CN101027560A - 用于治疗高血糖症和相关病症的人类g蛋白偶合受体及其调节物 - Google Patents

用于治疗高血糖症和相关病症的人类g蛋白偶合受体及其调节物 Download PDF

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戴维·J·阿纳特
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Abstract

本发明涉及鉴别一种或一种以上候选化合物是否为G蛋白偶合受体(GPCR)的调节物或血糖浓度调节物的方法。在某些实施例中，GPCR为人类GPCR。本发明也涉及使用GPCR的调节物的方法。一优选调节物为激动剂。本发明的激动剂用作降低血糖浓度、预防或治疗某些代谢病症(例如胰岛素抗性、葡萄糖耐受性异常和糖尿病)以及预防或治疗血糖浓度升高并发症(例如动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压和周边血管疾病)的治疗剂。

Description

用于治疗高血糖症和相关病症的人类G蛋白偶合受体及其调节物
本申请案主张在指定日期经由美国特快专递向美国专利商标局提出申请的下列临时申请案的优先权：2004年4月13日申请的美国临时案第60/561,954号。前述临时申请案的揭示内容以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及鉴别一种或一种以上候选化合物是否为G蛋白偶合受体(GPCR)的调节物或血糖浓度调节物的方法。在某些实施例中，GPCR为人类GPCR。本发明也涉及使用GPCR的调节物的方法。优选调节物为激动剂。本发明的激动剂适用作降低血糖浓度、预防或治疗某些代谢病症(例如胰岛素抗性、葡萄糖耐受性异常和糖尿病)以及预防或治疗血糖浓度升高并发症(例如动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压和周边血管疾病)的治疗剂。
背景技术
以下讨论旨在帮助理解本发明，但并不打算使本发明不承认先前技术。
A.高血糖症
血糖浓度一般维持在狭窄范围内。血糖浓度升高通常导致胰岛素释放增加，其接着作用于目标细胞以增加葡萄糖摄取。血糖稳定状态的失调可导致血糖浓度持续升高或高血糖症。一些患有高血糖症的个体可继续发展成2型糖尿病。使组织慢性暴露于高血糖症可导致各种并发症，包括神经病、视网膜病和肾病的微血管问题以及中风、冠心病和周边血管疾病的微血管并发症。高血糖症是需要更好管理选项的正在增长中的主要医学问题[Nesto，Reviews in Cardiovascular Medicine(2003)4：S11-S18；其揭示内容以全文引用的方式并入本文中]。
B.G蛋白偶合受体
虽然人类中存在许多受体类别，但是迄今为止最充足且最具治疗相关性的受体类别是由G蛋白偶合受体(GPCR)类别表示。估计在人类基因组内存在约30,000-40,000种基因，且估计其中大约2％编码GPCR。
GPCR表示医药产品发展的重要领域：已由100种已知GPCR中的大约20种发展出所有处方药品中的大约60％。例如，1999年，在前100种商标处方药物中，下列药物与GPCR相互作用(与药物相关的主要治疗疾病和/或病症表示在括号中)：
Claritin(过敏)Prozac(抑郁症)Vasotec(高血压)
Paxil(抑郁症)Zoloft(抑郁症)Zyprexa(精神病)
Cozaar(高血压)Imitrex(偏头痛)Zantac(逆流病)
Propulsid(逆流病)Risperdal(精神分裂症)Serevent(哮喘)
Pepcid(逆流病)Gaster(溃疡)Atrovent(支气管痉挛)
Effexor(抑郁症)Depakote(癫痫)Cardura(前列腺肥大症)
Allegra(过敏)Lupron(前列腺癌)Zoladex(前列腺癌)
Diprivan(麻木)BuSpar(焦虑)Ventolin(支气管痉挛)
Hytrin(高血压)Wellbutrin(抑郁症)Zyrtec(鼻炎)
Plavix(MI/中风)Toprol-XL(高血压)Tenormin(绞痛)
Xalatan(青光眼)Singulair(哮喘)Diovan(高血压)
Harnal(前列腺增生)
(Med Ad News 1999 Data)。
GPCR共有共同的结构基元，其具有7个含有22至24个疏水性氨基酸的序列，其形成7个α螺旋，所述螺旋各自跨膜(各跨越由数字鉴别，意即跨膜-1(TM-1)、跨膜-2(TM-2)等)。所述跨膜螺旋是通过细胞膜外部或“胞外”侧的跨膜-2与跨膜-3之间、跨膜-4与跨膜-5之间和跨膜-6与跨膜-7之间(其分别被称为“胞外”区1、2和3(EC-1、EC-2和EC-3))的氨基酸链接合。所述跨膜螺旋也是通过细胞膜内部或“胞内”侧的跨膜-1与跨膜-2之间、跨膜-3与跨膜-4之间和跨膜-5与跨膜-6之间(其分别被称为“胞内”区1、2和3(IC-1、IC-2和IC-3))的氨基酸链接合。受体的“羧基”(“C”)末端位于细胞内的胞内空隙中，且受体的“氨基”(“N”)末端位于细胞外的胞外空隙中。
当配体结合受体(通常被称为“激活”受体)时，受体的构形通常存在改变，其有助于胞内区与胞内“G蛋白”之间的偶合。已报导GPCR关于G蛋白是“混杂的”，意即GPCR可与一种以上的G蛋白相互作用。参见Kenakin，T.，43 Life Sciences 1095(1988)。虽然存在其它G蛋白，但是当前已鉴别Gq、Gs、Gi、Gz和Go为G蛋白。经配体激活的GPCR与G蛋白的偶合会引发信号级联过程(称为“信号转导”)。在正常条件下，信号转导最终导致细胞激活或细胞抑制。虽然不希望受理论限制，但是相信IC-3环以及受体的羧基末端与G蛋白相互作用。
另外存在似乎将数种GPCR类别与磷脂酶C路径偶合的混杂G蛋白(诸如Gα15或Gα16)[Offermanns & Simon，J Biol Chem(1995)270：15175-80]，或经设计为将多种不同GPCR偶合至相同路径(例如磷脂酶C)的嵌合G蛋白[Milligan & Rees，Trends inPharmaceutical Sciences(1999)20：118-24]。
在生理条件下，GPCR以下列两种不同构形之间的平衡存在于细胞膜中：“惰性”态和“活性”态。惰性态的受体不能连接至胞内信号转导路径以引发信号转导，从而引起生物学应答。受体构形改变成活性态将允许连接至转导路径(经由G蛋白)且产生生物学应答。
受体可在活性态下由配体或诸如药物的化合物达成稳定。最近的发现(包括(但不独有性限于)对受体氨基酸序列的修饰)提供除配体或药物之外的方式以促进并稳定活性态构形的受体。所述方式通过刺激结合至受体的配体的效应而有效稳定活性态受体。由所述配体独立性方式进行的稳定化作用被称为“组成性受体激活”。
RUP43
RUP43(其中应了解内源RUP43可为GPR131，例如GenBank入藏登记号NM_170699)近来已报导为充当胆汁酸的受体[2004年1月7日作为EP1378749出版的欧洲专利申请案第02717114.9号；以及Kawamata等人，J Biol Chem(2003)278：9435-9440；其揭示内容各自以全文引用的方式并入本文中]。白血球中的RUP43表达据报导对单核细胞具有特异性，且作用于单核细胞RUP43的胆汁酸据报导会抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)的表达。在EP1378749中揭示的化合物可用于本发明方法中。
发明内容
申请者出乎意料地发现，RUP43的激动剂会增加脂肪细胞和骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取。申请者揭示RUP43的激动剂对于降低哺乳动物中的血糖浓度具有出乎意料的效用。申请者进一步揭示对RUP43具有激动剂活性的新颖化合物及其用途。
第一方面，本发明提供鉴别一种或一种以上作为RUP43 GPCR调节物的候选化合物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述受体偶合至G蛋白；所述方法包含以下步骤：
(a)使候选化合物与受体接触；以及
(b)测定受体功能性是否受到调节；
其中受体功能性的变化指示候选化合物为RUP43 GPCR的调节物。
在某些实施例中，GPR131氨基酸序列选自由下列序列组成的群组：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其附带条件为RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ ID NO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；
(d)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(e)SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
(f)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(g)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(h)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代，其附带条件为RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ ID NO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；以及
(j)由在严格条件下与SEQ ID NO：1的互补体杂交的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
在某些实施例中，所述RUP43 GPCR为重组RUP43 GPCR。在某些实施例中，所述接触包含与表达GPCR的宿主细胞接触或与所述宿主细胞的细胞膜接触，其中所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码受体的多核苷酸。
在一些实施例中，所述接触在已知GPCR配体存在下进行。在一些实施例中，所述接触在已知GPCR调节物存在下进行。在一些实施例中，所述接触在已知GPCR激动剂存在下进行。在一些实施例中，所述GPCR的已知激动剂为化合物1、化合物2或化合物3。在一些实施例中，所述GPCR的已知激动剂为化合物1。在一些实施例中，所述GPCR的已知激动剂为化合物2。在一些实施例中，所述GPCR的已知激动剂为化合物3。在一些实施例中，所述已知激动剂关于所述测定应以约EC50至约EC75存在。
本发明也涉及鉴别一种或一种以上作为哺乳动物中血糖浓度调节物的候选化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
使候选化合物与包含GPR131氨基酸序列的GPCR接触，其中所述受体偶合至G蛋白；以及
测定受体功能性是否受到调节；
其中受体功能性的变化指示候选化合物为哺乳动物中血糖浓度的调节物。
在某些实施例中，GPR131氨基酸序列选自由下列序列组成的群组：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其附带条件为RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ ID NO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；
(d)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(e)SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
(f)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(g)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(h)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代，其附带条件为RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ ID NO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；以及
(j)由在严格条件下与SEQ ID NO：1的互补体杂交的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
在某些实施例中，受体功能性的增加指示候选化合物为降低哺乳动物中血糖浓度的化合物。
在某些实施例中，所述GPCR为重组GPCR。在某些实施例中，所述接触包含与表达GPCR的宿主细胞接触或与所述宿主细胞的细胞膜接触，其中所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码受体的多核苷酸。
在一些实施例中，所述接触在已知GPCR配体存在下进行。在一些实施例中，所述接触在已知GPCR调节物存在下进行。在一些实施例中，所述接触在已知GPCR激动剂存在下进行。在一些实施例中，所述GPCR的已知激动剂为化合物1、化合物2或化合物3。在一些实施例中，所述GPCR的已知激动剂为化合物1。在一些实施例中，所述GPCR的已知激动剂为化合物2。在一些实施例中，所述GPCR的已知激动剂为化合物3。在一些实施例中，所述已知激动剂关于所述测定应以约EC50至约EC75存在。
在某些实施例中，所述一种或一种以上候选化合物并非抗体或其抗原结合衍生物。
在某些实施例中，所述一种或一种以上候选化合物并非肽。
在某些实施例中，所述一种或一种以上候选化合物并非胆汁酸。
在一些实施例中，GPR131氨基酸序列为SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些实施例中，GPR131氨基酸序列为SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体。在一些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体为所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物。在一些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体为所述氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物的非内源组成性激活突变体。在某些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体为所述氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物的生物活性片段。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物的所述生物活性片段为SEQ ID NO：2或所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物的氨基酸序列，其缺失N末端甲硫氨酸。在某些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的一致性。在一些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的一致性。
在某些实施例中，所述包含GPR131氨基酸序列的RUP43 GPCR为进一步包含一种或一种以上抗原决定基标签的融合蛋白。在一些实施例中，所述包含一种或一种以上抗原决定基标签的融合蛋白为SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
在某些实施例中，所述G蛋白导致胞内cAMP水平的增加。在一些优选实施例中，所述G蛋白为Gs。
在某些实施例中，所述G蛋白对百日咳毒素敏感。在某些实施例中，所述G蛋白为Gi或Go。在某些实施例中，所述G蛋白为Gi。在某些实施例中，所述G蛋白为Go。
在某些实施例中，所述G蛋白为Gα15或Gα16。在某些实施例中，所述G蛋白为Gα15。在某些实施例中，所述G蛋白为Gα16。
在某些实施例中，所述G蛋白为Gq。
在某些实施例中，所述方法进一步包含将由候选化合物引起的受体调节与通过使受体与已知受体调节物接触所引起的第二受体调节相比较的步骤。在某些实施例中，所述已知调节物为激动剂。在某些实施例中，所述激动剂为化合物1、化合物2或化合物3。在某些实施例中，所述激动剂为化合物1。在某些实施例中，所述激动剂为化合物2。在某些实施例中，所述激动剂为化合物3。
在一些优选实施例中，所述测定或所述比较是通过测量结合至包含所述GPCR的膜的GTPγS来进行。在某些实施例中，所述GTPγS经[35S]标记。
在某些实施例中，所述测定或所述比较是通过测量第二信使含量来进行，所述第二信使选自由环状AMP(cAMP)、环状GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二酰甘油(DAG)、MAP激酶活性和Ca2+组成的群组。在某些优选实施例中，所述第二信使为cAMP。在某些优选实施例中，cAMP水平增加。在某些实施例中，所述cAMP测量是使用全细胞腺苷酰基环化酶检定来进行。在某些实施例中，所述cAMP测量是由包含所述GPCR的膜进行。在某些实施例中，所述第二信使为MAP激酶活性。在某些实施例中，MAP激酶活性水平增加。
在一些优选实施例中，所述测定或所述比较是通过CRE报导子检定来进行。在某些实施例中，所述报导子为荧光素酶。在一些实施例中，所述报导子为β-半乳糖苷酶。
在某些实施例中，所述测定或所述比较是通过测量胞内IP3来进行。
在某些实施例中，所述测定或所述比较是通过测量胞内Ca2+来进行。
在某些实施例中，所述测定或所述比较是通过测量获自哺乳动物的脂肪细胞的葡萄糖摄取来进行。
在某些实施例中，所述测定或所述比较是通过测量获自哺乳动物的骨骼肌细胞的葡萄糖摄取来进行。
在某些优选实施例中，所述测定或所述比较是通过使用黑素细胞检定来进行。
第二方面，本发明提供式(II)的化合物：
Figure A20058001873000301
或其医药学上可接受的盐，
其中：
R1为H或C1-6烷基；
R2为2-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-吲唑-3-基；或
R1和R2连同其所键结的氮形成3，4-二氢-2H-喹啉-1-基；且
R10和R11各自独立地为H或卤素。
第三方面，本发明提供根据第一方面的方法鉴别的GPCR调节物。在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，调节物并非肽。在某些实施例中，调节物并非胆汁酸。在某些实施例中，调节物为增加获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为增加获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。
本发明也提供可根据第一方面的方法鉴别的GPCR调节物。在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为增加获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为增加获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。
在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些实施例中，所述调节物为激动剂。在某些实施例中，所述调节物为部分激动剂。在某些实施例中，所述调节物为反向激动剂。在某些实施例中，所述调节物为拮抗剂。
在某些实施例中，所述调节物优选为激动剂。在某些实施例中，所述激动剂为根据第二方面的化合物。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQ IDNO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
在一些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在一些实施例中，所述调节物为化合物1(“Cmpd#1，见表1)、化合物2(“Cmpd#2，见表1)或化合物3(“Cmpd#3，见表1)。在一些实施例中，所述调节物为化合物1。在一些实施例中，所述调节物为化合物2。在一些实施例中，所述调节物为化合物3。
在一些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在一些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
第四方面，本发明提供一种制备医药组合物或生理学上可接受的组合物的方法，其包含混合载剂和RUP43 GPCR调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为增加获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为增加获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，调节物为部分激动剂。在某些实施例中，调节物为反向激动剂。在某些实施例中，调节物为拮抗剂。在某些实施例中，调节物优选为激动剂。在某些实施例中，所述激动剂为根据第二方面的化合物。
本发明也提供一种制备医药组合物或生理学上可接受的组合物的方法，其包含鉴别RUP43 GPCR调节物，其中所述受体包含GPR131氨基酸序列；以及接着混合载剂和调节物，其中所述调节物可通过根据第一方面的方法的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物是根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，调节物并非肽。在某些实施例中，调节物优选为激动剂。在某些实施例中，调节物为增加获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为增加获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，调节物为部分激动剂。在某些实施例中，调节物为反向激动剂。在某些实施例中，调节物为拮抗剂。在某些实施例中，调节物优选为激动剂。在某些实施例中，所述激动剂为根据第二方面的化合物。
在某些实施例中，所述组合物为医药组合物。在某些实施例中，所述组合物为生理学上可接受的组合物。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQ IDNO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
在一些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在一些实施例中，所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。在一些实施例中，所述调节物为化合物1。在一些实施例中，所述调节物为化合物2。在一些实施例中，所述调节物为化合物3。
在一些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在一些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
第五方面，本发明提供一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使受体与受体调节物接触的步骤。在某些实施例中，调节物可通过根据第一方面的方法的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物是根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，调节物并非肽。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，调节物为部分激动剂。在某些实施例中，调节物为反向激动剂。在某些实施例中，调节物为拮抗剂。在某些实施例中，调节物优选为激动剂。在某些实施例中，调节物为增加获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为增加获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述激动剂为根据第二方面的化合物。
本发明也提供一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使受体与受体调节物接触的步骤，其中所述调节物可通过第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物是根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，调节物为部分激动剂。在某些实施例中，调节物为反向激动剂。在某些实施例中，调节物为拮抗剂。在某些实施例中，调节物优选为激动剂。在某些实施例中，所述激动剂为根据第二方面的化合物。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQ IDNO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
在一些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在一些实施例中，所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。在一些实施例中，所述调节物为化合物1。在一些实施例中，所述调节物为化合物2。在一些实施例中，所述调节物为化合物3。
在一些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在一些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
在某些实施例中，所述接触包含将调节物投用给包含受体的膜。
在某些实施例中，所述接触包含将调节物投用给包含受体的细胞。
在某些实施例中，所述接触包含将调节物投用给包含受体的组织。
在某些实施例中，所述接触包含将调节物投用给包含受体的个体。在某些实施例中，所述将调节物投用给包含受体的个体的用药是口服。在某些实施例中，所述个体为哺乳动物。在某些实施例中，所述个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。在某些实施例中，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。最优选为人类。
第六方面，本发明提供一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于在需要所述调节的个体中降低血糖浓度，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的受体调节物接触。在某些实施例中，调节物为激动剂。
本发明也提供一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于在需要所述调节的个体中预防或治疗代谢病症，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的受体调节物接触。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于在需要所述调节的个体中预防或治疗血糖浓度升高的并发症，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的受体调节物接触。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high blood pressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，调节物可通过根据第一方面的方法的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物是根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些优选实施例中，所述调节物为激动剂。在某些实施例中，所述激动剂为根据第二方面的化合物。
在某些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在一些实施例中，所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。在一些实施例中，所述调节物为化合物1。在一些实施例中，所述调节物为化合物2。在一些实施例中，所述调节物为化合物3。
在某些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQ IDNO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
在某些实施例中，所述接触包含将所述调节物口服投用给所述个体。
在某些实施例中，所述个体为哺乳动物。在某些实施例中，所述个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。在某些实施例中，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。最优选为人类。
第七方面，本发明提供一种降低需要降低血糖浓度的个体血糖浓度的方法，其包含使治疗有效量的RUP43 GPCR调节物与所述受体接触，所述GPCR包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，调节物为激动剂。
本发明另外提供一种降低哺乳动物中血糖浓度的方法，其包含向需要所述降低的哺乳动物提供或投用RUP43 GPCR调节物，所述GPCR包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，RUP43 GPCR的激动剂为GPR131 GPCR的激动剂，其中应了解GPR131 GPCR为内源RUP43 GPCR。
本发明也提供一种预防或治疗需要预防或治疗代谢病症的个体的代谢病症的方法，其包含使治疗有效量的RUP43 GPCR调节物与所述受体接触，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
本发明另外提供一种预防或治疗代谢病症的方法，其包含向需要所述预防或治疗的哺乳动物投用RUP43 GPCR调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，RUP43 GPCR的激动剂为GPR131 GPCR的激动剂，其中应了解GPR131 GPCR为内源RUP43 GPCR。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供一种预防或治疗需要预防或治疗血糖浓度升高的并发症的个体血糖浓度升高的并发症的方法，其包含使治疗有效量的RUP43 GPCR调节物与所述受体接触，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
本发明另外提供一种预防或治疗血糖浓度升高的并发症的方法，其包含向需要所述预防或治疗的哺乳动物提供或投用RUP43 GPCR调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，RUP43 GPCR的激动剂为GPR131 GPCR的激动剂，其中应了解GPR131 GPCR为内源RUP43 GPCR。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，调节物可通过根据第一方面的方法的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物是根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些优选实施例中，所述调节物为激动剂。在某些实施例中，所述激动剂为根据第二方面的化合物。
在某些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在一些实施例中，所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。在一些实施例中，所述调节物为化合物1。在一些实施例中，所述调节物为化合物2。在一些实施例中，所述调节物为化合物3。
在某些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQ IDNO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
在某些实施例中，所述接触包含将所述调节物口服投用给所述个体。
在某些实施例中，所述个体为哺乳动物。在某些实施例中，所述个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。在某些实施例中，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。最优选为人类。
第八方面，本发明提供包含RUP43 GPCR调节物、基本上由所述调节物组成或由所述调节物组成的医药组合物或生理学上可接受的组合物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。
在某些实施例中，调节物可通过根据第一方面的方法的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物是根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些优选实施例中，所述调节物为激动剂。在某些实施例中，所述激动剂为根据第二方面的化合物。
在某些实施例中，所述组合物为医药组合物。在某些实施例中，所述医药组合物包含RUP43 GPCR的调节物。在某些实施例中，所述医药组合物基本上由RUP43 GPCR的调节物组成。在某些实施例中，所述医药组合物由RUP43 GPCR的调节物组成。
在某些实施例中，所述组合物为生理学上可接受的组合物。在某些实施例中，生理学上可接受的组合物包含RUP43 GPCR的调节物。在某些实施例中，生理学上可接受的组合物基本上由RUP43 GPCR的调节物组成。在某些实施例中，生理学上可接受的组合物由RUP43 GPCR的调节物组成。
在某些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在一些实施例中，所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。在一些实施例中，所述调节物为化合物1。在一些实施例中，所述调节物为化合物2。在一些实施例中，所述调节物为化合物3。
