
  *Z is average of EQ
  *B is average of ND
  *match with stop is_M；stop-stop＝0；J(joker)match＝0
  */
#define_M-8/*value of a match with a stop*/
int  _day[26][26]＝{
/*   A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z*/
/*A*/     {2，0，-2，0，0，-4，1，-1，-1，0，-1，-2，-1，0，_M，1，0，-2，1，1，0，0，-6，0，-3，0}，
/*B*/     {0，3，-4，3，2，-5，0，1，-2，0，0，-3，-2，2，_M，-1，1，0，0，0，0，-2，-5，0，-3，1}，
/*C*/     {-2，-4，15，-5，-5，-4，-3，-3，-2，0，-5，-6，-5，-4，_M，-3，-5，-4，0，-2，0，-2，-8，0，0，-5}，
/*D*/     {0，3，-5，4，3，-6，1，1，-2，0，0，-4，-3，2，_M，-1，2，-1，0，0，0，-2，-7，0，-4，2}，
/*E*/     {0，2，-5，3，4，-5，0，1，-2，0，0，-3，-2，1，_M，-1，2，-1，0，0，0，-2，-7，0，-4，3}，
/*F*/     {-4，-5，-4，-6，-5，9，-5，-2，1，0，-5，2，0，-4，_M，-5，-5，-4，-3，-3，0，-1，0，0，7，-5}，
/*G*/     {1，0，-3，1，0，-5，5，-2，-3，0，-2，-4，-3，0，_M，-1，-1，-3，1，0，0，-1，-7，0，-5，0}，
/*H*/     {-1，1，-3，1，1，-2，-2，6，-2，0，0，-2，-2，2，_M，0，3，2，-1，-1，0，-2，-3，0，0，2}，
/*I*/     {-1，-2，-2，-2，-2，1，-3，-2，5，0，-2，2，2，-2，_M，-2，-2，-2，-1，0，0，4，-5，0，-1，-2}，
/*J*/     {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}，
/*K*/     {-1，0，-5，0，0，-5，-2，0，-2，0，5，-3，0，1，_M，-1，1，3，0，0，0，-2，-3，0，-4，0}，
/*L*/     {-2，-3，-6，-4，-3，2，-4，-2，2，0，-3，6，4，-3，_M，-3，-2，-3，-3，-1，0，2，-2，0，-1，-2}，
/*M*/     {-1，-2，-5，-3，-2，0，-3，-2，2，0，0，4，6，-2，_M，-2，-1，0，-2，-1，0，2，-4，0，-2，-1}，
/*N*/     {0，2，-4，2，1，-4，0，2，-2，0，1，-3，-2，2，_M，-1，1，0，1，0，0，-2，-4，0，-2，1}，
/*O*/     {_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，
0，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M}，
/*P*/     {1，-1，-3，-1，-1，-5，-1，0，-2，0，-1，-3，-2，-1，_M，6，0，0，1，0，0，-1，-6，0，-5，0}，
/*Q*/     {0，1，-5，2，2，-5，-1，3，-2，0，1，-2，-1，1，_M，0，4，1，-1，-1，0，-2，-5，0，-4，3}，
/*R*/     {-2，0，-4，-1，-1，-4，-3，2，-2，0，3，-3，0，0，_M，0，1，6，0，-1，0，-2，2，0，-4，0}，
/*S*/     {1，0，0，0，0，-3，1，-1，-1，0，0，-3，-2，1，_M，1，-1，0，2，1，0，-1，-2，0，-3，0}，
/*T*/     {1，0，-2，0，0，-3，0，-1，0，0，0，-1，-1，0，_M，0，-1，-1，1，3，0，0，-5，0，-3，0}，
/*U*/     {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}，
/*V*/     {0，-2，-2，-2，-2，-1，-1，-2，4，0，-2，2，2，-2，_M，-1，-2，-2，-1，0，0，4，-6，0，-2，-2}，
/*W*/     {-6，-5，-8，-7，-7，0，-7，-3，-5，0，-3，-2，-4，-4，_M，-6，-5，2，-2，-5，0，-6，17，0，0，-6}，
/*X*/     {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}，
/*Y*/     {-3，-3，0，-4，-4，7，-5，0，-1，0，-4，-1，-2，-2，_M，-5，-4，-4，-3，-3，0，-2，0，0，10，-4}，
/*Z*/     {0，1，-5，2，3，-5，0，2，-2，0，0，-2，-1，1，_M，0，3，0，0，0，0，-2，-6，0，-4，4}
}；
/*
*/
#include<stdio.h>
#include<ctype.h>
#define MAXJMP    16    /*maxjumps in a diag*/
#define MAXGAP    24    /*don′t continue to penalize gaps larger than this*/
#define JMPS      1024  /*max jmps in an path*/
#define MX        4     /*save if there′s at least MX-1 bases since last jmp*/
#define DMAT      3     /*value of matching bases*/
#define DMIS      0     /*penalty for mismatched bases*/
#define DINS0     8     /*penalty for a gap*/
#define DINS1     1     /*penalty per base*/
#define PINS0     8     /*penalty for a gap*/
#define PINS1     4     /*penalty per residue*/
struct jmp{
       short             n[MAXJMP]；/*size of jmp(neg for dely)*/
       unsigned short    x[MAXJMP]；/*base no.of jmp in seq x*/
}；                                 /*limits seq to 2^16-1*/
struct diag{
       int               score；    /*score at last jmp*/
       long              offset；   /*offset of prev block*/
       short             ijmp；     /*current jmp index*/
       struct jmp        jp；       /*list of jmps*/
}；
struct path{
       int      spc；    /*number of leading spaces*/
       short    n[JMPS]；/*size of jmp(gap)*/
       int      x[JMPS]；/*loc of jmp(last elem before gap)*/
}；
char        *ofile；      /*output file name*/
char        *namex[2]；   /*seq names:getseqs()*/
char        *prog；       /*prog name for err msgs*/
char        *seqx[2]；    /*seqs:getseqs()*/
int         dmax；        /*best diag:nw()*/
int         dmax0；       /*final diag*/
int         dna；         /*set if dna:main()*/
int         endgaps；     /*set if penalizing end gaps*/
int         gapx，gapy；  /*total gaps in seqs*/
int         len0，len1；  /*seq lens*/
int         ngapx，ngapy；/*total size of gaps*/
int         smax；        /*max score:nw()*/
int         *xbm；        /*bitmap for matching*/
long        offset；      /*current offset in jmp file*/
struct diag *dx；         /*holds diagonals*/
struct path pp[2]；       /*holds path for seqs*/
char        *calloc()，*malloc()，*index()，*strcpy()；
char        *getseq()，*g_calloc()；
/*Needleman-Wunsch alignment program
  *
  *usage:progs file1 file2
  *where file1 and file2 are two dna or two protein sequences.
  *The sequences can be in upper-or lower-case an may contain ambiguity
  *Any lines beginning with′；′，′＞′or′＜′are ignored
  *Max file length is 65535(limited by unsigned short x in the jmp struct)
  *A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA
  *Output is in the file″align.out″
  *
  *The program may create a tmp file in/tmp to hold info about traceback.
  *Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650
  */
#include″nw.h″
#include″day.h″
static _dbval[26]＝{
       1，14，2，13，0，0，4，11，0，0，12，0，3，15，0，0，0，5，6，8，8，7，9，0，10，0
}；
static _pbval[26]＝{
       1，2|(1＜＜(′D′-′A′))|(1＜＜(′N′-′A′))，4，8，16，32，64，
       128，256，0xFFFFFFF，1＜＜10，1＜＜11，1＜＜12，1＜＜13，1＜＜14，
       1＜＜15，1＜＜16，1＜＜17，1＜＜18，1＜＜19，1＜＜20，1＜＜21，1＜＜22，
       1＜＜23，1＜＜24，1＜＜25|(1＜＜(′E′-′A′))|(1＜＜(′Q′-′A′))
}；
main(ac，av)                                                                             main
     int    ac；
     char   *av[]；
{
     prog＝av[0]；
     if(ac！＝3){
            fprintf(stderr，″usage:％s file1 file2\n″，prog)；
            fprintf(stderr，″where file1 and file2 are two dna or two protein sequences.\n″)；
            fprintf(stderr，″The sequences can be in upper-or lower-case\n″)；
            fprintf(stderr，″Any lines beginning with′；′or′＜′are ignored\n″)；
            fprintf(stderr，″Output is in the file\″align.out\″\n″)；
            exit(1)；
     }
     namex[0]＝av[1]；
     namex[1]＝av[2]；
     seqx[0]＝getseq(namex[0]，&len0)；
     seqx[1]＝getseq(namex[1]，&len1)；
     xbm＝(dna)？_dbval:_pbval；
     endgaps＝0；          /*1 to penalize endgaps*/
     ofile＝″align.out″；/*output file*/
     nw()；          /*fill in the matrix，get the possible jmps*/
     readjmps()；    /*get the actual jmps*/
     print()；       /*print stats，alignment*/
     cleanup(0)；    /*unlink any tmp files*/
}
/*do the alignment，return best score:main()
  *dna:values in Fitch and Smith，PNAS，80，1382-1386，1983
  *pro:PAM 250 values
  *When scores are equal，we prefer mismatches to any gap，prefer
  *a new gap to extending an ongoing gap，and prefer a gap in seqx
  *to a gap in seq y.