在某些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
第九方面，本发明提供一种降低血糖浓度的方法，其包含向需要所述降低的个体提供或投用所述第八方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物。
本发明也提供一种预防或治疗代谢病症的方法，其包含向需要所述预防或治疗的个体提供或投用所述第八方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供一种预防或治疗血糖浓度升高的并发症的方法，其包含向需要所述预防或治疗的个体提供或投用所述第八方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high b1oodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，所述调节物为激动剂。
在某些实施例中，将治疗有效量的所述医药组合物或生理学上可接受的组合物提供或投用给所述个体。
在某些实施例中，所述医药组合物或生理学上可接受的组合物的所述提供或投用是口服。
在某些实施例中，所述个体为哺乳动物。在某些实施例中，所述个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。在某些实施例中，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。最优选为人类。
第十方面，本发明提供用于通过疗法来治疗人体或动物体的方法中的RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。
在某些实施例中，调节物可通过根据第一方面的方法的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物是根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自人类或动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自人类或动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些优选实施例中，所述调节物为激动剂。在某些实施例中，所述激动剂为根据第二方面的化合物。
在某些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在一些实施例中，所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。在一些实施例中，所述调节物为化合物1。在一些实施例中，所述调节物为化合物2。在一些实施例中，所述调节物为化合物3。
在某些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQ IDNO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
在某些实施例中，所述动物为哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠或非人类灵长类动物。人类或动物中更优选为人类。
第十一方面，本发明提供用于通过疗法来降低人体或动物体中血糖浓度的方法中的RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，调节物为激动剂。
本发明也提供用于通过疗法来预防或治疗人体或动物体中代谢病症的方法中的RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供用于通过疗法来预防或治疗人体或动物体中血糖浓度升高并发症的方法中的RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，调节物可通过根据第一方面的方法的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物是根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自人类或动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自人类或动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些优选实施例中，所述调节物为激动剂。在某些实施例中，所述激动剂为根据第二方面的化合物。
在某些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在一些实施例中，所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。在一些实施例中，所述调节物为化合物1。在一些实施例中，所述调节物为化合物2。在一些实施例中，所述调节物为化合物3。
在某些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQ IDNO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
在某些实施例中，所述动物为哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠或非人类灵长类动物。人类或动物中更优选为人类。
第十二方面，本发明提供一种使用RUP43 GPCR的调节物来制备用于降低血糖浓度的药物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，RUP43 GPCR的激动剂为GPR131 GPCR的激动剂，其中应了解GPR131 GPCR为内源RUP43 GPCR。
本发明也提供一种使用RUP43 GPCR的调节物来制备用于预防或治疗代谢病症的药物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，RUP43 GPCR的激动剂为GPR131 GPCR的激动剂，其中应了解GPR131 GPCR为内源RUP43 GPCR。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供一种使用RUP43 GPCR的调节物来制备用于预防或治疗血糖浓度升高并发症的药物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，RUP43 GPCR的激动剂为GPR131 GPCR的激动剂，其中应了解GPR131 GPCR为内源RUP43 GPCR。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，调节物可通过根据第一方面的方法的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物是根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些优选实施例中，所述调节物为激动剂。在某些实施例中，所述激动剂为根据第二方面的化合物。
在某些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在一些实施例中，所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。在一些实施例中，所述调节物为化合物1。在一些实施例中，所述调节物为化合物2。在一些实施例中，所述调节物为化合物3。
在某些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQ IDNO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
第十三方面，本发明提供一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于在需要所述调节的个体中降低血糖浓度，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的受体调节物接触。在某些实施例中，所述方法包含首先执行根据第一方面的方法以由此鉴别调节物。在某些实施例中，调节物为激动剂。
本发明也提供一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于在需要所述调节的个体中预防或治疗代谢病症，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的受体调节物接触。在某些实施例中，所述方法包含首先执行根据第一方面的方法以由此鉴别调节物。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于在需要所述调节的个体中预防或治疗血糖浓度升高的并发症，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的受体调节物接触。在某些实施例中，所述方法包含首先执行根据第一方面的方法以由此鉴别调节物。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，所述调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物是根据第三方面。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些优选实施例中，所述调节物为激动剂。
在某些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在一些实施例中，所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。在一些实施例中，所述调节物为化合物1。在一些实施例中，所述调节物为化合物2。在一些实施例中，所述调节物为化合物3。
在某些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQ IDNO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
在某些实施例中，所述接触包含将所述调节物口服投用给所述个体。
在某些实施例中，所述个体为哺乳动物。在某些实施例中，所述个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。在某些实施例中，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。最优选为人类。
第十四方面，本发明提供一种降低需要降低血糖的个体的血糖的方法，其包含使治疗有效量的RUP43 GPCR调节物与所述受体接触，所述GPCR包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，所述方法包含首先执行根据第一方面的方法以由此鉴别调节物。在某些实施例中，调节物为激动剂。
本发明也提供一种预防或治疗需要预防或治疗代谢病症的个体的代谢病症的方法，其包含使治疗有效量的RUP43 GPCR调节物与所述受体接触，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，所述方法包含首先执行根据第一方面的方法以由此鉴别调节物。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供一种预防或治疗需要预防或治疗血糖浓度升高的并发症的个体血糖浓度升高的并发症的方法，其包含使治疗有效量的RUP43 GPCR调节物与所述受体接触，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，所述方法包含首先执行根据第一方面的方法以由此鉴别调节物。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，所述调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物是根据第三方面。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些优选实施例中，所述调节物为激动剂。
在某些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在一些实施例中，所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。在一些实施例中，所述调节物为化合物1。在一些实施例中，所述调节物为化合物2。在一些实施例中，所述调节物为化合物3。
在某些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQ IDNO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
在某些实施例中，所述接触包含将所述调节物口服投用给所述个体。
在某些实施例中，所述个体为哺乳动物。在某些实施例中，所述个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。在某些实施例中，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。最优选为人类。
第十五方面，本发明提供包含RUP43 GPCR调节物、基本上由所述调节物组成或由所述调节物组成的医药组合物或生理学上可接受的组合物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，所述调节物可通过执行根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，所述调节物是通过执行根据第一方面的方法来鉴别。
在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，所述调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物是根据第三方面。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些优选实施例中，所述调节物为激动剂。
在某些实施例中，所述组合物为医药组合物。在某些实施例中，所述医药组合物包含RUP43 GPCR的调节物。在某些实施例中，所述医药组合物基本上由RUP43 GPCR的调节物组成。在某些实施例中，所述医药组合物由RUP43 GPCR的调节物组成。
在某些实施例中，所述组合物为生理学上可接受的组合物。在某些实施例中，生理学上可接受的组合物包含RUP43 GPCR的调节物。在某些实施例中，生理学上可接受的组合物基本上由RUP43 GPCR的调节物组成。在某些实施例中，生理学上可接受的组合物由RUP43 GPCR的调节物组成。
在某些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在一些实施例中，所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。在一些实施例中，所述调节物为化合物1。在一些实施例中，所述调节物为化合物2。在一些实施例中，所述调节物为化合物3。
在某些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQ IDNO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
第十六方面，本发明提供一种降低血糖浓度的方法，其包含向需要所述降低的个体提供或投用所述第十五方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物。
本发明也提供一种预防或治疗代谢病症的方法，其包含向需要所述预防或治疗的个体提供或投用所述第十五方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供一种预防或治疗血糖浓度升高的并发症的方法，其包含向需要所述预防或治疗的个体提供或投用所述第十五方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，所述调节物为激动剂。
在某些实施例中，将治疗有效量的所述医药组合物或生理学上可接受的组合物提供或投用给所述个体。
在某些实施例中，所述医药组合物或生理学上可接受的组合物的所述提供或投用是口服。
在某些实施例中，所述个体为哺乳动物。在某些实施例中，所述个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。在某些实施例中，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。最优选为人类。
第十七方面，本发明提供用于通过疗法来治疗人体或动物体的方法中的RUP43GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，所述调节物可通过执行根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，所述调节物是通过执行根据第一方面的方法来鉴别。
在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，所述调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物是根据第三方面。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些优选实施例中，所述调节物为激动剂。
在某些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在一些实施例中，所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。在一些实施例中，所述调节物为化合物1。在一些实施例中，所述调节物为化合物2。在一些实施例中，所述调节物为化合物3。
在某些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQ IDNO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
在某些实施例中，所述动物为哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠或非人类灵长类动物。人类或动物中更优选为人类。
第十八方面，本发明提供用于通过疗法来降低人体或动物体中血糖浓度的方法中的RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，所述调节物可通过执行根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，所述调节物是通过执行根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物为激动剂。
本发明也提供用于通过疗法来预防或治疗人体或动物体中代谢病症的方法中的RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，所述调节物可通过执行根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，所述调节物是通过执行根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供用于通过疗法来预防或治疗人体或动物体中血糖浓度升高的并发症的方法中的RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，所述调节物可通过执行根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，所述调节物是通过执行根据第一方面的方法来鉴别。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，所述调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物是根据第三方面。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些优选实施例中，所述调节物为激动剂。
在某些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在某些实施例中，所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。在某些实施例中，所述调节物为化合物1。在某些实施例中，所述调节物为化合物2。在某些实施例中，所述调节物为化合物3。
在某些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQ IDNO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
在某些实施例中，所述动物为哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠或非人类灵长类动物。人类或动物中更优选为人类。
第十九方面，本发明提供一种使用RUP43 GPCR的调节物来制备用于降低血糖浓度的药物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，所述方法包含首先执行根据第一方面的方法以由此鉴别调节物。在某些实施例中，调节物为激动剂。
本发明也提供一种使用RUP43 GPCR的调节物来制备用于预防或治疗代谢病症的药物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，所述方法包含执行根据第一方面的方法以由此鉴别调节物。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供一种使用RUP43 GPCR的调节物来制备用于预防或治疗血糖浓度升高并发症的药物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列。在某些实施例中，所述方法包含执行根据第一方面的方法以由此鉴别调节物。在某些实施例中，调节物为激动剂。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，调节物并非抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，所述调节物并非肽。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的脂肪细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，调节物为刺激获自哺乳动物的骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的化合物。在某些实施例中，所述调节物是根据第三方面。在某些实施例中，所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。在某些优选实施例中，所述调节物为激动剂。
在某些实施例中，所述调节物对GPCR具有选择性。
在某些实施例中，所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。在某些实施例中，所述调节物为化合物1。在某些实施例中，所述调节物为化合物2。在某些实施例中，所述调节物为化合物3。
在某些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。
在一些实施例中，所述调节物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。在某些实施例中，所述EC50是使用选自由下列检定组成的群组的检定来确定：使用经转染的HEK293细胞执行的全细胞cAMP检定，所述细胞表达具有SEQ IDNO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43 GPCR多肽；和使用经转染的黑素细胞执行的黑素细胞检定，所述黑素细胞表达具有SEQ ID NO：2或6的氨基酸序列的重组RUP43GPCR多肽。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于10μM、在所述检定中小于9μM、在所述检定中小于8μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于7μM、在所述检定中小于6μM、在所述检定中小于5μM、在所述检定中小于4μM、在所述检定中小于3μM、在所述检定中小于2μM、在所述检定中小于1μM、在所述检定中小于900nM、在所述检定中小于800nM、在所述检定中小于700nM、在所述检定中小于600nM、在所述检定中小于500nM、在所述检定中小于400nM、在所述检定中小于300nM、在所述检定中小于200nM、在所述检定中小于100nM、在所述检定中小于90nM、在所述检定中小于80nM、在所述检定中小于70nM、在所述检定中小于60nM、在所述检定中小于50nM、在所述检定中小于40nM、在所述检定中小于30nM、在所述检定中小于20nM或在所述检定中小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至10μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至1μM的范围的值的激动剂。在一些实施例中，所述调节物为EC50在所述检定中小于选自10nM至100nM的范围的值的激动剂。
第二十方面，本发明提供一种制备医药组合物或生理学上可接受的组合物的方法，其包含混合根据第二方面的化合物和载剂。
在某些实施例中，所述组合物为医药组合物。在某些实施例中，所述组合物为生理学上可接受的组合物。
在某些实施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用化合物进一步能够穿过血脑障壁。
第二十一方面，本发明提供包含根据第二方面的化合物、基本上由所述化合物组成或由所述化合物组成的医药组合物或生理学上可接受的组合物。
在某些实施例中，所述组合物为医药组合物。在某些实施例中，所述医药组合物包含根据第二方面的化合物。在某些实施例中，所述医药组合物基本上由根据第二方面的化合物组成。在某些实施例中，所述医药组合物由根据第二方面的化合物组成。
在某些实施例中，所述组合物为生理学上可接受的组合物。在某些实施例中，生理学上可接受的组合物包含根据第二方面的化合物。在某些实施例中，生理学上可接受的组合物基本上由根据第二方面的化合物组成。在某些实施例中，生理学上可接受的组合物由根据第二方面的化合物组成。
在某些实施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用化合物进一步能够穿过血脑障壁。
第二十二方面，本发明提供一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于降低需要所述调节的个体中的血糖含量，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的根据第二方面的化合物接触，或与治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物接触。在某些实施例中，所述接触是与治疗有效量的根据第二方面的化合物接触。在某些实施例中，所述接触是与治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物接触。
在某些实施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用化合物进一步能够穿过血脑障壁。
在某些实施例中，所述个体为哺乳动物。在某些实施例中，所述个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。在某些实施例中，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。最优选为人类。
第二十三方面，本发明提供一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于预防或治疗需要所述调节的个体中的代谢病症，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的根据第二方面的化合物接触，或与治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物接触。在某些实施例中，所述接触是与治疗有效量的根据第二方面的化合物接触。在某些实施例中，所述接触是与治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物接触。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于预防或治疗需要所述调节的个体中的血糖浓度升高并发症，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的根据第二方面的化合物接触，或与治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物接触。在某些实施例中，所述接触是与治疗有效量的根据第二方面的化合物接触。在某些实施例中，所述接触是与治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物接触。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用化合物进一步能够穿过血脑障壁。
在某些实施例中，所述个体为哺乳动物。在某些实施例中，所述个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。在某些实施例中，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。最优选为人类。
第二十四方面，本发明提供一种用RUP43 GPCR降低需要降低血糖浓度的个体血糖浓度的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的根据第二方面的化合物接触，或与治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物接触。在某些实施例中，所述接触是与治疗有效量的根据第二方面的化合物接触。在某些实施例中，所述接触是与治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物接触。
在某些实施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在某些实施例中，所述口服生物可用化合物进一步能够穿过血脑障壁。
在某些实施例中，所述个体为哺乳动物。在某些实施例中，所述个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。在某些实施例中，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。最优选为人类。
第二十五方面，本发明提供一种用RUP43 GPCR预防或治疗需要降低代谢病症的个体的代谢病症的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的根据第二方面的化合物接触，或与治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物接触。在某些实施例中，所述接触是与治疗有效量的根据第二方面的化合物接触。在某些实施例中，所述接触是与治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物接触。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供一种用RUP43 GPCR预防或治疗需要预防或治疗血糖浓度升高并发症的个体的血糖浓度升高并发症的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的根据第二方面的化合物接触，或与治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物接触。在某些实施例中，所述接触是与治疗有效量的根据第二方面的化合物接触。在某些实施例中，所述接触是与治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物接触。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用化合物进一步能够穿过血脑障壁。
在某些实施例中，所述个体为哺乳动物。在某些实施例中，所述个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。在某些实施例中，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。最优选为人类。
第二十六方面，本发明提供一种降低血糖浓度的方法，其包含向需要所述降低的个体提供或投用根据第二方面的化合物或治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物。在某些实施例中，所述提供或投用化合物是提供或投用根据第二方面的化合物。在某些实施例中，所述提供或投用医药组合物或生理学上可接受的组合物是提供或投用根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物。
在某些实施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用化合物进一步能够穿过血脑障壁。
在某些实施例中，所述个体为哺乳动物。在某些实施例中，所述个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。在某些实施例中，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。最优选为人类。
第二十七方面，本发明提供一种治疗代谢病症的方法，其包含向需要所述治疗或预防的个体提供或投用根据第二方面的化合物或治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物。在某些实施例中，所述提供或投用化合物是提供或投用根据第二方面的化合物。在某些实施例中，所述提供或投用医药组合物或生理学上可接受的组合物是提供或投用根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供一种治疗血糖浓度升高的并发症的方法，其包含向需要所述治疗或预防的个体提供或投用根据第二方面的化合物或治疗有效量的根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物。在某些实施例中，所述提供或投用化合物是提供或投用根据第二方面的化合物。在某些实施例中，所述提供或投用医药组合物或生理学上可接受的组合物是提供或投用根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用化合物进一步能够穿过血脑障壁。
在某些实施例中，所述个体为哺乳动物。在某些实施例中，所述个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。在某些实施例中，所述哺乳动物为小鼠、大鼠、非人类灵长类动物或人类。最优选为人类。
第二十八方面，本发明提供用于通过疗法来治疗人体或动物体的方法中的根据第二方面的化合物。
在某些实施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用化合物进一步能够穿过血脑障壁。
在某些实施例中，所述动物为哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠或非人类灵长类动物。人类或动物中更优选为人类。
第二十九方面，本发明提供用于通过疗法来降低人体或动物体中血糖浓度的方法中的根据第二方面的化合物。
在某些实施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用化合物进一步能够穿过血脑障壁。
在某些实施例中，所述动物为哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠或非人类灵长类动物。人类或动物中更优选为人类。
第三十方面，本发明提供用于通过疗法来预防或治疗人体或动物体中的代谢病症的方法中的根据第二方面的化合物。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供用于通过疗法来预防或治疗人体或动物体中的血糖浓度升高并发症的方法中的根据第二方面的化合物。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用化合物进一步能够穿过血脑障壁。
在某些实施例中，所述动物为哺乳动物。在某些实施例中，所述哺乳动物为马、牛、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠、大鼠或非人类灵长类动物。人类或动物中更优选为人类。
第三十一方面，本发明提供一种使用根据第二方面的化合物来制备用于降低血糖浓度的药物的方法。
在某些实施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用化合物进一步能够穿过血脑障壁。
第三十二方面，本发明提供一种使用根据第二方面的化合物来制备用于预防或治疗代谢病症的药物的方法。在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
本发明也提供一种使用根据第二方面的化合物来制备用于预防或治疗血糖浓度升高并发症的药物的方法。在某些实施例中，所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
在某些实施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用化合物进一步能够穿过血脑障壁。
第三十三方面，本发明提供一种调节RUP43 GPCR的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使所述受体与根据第二方面的化合物接触或与根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物接触。在某些实施例中，所述接触是与根据第二方面的化合物接触。在某些实施例中，所述接触是与根据第二十一方面的医药组合物或生理学上可接受的组合物接触。
在某些实施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述口服生物可用性相对于腹膜内用药为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些实施例中，所述口服生物可用化合物进一步能够穿过血脑障壁。
第三十四方面，本发明提供一种鉴别一种或一种以上作为结合至RUP43 GPCR的化合物的候选化合物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含以下步骤：
(a)在候选化合物存在或不存在下，使受体与经可检测标记的已知GPCR配体接触；和
(b)测定所述经标记配体的结合是否在候选化合物存在下受到抑制；
其中所述抑制指示候选化合物为结合至RUP43 GPCR的化合物。
在某些实施例中，GPR131氨基酸序列选自由下列序列组成的群组：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其附带条件为RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ ID NO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；
(d)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(e)SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
(f)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(g)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(h)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代，其附带条件为RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ ID NO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；以及
(j)由在严格条件下与SEQ ID NO：1的互补体杂交的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
在某些实施例中，所述RUP43 GPCR为重组RUP43 GPCR。在某些实施例中，所述接触包含与表达GPCR的宿主细胞接触或与所述宿主细胞的细胞膜接触。在某些实施例中，所述表达GPCR的宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码受体的多核苷酸。
在一些实施例中，GPR131氨基酸序列为SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些实施例中，GPR131氨基酸序列为SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体。在一些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体为所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物。在一些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体为所述氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物的非内源组成性激活突变体。在某些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体为所述氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物的生物活性片段。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物的所述生物活性片段为SEQ ID NO：2或所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物的氨基酸序列，其缺失N末端甲硫氨酸。在某些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的一致性。在一些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的一致性。
在某些实施例中，所述膜制备是通过用Brinkman PolytronTM均质化细胞来进行。在某些实施例中，所述膜制备是通过用所述polytron各自进行3次持续时间为10-20sec的均质化来进行。
在某些实施例中，所述候选化合物并非抗体或其衍生物。
在某些实施例中，所述候选化合物并非肽。
在某些实施例中，所述已知配体为根据第二方面的化合物。
在某些实施例中，所述已知配体为根据第三方面的调节物。
在某些实施例中，所述已知配体为化合物1、化合物2或化合物3。在某些实施例中，所述已知配体为化合物1。在某些实施例中，所述已知配体为化合物2。在某些实施例中，所述已知配体为化合物3。
在某些实施例中，所述已知配体为GPCR的特异性抗体，或所述抗体的抗原结合衍生物。
在某些实施例中，所述标记选自由下列各物组成的群组：
(a)放射性同位素；
(b)酶；和
(c)荧光团。
在某些实施例中，所述标记为放射性同位素。在某些实施例中，所述标记选自由下列各物组成的群组：3H、14C、35S和125I。
化合物1、化合物2或化合物3可使用所属领域中已知的下文所述技术经放射性标记。在某些实施例中，化合物1、化合物2或化合物3是经3H或14C放射性标记。
在其它实施例中，所述方法进一步包含以下步骤：将候选化合物抑制经标记的第一已知配体的结合的水平与已知结合至GPCR的第二配体抑制所述经标记的第一已知配体的结合的第二水平相比较。
第三十五方面，本发明提供一种检测结合至RUP43 GPCR的配体的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含以下步骤：
在允许所述受体与测试配体之间的相互作用的条件下，使所述测试配体与表达所述受体的宿主细胞或所述宿主细胞的细胞膜接触；和
检测结合至所述受体的配体。
在某些实施例中，GPR131氨基酸序列选自由下列序列组成的群组：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其附带条件为RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ ID NO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；
(d)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(e)SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
(f)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(g)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(h)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代，其附带条件为RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ ID NO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；以及
(j)由在严格条件下与SEQ ID NO：1的互补体杂交的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
在一些实施例中，GPR131氨基酸序列为SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些实施例中，GPR131氨基酸序列为SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体。在一些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体为所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物。在一些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体为所述氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物的非内源组成性激活突变体。在某些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体为所述氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物的生物活性片段。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物的所述生物活性片段为SEQ ID NO：2或所述氨基酸序列的等位基因变异体或哺乳动物直向同源物的氨基酸序列，其缺失N末端甲硫氨酸。在某些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的一致性。在一些实施例中，所述SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变异体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的一致性。
在某些实施例中，所述RUP43 GPCR为重组RUP43 GPCR。在某些实施例中，所述接触包含与表达GPCR的宿主细胞接触或与所述宿主细胞的细胞膜接触。在某些实施例中，所述表达GPCR的宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码受体的多核苷酸。
在某些实施例中，所述测试配体并非抗体或其抗原结合衍生物。
在某些实施例中，所述测试配体并非肽。
在某些实施例中，所述膜制备是通过用Brinkman PolytronTM均质化细胞来进行。在某些实施例中，所述膜制备是通过用所述polytron各自进行3次持续时间为10-20sec的均质化来进行。
在某些实施例中，所述测试配体经标记。在某些实施例中，所述标记为放射性同位素。在某些实施例中，所述标记选自由下列各物组成的群组：3H、14C、35S和125I。
申请者保留将任一或多种候选化合物排除在任何本发明实施例之外的权利。申请者也保留将任一或多种调节物排除在任何本发明实施例之外的权利。申请者另外保留将任何多核苷酸或多肽排除在任何本发明实施例之外的权利。申请者另外保留将任何代谢病症或任何血糖浓度升高并发症排除在外的权利。另外，明确涵盖本发明的代谢病症可个别地或以任何组合包括于实施例中。另外，明确涵盖本发明的血糖浓度升高并发症可个别地或以任何组合包括于实施例中。
在本申请案通篇中，引用各种公开案、专利和已公开专利申请案。在本申请案中所引用的这些公开案、专利和已公开专利申请案的揭示内容以全文引用的方式并入所述揭示内容中。公开案、专利或已公开专利申请案的申请者在本文中的引用并不是所述公开案、专利或已公开专利申请案的申请者对先前技术的承认。
在熟练技术工人权限内对所揭示的发明进行的修改和扩展涵盖于上文揭示内容和下述权利要求书中。
附图说明
图1：以实例说明而非限制，图1描述候选化合物初次筛检作为与RUP43无关的内源组成性活性Gs偶合GPCR的Gsα融合蛋白构筑体的“目标受体”的结果。孔A2提供“化合物A”的结果。孔G9提供“化合物B”的结果。(参见实例7。)
图2：由脂肪细胞和骨骼肌细胞表达RUP43的RT-PCR分析。人类和小鼠脂肪细胞表达RUP43。人类和小鼠骨骼肌细胞表达RUP43。(参见实例11。)
图3：内源RUP43偶合至Gs。(参见实例14。)
图4：鉴别作为RUP43激动剂的化合物1。(参见实例15。)
图5：鉴别作为RUP43激动剂的化合物2。(参见实例16。)
图6：化合物2刺激小鼠3T3L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取。(参见实例18。)
图7：化合物2增强小鼠3T3L1脂肪细胞中的胰岛素刺激的葡萄糖摄取。(参见实例19。)
图8：化合物2刺激原代人类脂肪细胞中的葡萄糖摄取。(参见实例20。)
图9：化合物2刺激大鼠L6成肌细胞中的葡萄糖摄取。(参见实例21。)
图10：化合物2增强大鼠L6成肌细胞中的胰岛素刺激的葡萄糖摄取。(参见实例22。)
图11：化合物2刺激原代人类骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取。(参见实例23。)
具体实施方式
定义
已关于受体发展的科学文献采用多种术语来指明对受体具有各种作用的配体。简明起见且为一致，在本专利文献中将全篇使用下列定义。为达到使这些定义与这些术语的其它定义相冲突的程度，下列定义应控制为：
激动剂应表示在与受体结合时将激活胞内应答的物质(例如配体、候选化合物)。在一些实施例中，激动剂是在与受体结合时将激活胞内应答(例如，为增强结合至膜的GTPγS，或为升高胞内cAMP水平)的那些先前未知的物质。在一些实施例中，激动剂是在与受体结合时将刺激获自哺乳动物的脂肪细胞或骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的那些先前未知的物质。
本文所用的氨基酸缩写列于表A中：
表A
    丙氨酸     ALA     A
    精氨酸     ARG     R
    天冬酰胺酸     ASN     N
    天冬氨酸     ASP     D
    半胱氨酸     CYS     C
    谷氨酸     GLU     E
    谷氨酰胺     GLN     Q
    甘氨酸     GLY     G
    组氨酸     HIS     H
    异白氨酸     ILE     I
    白氨酸     LEU     L
    赖氨酸     LYS     K
    甲硫氨酸     MET     M
    苯丙氨酸     PHE     F
    脯氨酸     PRO     P
    丝氨酸     SER     S
    苏氨酸     THR     T
    色氨酸     TRP     W
    酪氨酸     TYR     Y
    缬氨酸     VAL     V
拮抗剂应表示在与激动剂相同的位点竞争性结合至受体，但不会激活胞内应答且由此可抑制由激动剂引发的胞内应答的物质(例如配体、候选化合物)。拮抗剂在无激动剂存在下不会减少基线胞内应答。在一些实施例中，拮抗剂是在与受体结合时将与激动剂竞争抑制细胞应答的那些先前未知的物质，例如，其中细胞应答为GTPγS结合至膜或胞内cAMP水平升高。
本文中抗体旨在涵盖单克隆抗体和多克隆抗体。抗体进一步旨在涵盖IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。抗体包括全抗体，包括单链全抗体；及其抗原结合片段，包括Fab、Fab′、F(ab)2和F(ab′)2。抗体可来自任何动物来源。抗体优选为人类、鼠科动物、兔、山羊、豚鼠、仓鼠、骆驼、驴、绵羊、马或鸡。抗体优选具有离解常数或Kd值小于5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M和10-15M的结合亲和力。本发明抗体可以所属领域中已知的任何合适方法来制备。抗体衍生物旨在涵盖(但不限于)抗原结合片段。
GPCR多肽或氨基酸序列的生物学活性片段应表示多肽或氨基酸序列的具有天然产生GPCR的结构和生化功能的片段。在某些实施例中，生物学活性片段偶合至G蛋白。在某些实施例中，生物学活性片段结合至内源配体。
候选化合物应表示经受筛检技术的分子(例如但不限于化合物)。
化学基团：
术语“C1-6烷基”表示含有所示碳数目的直链或支链碳基团，例如，在一些实施例中，烷基为“C1-4烷基”且所述基团含有1-4个碳，而在其它实施例中，烷基为“C2-6烷基”且所述基团含有2-6个碳。在一些实施例中烷基含有1-3个碳，在一些实施例中含有1-2个碳，且在一些实施例中含有1个碳。烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、异己基、仲己基、新己基等等。
术语“卤素”或“卤基”表示氟、氯、溴或碘基团。
密码子应表示三个核苷酸(或核苷酸的等效物)的群组，所述核苷酸通常包含偶合至磷酸基的核苷[腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、尿苷(U)和胸苷(T)]且在翻译时编码氨基酸。
组合物表示包含至少一种组份的物质。“医药组合物”是组合物的实例。
化合物功效应表示化合物抑制或刺激受体功能性的能力的测量；意即，激活/抑制信号转导路径的能力，与受体结合亲和力形成对比。检测化合物功效的例示性方式揭示于本专利文献的实例部分中。
包含、基本上由...组成和由...组成在本文中根据其标准含义来定义。陈述于M.P.E.P.中的所定义含义控制所属领域中的所定义含义，且陈述于监督联邦巡回法院判例法(controlling Federal Circuit case law)中的所定义含义控制陈述于M.P.E.P.中的含义。
组成性活性受体应表示以除经由使受体结合至其配体或其化学等效物之外的方式稳定在活性态的受体。组成性活性受体可为内源或非内源组成性活性受体。
组成性激活受体应表示已修饰为具有组成性活性的内源受体。
组成性受体激活应表示在无受体结合至其配体或其化学等效物的情况下受体的激活。
接触(CONTACT或CONTACTING)应表示在体外系统或体内系统中使至少两个部分集合在一起。
降低(DECREASE)用于表示可测量的量的减少且在使用时与术语“减少”(“reduce”、“diminish”、“lower”和“lessen”)具有相同含义。
血糖浓度升高应表示哺乳动物中的禁食血糖浓度高于哺乳动物的正常禁食血糖浓度。以实例说明，正常人类禁食血糖浓度低于100mg/dl。如本文所用，人类血糖浓度升高是禁食血糖浓度为100mg/dl或更高。以实例说明而非限制，血糖浓度升高涵盖高血糖症。
内源应表示哺乳动物天然产生的物质。关于(例如但不限于)术语“受体”的内源应表示其是由哺乳动物(例如但不限于人类)天然产生。内源应理解为涵盖基因的等位基因变异体以及如此编码的等位基因多肽变异体。如本文所用，“内源GPCR”和“原生GPCR”可互换使用。相反，本文中的术语非内源应表示并非由哺乳动物(例如但不限于人类)天然产生。例如(但非限制)，内源形式不具有组成性活性但在受操纵时变得具有组成性活性的受体在本文中最好称作“非内源组成性激活受体”。
表达载体在本文中是定义为在用于所述表达载体的适当宿主细胞重组体中经克隆DNA的转录和经转录mRNA的翻译所需的DNA序列。经适当构建的表达载体应含有用于在宿主细胞中自主复制的复制起点、可选择标记物、有限数目的适用限制酶位点、高拷贝数的可能性和活性启动子。所述待转录的经克隆DNA可操作性地连接至所述表达载体内的组成性或条件性活性启动子。以实例说明而非限制，pCMV为表达载体。
在本文所揭示的发明内容中，G蛋白偶合受体融合蛋白和GPCR融合蛋白各表示包含融合至至少一个G蛋白、最优选为所述G蛋白的α亚单元(其为结合GTP的亚单元)的内源组成性活性GPCR或非内源组成性激活GPCR的非内源蛋白，所述G蛋白优选为与天然偶合内源GPCR的G蛋白相同的类型。例如(而非限制)，在内源状态中，如果G蛋白“Gsα”是偶合GPCR的主要G蛋白，则基于特异GPCR的GPCR融合蛋白将为包含融合至Gsα的GPCR的非内源蛋白；在一些情况下，如下文所述，非主要G蛋白可融合至GPCR。G蛋白可直接融合至组成性活性GPCR的C末端，或者在两者之间可存在间隔物。
宿主细胞应表示能够使载体并入其中的细胞。在某些实施例中，载体为表达载体。例示性宿主细胞包括(但不限于)293、293T、CHO、MCB3901和COS-7细胞以及黑素细胞。
如本文所用，需要预防或治疗是指由护理者(例如，在人类状况下为医师、护士、从业护士等；在动物(包括非人类哺乳动物)状况下为兽医)所作的个体或动物需要治疗或将受益于治疗的判断。此判断是基于各种因素而作出，所述因素是在护理者的专业知识范围内，但包括个体或动物由于本发明化合物可治疗的病症而生病或将生病的知识。
如本文所用，个体是指包括哺乳动物的任何动物，优选为小鼠、大鼠、其它啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物，且最优选为人类。
与术语“应答”相关的抑制(INHIBIT或INHIBITING)应表示相对于无化合物存在的情况，在所述化合物存在下应答得以降低或预防。
如本文所用，葡萄糖耐受性异常(IGT)旨在说明与胰岛素抗性相关的病症，其为frank、2型糖尿病和正常葡萄糖耐受性(NGT)之间的中间病症。在诊断IGT的程序中，通过对饭后2小时血糖水平进行评估，确定病人的饭后葡萄糖应答异常。在此测试中，将所测量的量的葡萄糖投用给患者，并以固定时间间隔测量血糖水平，所述时间间隔通常在前两个小时中为每隔半小时且在其后为每隔1小时。在“正常”或非IGT个体中，葡萄糖水平在前两个小时中升至低于140mg/dl的水平且接着快速下降。在IGT个体中，血糖水平较高且以较缓慢速率直降。
如本文所用，胰岛素抗性旨在涵盖由多种方法中的任一方法对胰岛素抗性作出的常规诊断，所述方法包括(但不限于)：静脉内葡萄糖耐受性测试或禁食胰岛素水平测量。应了解，在禁食胰岛素水平高度与胰岛素抗性程度之间存在良好关系。因此，可将禁食胰岛素水平升高用作胰岛素抗性的代用标记物，以达成鉴别正常葡萄糖耐受性(NGT)个体具有胰岛素抗性的目的。胰岛素抗性的诊断也可使用正常血糖钳葡萄糖测试来进行。
反向激动剂应表示结合至内源形式或组成性激活形式的受体以减少在无激动剂的情况下所观察到的受体的基线胞内应答的物质(例如配体、候选化合物)。
经分离应表示自物质的初始环境(如果其天然存在，则为其天然环境)中将其移除。例如，存在于活体动物中的天然存在多核苷酸或多肽并未经分离，但自天然系统中的一些或所有共存物质中分离的相同多核苷酸或DNA或多肽却经分离。所述多核苷酸可为载体的部分，和/或所述多核苷酸或多肽可为组合物的部分，且仍经分离，因为所述载体或组合物并非天然环境的部分。
配体应表示特异性结合至GPCR的分子。例如配体可为多肽、脂质、小分子、抗体。内源配体是作为原生GPCR的内源天然配体的配体。配体可为GPCR“拮抗剂”、“激动剂”、“部分激动剂”或“反向激动剂”等等。
如本文所用，术语调节或修饰表示指特定活性、功能或分子的量、性质或效应的增加或减少。以实例说明而非限制，G蛋白偶合受体的激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂为受体的调节物。
部分激动剂应表示在结合至受体时将激活胞内应答至低于完全激动剂的程度的物质(例如配体、候选化合物)。
医药组合物应表示包含至少一种活性成份的组合物，从而所述组合物可用于研究哺乳动物(例如但不限于人类)中的指定有效结果。所属领域的技术人员应了解并认识到适用于确定活性成份是否具有所要有效结果(基于技术人员的需要)的技术。
多核苷酸应表示单链或双螺旋形式的具有一个以上核苷酸的RNA、DNA或RNA/DNA杂合序列。本发明的多核苷酸可以任何已知方法(包括合成、重组、离体产生方法或其组合)以及使用所属领域中已知的任何纯化方法制备。
多肽是指与聚合物长度无关的氨基酸聚合物。因此，肽、寡肽和蛋白包括于多肽的定义内。此术语也并未规定或排除多肽的表达后修饰。举例而言，包括糖基、乙酰基、磷酸基、脂质基团等等的共价连接的多肽明显由术语多肽所涵盖。
本文中使用引物来表示与目标核苷酸序列互补且用于与目标核苷酸序列杂交的特异性寡核苷酸序列。引物充当由DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶所催化的核苷酸聚合作用的引发点。
本文中使用经纯化来描述已自其它化合物分离的本发明多核苷酸或多肽载体，所述其它化合物包括(但不陷于)其它核酸、碳水化合物、脂质和蛋白(例如用于合成多核苷酸的酶)。在某些实施例中，当至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的样品含有单一多核苷酸序列时，多核苷酸是实质上纯的。在一些实施例中，实质上纯的多核苷酸一般包含约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％重量/重量的多核苷酸样品。
类似地，本文中使用术语经纯化来描述已自其它化合物分离的本发明多肽，所述其它化合物包括(但不限于)核酸、脂质、碳水化合物及其它蛋白。在某些实施例中，当至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的样品的多肽分子具有单一氨基酸序列时，多肽是实质上纯的。在一些实施例中，实质上纯的多肽一般包含约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％重量/重量的蛋白样品。
类似地，本文中使用术语经纯化来描述本发明的调节物。在某些实施例中，实质上纯的调节物一般包含至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％重量/重量的所述调节物的制剂。在某些实施例中，调节物具有“至少”为90％与100％之间的任何数目(达到千分之一位置)的纯度(例如，至少99.995％纯)。
此外，如本文所用，术语经纯化并不需要绝对纯度；相反，其旨在表示相对定义。
受体功能性应指受体在细胞中接收刺激且缓和效应的正常运作，其包括(但不限于)调节基因转录、调节离子的流入或流出、实现催化反应和/或经由G蛋白调节活性。
第二信使应表示由于受体激活作用而产生的胞内应答。例如，第二信使可包括三磷酸肌醇(IP3)、二酰甘油(DAG)、环状AMP(cAMP)、环状GMP(cGMP)、MAP激酶活性和Ca2+。可测量第二信使应答以用于确定受体激活。此外，可测量第二信使应答以用于鉴别(例如)作为反向激动剂、部分激动剂、激动剂和拮抗剂的候选化合物。
信号噪声比(SIGNAL TO NOISE RATIO)应表示应答激活、放大或刺激作用而产生的信号，其中应答非激活、非扩大或非刺激作用的信号在背景噪声或基线水平以上。
间隔物应表示位于基因(例如所关注的GPCR)的最后密码子或最后氨基酸之后，但在所关注G蛋白的起始密码子或起始区之前的经翻译氨基酸数目，其中经翻译数目的氨基酸与所关注G蛋白的起始区置于同框内。经翻译氨基酸的数目可为1、2、3、4等，且多达12个。
与术语“应答”相关的刺激(STIMULATE或STIMULATING)应表示相对于无化合物存在的情况，在所述化合物存在下应答得以增加。
受检者应表示灵长类动物，包括(但不限于)：人类和狒狒；以及宠物动物，例如狗和猫；实验室动物，例如大鼠和小鼠；以及家畜，例如马、绵羊和牛。
如本文所用，治疗有效量是指在组织、系统、动物、个体或人类中引发研究人员、兽医、医生或其它医师所寻求的生物或医学应答的活性化合物或医药剂的量，所述生物或医学应答包括下列应答中的一或多种：
(1)预防疾病，例如在易患疾病、病状或病症但未经历或显示所述疾病的病理学或症状学的个体中预防所述疾病、病状或病症；
(2)抑制疾病，例如在经历或显示疾病、病状或病症的病理学或症状学的个体中抑制所述疾病、病状或病症(意即遏制病理学和/或症状学的进一步发展)；和
(3)改善疾病，例如在经历或显示疾病、病状或病症的病理学或症状学的个体中改善所述疾病、病状或病症(意即逆转病理学和/或症状学)。
如本文所用，术语变异体是与参考多核苷酸或多肽各自不同但保留基本特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型变异体与另一参考多核苷酸在核苷酸序列中有所不同。变异体核苷酸序列的变化可能改变或可能不改变由参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。多肽的典型变异体与另一参考多肽在氨基酸序列中有所不同。变异体与参考多肽可因一个或一个以上取代、添加、缺失的任何组合而在氨基酸序列中有所不同。多核苷酸或多肽的变异体可为天然产生的变异体，例如等位基因变异体，或者其可为并非已知为天然产生的变异体。多核苷酸和多肽的非天然产生变异体可通过突变诱发技术或通过直接合成来制得。
引言
出于呈现效率而阐述下列章节的顺序且并不打算或不应解释为对下列揭示内容或权利要求书构成限制。
B.受体表达
1.所关注GPCR多肽
本发明的RUP43 GPCR包含GPR131氨基酸序列。如本文所用，“GPR131氨基酸序列”旨在涵盖SEQ ID NO：2的内源人类GPR131氨基酸序列以及与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％一致性的变异体氨基酸序列。换言之，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列变异体的GPCR可用于本发明方法中。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的等位基因变异体。在某些实施例中，SEQ ID NO：2的氨基酸序列的等位基因变异体是由可通过使用特异性引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4对人类DNA样品执行聚合酶链式反应(PCR)而获得的内源GPR131核苷酸序列编码。在一些实施例中，SEQ ID NO：2的氨基酸序列的等位基因变异体是由可通过使用包含SEQ ID NO：3的特异性引物和包含SEQ ID NO：4的特异性引物对人类DNA样品执行聚合酶链式反应(PCR)而获得的内源GPR131核苷酸序列编码。在某些实施例中，人类DNA样品为人类基因组DNA。在某些实施例中，所述过程为PT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)。RT-PCR技术为熟练技术人员所熟知。在某些实施例中，人类cDNA样品为人类单核细胞或巨嗜细胞cDNA。在某些实施例中，人类cDNA样品为人类脂肪细胞cDNA。在某些实施例中，人类cDNA样品为人类骨骼肌细胞cDNA。在某些实施例中，提供人类DNA样品。在某些实施例中，人类DNA样品获自商业来源。在某些实施例中，可用于本发明方法中的变异体氨基酸序列为SEQ ID NO：2的氨基酸序列的哺乳动物直向同源物。以实例说明而非限制，构想兔(例如GenBank入藏登记号BAC55237)、牛(例如GenBank入藏登记号NP_778219)、小鼠(例如GenBank入藏登记号NP_778150)和大鼠(例如GenBank入藏登记号NP_808797)的GPR131氨基酸序列在“GPR131氨基酸序列”的范围内。应了解，如本文所用的“GPR131 GPCR”为内源RUP43GPCR；以实例说明而非限制，内源人类RUP43 GPCR是GenBank入藏登记号NM_170699的人类GPR131(具有与SEQ ID NO：2一致的氨基酸序列)及其等位基因，内源兔RUP43 GPCR是GenBank入藏登记号BAC55237的兔GPR131及其等位基因，内源牛RUP43 GPCR是GenBank入藏登记号NP_778219的牛GPR131及其等位基因，内源小鼠RUP43 GPCR是GenBank入藏登记号NP_778150的小鼠GPR131及其等位基因，且内源大鼠RUP43 GPCR是GenBank入藏登记号NP_808797的大鼠GPR131及其等位基因。