  */
nw()                                                                                          nw
{
        char        *px，*py；     /*seqs and ptrs*/
        int         *ndely，*dely；/*keep track of dely*/
        int         ndelx，delx；  /*keep track of delx*/
        int         *tmp；         /*for swapping row0，row1*/
        int         mis；          /*score for each type*/
        int         ins0，ins1；   /*insertion penalties*/
        register    id；           /*diagonal index*/
        register    ij；           /*jmp index*/
        register    *col0，*col1； /*score for curr，last row*/
        register    xx，yy；             /*index into seqs*/
        dx＝(struct diag*)g_calloc(″to get diags″，len0+len1+1，sizeof(struct diag))；
        ndely＝(int*)g_calloc(″to get ndely″，len1+1，sizeof(int))；
        dely＝(int*)g_calloc(″to get dely″，len1+1，sizeof(int))；
        col0＝(int*)g_calloc(″to get col0″，len1+1，sizeof(int))；
        col1＝(int*)g_calloc(″to get col1″，len1+1，sizeof(int))；
        ins0＝(dna)？DINS0:PINS0；
        ins1＝(dna)？DINS1:PINS1；
smax＝-10000；
if(endgaps){
      for(col0[0]＝dely[0]＝-ins0，yy＝1；yy＜＝len1；yy++){
            col0[yy]＝dely[yy]＝col0[yy-1]-ins1；
            ndely[yy]＝yy；
      }
      col0[0]＝0；/*Waterman Bull Math Biol 84*/
}
else
      for(yy＝1；yy＜＝len1；yy++)
           dely[yy]＝-ins0；
/*fill in match matrix
  */
for(px＝seqx[0]，xx＝1；xx＜＝len0；px++，xx++){
     /*initialize first entry in col
       */
     if(endgaps){
           if(xx＝＝1)
                col1[0]＝delx＝-(ins0+ins1)；
           else
                col1[0]＝delx＝col0[0]-ins1；
           ndelx＝xx；
     }
     else{
           col1[0]＝0；
           delx＝-ins0；
           ndelx＝0；
     }
                                                                ...nw
     for(py＝seqx[1]，yy＝1；yy＜＝len1；py++，yy++){
           mis＝col0[yy-1]；
           if(dna)
                 mis+＝(xbm[*px-′A′]&xbm[*py-′A′])？DMAT:DMIS；
           else
                 mis+＝_day[*px-′A′][*py-′A′]；
           /*update penalty for del in x seq；
             *favor new del over ongong del
             *ignore MAXGAP if weighting endgaps
             */
           if(endgaps||ndely[yy]＜MAXGAP){
                 if(col0[yy]-ins0＞＝dely[yy]){
                        dely[yy]＝col0[yy]-(ins0+ins1)；
                        ndely[yy]＝1；
                  }else{
                        dely[yy]-＝ins1；
                        ndely[yy]++；
                  }
             }else{
                  if(col0[yy]-(ins0+ins1)＞＝dely[yy]){
                        dely[yy]＝col0[yy]-(ins0+ins1)；
                        ndely[yy]＝1；
                  }else
                        ndely[yy]++；
             }
/*update penalty for del in y seq；
  *favor new del over ongong del
  */
if(endgaps||ndelx＜MAXGAP){
      if(col1[yy-1]-ins0＞＝delx){
             delx＝col1[yy-1]-(ins0+ins1)；
             ndelx＝1；
      }else{
             delx-＝ins1；
             ndelx++；
      }
}else{
     if(col1[yy-1]-(ins0+insl)＞＝delx){
            delx＝col1[yy-1]-(ins0+ins1)；
            ndelx＝1；
      }else
            ndelx++；
}
/*pick the maximum score；we′re favoring
  *mis over any del and delx over dely
  */
                                                                    ...nw
          id＝xx-yy+len1-1；
          if(mis＞＝delx&&mis＞＝dely[yy])
                 col1[yy]＝mis；
          else if(delx＞＝dely[yy]){
                 col1[yy]＝delx；
                 ij＝dx[id].ijmp；
                 if(dx[id].jp.n[0]&&(！dna||(ndelx＞＝MAXJMP
                 &&xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)||mis＞dx[id].score+DINS0)){
                     dx[id].ijmp++；
                     if(++ij＞＝MAXJMP){
                            writejmps(id)；
                            ij＝dx[id].ijmp＝0；
                            dx[id].offset＝offset；
                            offset+＝sizeof(struct jmp)+sizeof(offset)；
                        }
                  }
                  dx[id].jp.n[ij]＝ndelx；
                  dx[id].jp.x[ij]＝xx；
                  dx[id].score＝delx；
            }
            else{
                  col1[yy]＝dely[yy]；
                  ij＝dx[id].ijmp；
if(dx[id].jp.n[0]&&(！dna||(ndely[yy]＞＝MAXJMP
                  &&xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)||mis＞dx[id].score+DINS0)){
                      dx[id].ijmp++；
                      if(++ij＞＝MAXJMP){
                             writejmps(id)；
                                    ij＝dx[id].ijmp＝0；
                                    dx[id].offset＝offset；
                                    offset+＝sizeof(struct jmp)+sizeof(offset)；
                            }
                     }
                     dx[id].jp.n[ij]＝-ndely[yy]；
                     dx[id].jp.x[ij]＝xx；
                     dx[id].score＝dely[yy]；
                }
                if(xx＝＝len0&&yy＜len1){
                     /*last col
                       */
                     if(endgaps)
                          col1[yy]-＝ins0+ins1*(len1-yy)；
                     if(col1[yy]＞smax){
                          smax＝col1[yy]；
                          dmax＝id；
                      }
                 }
           }
           if(endgaps&&xx＜len0)
                 col1[yy-1]-＝ins0+ins1*(len0-xx)；
           if(col1[yy-1]＞smax){
                 smax＝col1[yy-1]；
                 dmax＝id；
            }
            tmp＝col0；col0＝col1；col1＝tmp；
      }
      (void)free((char*)ndely)；
      (void)free((char*)dely)；
      (void)free((char*)col0)；
      (void)free((char*)col1)；}
/*
  *
  *print()--only routine visible outside this module
  *
  *static:
  *getmat()--trace back best path，count matches:print()
  *pr_align()--print alignment of described in array p[]:print()
  *dumpblock()--dump a block of lines with numbers，stars:pr_align()
  *nums()--put out a number line:dumpblock()
  *putline()--put out a line(name，[num]，seq，[num]):dumpblock()
  *stars()--put a line of stars:dumpblock()
  *stripname()--strip any path and prefix from a seqname
  */
#include″nw.h″
#define SPC 3
#define P_LINE   256    /*maximum output line*/
#define P_SPC    3      /*space between name or num and seq*/
extern      _day[26][26]；
int         olen；      /*set output line length*/
FILE        *fx；       /*output file*/
print()                                                          print
{
      int lx，ly，firstgap，lastgap；/*overlap*/
      if((fx＝fopen(ofile，″w″))＝＝0){
            fprintf(stderr，″％s:can′t write％s\n″，prog，ofile)；
            cleanup(1)；
      }
      fprintf(fx，″＜first sequence:％s(length＝％d)\n″，namex[0]，len0)；
      fprintf(fx，″＜second sequence:％s(length＝％d)\n″，namex[1]，len1)；
      olen＝60；
      lx＝len0；
      ly＝len1；
      firstgap＝lastgap＝0；
      if(dmax＜len1-1){/*leading gap in x*/
             pp[0].spc＝firstgap＝len1-dmax-1；
             ly-＝pp[0].spc；
      }
      else if(dmax＞len1-1){/*leading gap in y*/
             pp[1].spc＝firstgap＝dmax-(len1-1)；
             lx-＝pp[1].spc；
      }
      if(dmax0＜len0-1){/*trailing gap in x*/
             lastgap＝len0-dmax0-1；
             lx-＝lastgap；
      }
      else if(dmax0＞len0-1){/*trailing gap in y*/
             lastgap＝dmax0-(len0-1)；
             ly-＝lastgap；
      }
      getmat(lx，ly，firstgap，lastgap)；
      pr_align()；
}
/*
  *trace back the best path，count matches
  */
static
getmat(lx，ly，firstgap，lastgap)                                   getmat
      int    lx，ly；           /*″core″(minus endgaps)*/
      int    firstgap，lastgap；/*leading trailing overlap*/
{
      int              nm，i0，i1，siz0，siz1；
      char             outx[32]；
      double           pct；
      register         n0，n1；
      register char    *p0，*p1；
      /*get total matches，score
        */
      i0＝i1＝siz0＝siz1＝0；
      p0＝seqx[0]+pp[1].spc；
      p1＝seqx[1]+pp[0].spc；
      n0＝pp[1].spc+1；
      n1＝pp[0].spc+1；
      nm＝0；
      while(*p0&&*p1){
     if(siz0){
            p1++；
            n1++；
            siz0--；
     }
     else if(siz1){
            p0++；
            n0++；
            siz1--；
     }
     else{
            if(xbm[*p0-′A′]&xbm[*p1-′A′])
                  nm++；
            if(n0++＝＝pp[0].x[i0])
                  siz0＝pp[0].n[i0++]；
            if(n1++＝＝pp[1].x[i1])
                  siz1＝pp[1].n[i1++]；
            p0++；
            p1++；
      }
}
/*pct homology:
  *if penalizing endgaps，base is the shorter seq