在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的非内源组成性激活突变体、SEQ ID NO：2的等位基因或SEQ ID NO：2的哺乳动物直向同源物。如所属领域中已知，组成性激活GPCR可使用各种方法来制备(例如参见1998年10月22日作为WO 98/46995公开的PCT申请案第PCT/US98/07496号，和美国专利第6,555,339号；其揭示内容各以全文引用的方式并入本文中)。SEQ ID NO：2的氨基酸序列、SEQ ID NO：2的等位基因、SEQ ID NO：2的哺乳动物直向同源物、内源GPR131的非内源组成性激活突变体或与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％一致性的氨基酸序列的生物活性片段可用于本发明中。以实例说明而非限制，构想缺失N末端甲硫氨酸或N末端信号肽以提供可用于本发明方法的生物活性片段。以实例进一步说明而非限制，可用于本发明方法中的RUP43 GPCR可包含SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其附带条件为RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ ID NO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基。
在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约75％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约80％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ IDNO：2的氨基酸序列具有至少约85％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约90％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约91％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约92％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约93％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约94％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约95％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约96％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约97％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约98％一致性的氨基酸序列。在某些实施例中，可用于本发明方法中的GPCR可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约99％一致性的氨基酸序列。与SEQ IDNO：2的氨基酸序列具有至少(例如)95％“一致性”的氨基酸序列表示所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列一致，但其可包括每100个SEQ ID NO：2的氨基酸序列的氨基酸中多达5个氨基酸改变。因此，为获得与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，序列中多达5％(100个中的5个)的氨基酸残基可经插入、缺失或经另一氨基酸取代。这些改变可发生在氨基或羧基末端或所述末端位置之间的任何地方，其个别地散布在序列中的残基中或散布在序列内的一个或一个以上邻近基团中。
在一些实施例中，可用于本发明方法中的GPR131氨基酸序列是由在严格条件下与具有SEQ ID NO：1中所述序列的过滤结合DNA杂交的多核苷酸序列的互补序列编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。以实例说明而非限制，可用于本发明方法中的GPR131氨基酸序列是由在严格条件下杂交至与SEQ ID NO：1的互补体杂交的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。杂交技术为熟练技术人员所熟知。优选的严格杂交条件包括在42℃下在包含下列组份的溶液中培育过夜：50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×邓氏溶液(Denhardt’s solution)、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切鲑鱼精DNA；随后在约65℃下在0.1×SSC中洗涤过滤器。
a.序列一致性
用于确定查询序列(例如SEQ ID NO：2的氨基酸序列)与待询问序列之间的最优选总体匹配的优选方法(也称作总体序列比对)可基于Brutlag等人[Comp App Biosci(1990)6：237-245，其揭示内容以全文引用的方式并入本文中]的算法使用FASTDB计算机程序来确定。在序列比对中，查询序列与询问序列都为氨基酸序列。所述总体序列比对的结果为一致性百分比。FASTDB氨基酸比对中所用的优选参数为：矩阵＝PAM 0，k元组＝2，错配罚分＝1，接合罚分＝20，随机组＝25，长度＝0，截断计分＝1，窗口大小＝序列长度，间隙罚分＝5，间隙大小罚分＝0.05，窗口大小＝247或询问氨基酸序列的长度，无论哪个都可更小。
如果询问序列因N或C末端缺失而非因内部缺失而比查询序列更短，则一致性百分比结果必须手动校正，因为FASTDB程序在计算总体一致性百分比时并不说明询问序列的N和C末端截断。关于在N和C末端截断的询问序列，相对于查询序列，通过计算作为询问序列的N和C末端、不与对应询问序列残基匹配/比对的查询序列的残基数目，将一致性百分比校正为查询序列的总碱基数百分比。由FASTDB序列比对的结果来确定残基是否匹配/比对。接着，自通过使用指定参数的上述FASTDB程序计算的一致性百分比减去此百分数以得到最终一致性百分比计分。此最终一致性百分比计分是用于达成本发明目的。仅询问序列的N和C末端的不与查询序列匹配/比对的残基被认为用于达成手动调节一致性百分比计分的目的。即，仅询问序列的最远N和C末端残基之外的查询氨基酸残基。
举例而言，将90个氨基酸残基的询问序列与100个残基的查询序列相比对以确定一致性百分比。在询问序列的N末端发生缺失，且因此FASTDB比对并不与N末端的第一残基匹配/比对。10个未配对残基表示10％的序列(N和C末端不匹配的残基数目/查询序列中的残基总数)，因此自通过FASTDB程序所计算的一致性百分比计分减去10％。如果剩余90个残基完全匹配，则最终一致性百分比为90％。
在另一实例中，将90个残基的询问序列与100个残基的查询序列相比较。这次缺失为内部缺失，因此在询问序列的N或C末端不存在不与查询序列匹配/比对的残基。在所述状况下，由FASTDB计算的一致性百分比并不是手动校正。再一次，仅手动校正目标序列的N和C末端外部不与查询序列匹配/比对的残基位置(如FASTDB比对中所显示)。为达成本发明目的，并不进行任何其它校正。
b.融合蛋白
在某些实施例中，所关注多肽为融合蛋白，且(例如)可含有亲和标签域或报导子域。合适亲和标签包括可与另一部分(通常为另一多肽，最通常为抗体)特异性结合的任何氨基酸序列。如所属领域中已知，合适亲和标签包括抗原决定基标签，例如V5标签、FLAG标签、HA标签(来自血球凝集素流行性感冒病毒)、myc标签等等。合适亲和标签也包括已知结合底物的区域(例如所属领域中已知的HIS、GST和MBP标签)，以及可获得特异性结合配对物(例如抗体，尤其为单克隆抗体)的来自其它蛋白的区域。合适亲和标签也包括可使用合适的结合配对物(诸如IgG Fc受体)特异性结合且检测的任何蛋白-蛋白相互作用域，诸如IgG Fc区。明确涵盖所述融合蛋白可含有N末端甲硫氨酸残基缺失或经替代氨基酸取代的与GPCR同框融合的异源N末端域(例如抗原决定基标签)。
合适报导子域包括可报导多肽存在的任何区域。虽然认为使用(例如)特异性结合至标签的经标记抗体，可将亲和标签用于报导多肽存在，但更通常使用发光报导子域。合适发光报导子域包括荧光素酶(例如来自萤火虫、Vargula、珊瑚虫(Renilla reniformis)或Renilla muelleri)或其发光变异体。其它合适报导子域包括荧光蛋白(例如来自水母、珊瑚虫及其它腔肠动物，例如来自水母(Aequoria)、海肾(Renilla)、Ptilosarcus、Stylatula属的腔肠动物)或其发光变异体。这些报导蛋白的发光变异体在所属领域中为人所熟知，且与原生报导蛋白相比其可更明亮、更黯淡或具有不同的激发和/或发射光谱。举例而言，可改变一些变异体使得其不再呈现绿色且可呈现蓝色、青色、黄色、增强的黄红色(各自称为BFP、CFP、YFP、eYFP和RFP)或具有所属领域中已知的其它发射光谱。其它合适报导子域包括可经由生化或颜色变化来报导多肽存在的区域，诸如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、氯霉素乙酰转移酶和经分泌胚胎碱性磷酸酶。
所属领域中同样已知，亲和标签或报导子域可存在于所关注多肽中的任何位置。然而，在大多数实施例中，其存在于所关注多肽的C或N末端。
2.编码所关注GPCR多肽的核酸
因为操纵核酸的遗传密码和重组技术是已知的且所关注GPCR多肽的氨基酸序列如上所述，所以编码所关注GPCR多肽的核酸的设计和产生为熟练技术人员所熟知。在某些实施例中，使用标准重组DNA技术(Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley & Sons，1995；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)方法。举例而言，可使用无需在本文中描述的各种重组方法中的任一种或其组合自GPCR编码序列文库分离GPCR编码序列。也可使用标准重组DNA技术进行编码蛋白的核酸序列中核苷酸的随后取代、缺失和/或添加。
举例而言，可使用定点突变诱发和亚克隆以在编码所关注多肽的多核苷酸中引入/缺失/取代核酸残基。在其它实施例中，可使用PCR。编码所关注多肽的核酸也可通过化学合成而完全自寡核苷酸制得(例如Cello等人，Science(2002)297：1016-8)。
在一些实施例中，编码所关注多肽的核酸的密码子经优化以在特定物种(尤其为哺乳动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、非人类灵长类动物或人类物种)的细胞中表达。在一些实施例中，编码所关注多肽的核酸的密码子经优化以在特定物种、尤其为两栖动物物种的细胞中表达。
a.载体
本发明进一步提供包含本发明核酸的载体(也称作“构筑体”)。在许多本发明实施例中，本发明核酸序列将在所述序列已可操作性连接至表达控制序列(例如包括启动子)之后在宿主中表达。本发明核酸通常也置于可在宿主细胞中复制为游离基因或宿主染色体DNA的整体部分的表达载体中。表达载体通常含有选择标记(例如四环素或新霉素)以允许检测经所要DNA序列转染的那些细胞(例如参见美国专利第4,704,362号，其以引用的方式并入本文中)。包括单和双表现序列盒载体的载体为所属领域中所熟知(Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley & Sons，1995；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，(1989)Cold SpringHarbor，N.Y.)。合适载体包括病毒载体、质粒、粘质粒、人工染色体(人类人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体等)、微小染色体等等。可使用逆转录酶病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。
多种表达载体可用于所属领域中以在细胞中产生所关注多肽。一种合适载体为pCMV，其用于某些实施例中。在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganisms forthe Purpose of Patent Procedure)的规定下，此载体于1998年10月13日保存于美国菌种保藏中心(ATCC)(1080l University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209 USA)。由ATCC测试DNA且确定其具有存活力。ATCC将以下保存号指派给pCMV：ATCC#203351。
本发明核酸通常包含编码本发明所关注多肽的单一开放阅读框，然而，在某些实施例中，因为表达所关注多肽的宿主细胞可为真核生物细胞(例如哺乳动物细胞，诸如人类细胞)，所以开放阅读框可由内含子中断。本发明核酸一般为转录单元的部分，所述转录单元除本发明核酸之外也可含有可指导RNA稳定性、翻译效率等的3′和5′未翻译区(UTR)。本发明核酸也可为表达序列盒的部分，所述表达序列盒除本发明核酸之外也含有指导所关注多肽的转录和表现的启动子以及转录终止子。
真核生物启动子可为在真核生物宿主细胞中具有功能性的任何启动子，其包括病毒启动子和来源于真核生物基因的启动子。例示性真核生物启动子包括(但不限于)以下启动子：小鼠金属硫蛋白I基因序列的启动子(Hamer等人，J.Mol.Appl.Gen.1：273-288，1982)、疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell 31：355-365，1982)、SV40早期启动子(Benoist等人，Nature(London)290：304-310，1981)、酵母gall基因序列启动子(Johnston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79：6971-6975，1982；Silver等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81：5951-59SS，1984)、CMV启动子、EF-1启动子、蛻皮激素应答性启动子、四环素应答性启动子等等。病毒启动子尤其受到关注，因为其通常为尤其强的启动子。在某些实施例中，使用作为目标病原体的启动子的启动子。选择用于本发明的启动子，使得其在引入其中的细胞类型(和/或动物)中具功能性。在某些实施例中，启动子为CMV启动子。
在某些实施例中，本发明载体也可用于表达可选择标记。合适载体和可选择标记为所属领域中所熟知且讨论于Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley & Sons，1995和Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，(2001)Cold Spring Harbor，N.Y.中。各种不同基因已用作可选择标记，且主要为方便起见，选择在本发明载体中用作可选择标记的特定基因。已知可选择标记基因包括：胸苷激酶基因、二氢叶酸还原酶基因、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因、CAD、腺苷脱氨酶基因、天冬酰胺酸合成酶基因、抗生素抗性基因(例如tetr、ampr、Cmr或cat、kanr或neor(氨基糖苷磷酸转移酶基因))、潮霉素B磷酸转移酶基因等等。
如上所述，所关注多肽可为含有亲和域和/或报导子域的融合蛋白。例如，在GPCR的C或N末端制得报导子或标签与GPCR的融合体的方法完全在所属领域的技术人员的能力范围内(例如McLean等人，Mol.Pharma.Mol Pharmacol.1999 56：1182-91；Ramsay等人，Br.J.Pharmacology，2001，315-323)且不再进一步描述。明确涵盖所述融合蛋白可含有N末端甲硫氨酸残基缺失或经替代氨基酸取代的与GPCR同框融合的异源N末端域(例如抗原决定基标签)。应了解所关注多肽首先可由原生多肽制得且接着可操作性连接至如上所述的合适报导子/标签。
本发明核酸也可含有限制位点、多克隆位点、引物结合位点、可连接末端、重组位点等，通常以便帮助构建编码所关注多肽的核酸。
b.宿主细胞
本发明进一步提供包含载体的宿主细胞，所述载体包含本发明核酸。合适宿主细胞包括原核生物细胞(例如细菌细胞(例如大肠杆菌))以及真核生物细胞(例如动物细胞(例如昆虫、哺乳动物、鱼类、两栖动物、鸟类或爬行动物细胞)、植物细胞(例如玉米或芥菜属(Arabidopsis)细胞)或真菌细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞))。在某些实施例中，适于表达编码所关注多肽的核酸的任何细胞都可用作宿主细胞。通常使用动物宿主细胞株，其实例如下：猴肾细胞(COS细胞)、由SV40转化的猴肾CVI细胞(COS-7，ATCC CRL 1651)、人类胚胎肾细胞(HEK-293[“293”]，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))、HEK-293T[“293T”]细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中华仓鼠卵巢细胞(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77：4216，(1980))、叙利亚黄金仓鼠细胞(Syrian golden hamster cells)MCB3901(ATCC CRL-9595)、小鼠史拖利细胞(mouse sertoli cell)(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))、猴肾细胞(CVI ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人类宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、水牛鼠肝脏细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人类肝脏细胞(hepG2，HB 8065)、小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)、TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci 383：44-68(1982))、NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)和小鼠L细胞(ATCC CCL-1)。在某些实施例中，使用黑素细胞。黑素细胞为在低等脊椎动物中所发现的皮肤细胞。将遵循根据美国专利第5,462,856号和美国专利第6,051,386号的揭示内容的相关物质和方法。这些专利揭示内容以全文引用的方式并入本文中。额外细胞株将对一般技术人员变得显而易见，且多种细胞株可获自美国菌种保藏中心(10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209)。
C.筛检候选化合物
1.通用GPCR筛检检定技术
当G蛋白受体变得具有活性时，其结合至G蛋白(例如Gq、Gs、Gi、Gz、Go)且刺激GTP与G蛋白的结合。G蛋白接着充当GTP酶且将GTP缓慢水解为GDP，由此受体在正常条件下变得失活。然而，激活受体继续将GDP交换为GTP。GTP的不可水解类似物[35S]GTPγS可用于监测表达激活受体的膜的增强结合。据报导[35S]GTPγS可用于监测在配体不存在和存在下偶合至膜的G蛋白。在所属领域所熟知且可使用的其它实例中，此监测的一实例是由Traynor和Nahorski在1995年报导。此检定系统的优选用途是用于初始筛检候选化合物，因为无论与受体的胞内域相互作用的特定G蛋白如何，所述系统通常都适用于所有G蛋白偶合受体。
2.特异性GPCR筛检检定技术
在使用“通用”G蛋白偶合受体检定(意即选择作为激动剂或反向激动剂的化合物的检定)鉴别候选化合物之后，在一些实施例中进一步筛检以确定化合物已在受体位点相互作用是优选的。举例而言，由“通用”检定所鉴别的化合物可能不结合至受体，但可能代之以仅仅“解开”来自胞内域的G蛋白。
Gs、Gz和Gi
Gs刺激酶腺苷酰基环化酶。另一方面，Gi(和Gz与Go)抑制腺苷酰基环化酶。腺苷酰基环化酶催化ATP转化为cAMP，因此偶合Gs蛋白的激活GPCR与cAMP的胞内含量增加相关。另一方面，偶合Gi(或Gz、Go)蛋白的激活GPCR与cAMP的胞内含量降低相关。通常参见“Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission，”第8章， From Neuron To Brain(第3版)Nichols，J.G.等人编，Sinauer Associates，Inc.(1992)。因此，检测cAMP的检定可用于确定候选化合物是否为(例如)受体的反向激动剂(意即所述化合物将降低cAMP含量)。可使用测量cAMP的所属领域中已知的各种方法；在一些实施例中，优选方法依赖于抗cAMP抗体在基于ELISA的格式中的使用。可使用的另一类型检定为全细胞第二信使报导子系统检定。基因上的启动子驱动特定基因所编码的蛋白的表达。环状AMP通过促进cAMP-应答性DNA结合蛋白或转录因子(CREB)的结合来驱动基因表达，所述结合蛋白或转录因子接着在特异性位点结合至被称为cAMP应答元件的启动子且驱动基因表达。可构建报导子系统，其在报导基因(例如β-半乳糖苷酶或荧光素酶)之前具有含有多个cAMP应答元件的启动子。因此，经激活的连接Gs的受体会引起cAMP积聚，其接着激活基因和报导蛋白的表达。接着，可使用标准生化检定(Chen等人，1995)来检测诸如β-半乳糖苷酶或荧光素酶的报导蛋白。
Go和Gq
Gq和Go与酶磷脂酶C的激活作用相关，磷脂酶C接着水解磷脂PIP2，从而释放两种胞内信使：二酰甘油(DAG)和1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)。增加的IP3积聚与Gq和Go相关受体的激活作用相关。通常参见“Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission，”第8章， From Neuron To Brain(第3版)Nichols，J.G.等人编，Sinauer Associates，Inc.(1992)。检测IP3积聚的检定可用于确定候选化合物是否为(例如)Gq或Go相关受体的反向激动剂(意即所述化合物将降低IP3含量)。也可使用AP1报导子检定来检测Gq相关受体，在所述检定中Gq依赖性磷脂酶C引起含AP1元件的基因的激活，因此经激活Gq相关受体将证明所述基因的表达增加，由此其反向激动剂将证明所述表达降低，且激动剂将证明所述表达增加。可使用用于所述检测的市售检定。
3.GPCR融合蛋白
内源组成性活性GPCR或非内源组成性激活GPCR用于筛检直接鉴别反向激动剂或激动剂的候选化合物的用途提供引人注意的筛检挑战，因为根据定义，受体甚至在没有与其结合的内源配体存在下也具有活性。因此，为(例如)区分候选化合物存在下的非内源受体与无所述化合物存在下的非内源受体(所述区分的目的是允许了解所述化合物是否可为反向激动剂或激动剂或对所述受体不具有效应)，在一些实施例中优选使用可增强所述区分的方法。在一些实施例中，优选方法为使用GPCR融合蛋白。
通常，在使用上述检定技术(以及为熟练技术人员已知的其它技术)确定非内源GPCR经组成性激活之后，可能确定与内源GPCR偶合的主要G蛋白。G蛋白与GPCR的偶合提供可评估的信号转导路径。在一些实施例中，优选使用哺乳动物表达系统进行筛检，因为预期所述系统中具有内源G蛋白。因此，根据定义，在所述系统中非内源组成性激活GPCR将持续信号转导。在一些实施例中，此信号优选为增强的，使得在(例如)受体的反向激动剂存在下，更可能能够在受体与反向激动剂接触时更易于区分受体，尤其是在筛检情况下。
GPCR融合蛋白旨在增强与非内源GPCR偶合的G蛋白的功效。对于筛检内源组成性活性GPCR或非内源组成性激活GPCR而言，GPCR融合蛋白是优选的，因为所述方法增加在所述筛检技术中产生的信号。这在促进显著“信号噪声”比方面是重要的；所述显著比率对于筛检如本文所揭示的候选化合物而言是优选的。
适用于表达GPCR融合蛋白的构筑体的构建在一般技术人员的能力范围内。市售表达载体和系统提供可符合研究人员特定需要的多种方法。所述GPCR融合蛋白构筑体的构建中的重要标准包括(但不限于)GPCR序列与G蛋白序列同框(优选为内源GPCR的序列在G蛋白序列上游)以及GPCR的“终止”密码子缺失或经替代以致使得在表达GPCR之后也可表达G蛋白。GPCR可直接连接至G蛋白，或者在两者之间可存在间隔残基(优选不超过约12个，虽然此数目可易于由一般技术人员确认)。基于便利性，优选使用间隔物。在一些实施例中，偶合至非内源GPCR的G蛋白优选在产生GPCR融合蛋白构筑体之前已经鉴别。因为仅很少G蛋白已被鉴别，所以包含G蛋白序列的构筑体(意即通用G蛋白构筑体，参见以下实例5(a))优选可用于在其中插入内源GPCR序列；此在大规模筛检具有不同序列的各种不同内源GPCR的情况下提供更高效率。
如上所述，预期偶合至Gi、Gz和Go的激活GPCR将抑制cAMP形成，使得基于这些类型GPCR的检定具有挑战性[意即cAMP信号在激活之后减少，因此使得(例如)激动剂(其将进一步减少此信号)的直接鉴别具有挑战性]。如本文中所揭示，已确定对于这些类型的受体而言，可能产生不基于GPCR的内源G蛋白的GPCR融合蛋白，其目的为创立可行的基于环化酶的检定。因此，举例而言，偶合内源Gi的受体可融合至Gs蛋白，所述融合构筑体在表达之后可“驱动”或“驱使”内源GPCR与(例如)Gs而非“天然”Gi蛋白偶合，使得可确立基于环化酶的检定。因此，对于偶合Gi、Gz和Go的受体而言，在一些实施例中当使用GPCR融合蛋白且检定是基于腺苷酰基环化酶活性的检测时，以Gs(或刺激酶腺苷酰基环化酶形成的等效G蛋白)创建融合构筑体是优选的。
表B
  G蛋白 在激活GPCR(意即组成性激活或激动剂结合)之后对cAMP产生的影响 在激活GPCR(意即组成性激活或激动剂结合)之后对IP3积聚的影响 在与反向激动剂接触之后对cAMP产生的影响 在与反向激动剂接触之后对IP3积聚的影响
  Gs     增加     N/A     减少     N/A
  Gi     减少     N/A     增加     N/A
  Gz     减少     N/A     增加     N/A
  Go     减少     增加     增加     减少
  Gq     N/A     增加     N/A     减少
使用与Gs、Gi、Gz或Go蛋白融合的Gq蛋白的G蛋白融合构筑体具有相等效率。在一些实施例中，可以Gq蛋白获得优选融合构筑体，其中G蛋白α亚单元(“Gαq”)的最先六(6)个氨基酸缺失且Gαq的C末端的最后五(5)个氨基酸由所关注G蛋白的Gα的对应氨基酸替代。举例而言，融合构筑体可具有与Gi蛋白融合的Gq(6个氨基酸缺失)，从而导致“Gq/Gi融合构筑体”。所述融合构筑体将驱使偶合内源Gi的受体偶合至其非内源G蛋白Gq，使得可测量第二信使(例如三磷酸肌醇或二酰甘油)而非cAMP产生。
以偶合信号增强子Gs的GPCR共转染偶合目标Gi的GPCR(基于cAMP的检定)
已知偶合Gi的受体抑制腺苷酰基环化酶，且因此降低cAMP产生水平，其可使得cAMP含量的评定具有挑战性。在某些实施例中，测量指示在激活时主要偶合Gi的受体的激活作用的cAMP的产生降低的有效技术可通过以Gi连接GPCR共转染信号强化子(例如在激活时主要偶合Gs的非内源组成性激活受体(例如TSHR-A623I；参见上文))来实现。显而易见，可基于cAMP产生的增加来确定偶合Gs的受体的激活作用。偶合Gi的受体的激活作用引起cAMP产生的降低。因此，共转染方法旨在有利地利用这些“相对”影响。举例而言，单独用表达载体共转染非内源组成性激活的偶合Gs的受体(“信号增强子”)可提供基线cAMP信号(意即虽然偶合Gi的受体将降低cAMP含量，但是此“降低”是相对于由组成性激活的偶合Gs的信号增强子所创建的cAMP含量的实质增加)。通过接着用“目标受体”共转染信号增强子，偶合Gi的目标受体的反向激动剂将增加所测量的cAMP信号，而偶合Gi的目标受体的激动剂将降低此信号。
使用此方法直接鉴别的候选化合物应独立评定以确保其不靶向信号增强受体(此可在筛检共转染受体之前或之后进行)。
D.医学化学
候选化合物
可测试所属领域中已知的任何分子调节(增加或降低)本发明GPCR的活性的能力。为鉴别调节活性的化合物，候选化合物可直接提供给表达受体的细胞。
本发明的此实施例非常适于筛检调节(例如抑制、拮抗或促效)受体的量或活性的分子的化学文库。化学文库可为肽文库、肽模拟剂文库、化学合成文库、重组文库(例如噬菌体展示文库)和基于体外翻译的文库、其它非肽合成性有机文库等。本发明的此实施例也非常适于筛检包含生物物质(包括(但不限于)血浆和组织提取物)的内源候选化合物和筛检已知具有生物活性的内源化合物的文库。
在一些实施例中，候选化合物的直接鉴别是结合经由组合化学技术产生的化合物来进行，从而随机制备数千种化合物以用于所述分析。候选化合物可为化学文库的成员。此可包含任何合适数目的个体成员，例如几十至几百至几千至几百万种合适化合物，例如肽、类肽及其它寡聚化合物(环状或线性)以及基于模板的较小分子，例如苯并二氮呯、乙内酰脲、联芳基、碳环和多环化合物(例如萘、吩噻嗪、吖啶、类固醇等)、碳水化合物和氨基酸衍生物、二氢吡啶、二苯甲基和杂环(例如三嗪、吲哚、噻唑烷等)。所述数目和所列化合物类型为例示性而非限制性的。优选化学文库包含低分子量化合物和潜在治疗剂。
例示性化学文库可自若干来源(ArQule、Tripos/PanLabs、ChemDesign、Pharmacopoeia)购得。在一些情况下，使用组合策略产生这些化学文库，所述组合策略编码各文库成员对成员化合物所连接的底物的一致性，因此允许直接和立即鉴别作为有效调节物的分子。因此，在许多组合方法中，化合物平板上的位置说明所述化合物的组成。在一实例中，单一平板位置也可具有1-20种可通过投用给含有所关注相互作用的孔来筛检的化学制剂。因此，如果检测调节作用，则可检定越来越小的相互作用对的集合的调节活性。可以所述方法筛检许多候选分子。
适于使用的许多多样性文库在所属领域中为已知的且可用于提供根据本发明待测试的化合物。或者，可使用标准方法来构建文库。此外，也可使用更一般的结构受限的有机多样性(例如非肽)文库。以实例说明，可使用苯并二氮呯文库(例如参见Bunin等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：4708-4712)。
在本发明的另一实施例中，可使用组合化学来鉴别本发明GPCR的调节物。组合化学能够产生含有几十万种化合物的文库，其中许多文库可在结构上类似。虽然高产量筛检程序能够筛检这些巨大文库对已知目标的亲和力，但是已开发出达成具有较小规模但提供最大化学多样性的文库的新颖方法。(例如参见Matter，1997，Journal of MedicinalChemistry 40：1219-1229)。
一种组合化学方法(亲和力指纹法)先前已用于测试小分子离散文库对界定蛋白组的结合亲和力。通过筛检所获得的指纹可用于预测个别文库成员对所关注的其它蛋白或受体(在本发明中为本发明的受体)的亲和力。将指纹与获自己知与所关注蛋白反应的其它化合物的指纹相比较以预测文库化合物是否可类似地反应。举例而言，并非测试大文库中的每个配体与复合物或蛋白组份的相互作用，而是测试与已知具有所述活性的其它化合物具有类似指纹的那些配体。(例如参见Kauvar等人，1995，Chemistry and Biology2：107-118；Kauvar，1995，Affinity fingerprinting，Pharmaceutical ManufacturingInternational.8：25-28；以及Kauvar，Toxic-Chemical Detection by Pattern Recognition inNew Frontiers in Agrochemical Immunoassay，D.Kurtz.、L.Stanker和J.H.Skerritt编辑，1995，AOAC：Washington，D.C.，305-312)。
经鉴别为调节物的候选化合物
所述筛检的结果通常为具有独特核心结构的化合物；其后，这些化合物可经受优选核心结构周围的额外化学修饰以进一步增强其医学特性。所述技术为所属领域的技术人员已知且不在本专利文献中详细说明。
在某些实施例中，所述经鉴别调节物具有生物可用性。已开发一般技术人员可使用的多种计算方法以预测药物的口服生物可用性[Ooms等人，Biochim Biophys Acta(2002)1587：118-25；Clark & Grootenhuis，Curr OpinDrug Discov Devel(2002)5：382-90；Cheng等人，J Comput Chem(2002)23：172-83；Norinder & Haeberlein，Adv Drug Deliv Rev(2002)54：291-313；Matter等人，Comb Chem High Throughput Screen(2001)4：453-75；Podlogar &Muegge，Curr Top Med Chem(2001)1：257-75，其揭示内容各自以全文引用的方式并入本文中]。此外，许多群组已成功使用正电子放射断层摄影法(PET)来获得口服药物的哺乳动物体(包括非人类灵长类动物和人体)中药物分布的直接测量(包括口服生物可用性的评定)[Noda等人，J Nucl Med(2003)44：105-8；Gulyas等人，Eur J Nucl Med MolImaging(2002)29：1031-8；Kanerva等人，Psychopharmacology(1999)145：76-81，其揭示内容各自以全文引用的方式并入本文中]。另见下文，包括实例25。
在某些实施例中，所述生物可用性经鉴别调节物进一步能够穿过血脑障壁。已开发一般技术人员可使用的多种计算方法以预测血脑障壁的渗透[Ooms等人，BiochimBiophys Acta(2002)1587：118-25；Clark & Grootenhuis，Curr OpinDrug Discov Devel(2002)5：382-90；Cheng等人，J Comput Chem(2002)23：172-83；Norinder & Haeberlein，Adv DrugDeliv Rev(2002)54：291-313；Matter等人，Comb Chem High Throughput Screen(2001)4：453-75；Podlogar & Muegge，Curr Top Med Chem(2001)1：257-75，其揭示内容各自以全文引用的方式并入本文中]。已开发多种体外方法以预测药物的血脑障壁渗透性[Lohmann等人，J Drug Target(2002)10：263-76；Hansen等人，J Pharm Biomed Anal(2002)27：945-58；Otis等人，J Pharmocol Toxicol Methods(2001)45：71-7；Dehouck等人，JNeurochem(1990)54：1798-801，其揭示内容各自以全文引用的方式并入本文中]。此外，已开发多种策略以增强穿过血脑障壁的药物传递[Scherrmann，Vascul Pharmacol(2002)38：349-54；Pardridge，Arch Neurol(2002)59：35-40；Pardridge，Neuron(2002)36：555-8，其揭示内容各自以全文引用的方式并入本文中]。最终，许多群组已成功使用正电子放射断层摄影法(PET)来获得哺乳动物体内(包括非人类灵长类动物和人体)药物分布的直接测量(包括大脑内)[Noda等人，J Nucl Med(2003)44：105-8；Gulyas等人，Eur J NuclMed Mol Imaging(2002)29：1031-8；Kanerva等人，Psychopharmacology(1999)145：76-81，其揭示内容各自以全文引用的方式并入本文中]。另见下文，包括实例26。