  *else，knock off overhangs and take shorter core
  */
if(endgaps)
      lx＝(len0＜len1)？len0:len1；
else
      lx＝(lx＜ly)？lx:ly；
pct＝100.*(double)nm/(double)lx；
fprintf(fx，″\n″)；
fprintf(fx，″＜％d match％s in an overlap of％d:％.2f percent similarity\n″，
      nm，(nm＝＝1)？″″:″es″，lx，pct)；
  fprintf(fx，″＜gaps in first sequence:％d″，gapx)；                 ...getmat
if(gapx){
      (void)sprintf(outx，″(％d％s％s)″，
            ngapx，(dna)？″base″:″residue″，(ngapx＝＝1)？″″:″s″)；
      fprintf(fx，″％s″，outx)；
fprintf(fx，″，gaps in second sequence:％d″，gapy)；
if(gapy){
      (void)sprintf(outx，″(％d％s％s)″，
            ngapy，(dna)？″base″:″residue″，(ngapy＝＝1)？″″:″s″)；
      fprintf(fx，″％s″，outx)；
}
if(dna)
      fprintf(fx，
      ″\n＜score:％d(match＝％d，mismatch＝％d，gap penalty＝％d+％d per base)\n″，
      smax，DMAT，DMIS，DINS0，DINS1)；
else
      fprintf(fx，
      ″\n＜score:％d(Dayhoff PAM 250 matrix，gap penalty＝％d+％d per residue)\n″，
      smax，PINS0，PINS1)；
if(endgaps)
             fprintf(fx，
             ″＜endgaps penalized.left endgap:％d％s％s，right endgap:％d％s％s\n″，
             firstgap，(dna)？″base″:″residue″，(firstgap＝＝1)？″″:″s″，
             lastgap，(dna)？″base″:″residue″，(lastgap＝＝1)？″″:″s″)；
        else
             fprintf(fx，″＜endgaps not penalized\n″)；
}
  static            nm；            /*matches in core--for checking*/
  static            lmax；          /*lengths of stripped file names*/
  static            ij[2]；         /*jmp index for a path*/
  static            nc[2]；         /*number at start of current line*/
  static            ni[2]；         /*current elem number--for gapping*/
  static            siz[2]；
  static char       *ps[2]；        /*ptr to current element*/
  static char       *po[2]；        /*ptr to next output char slot*/
  static char       out[2][P_LINE]；/*output line*/
  static char       star[P_LINE]；  /*set by stars()*/
/*
  *print alignment of described in struct path pp[]
  */
static
pr_align()                                                                   pr_align
{
      int    nn；/*char count*/
      int    more；
      register    i；
      for(i＝0，lmax＝0；i＜2；i++){
          nn＝stripname(namex[i])；
          if(nn＞lmax)
                lmax＝nn；
          nc[i]_1；
          ni[i]＝1；
          siz[i]＝ij[i]＝0；
          ps[i]＝seqx[i]；
          po[i]＝out[i]；              }
      for(nn＝nm＝0，more＝1；more；){                                    ...pr_align
          for(i＝more＝0；i＜2；i++){
                /*
                  *do we have more of this sequence？
                  */
                if(！*ps[i])
                       continue；
                more++；
                if(pp[i].spc){/*leading space*/
                       *po[i]++＝″；
                       pp[i].spc--；
                }
                else if(siz[i]){/*in a gap*/
                       *po[i]++＝′-′；
                       siz[i]--；
                }
                  else{      /*we′re putting a seq element
                               */
                        *po[i]＝*ps[i]；
                        if(islower(*ps[i]))
                              *ps[i]＝toupper(*ps[i])；
                        po[i]++；
                        ps[i]++；
                        /*
                          *are we at next gap for this seq？
                          */
                        if(ni[i]＝＝pp[i].x[ij[i]]){
                               /*
                                 *we need to merge all gaps
                                 *at this location
                                 */
                               siz[i]＝pp[i].n[ij[i]++]；
                               while(ni[i]＝＝pp[i].x[ij[i]])
                                    siz[i]+＝pp[i].n[ij[i]++]；
                        }
                        ni[i]++；
                  }
            }
            if(++nn＝＝olen||！more&&nn){
                  dumpblock()；
                  for(i＝0；i＜2；i++)
                       po[i]＝out[i]；
                  nn＝0；
            }
     }
}
/*
  *dump a block of lines，including numbers，stars:pr_align()
  */
static
dumpblock()                                                              dumpblock
{
     register    i；
     for(i＝0；i＜2；i++)
     *po[i]--＝′\0′；
                                                                      ...dumpblock
     (void)putc(′\n′，fx)；
     for(i＝0；i＜2；i++){
           if(*out[i]&&(*out[i]！＝″||*(po[i])！＝″)){
                 if(i＝＝0)
                        nums(i)；
                 if(i＝＝0&&*out[1])
                        stars()；
                 putline(i)；
                 if(i＝＝0&&*out[1])
                        fprintf(fx，star)；
                 if(i＝＝1)
                        nums(i)；
           }
     }
}
/*
  *put out a number line:dumpblock()
  */
static
nums(ix)                                                  nums
     int    ix；/*index in out[]holding seq line*/
{
     char             nline[P_LINE]；
     register         i，j；
     register char    *pn，*px，*py；
     for(pn＝nline，i＝0；i＜lmax+P_SPC；i++，pn++)
           *pn＝″；
     for(i＝nc[ix]，py＝out[ix]；*py；py++，pn++){
           if(*py＝＝″||*py＝＝′-′)
                 *pn＝″；
           else{
                 if(i％10＝＝0||(i＝＝1&&nc[ix]！＝1)){
                       j＝(i＜0)？-i:i；
                       for(px＝pn；j；j/＝10，px--)
                             *px＝j％10+′0′；
                       if(i＜0)
                             *px＝′-′；
                 }
                 else
                       *pn＝″；
                 i++；
           }
     }
     *pn＝′\0′；
     nc[ix]＝i；
     for(pn＝nline；*pn；pn++)
           (void)putc(*pn，fx)；
     (void)putc(′\n′，fx)；
}
/*
  *put out a line(name，[num]，seq，[num]):dumpblock()
  */
static
putline(ix)                                               putline
       int  ix；               {
                                                       ...putline
       int       i；
       register char    *px；
       for(px＝namex[ix]，i＝0；*px&&*px！＝′:′；px++，i++)
             (void)putc(*px，fx)；
       for(；i＜lmax+P_SPC；i++)
             (void)putc(″，fx)；
/*these count from 1:
  *ni[]is current element(from 1)
  *nc[]is number at start of current line
  */
for(px＝out[ix]；*px；px++)
     (void)putc(*px&0x7F，fx)；
(void)putc(′\n′，fx)；
}
/*
  *put a line of stars(seqs always in out[0]，out[1]):dumpblock()
  */
static
stars()                                                            stars
{
       int              i；
       register char    *p0，*p1，cx，*px；
       if(！*out[0]||(*out[0]＝＝″&&*(po[0])＝＝″)||
         ！*out[1]||(*out[1]＝＝″&&*(po[1])＝＝″))
              return；
       px＝star；
       for(i＝lmax+P_SPC；i；i--)
             *px++＝″；
       for(p0＝out[0]，p1＝out[1]；*p0&&*p1；p0++，p1++){
            if(isalpha(*p0)&&isalpha(*p1)){
                   if(xbm[*p0-′A′]&xbm[*p1-′A′]){
                         cx＝′*′；
                         nm++；
                   }
                   else if(！dna&&_day[*p0-′A′][*p1-′A′]＞0)
                         cx＝′.′；
                   else
                         cx＝″；
            }
            else
                   cx＝″；
            *px++＝cx；
       }
       *px++＝′\n′；
       *px＝′\0′；
}
/*
  *strip path or prefix from pn，return len:pr_align()
  */
static
stripname(pn)                                                  stripname
       char*pn；/*file name(may be path)*/
{
       register char    *px，*py；
       py＝0；
       for(px＝pn；*px；px++)
            if(*px＝＝′/′)
                   py＝px+1；
       if(py)
             (void)strcpy(pn，py)；
       return(strlen(pn))；
}
/*
  *cleanup()--cleanup any tmp file
  *getseq()--read in seq，set dna，len，maxlen
  *g_calloc()--calloc()with error checkin
  *readjmps()--get the good jmps，from tmp file if necessary
  *writejmps()--write a filled array of jmps to a tmp file:nw()
  */
#include″nw.h″
#include<sys/file.h>
char*jname＝″/tmp/homgXXXXXX″；/*tmp file forjmps*/
FILE *fj；
int   cleanup()；       /*cleanup tmp file*/
long  lseek()；
/*
  *remove any tmp file if we blow
  */
cleanup(i)                                                   cleanup
      int    i；
{
      if(fj)
             (void)unlink(jname)；
      exit(i)；
}
/*
  *read，return ptr to seq，set dna，len，maxlen
  *skip lines starting with′；′，′＜′，or′＞′
  *seq in upper or lower case
  */
char  *
getseq(file，len)                                            getseq
      char  *file；/*file name*/