E.本发明化合物
本发明的一方面涉及式(II)的化合物：
Figure A20058001873001041
或其医药学上可接受的盐，
其中：
R1为H或C1-6烷基；
R2为2-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-吲唑-3-基；或
R1和R2连同其所键结的氮形成3，4-二氢-2H-喹啉-1-基；且
R10和R11各自独立地为H或卤素。
F.用于制备本发明化合物的合成方法
本发明化合物的制备一一般合成方法
本发明的新颖化合物可易于根据各种合成方法来制备，所述方法都为所属领域的技术人员所熟悉。用于制备本发明化合物的某些方法包括(但不限于)下文流程1-3中所述的那些方法。
如流程1所示，可制备新颖2-哌啶-4-基-噻唑的中间物(AD)。在氮处受合适保护基(意即PG)保护的硫代酰胺(AA)通过与在羧酸处受到保护的3-卤基-2-氧代-丙酸(AB)发生类Hantzsch反应而得以环化，从而生成经二保护的2-哌啶-4-基-噻唑(AC)。两个保护基通常不同。例如，适用于环化作用的溶剂包括醇类(例如甲醇、乙醇和丙醇)、低碳卤代烃(例如二氯甲烷、二氯乙烷和氯仿)、DMF等等。环化作用的反应温度可在约室温至约所用溶剂的沸点的范围内；所述温度范围通常为约50℃至约90℃。
适用于硫代酰胺(AA)的保护基包括氨基甲酸叔丁酯(BOC)、氨基甲酸苯甲酯(Cbz)、氨基甲酸对甲氧基苯甲酯(Moz)等等。可使用各种方法来保护硫代酰胺(AA)的氮。例如，可在约0℃至约50℃的温度下在合适溶剂(THF、CH3CN、DMF、EtOH、MeOH、H2O或其混合物)中使用各种试剂(例如(BOC)2O)由合适的碱(例如NaOH、KOH或Me4OH)引入氨基甲酸叔丁酯基团。
适用于3-卤基-2-氧代-丙酸(AB)的保护基包括烷基酯(例如甲基、乙基、丙基和叔丁基)、经取代的甲基酯(例如甲氧基甲基、甲氧乙氧基甲基和苯甲氧基甲基)、视情况经取代的苯甲基酯(例如苯甲基、4-甲氧基苯甲基和2，6-二甲氧基苯甲基)等等。一种特别适用的经保护3-卤基-2-氧代-丙酸(AB)为3-溴-2-氧代-丙酸乙酯，其通常也称作溴丙酮酸乙酯。
适用于各种合成转化的其它代表性保护基揭示于Greene和Wuts的ProtectiveGroups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons，New York，1999中，其揭示内容以全文引用的方式并入本文中。
为简便起见，选择2-哌啶-4-基-噻唑(AC)中的两个保护基，使得一个保护基实质上可在并未实质上影响另一保护基的情况下移除。这种类型的策略被称作正交保护。一个实例包括用BOC基团保护氮且将羧酸保护为甲酯或乙酯。在此实例中，可在并未实质上影响酯基的情况下在酸性条件下移除BOC基团。或者，由于BOC基团在碱性条件下并未实质上水解，所以可在并未实质上影响BOC基团的情况下移除酯。所属领域中已知多种正交保护流程且其可用于本文中。
随后，如流程1所示，在实质上保持羧酸保护的情况下移除(意即去保护)2-哌啶-4-基-噻唑(AC)的氮保护基以生成常见中间物(AD)。在由BOC基团保护氮的情况下，可在酸存在下且视情况在合适溶剂存在下达成有效裂解。合适的酸包括HCl(水溶液或无水)、HBr(水溶液或无水)、H2SO4、三氟乙酸、对甲苯磺酸等等。在存在溶剂时，合适的溶剂包括酯溶剂(例如乙酸乙酯)、烷基醇(例如甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇和正丁醇)、醚性溶剂(例如四氢呋喃和二噁烷)等等或混合物。可视情况加入净化剂以捕获所释放的阳离子。合适的净化剂包括苯硫酚、苯甲醚、苯硫基甲烷、甲苯硫酚、甲酚、甲硫醚等等。用于2-哌啶-4-基-噻唑(AC)中的氮的去保护的反应温度范围可在约-20℃至约所用溶剂的沸点的范围内；通常所述温度范围为约-10℃至约50℃。
流程1
Figure A20058001873001061
如流程2方法A所说明，无论是否存在碱，在脱水缩合剂和惰性溶剂存在下使中间物(AD)与羧酸偶合以提供酰胺(AE)。合适的脱水缩合剂包括二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、溴-三吡咯烷-磷六氟磷酸盐(PyBroP)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、1-环己基-3-甲基聚苯乙烯-碳二亚胺等等。合适的碱包括叔胺(例如N，N-二异丙基-乙胺、N-甲基吗啉和三乙胺)。合适的惰性溶剂包括低碳卤代烃溶剂(优选为二氯甲烷、二氯乙烷和氯仿)、醚性溶剂(例如四氢呋喃和二噁烷)、腈溶剂(例如乙腈)、酰胺溶剂(例如N，N-二甲基甲酰胺和N，N-二甲基乙酰胺)或其混合物。视情况，其它试剂可用于偶合反应中且所述试剂包括1-羟基苯并三唑(HOBT)、HOBT-6-氨甲酰基甲基聚苯乙烯、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAT)等等。合适的反应温度在约-25℃至约60℃的范围内，且在约0℃至约35℃的范围内。
流程2
或者，如流程2方法B所示，可在碱和惰性溶剂存在下使用酰基卤由中间物(AD)通过酰胺化反应来获得酰胺(AE)。合适的酰基卤包括酰基氯或酰基溴。合适的碱包括碱金属碳酸盐(例如碳酸钠和碳酸钾)、碱金属碳酸氢盐(例如碳酸氢钠和碳酸氢钾)、碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠和氢氧化钾)、叔胺(例如N，N-二异丙基乙胺、三乙胺和N-甲基吗啉)和芳族胺(例如吡啶、咪唑和聚-(4-乙烯基吡啶))。合适的惰性溶剂包括低碳卤代烃溶剂(例如二氯甲烷、二氯乙烷和氯仿)、醚性溶剂(例如四氢呋喃和二噁烷)、酰胺溶剂(例如N，N-二甲基甲酰胺和N，N-二甲基乙酰胺)和芳族溶剂(例如甲苯、苯和吡啶)。合适的反应温度在约-25℃至约55℃、优选为约-5℃至约40℃的范围内。
如流程3所示，移除酰胺(AE)中的受保护酸基以生成相应羧酸。适用于羧酸去保护的方法为所属领域的一般技术人员所知。例如，烷基酯(例如甲基、乙基和正丙基)可在碱存在下在合适溶剂中经由水解而转化为羧酸。合适的碱包括碱金属碳酸盐(例如碳酸钠和碳酸钾)、碱金属碳酸氢盐(例如碳酸氢钠和碳酸氢钾)和碱金属氢氧化物(例如氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钾)。适用于去保护的溶剂包括烷基醇类(例如甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇和正丁醇)、醚性溶剂(例如四氢呋喃和二噁烷)等等或其混合物，优选在H2O存在下进行水解。用于酰胺(AE)中的酸基去保护的反应温度可在约室温至约所用溶剂的沸点的范围内；所述温度范围通常为约50℃至约90℃。酯以及其它额外的合适保护基的其它去保护方法描述于Greene和Wuts，Protective Groups inOrganic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons，New York，1999，上文中。分别使羧酸(AF)与甲基-(2-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-吲唑-3-基)-胺或1，2，3，4-四氢-喹啉偶合以生成式(AG)和(AH)的化合物。通常，无论碱是否存在，可在脱水缩合剂和惰性溶剂存在下进行偶合，或者可在碱和惰性溶剂存在下使用由羧酸(AF)产生的酰基卤通过酰胺化反应进行偶合，各方法都如上文流程2所述。
流程3
Figure A20058001873001081
本发明的-些实施例包括如下文所示表1中说明的化合物。
表1
Figure A20058001873001082
G.医药组合物
本发明提供通过向需要治疗(或预防)的个体投用治疗有效量的本发明调节物来进行所述治疗(和预防)的方法[另外，例如参见在2002年8月29日作为WO 02/066505公开的PCT申请案第PCT/IB02/01461号，其揭示内容各以全文引用的方式并入本文中]。在优选方面，调节物为激动剂。在优选方面，调节物实质上经纯化。所述个体优选为动物，其包括(但不限于)例如牛、猪、马、鸡、非人类灵长类动物、猫、狗、兔、大鼠、小鼠等的动物，且优选为哺乳动物，且最优选为人类。
可使用所属领域中熟知的技术将本发明调节物单独或在其与合适载剂或赋形剂混合的医药组合物或生理学上可接受的组合物中投用给非人类动物[参见下文实例]和/或人类。所属领域的技术人员可获得合适的医药学上可接受的载剂，例如参见Remington’sPharmaceutical Sciences，第16版，1980，Mack Publishing Co.(Oslo等人编)。
接着以治疗有效剂量提供医药组合物或生理学上可接受的组合物。治疗有效剂量是指如以实例说明所确定且不受本文所述方法限制，足以导致病症的症状或生理学状态得到预防或改善的调节物的量，其中病症的症状或生理学状态的预防或改善包括(但不限于)降低血糖浓度、预防或治疗特定代谢病症(例如胰岛素抗性、葡萄糖耐受性异常和糖尿病)以及预防或治疗血糖浓度升高并发症(例如动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压和周边血管疾病)。
显然认为本发明调节物可单独提供或与其它医药学或生理学上可接受的化合物组合提供。目前，所属领域中熟知用于治疗本发明病症的其它化合物，其中本发明病症的治疗包括(但不限于)降低血糖浓度、预防或治疗特定代谢病症(例如胰岛素抗性、葡萄糖耐受性异常和糖尿病)以及预防或治疗血糖浓度升高并发症(例如动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压和周边血管疾病)。本发明的一方面涵盖根据本文所揭示实施例的用途，所述实施例进一步包含一种或一种以上选自由下列各物组成的群组的药剂：磺酰脲(例如格列本脲(glibenclamide)、格列甲嗪(glipizide)、格列齐特(gliclazide)、谷胱甘肽(glimepiride))、美格替耐(meglitinide)(例如瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(nateglinide))、双胍(例如二甲双胍(metformin))、α-葡糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖(acarbose)、依帕司他(epalrestat)、米格列醇(miglitol)、伏格列波糖(voglibose))、噻唑烷二酮(例如罗格列酮(rosiglitazone)、吡格列酮(pioglitazone))、胰岛素类似物(例如赖脯胰岛素(insulin lispro)、门冬胰岛素(insulin aspart)、甘精胰岛素(insulinglargine))、吡啶甲酸铬(chromium picolinatefoiotin)和生物药剂(例如脂联素(adiponectin)或其包含C末端球状域的片段，或其脂联素或所述片段的多聚物；或脂联素受体AdipoRl或AdipoR2的激动剂，优选其中所述激动剂具有口服生物可用性)。此外，明确涵盖本发明调节物(例如本发明的激动剂和部分激动剂)可单独提供或与磷酸二酯酶(PDE)抑制剂(包括4型cAMP特异性PDE(PDE4)的选择性抑制剂，例如罗氟司特；PDE4B的选择性抑制剂；和PDE4B2的选择性抑制剂)组合提供。
在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：葡萄糖耐受性异常、胰岛素抗性、高胰岛素血症和糖尿病。在一些实施例中，糖尿病为l型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为l型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
在某些实施例中，血糖浓度升高并发症选自由下列病症组成的群组：综合症X、动脉粥样硬化、动脉粥样化疾病、心脏病、高血压、中风、神经病、视网膜病、肾病和周边血管疾病。心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
投药途径
合适投药途径包括使用所属领域中已知的方法经口、经鼻、经直肠、经粘膜、经皮或经肠投药、非经肠传递(包括肌肉内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、肺内(吸入)或眼内注射)。其它尤其优选的投药途径为气雾剂和储槽调配物。明确涵盖所发明药物的持续释放调配物(尤其为储槽)。在某些实施例中，投药途径为口服。
组合物/调配物
可使用一种或一种以上生理学上可接受的载剂(包含赋形剂和助剂)，以常规方式调配根据本发明使用的医药或生理学上可接受的组合物和药物。合适调配视所选投药途径而定。
某些本文所述的药物将包括医药学或生理学上可接受的载剂和至少一种本发明调节物。为进行注射，可在水溶液中、优选在生理学上可相容的缓冲液(诸如汉克氏溶液(Hanks’s solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理盐水缓冲液(诸如磷酸盐或碳酸氢盐缓冲液))中调配本发明药剂。为经粘膜投药，在调配物中使用适于待渗透障壁的渗透剂。所述渗透剂通常为所属领域中已知的。
可口服的医药制剂或生理学上可接受的制剂包括由明胶制得的配合插入胶囊，以及由明胶和增塑劑(诸如甘油或山梨醇)制得的软质密封胶囊。配合插入胶囊可含有与填充剂(诸如乳糖)、粘合剂(诸如淀粉)和/或润滑剂(诸如滑石或硬脂酸镁)以及视情况与稳定剂混合的活性成份。在软质胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮于合适液体(诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇)中。此外，可加入稳定剂。用于口服的所有调配物都应呈适于所述投药的剂量形式。
为经口腔投药，组合物可采用以常规方式调配的片剂或锭剂形式。
为通过吸入投药，根据本发明使用的化合物便于以气雾剂喷雾呈现形式自雾化器的加压包传递，其中使用合适的气态推进剂(例如二氧化碳)。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门以传递定量来确定剂量单位。用于吸入器或吹入器中的(例如)明胶胶囊和药筒可调配成含有所述化合物与合适的粉末基剂(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
所述化合物可调配成通过注射(例如通过快速注射或连续输注)来非经肠投药。用于注射的调配物可以单位剂量呈现以用于(例如)具有附加防腐剂的安瓿或多剂量容器中。组合物可采用诸如在水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式，且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的调配剂。
用于非经肠投药的医药调配物或生理学上可接受的调配物包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。水性悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。悬浮液也可视情况含有增加化合物溶解性以允许制备高浓度溶液的合适稳定剂或药剂。
或者，活性成份可呈现为在使用前以合适媒剂(例如无菌无热原质水)复水的粉末或冻干形式。
除先前所述的调配物外，化合物也可调配成储槽制剂。可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过静脉内注射来投用所述长效调配物。因此，举例而言，可用合适的聚合或疏水物质(例如调配为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂调配化合物或将其调配为微溶性衍生物(例如微溶性盐)。
在特定实施例中，可经由控制释放系统传递化合物。在一实施例中，可使用泵(Langer，上文；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：20l-240；Buchwald等人，1980，Surgery 88：507-516；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321：574-579)。在另一实施例中，可使用聚合物质(Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise编，CRC Press，Boca Raton，Florida，1974；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen和Ball编，Wiley，New York，1984；Ranger和Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：6l；Levy等人，1985，Science 228：190-192；During等人，1989，Ann.Neurol.25：35l-356；Howard等人，1989，J.Neurosurg.7l：858-863)。其它控制释放系统由Langer(1990，Science 249：1527-1533)在综述中讨论。
此外，也可使用持续释放系统(诸如含有治疗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质)传递化合物。已确定各种持续释放物质且其为所属领域的技术人员所熟知。视化学性质而定，持续释放胶囊可释放化合物历时数周至长达100天以上。
视治疗试剂的化学性质和生物稳定性而定，可使用调节物稳定化作用的额外策略。
医药组合物或生理学上可接受的组合物也可包含合适的固相或凝胶相载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂的实例包括(但不限于)碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物(诸如聚乙二醇)。
有效剂量
适用于本发明的医药组合物或生理学上可接受的组合物包括其中含有有效量的活性成份以达成其预定目的的组合物。更特定言之，治疗有效量表示可有效预防所治疗受检者的现有症状发展或缓解所述症状的量。对有效量的判定在所属领域的技术人员的能力范围内，尤其是根据本文所提供的详细揭示内容。
对于本发明方法中所用的任何化合物而言，治疗有效剂量起初可根据细胞培养检定进行评估。举例而言，可在动物模型中调配剂量以达成包括或涵盖显示为刺激细胞中的葡萄糖摄取、预防或治疗特定代谢病症或预防或治疗血糖浓度升高并发症的浓度点或范围的循环浓度范围。[见下文关于体外检定和体内动物模型的实例]。所述信息可用于更准确地判定人类的适用剂量。
治疗有效剂量是指导致患者症状改善的化合物的量。可在细胞培养物或实验动物中以标准医药程序来确定所述化合物的毒性和治疗功效，例如用于确定LD50(致死50％测试群体的剂量)和ED50(在50％测试群体中治疗有效的剂量)。毒性效应与治疗效应的剂量比为治疗指数且其可表示为LD50与ED50的比率。优选为呈现高治疗指数的化合物。
自所述细胞培养检定和动物研究获得的资料可用于调配用于人类的多种剂量。所述化合物的剂量优选处于包括ED50的循环浓度范围内，其具有很少毒性或无毒性。视所用剂型和所用投药途径而定，剂量可在此范围内变化。精确配方、投药途径和剂量可由主治医师根据患者情况来选择。(例如参见Fingl等人，1975，“The Pharmacological Basisof Therapeutics”，第1章)。
视特定情形而定，可个别调节剂量和间隔以提供足以预防或治疗本发明病症的活性化合物的血浆含量。达成这些效应所需的剂量将视个体特征和投药途径而定。
也可使用最低有效浓度的值来确定剂量间隔。应使用当时维持血浆含量高于最低有效浓度达10-90％、优选介于30与99％之间且最优选介于50与90％之间的方案来投用化合物。在局部投药或选择性摄取的状况下，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。
所投用组合物的量当然将视所治疗的受检者、受检者体重、病患严重性、投药方式和主治医师的判断而定。
本发明调节物的量的优选剂量范围为0.1-100mg/kg身体质量，所述剂量范围可基于每日或常规基础来投用以达成所要结果。另一优选剂量范围为0.1-30mg/kg身体质量。另一优选剂量范围为0.1-10mg/kg身体质量。另一优选剂量范围为0.1-3.0mg/kg身体质量。当然，这些每日剂量可在一天之中以少量周期性传递或投用。应注意这些剂量范围仅为优选范围且并不表示对本发明构成限制。所述所要结果包括(但不限于)：降低血糖浓度；预防或治疗某些代谢病症，例如胰岛素抗性、葡萄糖耐受性异常和糖尿病；以及预防或治疗血糖浓度升高并发症，例如动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压和周边血液疾病。
H.治疗方法
本发明尤其涉及下列方法，其包括(但不限于)降低血糖浓度的方法、预防或治疗某些代谢病症(例如胰岛素抗性和糖尿病)的方法和预防或治疗血糖浓度升高并发症(例如动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压和周边血管疾病)的方法，其包含将本发明调节物提供给需要所述治疗的个体。在某些实施例中，调节物为激动剂。在一些实施例中，所述调节物具有口服生物可用性。在一些实施例中，所述口服生物可用调节物进一步能够穿过血脑障壁。在某些实施例中，将调节物以医药组合物或生理学上可接受的组合物形式提供给个体。在某些实施例中，将调节物以医药组合物形式提供给个体。在某些实施例中，将调节物以生理学上可接受的组合物形式提供给个体。在某些实施例中，将调节物以口服的医药组合物或生理学上可接受的组合物形式提供给个体。在某些实施例中，所述个体为非人类哺乳动物。在某些实施例中，所述个体为哺乳动物。在某些实施例中，所述个体或哺乳动物为人类。
在某些实施例中，代谢病症选自由下列病症组成的群组：葡萄糖耐受性异常、胰岛素抗性、高胰岛素血症和糖尿病。在一些实施例中，糖尿病为1型糖尿病。在某些优选实施例中，糖尿病为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为1型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为2型糖尿病。在某些实施例中，代谢病症为葡萄糖耐受性异常。在某些实施例中，代谢病症为胰岛素抗性。在某些实施例中，代谢病症为高胰岛素血症。在某些实施例中，代谢病症与个体中血糖浓度升高有关。
在某些实施例中，血糖浓度升高并发症选自由下列病症组成的群组：综合症X、动脉粥样硬化、动脉粥样化疾病、心脏病、高血压、中风、神经病、视网膜病、肾病和周边血管疾病。心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。在某些实施例中，并发症为综合症X。在某些实施例中，并发症为动脉粥样硬化。在某些实施例中，并发症为动脉粥样化疾病。在某些实施例中，并发症为心脏病。在某些实施例中，并发症为心功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉功能不全。在某些实施例中，并发症为冠状动脉疾病。在某些实施例中，并发症为高血压(high bloodpressure)。在某些实施例中，并发症为高血压(hypertension)。在某些实施例中，并发症为中风。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为视网膜病。在某些实施例中，并发症为神经病。在某些实施例中，并发症为周边血管疾病。在某些实施例中，并发症为多囊卵巢综合症。在某些实施例中，并发症为高脂质血症。
I.其它效用
可通过使候选化合物与RUP43受体接触且确定候选化合物对RUP43受体功能性的影响来鉴别调节(意即增加、降低或阻断)RUP43受体功能性的药剂。可通过将调节RUP43受体功能性的化合物对RUP43受体的影响与所述化合物对其它G蛋白偶合受体的影响相比较来评估所述化合物的选择性。以实例说明而非限制，内源RUP43受体的调节物与一种或一种以上来自相同物种的其它内源G蛋白偶合受体相比较显示出具有选择性。以实例说明而非限制，如果内源RUP43受体的激动剂关于内源RUP43受体的EC50比所述激动剂关于来自相同物种的一种或一种以上其它内源G蛋白偶合受体的EC50低至少100倍，则所述激动剂可显示为选择性RUP43激动剂。在鉴别调节RUP43受体功能性的化合物之后，可在其它检定(包括(但不限于)体内模型)中进一步测试所述候选化合物以便确认或量化其活性。RUP43受体功能性的调节物在治疗上适用于治疗其中涉及正常或异常RUP43受体功能性的疾病和生理病状。
通过使候选化合物与RUP43受体接触且确定所述候选化合物是否结合至RUP43受体可鉴别作为RUP43受体的配体的药剂。结合RUP43受体的化合物的选择性可通过将其对RUP43受体的结合与其对其它受体的结合相比较来进行评估。以实例说明而非限制，内源RUP43受体的配体与一种或一种以上来自相同物种的其它内源G蛋白偶合受体相比较可显示出具有选择性。作为RUP43受体功能性的调节物的配体在治疗上适用于治疗其中涉及正常或异常RUP43受体功能性的疾病和生理病状。
本发明也涉及鉴别为RUP43受体的调节物或配体的本发明化合物的经放射性同位素标记的型式，其不仅适用于放射成像，而且适用于定位且量化组织样品(包括人类)中的RUP43受体以及通过抑制经放射性同位素标记的化合物的结合来鉴别RUP43受体配体的体外和体内检定中。本发明的另一目的是开发包含所述经放射性同位素标记的化合物的新颖RUP43受体检定。
本发明涵盖经鉴别为RUP43受体的调节物或配体的本发明化合物的经放射性同位素标记的型式。
本发明也涉及适用于检测结合至RUP43受体的配体的测试配体的经放射性同位素标记的型式。在一些实施例中，本发明明确涵盖适用于检测结合至RUP43受体的配体的所述经放射性同位素标记的测试配体的文库。在某些实施例中，所述文库包含至少约10、至少约102、至少约103、至少约105或至少约106种所述经放射性同位素标记的测试化合物。本发明的另一目的是开发包含所述经放射性同位素标记的测试配体的新颖RUP43受体检定。
在一些实施例中，化合物的经放射性同位素标记的型式与所述化合物相同，但实际上一个或一个以上原子由具有与自然界中一般所发现(意即天然产生)的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子置换或取代。可并入本发明化合物中的合适放射性核素包括(但不限于)2H(氘)、3H(氚)、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、18F、35S、36Cl、82Br、75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I和131I。并入本发明经放射性标记化合物中的放射性核素将视所述经放射性标记化合物的特定应用而定。举例而言，对于体外RUP40受体标记和竞争检定而言，并入3H、14C、82Br、125I、131I、35S的化合物通常将最为适用。对于放射成像应用而言，11C、18F、125I、123I、124I、131I、75Br、76Br或77Br通常将最为适用。在一些实施例中，放射性核素选自由3H、11C、18F、14C、125I、124I、131I、35S和82Br组成的群组。
将放射性同位素并入有机化合物中的合成方法适用于本发明化合物且在所属领域中为人所熟知。例如，将放射性水平的氚并入目标分子中的这些合成方法如下所示：
A.用氚气催化还原-此程序通常得到高比放射性产物且需要卤化或不饱和前驱物。
B.用硼氢[3H]化钠还原-此程序非常廉价且需要含有可还原官能基(诸如醛、酮、内酯、酯等等)的前驱物。
C.用氢化铝锂[3H]还原-此程序提供几乎具有理论比放射性的产物。其也需要含有可还原官能基(诸如醛、酮、内酯、酯等等)的前驱物。
D.氚气曝露标记-此程序包括在合适催化剂存在下将含有可交换质子的前驱物曝露于氚气下。
E.使用甲基碘[3H]进行N-甲基化-此程序通常通过以高比放射性甲基碘(3H)处理适当前驱物而用于制备O-甲基或N-甲基(3H)产物。此方法大体而言允许较高比放射性，例如约70-90 Ci/mmol。
将放射性水平的125I并入目标分子中的合成方法包括：
A.Sandmeyer和类似反应-此程序将芳基胺或杂芳基胺转化为重氮盐(诸如四氟硼酸盐)且随后使用Na125I将其转化为经125I标记的化合物。代表程序由Zhu，D.-G.及其合作者在J.Org.Chem.2002，67，943-948中报导。
B.苯酚的邻位125碘化-此程序允许在苯酚邻位上并入125I，如Collier，T.L.及其合作者在J.Labeled Compd Radiopharm.1999，42，S264-S266中所报导。
C.用125I交换芳基溴和杂芳基溴-此方法通常为两步方法。第一步是在三烷基卤化锡或六烷基二锡[例如(CH3)3SnSn(CH3)3]存在下，使用(例如)Pd催化反应[意即Pd(Ph3P)4]或通过芳基锂或杂芳基锂，将芳基溴或杂芳基溴转化为对应的三烷基锡中间物。代表程序由Bas，M.-D.及其合作者在J.Labeled Compd Radiopharm.2001，44，S280-S282中报导。
在一些实施例中，化合物的经放射性同位素标记的型式与所述化合物相同，但添加有一个或一个以上包含放射性核素的取代基。在一些其它实施例中，化合物为多肽。在一些其它实施例中，化合物为抗体或其抗原结合片段。在一些其它实施例中，所述抗体为单克隆抗体。合适的所述放射性核素包括(但不限于)2H(氘)、3H(氚)、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、18F、35S、36Cl、82Br、75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I和131I。并入本发明经放射性标记化合物中的放射性核素将视所述经放射性标记化合物的特定应用而定。举例而言，对于体外RUP43受体标记和竞争检定而言，并入3H、14C、82Br、125I、131I、35S的化合物通常将最为适用。对于放射成像应用而言，11C、18F、125I、123I、124I、131I、75Br、76Br或77Br通常将最为适用。在一些实施例中，放射性核素是选自由3H、11C、18F、14C、125I、124I、131I、35S和82Br组成的群组。
添加一个或一个以上包含放射性核素的取代基的方法在熟练技术人员的能力范围内且包括(但不限于)以酶促方法[Marchalonic JJ，Biochemical Journal(1969)113：299-305；Thorell JI和Johansson BG，Biochimica et Biophysica Acta(1969)251：363-9；其各自揭示内容以全文引用的方式并入本文中]和/或以氯胺-T/Iodogen/Iodobead方法[Hunter WM和Greenwood FC，Nature(1962)194：495-6；Greenwood FC等人，Biochemical Journal(1963)89：114-23；其各自揭示内容以全文引用的方式并入本文中]添加放射性同位素碘。
尤其基于本专利文献的综述，所揭示受体和方法的其它用途将对所属领域的技术人员变得显而易见。
实例
呈现以下实例以用于阐述而非限制本发明。虽然本文揭示特定核酸和氨基酸序列，但相信所属领域的一般技术人员具有对这些序列进行微小修饰同时达成下文所报导的相同或实质上类似的结果的能力。所述经修改方法被视为在本揭示案的范围内。
提供以下实例以达成说明目的而非一种限制手段。所属领域的一般技术人员将能够基于本文的揭示内容来设计等效检定和方法，其共同形成本发明的部分。
例如，与本发明主旨相关且为所属领域的一般技术人员所熟知的重组DNA技术可见于Maniatis T等人， Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989)Cold Spring HarborLaboratory；美国专利第6,399,373号；和在2002年8月29日作为WO 02/066505公开的PCT申请案第PCT/IB02/01461号中，其各自揭示内容以全文引用的方式并入本文中。
实例1
人类GPCR的全长克隆
内源人类RUP43(SEQ ID NO：1和2)
如本文所述，可克隆编码全长内源人类RUP43(GPR131，例如GenBank入藏登记号NM_170699)的多核苷酸序列。SEQ ID NO：1是可如本文所述进行克隆的内源人类RUP43(GPR131)多核苷酸编码序列。SEQ ID NO：2是对应的经编码的内源人类RUP43(GPR131)多肽。
使用Platinum PCR SuperMix(Invitrogen目录号11306-016)和特异性引物5′-GACAAGCATGACGCCCAACAGCACTGGCGAG-3′(5′-引物；SEQ ID NO：3)与5′-CTTGAATTAGTTCAAGTCCAGGTCGACACTGC-3′(3′-引物；SEQ ID NO：4)以及作为模板的人类DNA，通过PCR来克隆全长内源人类RUP43。人类DNA可为基因组DNA或cDNA。所用的循环条件为以下过程的25个循环：95℃，40秒；60℃，50秒；和72℃，1分钟。将1.0 kb PCR产物克隆到pCRII-TOPOTM载体(Invitrogen)中。
经HA/V5His双标记的内源人类RUP43(SEQ ID NO：5和6)
如本文所述，克隆编码全长内源人类RUP43(GPR131)多肽(缺乏N末端甲硫氨酸)的多核苷酸，其具有N末端HA抗原决定基标签和安置于C末端的V5His抗原决定基标签。“HA”抗原决定基标签包含氨基酸序列MYPYDVPDYA。“V5”包含氨基酸序列GKPIPNPLLGLDST；“His”包含氨基酸序列HHHHHH。SEQ ID NO：5是具有5′-末端HA抗原决定基标签和3′-末端V5His抗原决定基标签的内源人类RUP43(GPR131)多核苷酸编码序列(缺乏编码N末端甲硫氨酸的密码子)。SEQ ID NO：6是对应的经编码的经HA/V5His双标记的RUP43多肽。
使用EST克隆(MAGE#5221127，GenBank入藏登记号BC033625)作为模板且使用pfu聚合酶(Stratagene)来执行PCR，其中由制造商提供补充有10％DMSO、0.25μM各引物和0.5mM各4种核苷酸的缓冲液系统。循环条件为以下过程的25个循环：95℃，40秒；60℃，50秒；和72℃，1分钟40秒。5′PCR引物并入HindIII位点且具有下列序列：
5′-GACAAGCTTGACGCCCAACAGCACTGGCGAG-3′(SEQ ID NO：7)。
3′PCR引物并入EcoRI位点且具有下列序列：
5′-CTTGAATTCGTTCAAGTCCAGGTCGACACTGC-3′(SEQ ID NO：8)。
用HindIII和EcoRI消化1.0kb PCR产物且将其克隆到经5′HA/3′V5His双标记的pCMV表达载体中。
实例2
非内源组成性激活人类RUP43的制备
相信所属领域的技术人员具有选择核酸序列突变技术的能力。下文呈现可用于产生人类GPCR的非内源型式的方法。本文所揭示的关于内源人类RUP43(GPR131)的突变是基于算法逼近，由此在保守脯氨酸(或其内源保守取代)残基(位于GPCR的TM6区，接近TM6/IC3界面)的N末端的第16个氨基酸(位于GPCR的IC3区中)优选突变为组氨酸、精氨酸或赖氨酸氨基酸残基，最佳突变为赖氨酸氨基酸残基。
以实例说明而非限制，可通过在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223使丙氨酸优选突变为赖氨酸而制备内源人类RUP43(GPR131)的非内源组成性激活型式。
1.Transformer Site-DirectedTM Mutagenesis
根据制造商说明书尤其使用Transformer Site-DirectedTM Mutagenesis试剂盒(Clontech)，可在人类GPCR上完成非内源人类GPCR的制备。使用两种突变诱发引物，最佳为产生赖氨酸突变的赖氨酸突变诱发寡核苷酸和选择标记物寡核苷酸。为简便起见，也应注意将要并入人类GPCR中的标准形式的密码子突变。
2.QuikChangeTM Site-DirectedTM Mutagenesis
也可使用QuikChangeTM Site-DirectedTM Mutagenesis试剂盒(Stratagene，根据制造商说明书)来完成非内源人类GPCR的制备。优选使用内源GPCR作为模板，并使用两种突变诱发引物，且所述引物最佳为赖氨酸突变诱发寡核苷酸和选择标记物寡核苷酸(包括于试剂盒中)。为简便起见，应注意标准形式的并入新颖人类GPCR中的密码子突变和个别寡核苷酸。
实例3
受体表达
虽然多种细胞可用于表达蛋白的技术，但最佳为使用哺乳动物细胞或黑素细胞。如果有可能，将(例如)酵母细胞用于表达GPCR会在实验方案中引入非哺乳动物细胞，其可能不包括(在酵母状况下的确不包括)哺乳动物系统所涉及的受体偶合、遗传机制和分泌路径，因此在非哺乳动物细胞中获得结果，如果具有潜在用途，则并不如自哺乳动物细胞或黑素细胞所获得的结果一样优选，此情况的主要原因应根据实践来预测。虽然可基于技术人员的特定需要来预测所用的特定哺乳动物细胞，但在哺乳动物细胞中CHO、COS-7、MCB3901、293和293T细胞是尤其优选的。在一些实施例中，可使用获自哺乳动物的脂肪细胞或骨骼肌细胞。参见与黑素细胞相关的下文，包括实例10。
a.短暂转染
第1天，在每个10cm培养皿上涂板6×106个293细胞。第2天，制备两个反应管(各管所遵循的比例是对于每个培养盘而言)：通过在0.5ml无血清DMEM(Gibco BRL)中混合4μgDNA(例如pCMV载体；具有受体cDNA等的pCMV载体)来制备管A；通过在0.5ml无血清DMEM中混合24μl脂质转染剂(lipofectamine)(Gibco BRL)来制备管B。通过倒转(数次)，随后在室温下培育30-45min来混合管A和B。所述混合物被称为“转染混合物”。用1×PBS洗涤经涂板293细胞，随后加入5ml无血清DMEM。将1ml转染混合物加入细胞中，随后在37℃/5％CO2下培育4小时。通过抽吸移除转染混合物，随后加入10ml DMEM/10％胎牛血清。在37℃/5％CO2下培育细胞。培育48小时后，采集细胞且用于分析。
b.稳定细胞株
将大约12×106个293细胞涂板于15cm组织培养盘上。使其在含有10％胎牛血清和1％丙酮酸钠、L-谷氨酰胺以及抗生素的DME高葡萄糖培养基中生长。在涂板293细胞后24小时(或达到约80％长满)，使用12μgDNA(例如具有受体cDNA的pCMV载体)转染细胞。将12μgDNA与60μl脂质转染剂和2ml无血清DME高葡萄糖培养基组合。自培养盘抽吸培养基且用无血清培养基将细胞洗涤一次。将DNA、脂质转染剂和培养基混合物连同10ml无血清培养基加入培养盘中。在37℃下培育4至5小时后，抽吸培养基且加入25ml含血清培养基。在转染后24小时，再次抽吸培养基，且加入新鲜的含血清培养基。在转染后48小时，抽吸培养基且加入含有最终浓度遗传霉素(G418药物)的含血清培养基。将大约12×106个293细胞涂于15cm组织培养盘上。使其在含有10％胎牛血清和1％丙酮酸钠、L-谷氨酰胺以及抗生素的DME高葡萄糖培养基中生长。在涂板293细胞后24小时(或达到约80％长满)，使用12μgDNA(例如具有受体cDNA的pCMV载体)转染细胞。将12μgDNA与60μl脂质转染剂和2ml无血清DME高葡萄糖培养基组合。自培养盘抽吸培养基且用无血清培养基将细胞洗涤一次。将DNA、脂质转染剂和培养基混合物连同10mL无血清培养基加入培养盘中。在37℃下培育4至5小时后，抽吸培养基且加入25ml含血清培养基。在转染后24小时，再次抽吸培养基，且加入新鲜的含血清培养基。在转染后48小时，抽吸培养基且加入含有最终浓度为500μg/ml的遗传霉素(G418药物)的含血清培养基。经转染细胞现经历对含有G418抗性基因的阳性转染细胞的选择。在进行选择时每4至5天替换培养基。在选择期间，使细胞生长以产生稳定池，或使细胞分裂以进行稳定克隆选择。
实例4
用于确定GPCR激活作用的检定
多种方法可用于评定人类GPCR的激活作用。下文具有说明性；相信所属领域的技术人员具有判定优选有益于技术人员需要的那些技术的能力。
1.膜结合检定：[35S]GTPγS检定
当G蛋白偶合受体由于配体结合或组成性激活而呈其活性态时，受体偶合至G蛋白且刺激GDP释放且随后刺激GTP与G蛋白的结合。G蛋白-受体复合物的α亚单元充当GTP酶且将GTP缓慢水解成GDP，此时受体通常失活。激活受体继续将GDP交换为GTP。不可水解的GTP类似物[35S]GTPγS可用于证明[35S]GTPγS与表达激活受体的膜的增强结合。使用[35S]GTPγS结合来测量激活作用的优势在于：(a)其通常适用于所有G蛋白偶合受体；(b)其邻接于膜表面，使得采集影响胞内级联的分子的可能性较低。
所述检定使用G蛋白偶合受体刺激[35S]GTPγS结合至表达相关受体的膜的能力。因此，所述检定可用于直接鉴别方法中，从而将候选化合物筛检为内源GPCR和非内源组成性激活GPCR。所述检定为通用检定且适用于关于所有G蛋白偶合受体的药物发现。
[35S]GTPγS检定是在20mM HEPES和介于1与约20mM之间的MgCl2(此量可经调节以优化结果，虽然20mM为优选的)pH 7.4、含有介于约0.3与约1.2nM之间的[35S]GTPγS(此量可经调节以优化结果，虽然1.2为优选的)以及12.5至75μg膜蛋白(例如表达Gs融合蛋白的293细胞，此量可经调节以优化)的结合缓冲液和10μM GDP(此量可经改变以优化)中培育1小时。接着加入麦芽凝集素珠粒(25μl；Amersham)且将混合物在室温下培育另外30分钟。接着将管在室温下以1500×g离心5分钟且接着在闪烁计数器中计数。
2.腺苷酰基环化酶
针对基于细胞的检定所设计的Flash PlateTM腺苷酰基环化酶试剂盒(New EnglandNuclear，目录号SMP004A)可经修饰以用于粗质膜。Flash Plate孔可含有闪烁涂层，所述闪烁涂层也含有识别cAMP的特异性抗体。孔中所产生的cAMP可通过对放射性cAMP示踪剂与cAMP抗体的结合进行直接竞争来量化。下文充当用于测量表达受体的全细胞中cAMP水平变化的简要实验方案。
在短暂转染后大约24小时采集经转染细胞。小心吸出培养基且丢弃。将10ml PBS缓慢加入各细胞培养皿中，随后小心抽吸。将1ml Sigma细胞解离缓冲液和3ml PBS加入各培养盘中。自培养盘中吸出细胞且将细胞悬浮液收集到50ml锥形离心管中。接着，在室温下将细胞以1,100rpm离心5分钟。将细胞小球小心地再悬浮于适当体积的PBS(约3ml/培养盘)中。接着，使用血球计数器对细胞计数且加入额外PBS以得到适当数目的细胞(最终体积为约50μl/孔)。
制备cAMP标准物和检测缓冲液(包含1μCi示踪剂[125I]cAMP(50μl)至11ml检测缓冲液)且根据制造商说明书维持。新鲜制备检定缓冲液以用于筛检且其含有50μl刺激缓冲液、3μl测试化合物(12μM最终检定浓度)和50μl细胞。将检定缓冲液储存于冰上直至使用。通过加入50μl cAMP标准物至适当孔中，随后加入50μl PBSA至孔H-11和H12中来起始检定，其优选(例如)在96孔培养盘中进行。将50μl刺激缓冲液加入所有孔中。使用能够分配3μl化合物溶液的针头组将DMSO(或所选候选化合物)加入适当孔中，最终检定浓度为12μM测试化合物和100μl总检定体积。接着将细胞加入孔中且在室温下培育60分钟。接着将100μl含有示踪剂cAMP的检测混合物加入孔中。接着将培养盘培育额外2小时，随后在Wallac MicroBeta闪烁计数器中计数。接着，由内含于各检定盘中的标准cAMP曲线外推cAMP/孔的值。
3.用于Gi偶合目标GPCR的基于细胞的cAMP
TSHR是使得cAMP在激活后积聚的Gs偶合GPCR。TSHR将通过突变氨基酸残基623(意即将丙氨酸残基改变为异白氨酸残基)而得以组成性激活。预期Gi偶合受体会抑制腺苷酰基环化酶，且因此降低cAMP产生水平，其可使得cAMP水平的评定具有挑战性。测量指示Gi偶合受体的激活作用的cAMP产生的降低的有效技术可通过最佳以连接Gi的目标GPCR将非内源组成性激活TSHR(TSHR-A623I)(或内源组成性活性Gs偶合受体)共转染为“信号强化子”以创建cAMP的基线含量来实现。在产生Gi偶合受体的非内源型式后，接着以信号强化子共转染目标GPCR的所述非内源型式，且正是所述物质可用于筛检。所述方法可用于当使用cAMP检定时有效产生信号。在一些实施例中，此方法优选用于直接鉴别抗Gi偶合受体的候选化合物。应注意当使用此方法时，对于Gi偶合GPCR而言，目标GPCR的反向激动剂将增加cAMP信号且激动剂将降低cAMP信号。
第1天，每个孔中将涂板2×104个293细胞。第2天，制备两个反应管(各管所遵循的比例是对于每个培养盘而言)：通过在1.2ml无血清DMEM(Irvine Scientific，Irvine，CA)中混合转染至哺乳动物细胞中的各受体的2μgDNA(总共为4μgDNA(例如pCMV载体；具有突变THSR(TSHR-A623I)、TSHR-A623I和GPCR等的pCMV载体))来制备管A；通过在1.2ml无血清DMEM中混合120μl脂质转染剂(Gibco BRL)来制备管B。接着通过倒转(数次)混合管A和B，随后在室温下培育30-45分钟。所述混合物被称为“转染混合物”。用1×PBS洗涤经涂板293细胞，随后加入10ml无血清DMEM。接着，将2.4ml转染混合物加入细胞中，随后在37℃/5％CO2下培育4小时。接着，通过抽吸来移除转染混合物，随后加入25ml DMEM/10％胎牛血清。接着，在37℃/5％CO2下培育细胞。在培育24小时后，接着采集细胞且用于分析。
针对基于细胞的检定设计Flash PlateTM腺苷酰基环化酶试剂盒(New EnglandNuclear，目录号SMP004A)，但可视熟练技术人员需要对其进行修饰以用于粗质膜。FlashPlate孔将含有闪烁涂层，所述闪烁涂层也含有识别cAMP的特异性抗体。孔中所产生的cAMP可通过对放射性cAMP示踪剂与cAMP抗体的结合进行直接竞争来量化。下文充当用于测量表达受体的全细胞中cAMP水平变化的简要实验方案。
在短暂转染后大约24小时采集经转染细胞。小心吸出培养基且丢弃。将10ml PBS缓慢加入各细胞培养皿中，随后小心抽吸。将1ml Sigma细胞解离缓冲液和3ml PBS加入各培养盘中。自培养盘中吸出细胞且将细胞悬浮液收集到50ml锥形离心管中。接着，在室温下将细胞以1,100rpm离心5分钟。将细胞小球小心地再悬浮于适当体积的PBS(约3ml/培养盘)中。接着使用血球计数器对细胞计数且加入额外PBS以得到适当数目的细胞(最终体积为约50μl/孔)。
制备cAMP标准物和检测缓冲液(包含1μCi示踪剂[125I]cAMP(50μl)至11ml检测缓冲液)且根据制造商说明书维持。应新鲜制备检定缓冲液以用于筛检且其含有50μl刺激缓冲液、3μl测试化合物(12μM最终检定浓度)和50μl细胞。检定缓冲液可储存于冰上直至使用。可通过加入50μl cAMP标准物至适当孔中，随后加入50μl PBSA至孔H1和H12中来起始检定。加入50μl刺激缓冲液至所有孔中。使用能够分配3μl化合物溶液的针头组将所选化合物(例如TSH)加入适当孔中，最终检定浓度为12μM测试化合物和100μl总检定体积。接着将细胞加入孔中且在室温下培育60分钟。接着将100μl含有示踪剂cAMP的检测混合物加入孔中。接着将培养盘培育额外2小时，随后在Wallac MicroBeta闪烁计数器中计数。接着由内含于各检定盘中的标准cAMP曲线外推cAMP/孔的值。
4.基于报导子的检定
CRE-LUC报导子检定(Gs相关受体)
将293和293T细胞以每孔2×104个细胞的密度涂板于96孔培养盘上且在后一天根据制造商说明书使用脂质转染试剂(BRL)进行转染。如下制备用于各6孔转染的DNA/脂质混合物：将100μlDMEM中的260ng质粒DNA与100μl DMEM中的2μl脂质缓慢混合(260ng质粒DNA是由200ng 8×CRE-LUC报导子质粒、50ng包含内源受体或非内源受体的pCMV或单独pCMV和10ng GPRS表达质粒(pcDNA3(Invitrogen)中的GPRS)组成)。如下制备8×CRE-Luc报导子质粒：通过在pβgal-Basic载体(Clontech)中的BglV-HindIII位点处克隆大鼠生长激素抑制素启动子(-71/+51)来获得载体SRIF-β-gal。通过PCR自腺病毒模板AdpCF126CCRE8获得八个(8)cAMP应答元件的拷贝(参见Suzuki等人，Hum Gene Ther(1996)7：1883-1893，其揭示内容以全文引用的方式并入本文中)且将其在Kpn-BglV位点处克隆于SRIF-β-gal载体中，从而得到8×CRE-β-gal报导子载体。通过用获自pGL3-basic载体(Promega)的荧光素酶基因在HindIII-BamHI位点处替代8×CRE-β-gal报导子载体中的β-半乳糖苷酶基因来产生8×CRE-Luc报导子质粒。在室温下培育30分钟后，用400μl DMEM稀释DNA/脂质混合物且将100μl经稀释混合物加入各孔中。在细胞培养物培育箱中培育4小时后，将含有10％FCS的100μl DMEM加入各孔中。后一天，用含有10％FCS的200μl/孔DMEM交换经转染细胞。八(8)小时后，用PBS洗涤一次，随后将孔换成100μl/孔无酚红的DMEM。第2天使用LucLiteTM报导子基因检定试剂盒(Packard)，根据制造商说明书来测量荧光素酶活性且在1450 MicroBetaTM闪烁和发光计数器(Wallac)上读取。
b.AP1报导子检定(Gq相关受体)
检测Gq刺激的方法视Gq依赖性磷脂酶C引起在启动子内含有AP1元件的基因的激活作用的已知特性而定。可根据上文关于CREB报导子检定所述的实验方案使用PathdetectTM AP-1顺式报导系统(Stratagene，目录号219073)，其例外为磷酸钙沉淀物的组份为410ng pAP1-Luc、80ng pCMV-受体表达质粒和20ng CMV-SEAP。
c.SRF-LUC报导子检定(Gq相关受体)
一种检测Gq刺激的方法视Gq依赖性磷脂酶C引起在启动子内含有血清应答因子的基因的激活作用的已知特性而定。PathdetectTM SRF-Luc-报导系统(Stratagene)可用于检定(例如)COS7细胞中的Gq偶合活性。根据制造商说明书使用MammalianTransfectionTM试剂盒(Stratagene，目录号#200285)，以系统的质粒组份和编码内源或非内源GPCR的指定表达质粒转染细胞。简言之，根据制造商说明书在磷酸钙沉淀物中组合410ng SRF-Luc、80ng pCMV-受体表达质粒和20ng CMV-SEAP(经分泌的碱性磷酸酶表达质粒；在经转染细胞的培养基中测量碱性磷酸酶活性以控制样品之间的转染效率变化)。将一半沉淀物均等地分布于96孔培养盘中的3个孔上，在无血清培养基中的细胞上维持24小时。在最后5小时将细胞与(例如)1μM测试化合物一起培育。接着溶解细胞且根据制造商说明书使用LucliteTM试剂盒(Packard，目录号6016911)和“Trilux1450 Microbeta”液体闪烁和发光计数器(Wallac)检定荧光素酶活性。可使用GraphPadPrismTM 2.0a(GraphPad Software Inc.)分析资料。
胞内IP3积聚检定(Gq相关受体)
第1天，可将包含受体(内源或非内源)的细胞涂板于24孔培养盘上，通常为1×105个细胞/孔(但此数目可经优化)。第2天，可通过首先在50μl无血清DMEM/孔中混合0.25μgDNA且在50μl无血清DMEM/孔中混合2μl脂质转染剂来转染细胞。缓慢混合溶液且在室温下培育15-30分钟。用0.5ml PBS洗涤细胞且将400μl无血清培养基与转染培养基混合并加入细胞中。接着将细胞在37℃/5％CO2下培育3-4小时，且接着移除转染培养基并用1ml/孔的常规生长培养基替换。第3天，用3H-肌醇标记细胞。简言之，移除培养基且用0.5ml PBS洗涤细胞。接着，向0.5ml无肌醇/无血清培养基(GIBCOBRL)/孔中加入0.25μCi3H-肌醇/孔且将细胞在37℃/5％CO2下培育16-18小时。第4天，用0.5ml PBS洗涤细胞且加入0.45ml检定培养基(其含有无肌醇/无血清培养基、10μM帕吉林(pargyline)、10mM氯化锂)或0.4ml检定培养基以及50μl 10×酮色林(ketanserin，ket)直至最终浓度为10μM。接着将细胞在37℃下培育30分钟。接着用0.5ml PBS洗涤细胞且每孔加入200μl新鲜/冰冷终止溶液(1 M KOH；18mM硼酸钠；3.8mM EDTA)。将溶液在冰上维持5-10分钟或直至细胞溶解，且接着用200μl新鲜/冰冷中和溶液(7.5％HCl)中和。接着将溶胞物转移至1.5ml eppendorf管中且每管加入1ml氯仿/甲醇(1∶2)。将溶液涡旋15秒且将上层相施加于Biorad AG1-X8TM阴离子交换树脂(100-200目)。首先，用水以1∶1.25W/V洗涤树脂且将0.9ml上层相装载至管柱上。用10ml 5mM肌醇和10ml 5mM硼酸钠/60mM甲酸钠洗涤管柱。将三磷酸肌醇洗提到含有10ml闪烁混合液的闪烁瓶中，所述闪烁混合液含有2ml 0.1M甲酸/1M甲酸铵。通过用10ml 0.1M甲酸/3M甲酸铵洗涤来再生管柱且用双蒸水冲洗两次，并在4℃下储存于水中。
实例5
融合蛋白制备
a.GPCR：Gs融合构筑体
可如下实现GPCR-G蛋白融合构筑体的设计：对大鼠G蛋白Gsα(长形式；Itoh，H.等人，83 PNAS 3776(1986))的5’和3’端进行基因工程设计以在其上包括HindIII(5’-AAGCTT-3’)序列。在确认正确序列(包括侧接HindIII序列)之后，通过使用所述载体的HindIII限制位点进行亚克隆而使完整序列穿梭于pcDNA3.1(-)(Invitrogen，目录号V795-20)中。在亚克隆到pcDNA3.1(-)中之后确定Gsα序列的正确定位。接着校验在HindIII序列处含有大鼠Gsα基因的经修饰pcDNA3.1(-)，此载体现可用作“通用”Gsα蛋白载体。pcDNA3.1(-)载体在HindIII位点上游含有多种熟知限制位点，因此有益地提供在Gs蛋白上游插入内源组成性活性GPCR的编码序列的能力。此相同方法可用于产生其它“通用”G蛋白载体，且当然可使用技术人员已知的其它市售或专利载体-重要标准为GPCR的序列在上游且与G蛋白的序列同框。
Gq(6个氨基酸缺失)/Gi融合构筑体
可如下实现Gq(del)/Gi融合构筑体的设计：Gαq亚单元的N末端六个(6)氨基酸(氨基酸2-7，具有TLESIM的序列)将缺失且具有序列EYNLV的C末端五个(5)氨基酸将由Gαi蛋白的具有序列DCGLF的相应氨基酸替代。使用以下引物和作为模板的质粒63313，通过PCR获得此融合构筑体：
5′-gatcAAGCTTCCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGGAG-3′(SEQ ID NO：9)和
5′-gatcGGATCCTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG-3′(SEQ ID NO：10)，
所述质粒63313含有具有血球凝集素标签的小鼠Gαq野生型型式。包括小写形式的核苷酸，其为间隔物。
使用TaqPlus Precision DNA聚合酶(Stratagene)，通过以下循环进行扩增，其中步骤2至4重复35次：95℃，2分钟；95℃，20秒；56℃，20秒；72℃，2分钟；和72℃，7分钟。将PCR产物克隆到pCRII-TOPO载体(Invitrogen)中且使用ABI Big DyeTerminator试剂盒(P.E.Biosystems)测序。通过两步克隆方法使含有融合构筑体序列的来自TOPO克隆的插入物穿梭于HindIII/BamHI位点处的表达载体pcDNA3.1(+)中。另外参见2002年9月6日作为WO02068600出版的PCT申请案第PCT/US02/05625号，其揭示内容以全文引用的方式并入本文中。
实例6
[35S]GTPγS检定
A.膜制备
在一些实施例中，包含所关注的目标GPCR且用于鉴别作为(例如)反向激动剂、激动剂或拮抗剂的候选化合物的膜优选如下进行制备：
a. 物质
“膜刮擦缓冲液”包含20mM HEPES和10mM EDTA(pH 7.4)；“膜洗涤缓冲液”包含20mM HEPES和0.1mM EDTA(pH 7.4)；“结合缓冲液”包含20mM HEPES、100mMNaCl和10mM MgCl2(pH 7.4)。
b. 程序
在整个程序中，所有物质都保持在冰上。首先，自长满单层细胞抽吸培养基，随后用10ml冷PBS冲洗，随后抽吸。其后，将5ml膜刮擦缓冲液加入刮擦细胞中；此后将细胞提取物转移到50ml离心管中(在4℃下以20,000rpm离心17分钟)。其后，抽吸上清液且将离心块再悬浮于30ml膜洗涤缓冲液中，随后在4℃下以20,000rpm离心17分钟。接着抽吸上清液且将离心块再悬浮于结合缓冲液中。接着，使用BrinkmanPolytronTM均化器(15-20秒冲撞，直至所有物质都呈悬浮液形式)将其均质化。其在本文中被称作“膜蛋白”。
Bradford蛋白检定
在均质化之后，使用Bradford蛋白检定来测定膜的蛋白浓度(蛋白可稀释至约1.5mg/ml，等分且冷冻(-80℃)以供随后使用；当冷冻时，所用实验方案如下：在检定当天，在室温下将冷冻膜蛋白解冻，随后涡旋且接着用Polytron以约12×1,000rpm均质化约5-10秒；应注意对于多个制剂而言，均化器应在不同制剂的均质化之间彻底清洁)。
a.物质
根据制造商说明书(Biorad，目录号500-0006)使用结合缓冲液(根据上文)、Bradford染料试剂、Bradford蛋白标准物。
b.程序
制备双重复管，一只管包括膜且另一只作为对照“空白”。各自含有800μl结合缓冲液。其后，将10μl Bradford蛋白标准物(1mg/ml)加入各管中，且接着将10μl膜蛋白加入刚才那只管(非空白)中。其后，将200μl Bradford染料试剂加入各管中，随后各自涡旋。五(5)分钟后，将管再涡旋且将其中的物质转移至比色皿中。接着使用CECIL3041分光光度计在波长595下读取比色皿。
鉴别检定
a.物质
GDP缓冲液是由37.5ml结合缓冲液和2mg GDP(Sigma，目录号G-7127)组成，随后在结合缓冲液中连续稀释以获得0.2μM GDP(各孔中的GDP最终浓度为0.1μMGDP)；包含候选化合物的各孔具有200μl最终体积，其由100μl GDP缓冲液(最终浓度：0.1μM GDP)、50μl结合缓冲液中的膜蛋白和50μl结合缓冲液中的[35S]GTPγS(0.6nM)(每10ml结合缓冲液2.5μl[35S]GTPγS)组成。
b.程序
优选使用96孔培养盘格式筛检候选化合物(其可在-80℃下冷冻)。短暂均质化膜蛋白(或具有排除目标GPCR的表达载体的膜，其作为对照物)，直至呈悬浮液形式。接着使用上文所述的Bradford蛋白检定来测定蛋白浓度。接着，将膜蛋白(和对照物)在结合缓冲液(最终检定浓度，12.5μg/孔)中稀释至0.25mg/ml。其后，将100μl GDP缓冲液加入Wallac ScintistripTM(Wallac)的各孔中。接着，使用5μl针头组将5μl候选化合物转移至所述孔中(意即200μl总检定体积中的5μl为1∶40比率，使得候选化合物的最终筛检浓度为10μM)。为避免污染，在各转移步骤之后，针头组应在包含水(1×)、乙醇(1×)和水(2×)的三个储槽中再次清洗-在各清洗之后应自针头组振荡出过量液体且以纸和kimwipe干燥。其后，将50μl膜蛋白加入各孔(也使用包含不含目标GPCR的膜的对照孔)中，且在室温下预培育5-10分钟。其后，将50μl结合缓冲液中的[35S]GTPγS(0.6nM)加入各孔中，随后在振荡器上在室温下培育60分钟(在此实例中，再次用箔片覆盖培养盘)。接着，通过在22℃下以4000RPM旋转培养盘15分钟来终止检定。接着以8通道歧管抽吸所述培养盘且用培养盘覆盖物密封。接着使用设定“Prot.#37”(根据制造商说明书)在Wallac 1450上读取培养盘。
实例7
环状AMP检定
通过使用基于环化酶的检定来实现鉴别(例如)作为反向激动剂、激动剂或拮抗剂的候选化合物的另一检定方法。除直接鉴别外，此检定方法也可用作独立方法以提供对来自上文实例6中所述的[35S]GTPγS方法的结果的确认。
根据以下实验方案，经修饰Flash PlateTM腺苷酰基环化酶试剂盒(New EnglandNuclear，目录号SMP004A)优选用于直接鉴别作为内源或非内源组成性激活GPCR的反向激动剂和激动剂的候选化合物。
在转染后大约3天，采集经转染细胞。通过在含有20mM HEPES(pH 7.4)和10mMMgCl2的缓冲液中均质化悬浮细胞来制备膜。使用Brinkman PolytronTM在冰上进行大约10秒均质化。将所得匀浆在4℃下以49,000×g离心15分钟。接着将所得离心块再悬浮于含有20mM HEPES(pH 7.4)和0.1mM EDTA的缓冲液中，均质化10秒，随后在4℃下以49,000×g离心15分钟。接着将所得离心块储存于-80℃下直至使用。在直接鉴别筛检当天，将膜离心块在室温下缓慢解冻，再悬浮于含有20mM HEPES(pH 7.4)和10mMMgCl2的缓冲液中以得到0.60mg/ml的最终蛋白浓度(将再悬浮膜置于冰上直至使用)。
制备cAMP标准物和检测缓冲液(包含2μCi示踪剂[125I]cAMP(100μl)至11ml检测缓冲液)且根据制造商说明书维持。新鲜制备检定缓冲液以用于筛检且其含有20mM HEPES(pH 7.4)、10mM MgCl2、20mM磷酸肌酸(Sigma)、0.1单位/毫升肌酸磷酸激酶(Sigma)、50μM GTP(Sigma)和0.2mM ATP(Sigma)；接着将检定缓冲液储存于冰上直至使用。
优选将候选化合物连同40μl膜蛋白(30μg/孔)和50μl检定缓冲液加入(例如)96孔培养盘的孔中(3μl/孔；12μM最终检定浓度)。接着，在缓慢振荡下在室温下培育此混合物30分钟。
在培育后，向各孔中加入100μl检测缓冲液，随后培育2-24小时。接着，使用“Prot.#31”(根据制造商说明书)在Wallac MicroBetaTM培养盘读取器上对培养盘计数。
以实例说明而非限制，在图1中呈现所获得的说明性筛检检定盘(96孔格式)结果。各条形表示在各孔中不同的化合物的结果，“目标GPCR”为与GPR131无关的内源组成性活性Gs偶合GPCR的Gsα融合蛋白构筑体。图1中所呈现的结果也提供基于各培养盘的平均结果(“m”)的标准偏差，且平均值加两个自初步筛检选择作为“主导物”的反向激动剂的任意优选项包括通过平均培养盘应答减去两个标准偏差而选择减少应答百分比的候选化合物。相反地，自初步筛检选择作为“主导物”的激动剂的任意优选项包括通过至少平均培养盘应答加上两个标准偏差而选择增加应答百分比的候选化合物。基于这些选择方法，将下列孔中的候选化合物分别直接鉴别为孔A2和G9中的所述内源GPCR的假定反向激动剂(化合物A)和激动剂(化合物B)。参见图1。出于清晰性应注意：已在无任何关于此GPCR的内源配体的知识的情况下直接鉴别这些化合物。通过致力于基于受体功能而非化合物结合亲和力的检定技术，可能确定能够降低此受体的功能活性(化合物A)以及增加受体的功能活性(化合物B)的化合物。
实例8
测量胞内钙浓度的荧光成像板读取器(FLIPR)检定
将来自各别克隆株的经目标受体(实验性)和pCMV(阴性对照)稳定转染的细胞以5.5×104个细胞/孔接种至具有完全培养基(含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠的DMEM)的经聚-D-赖氨酸预处理的96孔培养盘(Becton-Dickinson，#356640)中以用于在第2天检定。为制备Fluo4-AM(Molecular Probe，#F14202)培育缓冲液储液，将1mg Fluo4-AM溶解于467μl DMSO和467μl泊洛尼克酸(Pluronic acid)(Molecular Probe，#P3000)中以得到1mM储备溶液，其可在-20℃下储存1个月。Fluo4-AM为荧光钙指示染料。
在洗涤缓冲液(1×HBSS/2.5mM丙磺舒(Probenicid)/20mM HEPES(pH 7.4))中制备候选化合物。
在检定时，自孔中移除培养基且以100μl的4μM Fluo4-AM/2.5mM丙磺舒(Sigma，#P8761)/20mM HEPES/完全培养基(pH 7.4)装载细胞。在37℃/5％CO2下使培育进行60分钟。
培育1小时后，移除Fluo4-AM培育缓冲液且用100μl洗涤缓冲液将细胞洗涤两次。在各孔中留下100μl洗涤缓冲液。将培养盘送回到培育箱中，在37℃/5％CO2下历时60分钟。
对FLIPR(荧光成像板读取器；Molecular Device)设定程式以在第30秒加入50μl候选化合物且记录由候选化合物引起的胞内钙浓度([Ca2+])短暂变化，历时另外150秒。使用FLIPR软件，使用总荧光变化计数来确定激动剂活性。仪器软件标准化荧光读数以得到零点的等效起始读数。
在一些实施例中，包含目标受体的细胞进一步包含Gα15、Gα16或嵌合Gq/Giα亚单元。
虽然上文提供使用稳定转染细胞进行的用于激动剂活性的FLIPR检定，但一般技术人员应能够易于修改所述检定以便表征拮抗剂活性。所述一般技术人员也应易于了解可替代性地使用经短暂转染的细胞。
实例9
MAP激酶检定
可监测MAP激酶(由促细胞分裂剂激活的激酶)以评估受体激活作用。可以数种方法检测MAP激酶。一种方法是基于对未经磷酸化(无活性)或经磷酸化(活性)的磷酸化状态的评估。经磷酸化蛋白在SDS-PAGE中具有较低移动力且因此可使用Western印迹法与未经刺激的蛋白相比较。或者，可使用经磷酸化蛋白的特异性抗体(NewEngland Biolabs)，其可用于检测经磷酸化激酶的增加。在任一方法中，以测试化合物刺激细胞且接着用Laemmli缓冲液提取。将可溶性部分施加于SDS-PAGE凝胶且以电泳法将蛋白转移至硝酸纤维素或Immobilin中。以标准Western印迹技术检测免疫反应带。在薄膜上记录可见或化学发光信号且可通过密度测定法量化。
另一方法是基于经由磷酸化检定对MAP激酶活性的评估。以测试化合物刺激细胞且制备可溶性提取物。在30℃下将提取物与γ-32p-ATP、ATP再生系统和MAP激酶的特异性底物(诸如由胰岛素调节的磷酸化热稳定和酸稳定蛋白或PHAS-I)一起培育10分钟。通过加入H3PO4来终止反应且将样品转移至冰上。将等分试样点渍于Whatman P81色谱纸上，其保留磷酸化蛋白。洗涤色谱纸且在液体闪烁计数器中计数32P。或者，将细胞提取物与γ-32p-ATP、ATP再生系统和由抗生蛋白链菌素结合至过滤器支撑物的生物素基化髓磷脂碱性蛋白一起培育。髓磷脂碱性蛋白为激活MAP激酶的底物。使磷酸化反应在30℃下进行10分钟。接着，可经由过滤器抽吸提取物，所述过滤器保留磷酸化髓磷脂碱性蛋白。洗涤过滤器且通过液体闪烁计数法计数32p。
实例10
黑素细胞技术
黑素细胞为在低等脊椎动物中所发现的皮肤细胞。其含有被称为黑素体的着色细胞器。黑素细胞能够在G蛋白偶合受体(GPCR)激活后沿微管网络再分布这些黑素体。此色素移动的结果为细胞明显变亮或变暗。在黑素细胞中，由Gi偶合受体的激活作用引起的胞内cAMP水平降低会引起黑素体向细胞中心迁移，从而导致颜色显著变亮。如果在Gs偶合受体激活之后接着升高cAMP水平，则黑素体再分散且细胞再次变暗。由Gq偶合受体的激活作用引起的二酰甘油含量的增加也可诱发此再分散作用。此外，所述技术也适于研究某些受体酪氨酸激酶。黑素细胞的应答在受体激活的数分钟内发生且在样品中导致强烈颜色变化。使用常规吸光度微板读取器或合适影像成像系统可易于检测应答。不同于其它皮肤细胞，黑素细胞来源于神经脊且似乎表达信号转导蛋白的完全互补体。详言之，所述细胞表达各种G蛋白且因此能够功能性地表达几乎所有GPCR。
黑素细胞可用于鉴别抗GPCR的化合物，包括天然配体。此方法也可通过引入应答特定刺激而能够分散或聚集色素的色素细胞株的测试细胞且表达编码GPCR的外源克隆来进行。刺激剂(例如褪黑激素)设定色素沉积的初始状态，其中如果GPCR的激活作用诱发色素分散，则色素在测试细胞内聚集。然而，用刺激剂刺激细胞以设定色素沉积的初始状态，其中如果GPCR的激活诱发色素积聚，则色素得以分散。接着以化合物接触测试细胞，且确定细胞中的色素沉积是否自色素沉积的初始状态变化而来。由候选化合物(包括(但不限于)配体)与GPCR的偶合引起的色素细胞沉积将在培养皿上变暗，同时色素细胞积聚将变亮。
遵循根据美国专利第5,462,856号和美国专利第6,051,386号的揭示内容的物质和方法。这些专利揭示内容以全文引用的方式并入本文中。
例如，将细胞涂板于96孔培养盘中(每个培养盘一种受体)。转染后48小时，用10nM褪黑激素处理各培养盘上的一半细胞。褪黑激素激活黑素细胞中的内源Gi偶合受体且引起黑素细胞积聚其色素。将剩余一半细胞转移至无血清培养基0.7XL-15(Gibco)中。1小时后，无血清培养基中的细胞仍保持色素分散状态，而经褪黑激素处理的细胞则呈色素积聚状态。此时，用剂量回应的测试/候选化合物处理细胞。如果经涂板GPCR结合至测试/候选化合物，则预期黑素细胞将应答所述化合物而经历颜色变化。如果受体为Gs或Gq偶合受体，则褪黑激素积聚的黑素细胞将经历色素分散。相反，如果受体为Gi偶合受体，则预期色素分散的细胞将经历剂量依赖性色素积聚。
实例11
人类和小鼠RUP43的组织分布
通过RT-PCR来询问人类和小鼠脂肪细胞和骨骼肌细胞的RUP43表达。人类白血球子集的RUP43表达是通过TaqMan RT-PCR来询问。
a.