      int   *len； /*seq len*/
{
      char    line[1024]，*pseq；
      register char    *px，*py；
      int     natgc，tlen；
      FILE    *fp；
      if((fp＝fopen(file，″r″))＝＝0){
            fprintf(stderr，″％s:can′t read％s\n″，prog，file)；
            exit(1)；
      }
      tlen＝natgc＝0；
      while(fgets(line，1024，fp)){
            if(*line＝＝′；′||*line＝＝′＜′||*line＝＝′＞′)
                   continue；
            for(px＝line；*px！＝′\n′；px++)
                   if(isupper(*px)||islower(*px))
                         tlen++；
       }
       if((pseq＝malloc((unsigned)(tlen+6)))＝＝0){
              fprintf(stderr，″％s:malloc()failed to get％d bytes for％s\n″，prog，tlen+6，file)；
              exit(1)；
       }
       pseq[0]＝pseq[1]＝pseq[2]＝pseq[3]＝′\0′；
                                                                                           ...getseq
       py＝pseq+4；
       *len＝tlen；
       rewind(fp)；
       while(fgets(line，1024，fp)){
            if(*line＝＝′；′||*line＝＝′＜′||*line＝＝′＞′)
                  continue；
            for(px＝line；*px！＝′\n′；px++){
                  if(isupper(*px))
                         *py++＝*px；
                   else if(islower(*px))
                         *py++＝toupper(*px)；
                   if(index(″ATGCU″，*(py-1)))
                         natgc++；
            }
       }
       *py++＝′\0′；
       *py＝′\0′；
       (void)fclose(fp)；
       dna＝natgc＞(tlen/3)；
       return(pseq+4)；
}
char *
g_calloc(msg，nx，sz)                                                                        g_calloc
       char   *msg；  /*program，calling routine*/
       int    nx，sz；/*number and size of elements*/
{
       char    *px，*calloc()；
       if((px＝calloc((unsigned)nx，(unsigned)sz))＝＝0){
             if(*msg){
                   fprintf(stderr，″％s:g_calloc()failed％s(n＝％d，sz＝％d)\n″，prog，msg，nx，sz)；
                   exit(1)；
             }
       }
       return(px)；
}
/*
  *get final jmps from dx[]or tmp file，set pp[]，reset dmax:main()
  */
readjmps()                                                                                    readjmps
{
       int         fd＝-1；
       int         siz，i0，i1；
       register    i，j，xx；
    if(fj){
          (void)fclose(fj)；
          if((fd＝open(jname，O_RDONLY，0))＜0){
               fprintf(stderr，″％s:can′t open()％s\n″，prog，jname)；
               cleanup(1)；
          }
    }
    for(i＝i0＝i1＝0，dmax0＝dmax，xx＝len0；；i++){
          while(1){
               for(j＝dx[dmax].ijmp；j＞＝0&&dx[dmax].jp.x[j]＞＝xx；j--)
                     ；
                                                                         ...readjmps
               if(j＜0&&dx[dmax].offset&&fj){
                     (void)lseek(fd，dx[dmax].offset，0)；
                     (void)read(fd，(char*)&dx[dmax].jp，sizeof(struct jmp))；
                     (void)read(fd，(char*)&dx[dmax].offset，sizeof(dx[dmax].offset))；
                     dx[dmax].ijmp＝MAXJMP-1；
               }
               else
                     break；
         }
         if(i＞＝JMPS){
               fprintf(stderr，″％s:too many gaps in alignment\n″，prog)；
               cleanup(1)；
         }
         if(j＞＝0){
               siz＝dx[dmax].jp.n[j]；
               xx＝dx[dmax].jp.x[j]；
               dmax+＝siz；
               if(siz＜0){/*gap in second seq*/
                     pp[1].n[i1]＝-siz；
                     xx+＝siz；
                     /*id＝xx-yy+len1-1
                      */
                     pp[1].x[i1]＝xx-dmax+len1-1；
                     gapy++；
                     ngapy-＝siz；
/*ignore MAXGAP when doing endgaps*/
                     siz＝(-siz＜MAXGAP||endgaps)？-siz:MAXGAP；
                     i1++；
               }
               else if(siz＞0){/*gap in first seq*/
                     pp[0].n[i0]＝siz；
                     pp[0].x[i0]＝xx；
                     gapx++；
                     ngapx+＝siz；
/*ignore MAXGAP when doing endgaps*/
                     siz＝(siz＜MAXGAP||endgaps)？siz:MAXGAP；
                     i0++；
               }
          }
          else
               break；
     }
     /*reverse the order of jmps
     */
         for(j＝0，i0--；j＜i0；j++，i0--){
               i＝pp[0].n[j]；pp[0].n[j]＝pp[0].n[i0]；pp[0].n[i0]＝i；
               i＝pp[0].x[j]；pp[0].x[j]＝pp[0].x[i0]；pp[0].x[i0]＝i；
         }
         for(j＝0，i1--；j＜i1；j++，i1--){
               i＝pp[1].n[j]；pp[1].n[j]＝pp[1].n[i1]；pp[1].n[i1]＝i；
               i＝pp[1].x[j]；pp[1].x[j]＝pp[1].x[i1]；pp[1].x[i1]＝i；
         }
         if(fd＞＝0)
               (void)close(fd)；
         if(fj){
               (void)unlink(jname)；
               fj＝0；
               offset＝0；
         }                                  }
/*
  *write a filled jmp struct offset ofthe prev one(if any):nw()
  */
writejmps(ix)                                                     writejmps
      int    ix；
{
      char  *mktemp()；
      if(！fj){
              if(mktemp(jname)＜0){
                   fprintf(stderr，″％s:can′t mktemp()％s\n″，prog，jname)；
                   cleanup(1)；
              }
              if((fj＝fopen(jname，″w″))＝＝0){
                   fprintf(stderr，″％s:can′t write％s\n″，prog，jname)；
                   exit(1)；
              }
      }
      (void)fwrite((char*)&dx[ix].jp，sizeof(struct jmp)，1，fj)；
      (void)fwrite((char*)&dx[ix].offset，sizeof(dx[ix].offset)，1，fj)；
术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分阻断。多核苷酸还可以在合成后修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然发生核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)，诸如例如蛋白质(如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与另外核苷酸的另外连接，或者可偶联至固相或半固相支持物。5′和3′末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2′-氧-甲基、2′-氧-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于如下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR2(“酰胺酯”(amidate))、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R′各自独立为H或者取代或未取代的烷基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。上述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
“寡核苷酸”在用于本文时一般指短多核苷酸，通常是单链，通常是合成的，长度通常但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。
“分离的”抗体指已经由其天然环境的一种成分鉴别和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry方法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
术语“依照Kabat的可变区残基编号”或“依照Kabat的氨基酸位置编号”及其变体指Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)中的抗体编辑用于重链可变区或轻链可变区的编号系统。利用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变区FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变区可包括H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat是残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat的残基82a、82b和82c等)。指定抗体的Kabat残基编号可通过将此抗体序列与“标准”Kabat编号序列在同源区进行比对来确定。除非另有说明，本文中的所有氨基酸位置编号依照Kabat编号系统。
“人共有框架”是代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常，所述人免疫球蛋白VL或VH选集来自可变区序列亚型。通常，所述序列亚型是如Kabat等人所述的亚型。在一个实施方案中，对于VL，所述亚型是如Kabat等人所述的亚型κI。在一个实施方案中，对于VH，所述亚型是如Kabat等人所述的亚型III。
“VH亚型III共有框架”包含获自Kabat等人所述的可变重链亚型III中的氨基酸序列的共有序列。在一个实施方案中，VH亚型III共有框架氨基酸序列包含以下各序列的至少一部分或整个全部：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：46)-H1-WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO：47)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC(SEQ ID NO：48)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：49)。
“VL亚型I共有框架”包含获自Kabat等人所述的可变轻链κ亚型I中的氨基酸序列的共有序列。在一个实施方案中，VL亚型I共有框架氨基酸序列包含以下各序列的至少一部分或整个：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：50)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：51)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：52)-L3-FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：53)。
除非另有明确或背景说明，术语“肝细胞生长因子”或“HGF”在用于本文时指能够在容许HGF/c-met信号途经发生的条件下激活所述过程的任何天然或变异的(或是天然发生的或是合成的)HGF多肽。术语“野生型HGF”通常指包含天然发生HGF蛋白质的氨基酸序列的多肽。术语“野生型HGF序列”通常指在天然发生HGF中发现的氨基酸序列。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体(如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体，只要它们展示期望的生物学活性)，且还可包括抗体片段(如本文中更为详细描述的)。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，由此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留通常与所述Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是具有与完整抗体基本上相似的体内半衰期的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连的一个抗原结合臂。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即构成群体的抗体个体是相同的，只是可能以极小数量存在可能的天然发生突变。单克隆抗体是高度特异的，即针对单一抗原。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展示期望的生物学活性(美国专利4,816,567；及Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855(1984))。