人类前成脂肪细胞购自Biowhirtaker且允许保持不分化或经历分化。人类分化脂肪细胞购自Zen Bio。由所述未分化或分化人类脂肪细胞制备RNA且将其转化为cDNA。接着执行RT-PCR以使用以下特异性引物来询问RUP43的表达：
5′-CTACCTGTACCTCGAAGTCTA-3′(正义引物；SEQ ID NO：11)和
5′-AGTGGCGGGCGCTGCTCAT-3′(反义引物；SEQ ID NO：12)。
所用循环条件为：94℃，2分钟；94℃，15秒；55℃，30秒；和72℃，1分钟，最后3个步骤历经35个循环。发现RUP43由分化人类脂肪细胞内源性表达且在较少程度上由人类前成脂肪细胞表达(图2A)。
b.
如上文[a]所述，通过RT-PCR来询问人类皮下(“Sub Q”)和内脏脂肪的RUP43表达。皮下脂肪样品获自BMI在19至35的范围内的10个个体。内脏脂肪样品获自BMI在19至45的范围内的8个个体。使用甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(GAPDH)的RT-PCR来显示样品的相当负载。发现人类RUP43在皮下和内脏脂肪中内源性表达(图2B)。
c.
使小鼠3T3L1细胞保持未分化或经历分化。由未分化3T3L1细胞、分化3T3L1细胞或小鼠骨骼肌细胞制备RNA。在逆转录酶存在(“+”)或不存在(“-”)下，执行将RNA转化为cDNA。接着使用以下特异性引物执行RT-PCR以询问RUP43的表达：
5′-TGAGCTGTCGGCCATTCCCAT-3′(正义引物；SEQ ID NO：13)和
5′-GATTGTCCCTCTTGGCTCTTC-3′(反义引物；SEQ ID NO：14)。
所用循环条件为：94℃，2分钟；94℃，15秒；55℃，30秒；和72℃，1分钟，最后3个步骤历经35个循环。发现RUP43由分化小鼠3T3L1脂肪细胞表达且在较少程度上由未分化3T3L1脂肪细胞表达。也发现RUP43由小鼠骨骼肌细胞内源性表达(图2C)。
d.
人类骨骼肌细胞获自Cambrex。由骨骼肌细胞制备RNA且将其转化为cDNA。作为阳性对照，使用如[a]所述由获自Biowhittaker的人类脂肪细胞制备的cDNA。如[a]中所述执行RT-PCR。发现RUP43由骨骼肌细胞内源性表达，且如先前在[a]中所示由脂肪细胞表达(图2D)。
实例12
脂肪细胞分化
小鼠3T3L1细胞的分化
3T3L1生长培养基          1000ml
DMEM                     1000ml
10％BCS                  100ml
L-谷氨酰胺，200mM        10ml
P/S                      10ml
3T3L1常规培养基          1000ml
DMEM                     1000ml
10％FBS                  100ml
L-谷氨酰胺，200mM        10ml
P/S                      10ml
3T3L1诱导培养基          1000ml
DMEM                     1000ml
10％FBS                  100ml
L-谷氨酰胺，200mM        10ml
P/S                      10ml
胰岛素(10mg/ml)          1ml
IBMax(10mg/ml)           11.1ml
地塞米松(10mg/ml)        328μl
3T3L1胰岛素唯一培养基    1000ml
DMEM                     1000ml
10％FBS                  100ml
L-谷氨酰胺，200mM        10ml
P/S                 10ml
胰岛素(10mg/ml)     1ml
DMEM：HYQ DEM/高葡萄糖，SH30081.01，500ml。SH30081.02，1000ml。
BCS：小牛血清，Hyclone SH 30073.03
FBS：胎牛血清，Hyclone SH 30071.03
L-谷氨酰胺，200mm，100×。Hyclone SH40003-11。
青霉素-链霉素，100ml Hyclone SV30010
胰蛋白酶，HYQ，0.05％1×，SH30236.01 100ml。
HYQ DPBS/经修饰的1×SH30028.0，50ml。
以50％长满接种3T3L1细胞，使得培养物第二天完全长满。在细胞已达到100％长满后2天，加入诱导培养基。2-5天后，将细胞转换为胰岛素唯一培养基。诱导后2-5天，将细胞返回至常规培养基中历时2天，完成3T3L1细胞分化为脂肪细胞的过程。
b.人类前成脂肪细胞的分化
以1×106个细胞/培养盘在24孔培养盘中接种购自Cambrex的人类前成脂肪细胞。2天后，当细胞达到100％长满时，加入购自Cambrex的诱导培养基。将细胞在诱导培养基中培养10天，由此完成初代人类前成脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程。
实例13
人类骨骼肌细胞的分化
在购自Cambrex的SKGM-2培养基中培养人类初代未分化骨骼肌细胞。当成骨骼肌细胞培养物达到50-70％长满时，移除SKGM-2培养基，且加入融合培养基(补充有2％马血清的DMEM-F12)。
使细胞在融合培养基中的培养继续4-7天(每隔1天替换融合培养基)或直至在整个培养物中观察到肌管。
观察到所得分化培养物含有多核(3个以上核)肌管。
如果将肌管用于需要延长培养期的检定中，则移除融合培养基且用SKGM-2培养基替换。为达到最佳性能，每隔1天替换SKGM-2培养基以将培养物维持2-3周。最佳使用肌管培养物至分化后2周。
实例14
内源RUP43偶合至Gs
通过比较经内源人类、小鼠或大鼠RUP43转染的HEK293细胞与经模拟转染的HEK293细胞(“pCMV”)中的胞内cAMP水平来询问RUP43的Gs偶合。基本上根据制造商说明书使用具有125I作为示踪剂(NEX130)的Perkin Elmer Flashplate试剂盒(SMP004B)，通过环化酶检定来执行胞内cAMP水平的确定。
以1.2×107的密度涂板HEK 293细胞且使其粘附过夜。接着使用脂质转染剂(每15cm培养皿120μg)，仅以pCMV转染HEK293细胞，或以含有编码内源人类、小鼠或大鼠RUP43的pCMV转染细胞。使经转染细胞恢复过夜。为进行检定，采集经转染细胞且将其以1×106个细胞的最终细胞计数加入flashplate孔中。使其粘附，接着使其经受示踪剂历时2小时。接着，抽吸所有孔且使用微板读取器(Wallac 1450 microbeta计数器)对培养盘读数。发现经RUP43转染的HEK293细胞的胞内水平显著高于经模拟转染的细胞的胞内水平，说明RUP43证明组成性Gs偶合的可检测水平(图3)。
实例15
鉴别作为RUP43激动剂的化合物1
物质
在所有检定中使用获自ATCC的HEK 293细胞。培养基由90ml补充有10％胎牛血清的DMEM(Gibco，BRL)组成。使用具有直接cAMP[125I]检测系统的腺苷酰基环化酶激活(Adenylyl Cyclase Activation)Flashplate检定，确定环状AMP测量。
短暂转染和全细胞环化酶Flashplate检定
将HEK 293细胞(5×105个细胞/ml)涂板于15cm培养皿中。第2天，如制造商所建议使用FuGENE 6试剂(Roche Applied Science)来转染细胞。简言之，将由OptiMEM(Gibco，BRL)和FuGENE 6试剂组成的转染混合物混合在一起且使其在室温下培育5分钟。将转染试剂逐滴加入含有2μg内源人类RUP43受体质粒(经转染)或2μg空pCMV载体(模拟)的独立管中，且使其在室温下培育15分钟。将DNA/转染混合物逐滴加入各透视板且在保持37℃、95/5％O2/CO2的潮湿培育箱中培育过夜。第2天，用正常生长培养基替换所述培养基且将细胞培育过夜。
第3天，用PBS将细胞冲洗一次，且使用非酶促细胞解离缓冲液(Gibco，BRL)使其脱离培养盘，并使其以2×106个细胞/ml的密度再悬浮于检定刺激缓冲液(PerkitiElmer)中以测量cAMP。相继将化合物1或媒剂以2×所要最终浓度稀释于刺激缓冲液中。将化合物1和媒剂(50μl/孔)加入96孔Flashplate(Perkin Elmer)的透视孔中。将经转染或模拟细胞等分到各孔(50μl/孔)中且使其在室温下在平板形式振荡器上培育1小时。将检测缓冲液(Perkin Elmer，100μL)加入各孔中且在室温下培育2小时并同时搅拌。在2小时培育结束时，抽吸培养盘且使用Wallac 1450 microbeta计数器来确定cAMP水平。
发现化合物1以剂量依赖方式导致经内源人类RUP43转染的HEK293细胞中胞内cAMP尤其增加，而经模拟转染细胞中的胞内cAMP并未增加，由此鉴别化合物1为RUP43的激动剂(图4)。
实例16
鉴别作为RUP43激动剂的化合物2
使用黑素细胞技术(上文实例10)，发现化合物2为内源人类RUP43的激动剂(图5)。简言之，使用胰蛋白酶(0.7×)自长满烧瓶(T-185cm2烧瓶)采集黑素细胞且通过电穿孔将其转染。将编码内源人类RUP43的多核苷酸(30μg)用于转染黑素细胞。电穿孔后，将细胞预涂于烧瓶中历时大约3-4小时以去除不可活细胞和碎片。一旦完成，随后使烧瓶胰蛋白酶化且一式三样将其涂板于384孔经聚-D-赖氨酸涂覆的培养盘上以用于检定。转染后48小时，以分光光度计对检定盘读数(吸光度T0)。接着，以相继稀释的化合物#2(100μM-51.2pM，5倍稀释，最终为0.5％DMSO)将细胞培育1小时且再次读数(吸光度T60)。分析三重测定吸光度资料且将其描述为与阳性对照孔(200)和阴性对照孔(100)相比的对照应答百分比。曲线高度约为对照物的92％，EC50＝0.212μM。
实例17
体外葡萄糖摄取检定
如本文所述来进行体外葡萄糖摄取检定。
缓冲液和试剂：
饥饿培养基：DMEM/具有0.5％BSA的高葡萄糖。
KRPH缓冲液：5mM NaHPO4，pH7.4(每次使KRPH缓冲液新鲜)
20mM Hepes.pH 7.4
1mM MgSO4
1mM CaCl2
136mM NaCl
4.7mM KCl
1％BSA
2-脱氧葡萄糖(DOG)：储液100mM：16.4mg/ml在水中(在4℃下储存1-2周)。
向各孔中加入1μl含1μCi[3H]-2-DOG和1μl冷储液2-DOG以及2ml KRPH。
细胞松弛素B(CytoB)：储液(10mM在95％乙醇中)：在-20℃下保存。
使用最终为10μM的CytoB来阻断经载剂介导的摄取。最终也使用此浓度来终止反应。终止缓冲液为PBS加10μM CytoB(“PBS”)。
1％Triton-X：此为溶解缓冲液。
将细胞涂板于24孔培养盘上。
程序：
1.使细胞饥饿至少2小时。
2.用KRPH缓冲液洗涤细胞2次且将2ml KRPH加入孔中。
3.用胰岛素和/或测试化合物或媒剂(对照物)处理细胞20min。
4.20min后，自孔中抽吸缓冲液且立即加入1ml KRPH缓冲液加2-DOG。在摄取检定前5min，向经CytoB处理的细胞中加入CytoB。
5.4min后，自孔中抽吸缓冲液且加入3ml冷PBS。在完成检定后，在各孔中用冷PBS洗涤细胞2次。完全抽吸终止PBS，且接着加入700μl的1％Triton X。将其置于37℃培育箱中历时30min。
6.对总溶胞物中的CPM计数。计算CPM/孔。
自关于经胰岛素和/或测试化合物处理的各细胞和经媒剂(对照物)处理的各细胞所获得的值减去CytoB值。
实例18
化合物2刺激小鼠3T3L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取
用50μM化合物2处理分化的小鼠3T3L1脂肪细胞不同时间，其后根据实例17来测定葡萄糖摄取。根据图6，显然化合物2刺激3T3L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取。结果表明RUP43激动剂是用于调节胰岛素无法控制的高血糖症中的葡萄糖水平的有吸引力的候选物。经刺激葡萄糖摄取的快速时程表明，RUP43激动剂可比当前可用于降低血糖浓度的药物提供更快速的治疗效果。
实例19
化合物2增强小鼠3T3L1脂肪细胞中的经胰岛素刺激的葡萄糖摄取
在无血清培养基中，用(“化合物2”)或不用(“对照物”)化合物2处理分化的小鼠3T3L1脂肪细胞，历时3小时。接着，用新鲜KRPH缓冲液洗涤3T3L1细胞两次且用各种浓度的胰岛素处理20min。用胰岛素处理后，根据实例17来测定葡萄糖摄取。根据图7，显然化合物2增强3T3L1脂肪细胞中的经胰岛素刺激的葡萄糖摄取。结果表明RUP43激动剂可增加胰岛素功效，由此降低达成最大葡萄糖摄取所需的胰岛素浓度。
实例20
化合物2刺激人类初代人类脂肪细胞中的葡萄糖摄取
人类前成脂肪细胞(Cambrex)分化成脂肪细胞。在无血清培养基中，用或不用50μM化合物2处理分化的初代人类脂肪细胞，历时3小时。接着，用新鲜KRPH缓冲液洗涤人类脂肪细胞两次且用或不用100nM胰岛素处理20min。用或不用胰岛素处理后，根据实例17来测定葡萄糖摄取。根据图8，显然化合物2刺激初代人类脂肪细胞中的葡萄糖摄取。根据图8，显然化合物2也增强初代人类脂肪细胞中的经胰岛素刺激的葡萄糖摄取。值得注意的是，如对小鼠3T3L1细胞所观察，RUP43激动剂可在无胰岛素存在的情况下刺激初代人类脂肪细胞中的葡萄糖摄取，且经RUP43刺激的葡萄糖摄取水平可与经胰岛素刺激的葡萄糖摄取水平相当。
实例21
化合物2刺激大鼠L6成肌细胞中的葡萄糖摄取
自ATCC获得大鼠骨骼肌L6成肌细胞且使其在24孔培养盘中生长至长满。
a.
在无血清培养基中，用或不用各种浓度的化合物2处理长满L6细胞历时3小时。接着，用KRPH缓冲液洗涤L6细胞两次。用KRPH缓冲液培育已经化合物2处理的L6细胞，历时20分钟；用10nM或100nM胰岛素处理未经化合物2处理的L6细胞，历时20分钟。用或不用胰岛素处理后，根据实例17来测定葡萄糖摄取。根据图9A，显然化合物2刺激大鼠L6成肌细胞中的葡萄糖摄取。RUP43激动剂可比胰岛素刺激大鼠L6成肌细胞中的更多葡萄糖摄取。由于骨骼肌细胞对体内的80％葡萄糖处理负责，所以所获得的结果表明RUP43激动剂是比胰岛素提供更好体内葡萄糖处理的有吸引力的候选物。
b.
用50μM化合物2处理长满L6成肌细胞不同时间。在各处理期结束时，根据实例17测定葡萄糖摄取。结果表明RUP43激动剂可在20分钟内刺激骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取，此时限类似于胰岛素的时限(图9B)。结果表明RUP43激动剂是用于在可与胰岛素时限相当的短期内调节体内葡萄糖水平的有吸引力的候选物。
实例22
化合物2增强大鼠L6成肌细胞中的经胰岛素刺激的葡萄糖摄取
在无血清培养基中，用或不用50μM化合物2处理长满大鼠L6成肌细胞，历时3小时。接着，用新鲜KRPH缓冲液洗涤L6细胞两次。接着，用或不用100nM胰岛素处理L6细胞，历时20分钟。用或不用胰岛素处理后，根据实例17来测定葡萄糖摄取。根据图10，显然类似于关于脂肪细胞的观察，化合物2增强大鼠L6成肌细胞中的经胰岛素刺激的葡萄糖摄取。结果进一步表明RUP43激动剂可增加胰岛素功效，由此降低达成最大葡萄糖摄取所需的胰岛素浓度。因此，RUP43代表患有高胰岛素血症引起的胰岛素抗性相关问题的个体的有吸引力的治疗选项。
实例23
化合物2刺激初代人类骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取
使获自Cambrex的初代人类骨骼肌细胞生长至50％长满且接着用诱导培养基使其在培养物中分化5至7天。接着，将分化的初代人类骨骼肌细胞转移到生长培养基中，历时7至10天。
a.
在无血清培养基中，用或不用各种浓度的化合物2处理分化的人类骨骼肌细胞，历时3小时。在用或不用化合物2处理后，用新鲜KRPH缓冲液洗涤细胞两次。接着，用KRPH缓冲液培育已经化合物2处理的细胞，历时20分钟；用10nM或100nM胰岛素培育未经化合物2处理的细胞，历时20分钟。用或不用胰岛素处理后，根据实例17来测定葡萄糖摄取。根据图11A，显然RUP43激动剂在无胰岛素存在的情况下可刺激人类骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取且比胰岛素更有效。所获得的结果表明RUP43激动剂在刺激人类骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取时有效，其中发生80％的葡萄糖处理。所获得的结果表明RUP43激动剂是用于控制胰岛素作用难以治愈的高血糖症中的葡萄糖水平的有吸引力的候选物。
b.