非人(如鼠源)抗体的“人源化”形式是最低限度含有衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体是如下人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体高变区的残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区的残基替换。在有些情况中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含没有在受体抗体中或在供体抗体中发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个且通常两个基本上整个可变区，其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白中的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列中的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的Fc。更多详情参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见下列综述性论文及其引用的参考文献：Vaswaniand Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)。
“人抗体”是具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列且/或使用本文所公开的用于制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的这种定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“亲和力成熟的”抗体指在其一个或多个CDR中具有导致抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的一处或多处改变的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔水平的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知流程生成。Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)描述了经由通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。下列文献描述了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.，Gene 169：147-155(1995)；Yelton et al.，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学活性。
“激动性抗体”在用于本文时是模拟目的多肽的至少一项功能性活性的抗体。
“紊乱”是将受益于本发明物质/分子或方法的治疗的任何状况。这包括慢性和急性紊乱或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论紊乱的病理状况。本文中待治疗的紊乱的非限制性实例包括恶性和良性肿瘤；非白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔的病症；及炎性、免疫学和其它血管发生相关的紊乱。
术语“细胞增殖性紊乱”和“增殖性紊乱”指与一定程度的异常细胞增殖有关的紊乱。在一个实施方案中，所述细胞增殖性紊乱是癌症。
“肿瘤”在用于本文时指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性紊乱”、“增殖性紊乱”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调节的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。这样的癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝的癌及各种类型的头和颈癌。
血管发生调节异常可导致可用本发明组合物和方法治疗的许多紊乱。这些紊乱包括非肿瘤性的和肿瘤性的两类状况。肿瘤性的包括但不限于上文所描述的。非肿瘤性紊乱包括但不限于不想要的或异常的肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、糖尿病性和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生、新生血管性青光眼、年龄相关黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、视网膜/脉络膜新血管形成、眼角的新血管形成(发红)、眼新血管疾病、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生(包括格雷夫斯氏(Graves)病)、角膜和其它组织的移植、慢性炎症、急性肺损伤/ARDS、脓毒病、原发性肺动脉高压、恶性肺积液(malignant pulmonary effusion)、脑水肿(例如与急性中风/闭合性头部损伤/外伤有关的)、滑液炎症、RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多囊性卵巢病、子宫内膜异位、第三空间流体病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病)、子宫平滑肌瘤(uterine fibroids)、早产、慢性炎症诸如IBD(克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎)、肾同种异体移植物排斥、炎性肠病、肾病综合征、不想要的或异常的组织块生长(非癌性的)、血友病性关节、肥厚性瘢痕、毛发生长的抑制、奥-韦二氏(Osler-Weber)综合征、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液(诸如与心包炎有关的)、以及胸腔积液。
“自身免疫病”在本文中指源于且针对个体自身组织的非恶性疾病或紊乱。自身免疫病在本文中明确排除恶性或癌性疾病或紊乱，尤其排除B细胞淋巴瘤、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病和慢性成髓细胞白血病。自身免疫疾病或紊乱的实例包括但不限于炎性应答，诸如炎性皮肤病，包括银屑病和皮炎(如特应性皮炎)；系统性硬皮病和硬化症；与炎性肠病有关的应答(诸如克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎)；呼吸窘迫综合症(包括成人呼吸窘迫综合症；ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏状况，诸如湿疹和哮喘及牵涉T细胞浸润和慢性炎性应答的其它状况；动脉粥样硬化；白细胞粘着缺陷；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；糖尿病(如I型糖尿病和胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化症；雷诺氏(Reynaud)综合症；自身免疫性甲状腺炎；特应性脑脊髓炎；斯耶格伦氏(Sjorgen)综合症；幼发型糖尿病；通常在肺结核、结节病、多肌炎、肉芽肿病和脉管炎中发现的与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应有关的免疫应答；恶性贫血(阿狄森氏(Addison)病)；牵涉白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性紊乱；多种器官损伤综合症；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症(cryoglobinemia)或库姆斯氏(Coombs)反应阳性贫血(Coombs positive anemia))；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基膜病；抗磷脂综合症；过敏性神经炎；格雷夫斯氏(Graves)病；兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合症；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多种内分泌腺病；莱特氏(Reiter)病；僵体综合症(stiff-man syndrome)；贝切特氏(Behcet)病；巨细胞动脉炎；免疫复合物肾炎；IgA肾病；IgM多神经病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症等。
在用于本文时，“治疗”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或紊乱的发展。
“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的数量。
本发明物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的数量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的数量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量将低于治疗有效量。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒性剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和
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环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，
Figure G200580033803620070406D000412
)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)
Figure G200580033803620070406D000413
CPT-11(伊立替康(irinotecan)，
Figure G200580033803620070406D000414
乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂
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和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)
Figure G200580033803620070406D000423
替加氟(tegafur)
Figure G200580033803620070406D000424
卡培他滨(capecitabine)埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure G200580033803620070406D000431
多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel)
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清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)
Figure G200580033803620070406D000434
苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)
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铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)
Figure G200580033803620070406D000436
奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)
Figure G200580033803620070406D000437
能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括
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他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)
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抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；雌激素受体拮抗剂，诸如氟维司群(fulvestrant)
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功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)
Figure G200580033803620070406D000445
醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)
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依西美坦(exemestane)
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福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)
Figure G200580033803620070406D000448
来曲唑(letrozole)
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和阿那曲唑(anastrozole)
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另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如
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或
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依替膦酸钠(etidronate)
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NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)
Figure G200580033803620070406D0004414
阿伦膦酸盐(alendronate)
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帕米膦酸盐(pamidronate)
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替鲁膦酸盐(tiludronate)
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或利塞膦酸盐(risedronate)
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以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如疫苗和基因疗法疫苗，例如
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疫苗、
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疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如
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rmRH
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lapatinibditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；COX-2抑制剂，诸如celecoxib
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4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制其生长依赖于HGF/c-met活化的细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期的HGF/c-met依赖性细胞百分比的药剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vinca)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxane)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(fluorouracil)和ara-C。其它信息可参见《TheMolecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycleregulation，oncogenes，and antieioplastic drugs”，Murakaini等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类(紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))皆为衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇
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Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞有丝分裂的抑制。
“多柔比星(Doxorubicin)”是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7，8，9，10-四氢-6，8，11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5，12-萘二酮((8S-cis)-10-[(3-amino-2，3，6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7，8，9，10-tetrahydro-6，8，11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5，12-naphthacenedione)。
载体、宿主细胞和重组方法
为了重组生产本发明的抗体，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规流程容易的分离编码抗体的DNA并测序(如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物)起源的。
使用原核宿主细胞生成抗体：
载体构建
可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。可从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段、和转录终止序列。
一般而言，与宿主细胞一起使用的质粒载体包含衍生自与这些宿主相容物种的复制子和控制序列。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例。
另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEM.TM.-11来构建可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。
本发明的表达载体可包含两种或多种启动子-顺反子对，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游(5′)的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型和组成性。诱导型启动子指响应培养条件的变化(如营养物的存在与否或温度变化)而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。
众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，由此可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。
适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接(Siebenlist et al.，Cell 20：269(1980))。
在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(如大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Proba and Pluckthun，Gene 159：203(1995))。
本发明提供了可调控所表达多肽构件的数量比率，从而将分泌且正确装配的本发明抗体的产量最大化的表达系统。这种调控是至少部分通过同时调控多肽构件的翻译强度而实现的。
Simmons等人，美国专利5,840,523中公开了用于调控翻译强度的一种技术。它在顺反子内利用翻译起始区(TIR)的变体。对于指定TIR，可创建具有一定范围翻译强度的一系列氨基酸或核苷酸序列变体，由此提供针对特定链的期望表达水平调节此因素的方便手段。可通过常规诱变技术导致能改变氨基酸序列的密码子变化(尽管优选核苷酸序列中的沉默变化)从而生成TIR变体。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno序列的数目或间距的改变，及信号序列中的改变。用于生成突变型信号序列的一种方法是在编码序列的开端生成不改变信号序列氨基酸序列的“密码子库”(即变化是沉默的)。这可通过改变每个密码子的第三个核苷酸位置来实现；另外，有些氨基酸，诸如亮氨酸、丝氨酸、和精氨酸，具有多种第一个和第二个位置，这可在建库中增加复杂性。Yansura et al.，METHODS：A Companion to Methodsin Enzymol.4：151-158(1992)中详细记载了这种诱变方法。
优选的是，对于载体中的每个顺反子，生成具有一定范围TIR强度的一组载体。这个有限集合提供了每条链的表达水平以及期望抗体产物的产量在各种TIR强度组合下的比较。可通过量化报道基因的表达水平来测定TIR强度，Simmons等人，美国专利5,840,523中有详细描述。根据翻译强度的比较，选择期望的个别TIR在本发明的表达载体构建物中进行组合。
适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(如大肠埃希氏菌E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)(如枯草芽孢杆菌B.subtilis)、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)(如铜绿假单胞菌P.aeruginosa)物种、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobium)、透明颤菌属(Vitreoscilla)、或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，第2卷，Washington，D.C.，美国微生物学学会，1987，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41kanR的菌株33D3(美国专利号5,639,635)。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)也是合适的。这些实例只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass et al.，Proteins 8：309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。
抗体生成
用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。
转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。
在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的实例包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。
除了碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。
在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌，优选的温度范围是约20℃至约39℃，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。主要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌，pH优选约6.8至约7.4，更优选约7.0。
如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。优选的是，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见例如Simmons etal.，J.Immunol.Methods 263：133-147(2002))。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。
在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常牵涉破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰(osmoticshock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可能转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表达蛋白质。
在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵流程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。
在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度(如OD550约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养更短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。
为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式，反式-异构酶)的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen et al.，J.Biol.Chem.274：19601-19605(1999)；Georgiou等人，美国专利6,083,715；Georgiou等人，美国专利6,027,888；Bothmann andPluckthun，J.Biol.Chem.275：17100-17105(2000)；Ramm and Pluckthun，J.Biol.Chem.275：17106-17113(2000)；Arie et al.，Mol.Microbiol.39：199-210(2001))。
为了将所表达异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解降至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly et al.，(1998)见上文；Georgiou等人，美国专利5,264,365；Georgiou等人，美国专利5,508,192；Hara et al.，Microbial Drug Resistance 2：63-72(1996)。
在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。
抗体纯化
在一个实施方案中，进一步纯化本文中生成的抗体蛋白质以获得基本上同质的制品，用于进一步的测定和使用。可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的流程是合适纯化流程的例示：免疫亲和或离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一个方面，将固定在固相上的蛋白A用于本发明全长抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白A固定其上的固相优选具有玻璃或石英表面的柱子，更优选可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，试图防止污染物的非特异粘附。
作为纯化的第一步，将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗体特异结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收目的抗体。
使用真核宿主细胞生成抗体：
载体构件通常包括但不限于如下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。
(i)信号序列构件
在真核宿主细胞中使用的载体还可在目的成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异切割位点的其它多肽。优选受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹病毒gD信号。
将这些前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框中。
(ii)复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因包含早期启动子才使用。
(iii)选择基因构件
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。
选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个实例是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(如ATCC CRL-9096)。
或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利4,965,199。
(iv)启动子构件
表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与抗体多肽核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体中。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽受到例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40))基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利4,601,978中记载了该系统的一种修改。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes et al.，Nature 297：598-601(1982)。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
(v)增强子元件构件
常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature297：17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。
(vi)转录终止构件
在真核宿主细胞中使用的表达载体通常还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。
(vii)宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚肾系(293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham et al.，J.Gen.Virol.36：59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))、小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))、猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL 1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(HepG2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)、TRI细胞(Matheret al.，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝细胞瘤(hepatoma)系(Hep G2)。
为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。
(viii)宿主细胞的培养
可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏修改Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；5,122,469；WO90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然的。
(ix)抗体的纯化
在使用重组技术时，可在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先需要通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析(优选的纯化技术是亲和层析)来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可将含有目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(如约0-0.25M盐)进行。
活性测定法
可通过本领域知道的多种测定法对本发明的抗体鉴定它们的物理/化学特性和生物学功能。
可通过一系列测定法进一步鉴定纯化的免疫球蛋白，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)、质谱、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。
在本发明的某些实施方案中，对本文在生成的免疫球蛋白分析它们的生物学活性。在有些实施方案中，对本发明的免疫球蛋白测试它们的抗原结合活性。本领域知道的且可用于本文的抗原结合测定法包括但不限于使用诸如Western印迹、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“三明治”免疫测定法、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法等技术的任何直接或竞争性结合测定法。下文在实施例部分中提供了例示性的抗原结合测定法。
在一个实施方案中，本发明设想了具有一些但非所有效应物功能的改良抗体，这使得它在抗体体内半衰期是重要的但某些效应物功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的许多应用中成为期望的候选物。在某些实施方案中，测量所生成免疫球蛋白的Fc活性以确保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定法以确认抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetchand Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国专利5,500,362或5,821,337中记载了用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的实例。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所公开的。还可进行C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。还可使用本领域知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定。
人源化抗体
本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science239：1534-1536(1988))，即用非人高变区序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中显著少于完整的人可变区用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。
用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变区的选择对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变区序列对已知人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚类(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的牵涉对抗原结合的影响。
抗体变体
一方面，本发明提供了在构成Fc区的Fc多肽界面中包含修饰的抗体，其中该修饰推动和/促进异多聚化。这些修饰包括将突起导入第一Fc多肽和将腔导入第二Fc多肽，其中突起可位于腔中，从而促进第一和第二Fc多肽的复合。本领域知道生成具有这些修饰的抗体的方法，例如美国专利5,731,168中所述。
在有些实施方案中，设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体是通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入主题抗体氨基酸序列。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085(1989)中所述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达免疫球蛋白筛选期望的活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶(如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替代。最有兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但是也设想了FR改变。表1中“优选替代”栏显示了保守替代。如果此类替代导致生物学活性变化，那么可导入表1中称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。
表1
Figure G200580033803620070406D000581
对抗体生物学特性的实质性修饰可通过选择对维持以下方面的效果差异显著的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如(折叠)片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，氨基酸可如下分组(A.L.Lehninger，《Biochemistry》，第2版，第73-75页，Worth Publishers，New York，1975)：
(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电荷、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，根据共同的侧链特性，天然发生残基可如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。还可将此类替代残基引入保守替代位点，或者更优选的是引入剩余(非保守)位点。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法牵涉使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。所述接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然发生氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对较早制备的变体或非变异型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
可能希望在本发明免疫球蛋白多肽的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置(包括铰链半胱氨酸)包含氨基酸修饰(如替代)的人Fc区序列(如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
依照此描述和本领域的教导，设想了在有些实施方案中，本发明方法中所使用的抗体与野生型对应抗体相比可在例如Fc区中包含一处或多处改变。与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍将基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可在Fc区中进行将会导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即或是增强或是削弱)的某些改变，例如WO99/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它实例的Duncan and Winter，Nature 322：738-40(1988)；美国专利5,648,260；美国专利5,624,821；及WO94/29351。
免疫偶联物
本发明还关于包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物或抗体-药物偶联物(ADC)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。
抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递毒害细胞剂或抑制细胞试剂(即用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的用途(Syrigos and Epenetos，Anticancer Research 19：605-614(1999)；Niculescu-Duvaz and Springer，Adv.Drg.Del.Rev.26：151-172(1997)；美国专利4,975,278)理论上能将药物部分靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些未经偶联的药物试剂可能在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平(Baldwin et al.，Lancet 603-05(1986年5月15日)；Thorpe，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，在《MonoclonalAntibodies′84：Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页，1985)。由此试图获得最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报道可用于这些策略(Rowland et al.，Cancer Immunol.Immunother.21：183-87(1986))。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)(Rowland et al.，1986，见上文)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler et al.，Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581(2000)；Mandler et al.，Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028(2000)；Mandler et al.，Bioconjugate Chem.13：786-791(2002))、美登木素生物碱类(EP 1391213；Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996))、和加利车霉素(Lode et al.，Cancer Res.58：2928(1998)；Hinman et al.，Cancer Res.53：3336-3342(1993))。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其毒害细胞和抑制细胞的效果。有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。
Figure G200580033803620070406D000611
(ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的111In或90Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman et al.，Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77(2000)；Wiseman et al.，Blood 99(12)：4336-42(2002)；Witzig et al.，J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63(2002)；Witzig et al.，J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69(2002))。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARGTM(gemtuzumabozogamicin，Wyeth Pharmaceuticals)，即由人CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future 25(7)：686(2000)；美国专利4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。Cantuzumabmertansine(Immunogen Inc.)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽、auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌上的Lewis Y特异)和cAC10(对恶性血液肿瘤上的CD30特异)偶联(Doronina et al.，NatureBiotechnology 21(7)：778-784(2003))，且正在进行治疗性开发。
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。
本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的片段的偶联物。
美登素和美登木素生物碱类
在一个实施方案中，本发明的抗体(全长或片段)与一个或多个美登木素生物碱分子偶联。
美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533，明确将其公开内容收入本文作为参考。
美登木素生物碱-抗体偶联物
在改进其治疗指数的尝试中，已经将美登素和美登木素生物碱类与特异结合肿瘤细胞抗原的抗体偶联。例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其治疗用途：美国专利5,208,020；5,416,064；及欧洲专利EP0 425 235 B1，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x105个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似的一定程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。
抗体-美登未素生物碱偶联物(免疫偶联物)
抗体-美登木素生物碱偶联物可通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0425235B1及Chari et al.，CancerResearch 52：127-131(1992)中所公开的。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。
加利车霉素
另一种感兴趣的免疫偶联物包含与一个或多个加利车霉素分子偶联的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都授予美国Cyanamid公司)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman et al.，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效果。
其它细胞毒剂
可与本发明抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利5,877,296)。
可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Frakeret al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，CRC Press，1989)详细记载了其它方法。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利5,208,020)。
本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化(如购自Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。见2003-2004年度应用手册和产品目录(ApplicationsHandbook and Catalog)第467-498页。
抗体-药物偶联物的制备
在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物部分(D)缀合，例如每个抗体偶联约1个至约20个药物部分。可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物部分D反应；和(2)药物部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。
Ab-(L-D)p    I
抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、巯基、和羟基是亲核的，能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理使抗体具有与接头试剂缀合的反应活性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。
还可通过修饰抗体来生成本发明的抗体-药物偶联物，即引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的键，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰(醛和酮)基团，它可与药物上的适宜基团反应(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan&Stroh，Bioconjugate Chem.3：138-146(1992)；US 5362852)。此类醛可与药物部分或接头亲核体反应。
同样，药物部分上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲和素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(如亲合素)。
抗体衍生物
可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质部分。优选的是，适于抗体衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
药用配制剂
可通过将具有期望纯度的抗体与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合来制备包含本发明抗体的治疗用配制剂，以水溶液、冻干或其它干燥剂型的形式贮存(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。
可制备持续释放配制剂。持续释放配制剂的合适例子包括含有本发明免疫球蛋白的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。
在某些实施方案中，将包含与细胞毒剂偶联的抗体的免疫偶联物施用于患者。在有些实施方案中，免疫偶联物和/或它所结合的抗原由细胞内在化，导致免疫偶联物杀伤它所结合的靶细胞的治疗功效提高。在一个实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰靶细胞中的核酸。此类细胞毒剂的实例包括本文所述任何化疗剂(诸如美登木素生物碱或加利车霉素)、放射性同位素、或核糖核酸酶或DNA内切核酸酶。
在治疗中，本发明的抗体可单独使用，或是联合其它组合物。例如，本发明的抗体可与另一种抗体、化疗剂(包括化疗剂混合物)、其它细胞毒剂、抗血管发生剂、细胞因子、和/或生长抑制剂联合施用。当本发明的抗体抑制肿瘤生长时，可能特别希望将其联合一种或多种同样抑制肿瘤生长的其它治疗剂。例如，在转移性乳癌的治疗中，可将本发明的抗体联合阻断VEGF活性的抗VEGF抗体和/或抗ErbB抗体(如
Figure G200580033803620070406D000701
抗HER2抗体)。或者/另外，患者可接受联合放射疗法(如外部射束照射或使用放射性标记药剂诸如抗体的疗法)。上文所述此类联合疗法包括联合施药(当相同或分开配制剂中包含两种或多种药剂时)和分开施药，在后一种情况中，本发明抗体的施用可发生在附属疗法的施用之前和/或之后。
可通过任何合适手段来施用本发明的抗体(和附属治疗剂)，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内，以及损伤内(如果希望局部治疗的话)施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。另外，脉冲输注抗体也是合适的，特别是抗体剂量衰减时。可通过任何合适路径服药，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施药是短期的还是长期的。
可以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明的抗体组合物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体紊乱、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、紊乱的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。不是必需而是任选将抗体与目前用于预防或治疗所讨论紊乱的一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的本发明抗体的量、紊乱或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常是以与上文所用相同剂量和施用路径使用，或是迄今所用剂量的大约1-99％。
对于疾病的预防或治疗，本发明抗体的适宜剂量(在单独使用或联合其它药剂诸如化疗剂时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和进程、施用抗体是出于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对抗体的响应、及主治医师的判断。合适的是，一次性或通过一系列治疗将抗体施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，施用于患者的初始候选剂量是约1μg/kg至15mg/kg(如0.1mg/kg-10mg/kg)抗体，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素，典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或更长的重复施药，根据状况，持续治疗直至疾病症状发生期望的抑制。抗体的例示剂量的范围可以是约0.05mg/kg至约10mg/kg。由此，可对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一剂或多剂。这些剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，例如约6剂抗体)。可施用一剂较高的初始加载剂量，后续一剂或多剂较低剂量。例示性剂量给药方案包括施用一剂约4mg/kg抗体的初始加载剂量，后续每周一剂约2mg/kg的维持剂量。然而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。
制品
在本发明的另一个方面，提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上文所述紊乱的物质的制品。制品包括容器和贴在所述容器上或与其相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有其自身或在联合其它组合物时有效治疗、预防和/或诊断疾患的组合物，而且可具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的疾患，诸如癌症。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其它细胞毒剂。本发明此实施方案中的制品还可包括指示第一和第二抗体组合物可用于治疗特定疾患如癌症的包装插页。或者/另外，制品还可包括第二(或第三)容器，其中装有制药学可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
下面是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，根据上文提供的一般描述，可实行多种其它实施方案。
实施例
材料和方法
试剂
玉米胰蛋白酶抑制剂购自Haematologic Technologies(Essex Junction，VT)，HGFA的显色底物
Figure G200580033803620070406D000721
fVIIa购自American Diagnostica(Stamford，CT)。可溶性HAI-1B(sHAI-1B)是如前所述(1)在中国仓鼠卵巢细胞中表达并纯化的。Kunitz结构域抑制剂IV-49C先前已有描述(2)(Genentech，Inc.，South San Francisco)。人重组HGFA(HGFA)是如前所述(1)在杆状病毒表达系统中表达的。
ProHGF活化测定法
ProHGF活化测定法和用Iodogen标记proHGF是如前所述进行的(1，3)。简而言之，将HGFA与抗HGFA抗体或sHAI-1B在HNC缓冲液(20mM Hepes，pH 7.5，150mM NaCl，5mM CaCl2)中室温预保温15分钟，然后加入在HNC缓冲液中配制的125I标记的proHGF，并在37℃保温4小时。最终混合物中的反应物浓度如下：2nM HGFA、0.05mg/ml 125I标记的proHGF、0.1mg/ml抗HGFA抗体、1μM sHAI-1B。4小时后，取出等分试样并加入含还原剂二硫苏糖醇(BIO-Rad)的样品缓冲液(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。短暂加热后，将样品(大约106cpm/泳道)加到4-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)上。电泳后，将干燥的凝胶对x射线胶片(X-OMAT AR，Eastman Kodak Company，Rochester，NY)曝光10-20分钟。将胶片显影(Kodak M35A X-OMAT Processor)、扫描(Umax S-12，Umax DataSystems，Inc.，Fremont，CA)，并用Adobe V.6.0Photoshop软件(Adobe SystemsInc.，San Jose，CA)进一步加工。
BIAcore实验
抗HGFA抗体与HGFA的结合亲和力是通过表面等离振子共振测量在BIAcore 3000仪器(Biacore，Inc.)上测定的。将重定格式(reformatted)的全长抗HGFA IgG1以300个共振单位(RU)的密度固定在Pioneer CM5传感器芯片的流动槽上。固定是使用制造商提供的方案通过经由氨基的随机偶联而实现的。注入范围为1μM至8nM、2倍增量的一系列溶液，记录HGFA与这些表面结合的传感图。从观察到的传感图中扣除参照槽的信号。使用制造商提供的软件依照1∶1 Languir结合模型通过非线性回归分析计算动力学常数。在竞争实验中，将HGFA(70nM)与多种浓度的sHAI-1B(4nM-300nM)或IV-49C(11nM-300nM)或小分子HGFA活性位点结合物(220nM-10μM)一起预保温。室温保温60分钟后，将酶抑制剂混合物注入流动槽并记录传感图。
HGFA酶抑制测定法
将抗体或sHAI-1B与HGFA(终浓度5nM)在HBSA缓冲液(20mM Hepes，pH 7.5，150mM NaCl，0.5mg/ml BSA，5mM CaCl2)中室温预保温20分钟。加入
Figure G200580033803620070406D000731
fVIIa(终浓度200μM，KM＝200μM)并在动力学微量板读数仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上测量405nm处吸光度的线性增加速率。酶活性的抑制表示为未受抑制活性的相对活性(vi/vo)。
结果和讨论
通过噬菌体展示鉴定抗HGFA抗体
鉴定抗体的一种方法是通过使用噬菌体抗体库。参见例如Lee et al.(4)。为了鉴定针对HGFA的抗体，我们使用先前报道的人合成噬菌粒抗体库(F(ab′)2库)进行了四轮淘选。用5μg/孔的HGFA包被平板。我们在每轮淘选后提高清洗的严谨度，清洗10-40次。我们在三轮淘选后观察到富集。四轮淘选后，挑出95个克隆进行ELISA测定法。测序后发现67个独特克隆特异性结合HGFA。斑点竞争ELISA后，对24个克隆进行了进一步鉴定，即使用纯化的噬菌体测量IC50值，它们是使用标准噬菌体竞争ELISA测定的。将IC50值小于100nM的14个独特克隆被亚克隆到PRK-人IgG1载体中。这些克隆的CDR序列列于图1中。将抗HGFA克隆的重链和轻链(来自人源化4D5抗体，如Lee et al.(4)中所述)共转染到哺乳动物293细胞中。一周后，收获无血清上清液，并使用蛋白A亲和层析纯化所述抗体。
全长抗HGFA抗体对HGFA酶活性的抑制
通过标准重组技术将选定的抗体重定格式成全长抗体(IgG)。在大分子底物活化测定法中使用125I标记的proHGF检验这些全长抗体。在4小时实验过程中，HGFA完全将proHGF转变成双链HGF，而且此反应可被1μMsHAI-1B抑制(图2A)，这与先前的报道一致(1)。除了抗体#49(图1)以外，所有被测抗HGFA抗体在0.67μM的测试浓度显著抑制proHGF的转变(图2)。另外的实验显示#58在低达0.03μM的浓度抑制proHGF的转变(图3)。与这些结果一致的是，抗体#58最强力的抑制HGFA对小合成底物
Figure G200580033803620070406D000741
的酶活性，IC50为1.3nM，而抗体#49在500nM不抑制(图8)。此外，与它们在proHGF活化测定法中相对较弱的抑制活性一致，抗体#39、#86、#90和#95在显色底物测定法中具有同等较弱的活性，IC50大于500nM(图8)。三种抗体#42、#61和#74也显示相对弱的抑制作用(IC50＞500nM)，尽管它们在0.67μM时几乎完全抑制proHGF的转变(图8)。有趣的是，抗体#75展示出不寻常的抑制动力学，其中与抗体#58所达到的完全抑制相比，它的抑制活性在约70％抑制达到了稳定水平(图4)。
抗体#75和#58的抑制机制
根据抗体#75对大分子底物加工的完全抑制，它不能完全中和HGFA对小合成底物的酶活性表明抗体#75结合位于活性位点外面或附近的功能上重要的HGFA区。相反，抗体#58强烈抑制HGFA对大分子和小底物二者的加工。为了更详细的了解抗体的抑制机制，使用多种已知活性位点抑制剂进行竞争结合研究。所用三种HGFA活性位点抑制剂是先前所述的双Kunitz结构域抑制剂sHAI-1B(1)、单Kunitz结构域抑制剂IV-49C(2)和小分子HGFA活性位点结合物。IV-49C是衍生自Alzheimer β-蛋白前体抑制剂(APPI)的62个氨基酸的Kunitz结构域，而且是组织因子/因子VIIa复合物的特异抑制剂(2)。我们发现IV-49C还是HGFA酶活性的强力抑制剂，IC50为0.079μM，而小分子HGFA活性位点结合物的抑制作用的IC50为0.8μM(Ki＝0.4μM)，如图5所示。
HGFA与固定化抗体#58的KD是1.3nM(图9)，与通过酰胺分解测定法测得的亲和力相似(图8)。BIAcore测量显示sHAI-1B、IV-49C和小分子HGFA活性位点结合物抑制HGFA结合#58。这表明#58或者直接结合HGFA的活性位点，或者对活性位点施用变构影响。
抗体#75与HGFA的结合(图6E；图9)弱于#58。此外，小分子HGFA活性位点结合物对HGFA结合抗体#75没有影响，表明抗体#75不结合活性位点的“核心”区。有趣的是，抗体#75部分抑制HGFA的酰胺分解活性，表明即使#75表位位于活性位点外面，这两个位点之间也必然有分子联系。这可以解释sHAI-1B和IV-49C对抗体#75结合的部分影响(图9；图6F、G)。
与抗体#75相似，两种抗体#74和#61在存在小分子活性位点结合物时也结合HGFA(图9)，而Kunitz结构域抑制剂则干扰HGFA结合。这些结果表明#74和#61的表位位于HGFA活性位点的外面。可以想象抗体#61、#74和#75所结合的HGFA外位点区对大分子底物相互作用是重要的或者它们从变构上影响活性位点区的构象。在结构相关的丝氨酸蛋白酶因子VIIa中，重要的外位点位于活性位点和钙结合环之间(5)。结合因子VIIa外位点的抗体以及肽是大分子底物加工的强力抑制剂(6，7)。例如，肽抑制剂E76的结合影响“活化结构域”环之一中的构象改变，由此破坏底物相互作用位点(7)。此外，这些改变诱导活性位点的变构效应，这解释了E-76肽尽管结合活性位点区的外面但仍抑制酰胺分解活性的观察结果(7)。
用生物素化抗体#75和#58进行的另外的竞争结合实验指出#75和#58在HGFA上具有交叠的表位(数据未显示)。酶动力学研究进一步证实了#58是竞争性抑制剂，而#75是部分竞争性抑制剂(即简单的交叉双曲线型竞争性抑制剂)(数据未显示)。综上所述，这些结果表明这两种抗体都结合HGFA活性位点的外面，而且它们是HGFA酶活性的变构抑制剂。
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Claims (2)

1.结合人肝细胞生长因子激活剂(HGFA)且阻断HGFA的蛋白水解活性的分离抗体，其中该抗体包含(i)重链可变区和(ii)轻链可变区，该重链可变区包含：
(a)如SEQ ID NO：3所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：4所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：5所示的CDR-H3序列；或
(b)如SEQ ID NO：6所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：7所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：8所示的CDR-H3序列；或
(c)如SEQ ID NO：9所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：10所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：11所示的CDR-H3序列；或
(d)如SEQ ID NO：12所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：13所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：14所示的CDR-H3序列；或
(e)如SEQ ID NO：15所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：16所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：17所示的CDR-H3序列；或
(f)如SEQ ID NO：18所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：19所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：20所示的CDR-H3序列；或
(g)如SEQ ID NO：21所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：22所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：23所示的CDR-H3序列；或
(h)如SEQ ID NO：24所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：25所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：26所示的CDR-H3序列；或
(i)如SEQ ID NO：27所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：28所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：29所示的CDR-H3序列；或
(j)如SEQ ID NO：30所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：31所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：32所示的CDR-H3序列；或
(k)如SEQ ID NO：33所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：34所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：35所示的CDR-H3序列；或
(l)如SEQ ID NO：36所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：37所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：38所示的CDR-H3序列；或
(m)如SEQ ID NO：39所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：40所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：41所示的CDR-H3序列；或
(n)如SEQ ID NO：42所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：43所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：44所示的CDR-H3序列；且
该轻链可变区具有SEQ ID NO：45或54所示序列。
2.权利要求1的抗体，其中所述的重链可变区包含：
(a)如SEQ ID NO：21所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：22所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：23所示的CDR-H3序列；或
(b)如SEQ ID NO：24所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：25所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：26所示的CDR-H3序列；或
(c)如SEQ ID NO：27所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：28所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：29所示的CDR-H3序列；或
(d)如SEQ ID NO：30所示的CDR-H1序列，如SEQ ID NO：31所示的CDR-H2序列，和如SEQ ID NO：32所示的CDR-H3序列。
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