用50μM化合物2处理分化的人类骨骼肌细胞，历时不同时期。在各处理期结束时，根据实例17来测定葡萄糖摄取。所获得的结果呈现于图11B中。关于RUP43激动剂所观察到的人类骨骼肌细胞中的葡萄糖摄取的快速刺激作用表明，RUP43激动剂是直接且在短期内调节体内葡萄糖水平的有吸引力的候选物。
实例24
口服生物可用性
用于直接评估口服生物可用性的物理化学分析方法为所属领域的技术人员所熟知，且可加以使用[例如(但不限于)参见：Wong PC等人，Cardiovasc Drug Rev(2002)20：137-52；和Buchan P等人，Headache(2002)Suppl 2：S54-62；其揭示内容各自以全文引用的方式并入本文中]。以实例说明而非限制，所述替代分析方法可包含液相色谱-串连质谱[Chavez-Eng CM等人，J ChromatogrB Analyt Technol Biomed Life Sci(2002)767：117-29；Jetter A等人，Clin Pharmacol Ther(2002)71：21-9；Zimmerman JJ等人，J ClinPharmacol(1999)39：1155-61；和Barrish A等人，Rapid Commun Mass Spectrom(1996)10：1033-7；其揭示内容各自以全文引用的方式并入本文中]。近来，正电子发射断层摄影法(PET)已成功用于在口服药物之后获得哺乳动物体内药物分布(包括口服生物可用性)的直接测量[Gulyas等人，Eur J Nucl Med Mol Imaging(2002)29：1031-8；其揭示内容以全文引用的方式并入本文中]。
或者，基于所发展的体内资料，以实例26的小鼠模型作为实例来说明而非限制。通过口服管饲来投用剂量在0.1mg kg-1至100mg kg-1的范围内的调节物。调节物的效果显示为剂量依赖性且可与腹膜内投药后的效果相当，其中所述效果为血糖浓度减少(实例26)。将通过口服达成有益效果的50％最大减少所需的调节物剂量与通过腹膜内投药达成有益效果的50％最大减少所需的调节物剂量相比较。以实例说明，如果所述口服剂量为所述腹膜内剂量的两倍，则调节物的口服生物可用性取为50％。更一般而言，如果所述口服剂量为θmg kg-1且所述腹膜内剂量为ρmg kg-1，则调节物的口服生物可用性百分比取为[(ρ/θ)×100]。
实例25
血脑障壁模型
使用获自脑部的细胞可测定本发明化合物通过血脑障壁的能力。以实例说明而非限制，所构想的一种方法是使用Dehouck等人[J Neurochem(1990)54：1798-801；以全文引用的方式并入本文中]的血脑障壁模型，所述模型使用脑部毛细管内皮细胞和星形细胞的共培养物。
如Meresse等人所述[J Neurochem(1989)53：1363-1371；以全文引用的方式并入本文中]，分离并表征牛毛细管内皮(BBCE)细胞。简言之，在通过机械均质化作用自牛脑部的一个半球分离之后，将微脉管接种到经牛角膜内皮细胞所分泌的胞外基质涂覆的培养皿上。在接种后5天，内皮细胞首先迁移出毛细管且开始形成微菌落。当菌落足够大时，在补充有15％小牛血清(Seromed)、3mM谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素B(Fungizone)和牛纤维母细胞生长因子(每隔1天加入1ng/ml)的杜氏培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)存在下使5个最大小岛胰蛋白酶化且将其接种到35mm直径的涂覆有明胶的培养皿(每个培养皿1个克隆)上。在长满时，自一个35mm直径培养皿采集内皮细胞且将其接种到60mm直径的涂覆有明胶的培养皿上。6-8天后，以1∶20的分裂比率传代培养长满细胞。将第3代继代移种的细胞(约100个培养皿)储存在液氮中。
由新生大鼠大脑皮层制得星形细胞的初代培养物。在已清除脑脊膜后，如Booher和Sensenbrenner[Neurobiology(1972)2：97-105；以全文引用的方式并入本文中]所述轻轻压迫脑组织使其通过尼龙筛。将补充有10％胎牛血清(Seromed)、2mM谷氨酰胺和50μg/ml庆大霉素的DMEM用于解离脑组织且发育星形细胞。
将培养盘插入物(Millicell-CM；孔径，0.4μM；直径，30mm；Millipore)涂覆于通过修饰Bornstein方法[Lab Invest(1958)7：134-139；以全文引用的方式并入本文中]所制备的大鼠尾部胶原蛋白的两侧。
使用倒置过滤器，以2.5×105个细胞/ml的浓度将星形细胞涂于底部。8天后，将过滤器正置，且每周替换两次培养基。接种后3周，星形细胞的培养物变得稳定。接着，在60mm直径的涂覆有明胶的培养皿上再培养冷冻的第3代BBCE细胞。使长满细胞胰蛋白酶化且以4×105个细胞的浓度将其涂于过滤器的上部。用于共培养的培养基是补充有15％小牛血清、2mM谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素和每隔1天加入的1ng/ml牛纤维母细胞生长因子的DMEM。在这些条件下，BBCE细胞在8天内形成长满单层。
将培养盘设定为6孔培养盘，其中将2ml缓冲液加入上部腔室且将2ml加入含有插入物的培养盘上。将6孔培养盘置于37℃的振荡水浴中。将本发明化合物加入上部腔室，且在各时间点自下部腔室移除100μl。在某些实施例中，测试化合物经放射性标记。在某些实施例中，放射性标记为3H或14C。在一些实施例中，最终时间点为约20min、约30min、约40min、约50min、约60min、约70min、约80min或约90min。测定在各时间点存在于下部腔室中的总测试化合物的百分比。将白氨酸用作渗透性阳性对照。将菊糖用作渗透性阴性对照。
在某些实施例中，在最终时间点测定至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的本发明化合物存在于下部腔室中，表明本发明化合物能够通过血脑障壁。
实例26
RUP43激动剂对大鼠中的葡萄糖稳定状态的体内影响
A.大鼠中的口服葡萄糖耐受性测试(oGTT)。
使10周龄的雄性Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠(Charles River)禁食18小时且将其随机分组(n＝11)以接收各种剂量的RUP43激动剂，或接收已知增加胰岛素敏感性的对照物罗格列酮(rosiglitazone)(RSG，10mg/kg)。经腹膜内传递RUP43激动剂。经腹膜内传递RSG。RUP43激动剂的优选剂量为0.1-100mg/kg。其它优选剂量选自由下列各量组成的群组：0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg、10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg。使安慰剂组服用媒剂。
在投用测试化合物和对照物RSG后30分钟，使大鼠口服2g/kg剂量的右旋糖。使用Glucometer Elite XL(Bayer)，在各时间点测定血糖水平。将右旋糖投用时间取为“0min”，例示性时间点为-30min、0min、30min、60min、90min和120min。对各治疗组中的11只动物的平均葡萄糖浓度取平均值。这些结果可证明RUP43激动剂在用葡萄糖免疫激发之后会以剂量依赖方式降低大鼠血糖。
或者，在7次每日注射RUP43激动剂、RSG或媒剂之后立即在大鼠中进行如本文所述的口服葡萄糖耐受性测试。
明确涵盖本文所述的口服葡萄糖耐受性测试也可在不同动物(例如小鼠或兔)中进行。
B.ZDF大鼠对RUP43激动剂的急剧应答。
将10周龄的雄性Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠(Charles River)随机分组(n＝6)以接收媒剂(经腹膜内)、RUP43激动剂(经腹膜内)或罗格列酮(RSG，10mg/kg，经腹膜内)。RUP43激动剂的优选剂量为0.1-100mg/kg。其它优选剂量选自由下列各量组成的群组：0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg、10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg。在投用化合物后，移除食物且在各时间点测定血糖水平。葡萄糖水平测定的例示性时间为0hr、1hr、2hr、3hr和4hr，且接着为1天至长达1周。将各时间点的血糖减少表示为由各组的6只动物平均的初始葡萄糖水平的百分比。这些动物具有300-400mg/dl的血糖水平(喂养状态)，显著高于非糖尿病野生型动物。用RUP43激动剂或RSG进行的治疗可显示为与媒剂对照物相比显著减少葡萄糖水平。这些资料可证明RUP43激动剂在改善糖尿病动物的葡萄糖稳定状态时具有功效。
或者，在每天测定血糖水平(历时7天)之前，每天即刻向大鼠注射RUP43激动剂、RSG或媒剂(历时7天)。
明确涵盖本文所述的急剧应答测试也可在不同动物(例如小鼠或兔)中进行。
实例27
合成本发明化合物
实例27A：2-{1-[2-(2-氯-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸甲基-(2-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-吲唑-3-基)-酰胺
2-哌啶-4-基-噻唑-4-羧酸乙酯二氢溴酸盐
将4-(氨基碳硫基)四氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(2.0g，8.2mmol)和溴丙酮酸乙酯(1.6g，8.2mmol)溶于30mL EtOH中的溶液在80℃下搅拌4h。其后，将所述混合物冷却到室温且接着馈入48％HBr(1.0mL，14mmol)。将反应混合物搅拌另外1h，且接着将其浓缩为油性固体。用乙醚湿磨会提供3.0g(91％)棕黄色固体：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.02(br s，1H)，8.77(br s，1H)，8.46(s，1H)，7.01(br s，1H)，4.29(q，J＝7.1 Hz，2H)，3.44-3.33(m，3H)，3.02(q，J＝11.7Hz，2H)，2.19(d，J＝13.2Hz，2H)，1.97-1.88(m，2H)，1.29(t，J＝7.0Hz，3H)。关于C11H16N2O2S+H的MS计算值：241，观测值：241。
2-{1-[2-(2-氯-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸乙酯
将2-哌啶-4-基-噻唑-4-羧酸乙酯二氢溴酸盐(1.0g，3.2mmol)、2-氯苯基乙酸(0.55g，3.2mmol)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(1.4g，3.5mmol)和二异丙基乙胺(3.0mL，17mmol)溶于30mL CH2Cl2中的溶液在40℃下搅拌8h。其后，用30mL CH2Cl2稀释粗混合物且用1M柠檬酸(3×50mL)、饱和NaHCO3水溶液(1×30mL)和饱和NaCl水溶液(1×30mL)洗涤。将所得有机层以MgSO4干燥、过滤且浓缩为褐色油状物。以EtOAc∶己烷(3∶1)进行硅胶纯化会提供0.94g(75％)浅褐色油状物：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.08(s，1H)，7.39(dd，J＝7.6，1.6Hz，1H)，7.32(dd，J＝7.2，2.0Hz，1H)，7.25-7.19(m，2H)，4.76(表观d，1H)，4.42(q，J＝7.2Hz，2H)，3.99-3.95(m，1H)，3.88(d，AB型式，JAB＝16.0Hz，1H)，3.83(d，AB型式，JAB＝16.0Hz，1H)，3.34(tt，J＝11.7，3.7Hz，1H)，3.21-3.14(m，1H)，2.83-2.76(m，1H)，2.20-2.16(m，2H)，1.74(qd，J＝12.3，4.1Hz，1H)，1.63(qd，J＝12.3，4.0Hz，1H)，1.40(t，J＝7.2Hz，3H)。关于C19H21ClN2O3S+H的MS计算值：393，观测值：393。
2-{1-[2-(2-氯-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸
用1M NaOH(20mL，20mmol)稀释2-{1-[2-(2-氯-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸乙酯(0.94g，2.4mmol)溶于20mL MeOH中的溶液且将其在60℃下搅拌4h。其后，浓缩粗混合物以移除MeOH溶剂。接着，用CH2Cl2(2×25mL)洗涤碱性水溶液且用5 M HCl将其酸化至pH＝1。用CH2Cl2(3×25mL)萃取所得酸性水溶液。将有机层组合、以MgSO4干燥、过滤且浓缩以提供0.51g(58％)白色泡沫状固体：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.96(br s，1H)，8.36(s，1H)，7.45-7.40(m，1H)，7.33-7.25(m，3H)，4.43(d，J＝13.2 Hz，1H)，4.06(d，J＝13.6 Hz，1H)，3.87(d，AB型式，JAB＝16.0 Hz，1H)，3.82(d，AB型式，JAB＝16.0 Hz，1H)，3.38-3.31(m，1H)，3.25(表观t，J＝11.8 Hz，1H)，2.79(表观t，J＝11.6 Hz，1H)，2.08(t，J＝10.6 Hz，2H)，1.67(qd，J＝12.1，3.7 Hz，1H)，1.53(qd，J＝12.2，4.0 Hz，1H)。关于C17H17ClN2O3S+H的MS计算值：365，观测值：365。
2-{1-[2-(2-氯-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸甲基-(2-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-吲唑-3-基)-酰胺二盐酸盐
将N，1-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-吲唑-3-胺(23mg，0.14mmol)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(75mg，0.20mmol)和2-{1-[2-(2-氯-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸(50mg，0.14mmol)溶于1OmL CH2Cl2中的溶液在40℃下搅拌8h。其后，用20mL CH2Cl2稀释粗混合物且用1M柠檬酸(3×30mL)、饱和NaHCO3水溶液(1×30mL)和饱和NaCl水溶液(1×30mL)洗涤。将所得有机层以MgSO4干燥、过滤且浓缩为黄色油状物。以梯度HPLC(乙腈-水，具有O.1％TFA)进行纯化且将其转化为二盐酸盐会提供56mg(70％)白色固体：1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.28(d，J＝8.8 Hz，1H)，7.43-7.41(m，1H)，7.30-7.26(m，3H)，4.50(t，J＝11.8 Hz，1H)，4.09-4.03(m，1H)，3.98-3.91(m，2H)，3.83(d，J＝12.8 Hz，3H)，3.37(s，3H)，3.24-3.20(m，1H)，2.89-2.82(m，1H)，2.83-2.66(m，2H)，2.47-2.41(m，1H)，2.03-1.88(m，4H)，1.72-1.60(m，3H)，1.46-1.26(m，3H)。关于C26H30ClN5O2S+H的MS计算值：512，观测值：512。
实例27B：2-(2-氯-苯基)-1-{4-[4-(3，4-二氢-2H-喹啉-1-羰基)-噻唑-2-基]-哌啶-1-基}-乙酮
以与实例29A相同的通用程序，由黄色固体状的1，2，3，4-四氢喹啉获得2-(2-氯-苯基)-1-{4-[4-(3，4-二氢-2H-喹啉-1-羰基)-噻唑-2-基]-哌啶-1-基}-乙酮。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.78(s，1H)，7.42-7.40(m，1H)，7.30-7.24(m，3H)，7.18(d，J＝7.6 Hz，1H)，7.03(t，J＝7.4 Hz，1H)，6.91(t，J＝7.6 Hz，1H)，6.72(br s，1H)，4.28(d，J＝12.8 Hz，1H)，3.94-3.81(m，5H)，3.30-3.20(m，2H)，2.98-2.91(m，1H)，2.83(t，J＝6.4 Hz，2H)，2.04(五重峰，J＝6.6 Hz，2H)，1.99-1.93(br m，2H)，1.60-1.51(m，2H)。关于C26H26C1N3O2S+H的MS计算值：480，观测值：480。
实例27C：2-{1-[2-(2-氟-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸甲基-(2-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-吲唑-3-基)-酰胺
以与实例29A相同的通用程序，由白色固体状的2-{1-[2-(2-氟-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸获得2-{1-[2-(2-氟-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸甲基-(2-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-吲唑-3-基)-酰胺。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.71(d，J＝10.4 Hz，1H)，7.30(t，J＝7.6 Hz，1H)，7.26-7.22(m，1H)，7.11(t，J＝7.4 Hz，1H)，7.05(t，J＝9.0 Hz，1H)，4.47(表观t，J＝1 3.6 Hz，1H)，3.90-3.79(m，1H)，3.74(s，2H)，3.63(d，J＝4.4 Hz，3H)，3.32(s，3H)，3.17-3.11(m，1H)，3.04-2.95(m，1H)，2.91-2.79(m，1H)，2.61-2.43(m，2H)，2.27(dt，J＝15.3，5.7 Hz，1H)，1.99-1.88(m，3H)，1.79-1.72(m，1H)，1.64-1.38(m，5H)。关于C26H30FN5O2S+H的MS计算值：496，观测值：496。
序列表
<110>艾尼纳制药公司
<120>用于治疗高血糖症和相关病症的人类G蛋白偶合受体及其调节物
<130>86.WO1
<150>60/561，954
<151>2004-04-13
<160>14
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>993
<212>DNA
<213>智人
<400>1
atgacgccca acagcactgg cgaggtgccc agccccattc ccaagggggc tttggggctc    60
tccctggccc tggcaagcct catcatcacc gcgaacctgc tcctagccct gggcatcgcc    120
tgggaccgcc gcctgcgcag cccacctgct ggctgcttct tcctgagcct actgctggct    180
gggctgctca cgggtctggc attgcccaca ttgccagggc tgtggaacca gagtcgccgg    240
ggttactggt cctgcctcct cgtctacttg gctcccaact tctccttcct ctccctgctt    300
gccaacctct tgctggtgca cggggagcgc tacatggcag tcctgaggcc actccagccc    360
cctgggagca ttcggctggc cctgctcctc acctgggctg gtcccctgct ctttgccagt    420
ctgcccgctc tggggtggaa ccactggacc cctggtgcca actgcagctc ccaggctatc    480
ttcccagccc cctacctgta cctcgaagtc tatgggctcc tgctgcccgc cgtgggtgct    540
gctgccttcc tctctgtccg cgtgctggcc actgcccacc gccagctgca ggacatctgc    600
cggctggagc gggcagtgtg ccgcgatgag ccctccgccc tggcccgggc ccttacctgg    660
aggcaggcaa gggcacaggc tggagccatg ctgctcttcg ggctgtgctg ggggccctac    720
gtggccacac tgctcctctc agtcctggcc tatgagcagc gcccgccact ggggcctggg    780
acactgttgt ccctcctctc cctaggaagt gccagtgcag cggcagtgcc cgtagccatg    840
gggctgggcg atcagcgcta cacagccccc tggagggcag ccgcccaaag gtgcctgcag    900
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agccaaagca gtgtcgacct ggacttgaac taa                                 993
<210>2
<211>330
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Thr Pro Asn Ser Thr Gly Glu Val Pro Ser Pro Ile Pro Lys Gly
1               5                   10                  15
Ala Leu Gly Leu Ser Leu Ala Leu Ala Ser Leu Ile Ile Thr Ala Asn
            20                  25                  30
Leu Leu Leu Ala Leu Gly Ile Ala Trp Asp Arg Arg Leu Arg Ser Pro
        35                  40                  45
Pro Ala Gly Cys Phe Phe Leu Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Thr
    50                  55                  60
Gly Leu Ala Leu Pro Thr Leu Pro Gly Leu Trp Asn Gln Ser Arg Arg
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Trp Ser Cys Leu Leu Val Tyr Leu Ala Pro Asn Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Leu Ser Leu Leu Ala Asn Leu Leu Leu Val His Gly Glu Arg Tyr Met
            100                 105                 110
Ala Val Leu Arg Pro Leu Gln Pro Pro Gly Ser Ile Arg Leu Ala Leu
        115                 120                 125
Leu Leu Thr Trp Ala Gly Pro Leu Leu Phe Ala Ser Leu Pro Ala Leu
    130                 135                 140
Gly Trp Asn His Trp Thr Pro Gly Ala Asn Cys Ser Ser Gln Ala Ile
145                 150                 155                 160
Phe Pro Ala Pro Tyr Leu Tyr Leu Glu Val Tyr Gly Leu Leu Leu Pro
                165                 170                 175
Ala Val Gly Ala Ala Ala Phe Leu Ser Val Arg Val Leu Ala Thr Ala
            180                 185                 190
His Arg Gln Leu Gln Asp Ile Cys Arg Leu Glu Arg Ala Val Cys Arg
        195                 200                 205
Asp Glu Pro Ser Ala Leu Ala Arg Ala Leu Thr Trp Arg Gln Ala Arg
    210                 215                 220
Ala Gln Ala Gly Ala Met Leu Leu Phe Gly Leu Cys Trp Gly Pro Tyr
225                 230                 235                 240
Val Ala Thr Leu Leu Leu ser Val Leu Ala Tyr Glu Gln Arg Pro Pro
                245                 250                 255
Leu Gly Pro Gly Thr Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Gly Ser Ala Ser
            260                 265                 270
Ala Ala Ala Val Pro Val Ala Met Gly Leu Gly Asp Gln Arg Tyr Thr
        275                 280                 285
Ala Pro Trp Arg Ala Ala Ala Gln Arg Cys Leu Gln Gly Leu Trp Gly
    290                 295                 300
Arg Ala Ser Arg Asp Ser Pro Gly Pro Ser Tle Ala Tyr His Pro Ser
305                 310                 315                 320
Ser Gln Ser Ser Val Asp Leu Asp Leu Asn
                325                 330
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
     引物序列
<223>
<400>3
gacaagcatg acgcccaaca gcactggcga g                                   31
<210>4
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
     引物序列
<223>
<400>4
cttgaattag ttcaagtcca ggtcgacact gc                                  32
<210>5
<211>1176
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>新颖序列
<400>5
atgtacccat acgacgtccc agactacgct ggaagcttga cgcccaacag cactggcgag    60
gtgcccagcc ccattcccaa gggggctttg gggctctccc tggccctggc aagcctcatc    120
atcaccgcga acctgctcct agccctgggc atcgcctggg accgccgcct gcgcagccca    180
cctgctggct gcttcttcct gagcctactg ctggctgggc tgctcacggg tctggcattg    240
cccacattgc cagggctgtg gaaccagagt cgccggggtt actggtcctg cctcctcgtc    300
tacttggctc ccaacttctc cttcctctcc ctgcttgcca acctcttgct ggtgcacggg    360
gagcgctaca tggcagtcct gaggccactc cagccccctg ggagcattcg gctggccctg    420
ctcctcacct gggctggtcc cctgctcttt gccagtctgc ccgctctggg gtggaaccac    480
tggacccctg gtgccaactg cagctcccag gctatcttcc cagcccccta cctgtacctc    540
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gatgagccct ccgccctggc ccgggccctt acctggaggc aggcaagggc acaggctgga    720
gccatgctgc tcttcgggct gtgctggggg ccctacgtgg ccacactgct cctctcagtc    780
ctggcctatg agcagcgccc gccactgggg cctgggacac tgttgtccct cctctcccta    840
ggaagtgcca gtgcagcggc agtgcccgta gccatggggc tgggcgatca gcgctacaca    900
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gacagtcccg gccccagcat tgcctaccac ccaagcagcc aaagcagtgt cgacctggac    1020
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agtctagagg gcccgcggtt cgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtctcgat    1140
tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cattga                              1176
<210>6
<211>391
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>新颖序列
<400>6
Met Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser Leu Thr Pro Ash
1               5                   10                  15
Ser Thr Gly Glu Val Pro Ser Pro Ile Pro Lys Gly Ala Leu Gly Leu
            20                  25                  30
Ser Leu Ala Leu Ala Ser Leu Ile Ile Thr Ala Asn Leu Leu Leu Ala
        35                  40                  45
Leu Gly Ile Ala Trp Asp Arg Arg Leu Arg Ser Pro Pro Ala Gly Cys
    50                  55                  60
Phe Phe Leu Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Leu Ala Leu
65                  70                  75                  80
Pro Thr Leu Pro Gly Leu Trp Asn Gln Ser Arg Arg Gly Tyr Trp Ser
                85                  90                  95
Cys Leu Leu Val Tyr Leu Ala Pro Asn Phe Ser Phe Leu Ser Leu Leu
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Ala Asn Leu Leu Leu Val His Gly Glu Arg Tyr Met Ala Val Leu Arg
        115                 120                 125
Pro Leu Gln Pro Pro Gly Ser Ile Arg Leu Ala Leu Leu Leu Thr Trp
    130                 135                 140
Ala Gly Pro Leu Leu Phe Ala Ser Leu Pro Ala Leu Gly Trp Asn His
145                 150                 155                 160
Trp Thr Pro Gly Ala Asn Cys Ser Ser Gln Ala Ile Phe Pro Ala Pro
                165                 170                 175
Tyr Leu Tyr Leu Glu Val Tyr Gly Leu Leu Leu Pro Ala Val Gly Ala
            180                 185                 190
Ala Ala Phe Leu Ser Val Arg Val Leu Ala Thr Ala His Arg Gln Leu
        195                 200                 205
Gln Asp Ile Cys Arg Leu Glu Arg Ala Val Cys Arg Asp Glu Pro Ser
    210                 215                 220
Ala Leu Ala Arg Ala Leu Thr Trp Arg Gln Ala Arg Ala Gln Ala Gly
225                 230                 235                 240
Ala Met Leu Leu Phe Gly Leu Cys Trp Gly Pro Tyr Val Ala Thr Leu
                245                 250                 255
Leu Leu Ser Val Leu Ala Tyr Glu Gln Arg Pro Pro Leu Gly Pro Gly
            260                 265                 270
Thr Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Gly Ser Ala Ser Ala Ala Ala Val
        275                 280                 285
Pro Val Ala Met Gly Leu Gly Asp Gln Arg Tyr Thr Ala Pro Trp Arg
    290                 295                 300
Ala Ala Ala Gln Arg Cys Leu Gln Gly Leu Trp Gly Arg Ala Ser Arg
305                 310                 315                 320
Asp Ser Pro Gly Pro Ser Ile Ala Tyr His Pro Ser Ser Gln Ser Ser
                325                 330                 335
Val Asp Leu Asp Leu Asn Glu Phe Gly Ser Lys Gly Asn Ser Ala Asp
            340                 345                 350
Ile Gln His Ser Gly Gly Arg Ser Ser Leu Glu Gly Pro Arg Phe Glu
        355                 360                 365
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr
    370                 375                 380
Gly His His His His His His
385                 390
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>7
gacaagcttg acgcccaaca gcactggcga g         31
<210>8
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>8
cttgaattcg ttcaagtcca ggtcgacact gc        32
<210>9
<211>36
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>9
gatcaagctt ccatggcgtg ctgcctgagc gaggag    36
<210>10
<211>53
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>10
gatcggatcc ttagaacagg ccgcagtcct tcaggttcag ctgcaggatg gtg    53
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>11
ctacctgtac ctcgaagtct a                                       21
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物序列
<400>12
agtggcgggc gctgctcat                                          19
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>小鼠引物序列
<400>13
tgagctgtcg gccattccca t                                       21
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>小鼠引物序列
<400>14
gattgtccct cttggctctt c                                       21

Claims (140)

1.一种鉴别一种或一种以上作为RUP43 GPCR调节物的候选化合物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述受体偶合至G蛋白；所述方法包含以下步骤：
(a)使候选化合物与所述受体接触；以及
(b)测定受体功能性是否受到调节；
其中受体功能性的变化表示所述候选化合物为RUP43 GPCR的调节物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPR131氨基酸序列选自由下列序列组成的群组：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其附带条件为所述RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ ID NO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；
(d)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(e)SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
(f)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(g)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(h)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代，其附带条件为所述RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ IDNO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；以及
(j)由在严格条件下与SEQ ID NO：1的互补体杂交的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述RUP43 GPCR是重组RUP43GPCR。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述接触包含与表达所述RUP43 GPCR的宿主细胞接触或与所述宿主细胞的细胞膜接触，其中所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码所述RUP43 GPCR的多核苷酸。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中所述接触在所述RUP43GPCR的已知激动剂存在下进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述接触在化合物1、化合物2或化合物3存在下进行。
7.一种鉴别一种或一种以上作为哺乳动物中血糖浓度的调节物的候选化合物的方法，所述方法包含以下步骤：
(a)使候选化合物与包含GPR131氨基酸序列的GPCR接触，其中所述受体偶合至G蛋白；以及
(b)测定受体功能性是否受到调节；
其中受体功能性的变化表示所述候选化合物为哺乳动物中血糖浓度的调节物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述GPR131氨基酸序列选自由下列序列组成的群组：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其附带条件为所述RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ ID NO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；
(d)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(e)SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
(f)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(g)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(h)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代，其附带条件为所述RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ IDNO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；以及
(j)由在严格条件下与SEQ ID NO：1的互补体杂交的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述RUP43 GPCR是重组RUP43GPCR。
10.根据权利要求7至9中任一权利要求所述的方法，其中所述接触包含与表达所述RUP43 GPCR的宿主细胞接触或与所述宿主细胞的细胞膜接触，其中所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码所述RUP43 GPCR的多核苷酸。
11.根据权利要求7至10中任一权利要求所述的方法，其中所述接触在所述RUP43GPCR的已知激动剂存在下进行。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述接触在化合物1、化合物2和化合物3存在下进行。
13.根据权利要求1至12中任一权利要求所述的方法，其中受体功能性的增加表示所述候选化合物为降低哺乳动物中血糖浓度的化合物。
14.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的方法，其中所述测定是通过测量第二信使的水平来进行，所述第二信使选自由环状AMP(cAMP)、环状GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二酰甘油(DAG)和Ca2+组成的群组。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述cAMP的胞内水平增加。
16.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的方法，其中所述测定是通过使用黑素细胞检定来进行，或通过测量结合至包含所述RUP43 GPCR的膜的GTPγS来进行。
17.一种制备RUP43 GPCR的调节物的方法，其包含以下步骤：
(a)根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法鉴别所述调节物；以及
(b)合成(a)中所鉴别的所述调节物。
18.一种根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法鉴别的调节物。
19.根据权利要求18所述的调节物或根据权利要求17所述的方法，其中所述调节物选自由激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂组成的群组。
20.根据权利要求18所述的调节物或根据权利要求17所述的方法，其中所述调节物为激动剂。
21.根据权利要求20所述的激动剂，其中所述激动剂为部分激动剂。
22.根据权利要求18所述的调节物或根据权利要求17所述的方法，其中所述调节物增加所述RUP43 GPCR的功能性。
23.根据权利要求18所述的调节物或根据权利要求17所述的方法，其中所述调节物增加所述cAMP的胞内水平。
24.一种式(II)的化合物：
Figure A2005800187300005C1
或其医药学上可接受的盐，
其中：
R1为H或C1-6烷基；
R2为2-甲基-4，5，6，7-四氢-2H-吲唑-3-基；或
R1和R2连同其所键结的氮形成3，4-二氢-2H-喹啉-1-基；且
R10和R11各自独立地为H或卤素。
25.一种制备医药组合物或生理学上可接受的组合物的方法，其包含混合载剂和RUP43GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。
26.一种调节RUP43 GPCR的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使所述受体与所述受体的调节物接触。
27.一种调节RUP43 GPCR的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于降低需要降低血糖浓度的哺乳动物的血糖浓度，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的所述受体的调节物接触。
28.一种调节RUP43 GPCR的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于预防或治疗需要预防或治疗代谢病症的哺乳动物的代谢病症，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的所述受体的调节物接触，其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
29.一种调节RUP43 GPCR的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于预防或治疗需要预防或治疗血糖浓度升高并发症的哺乳动物的血糖浓度升高并发症，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的所述受体的调节物接触，其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
30.一种降低需要降低血糖浓度的哺乳动物的血糖浓度的方法，其包含使治疗有效量的RUP43 GPCR的调节物与所述受体接触，所述受体包含GPR131氨基酸序列。
31.一利预防或治疗需要预防或治疗代谢病症的哺乳动物的代谢病症的方法，其包含使治疗有效量的RUP43 GPCR调节物与所述受体接触，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
32.一种预防或治疗需要预防或治疗血糖浓度升高并发症的哺乳动物的血糖浓度升高并发症的方法，其包含使治疗有效量的RUP43 GPCR调节物与所述受体接触，所受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
33.一种降低哺乳动物中血糖浓度的方法，其包含向需要所述降低的哺乳动物提供或投用RUP43 GPCR调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。
34.一种预防或治疗代谢病症的方法，其包含向需要所述预防或治疗的哺乳动物提供或投用RUP43 GPCR调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
35.一种预防或治疗血糖浓度升高并发症的方法，其包含向需要所述预防或治疗的哺乳动物提供或投用RUP43 GPCR调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
36.根据权利要求27至35中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物为人类。
37.根据权利要求27至36中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物是根据权利要求18至23中任一权利要求所述。
38.根据权利要求27至36中任一权利要求所述的方法，其中所述RUP43 GPCR的调节物为所述RUP43 GPCR的激动剂。
39.根据权利要求27至36中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物为根据权利要求24所述的化合物。
40.根据权利要求27至36中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。
41.根据权利要求27至40中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物为增加自哺乳动物获得的脂肪细胞的葡萄糖摄取的化合物。
42.根据权利要求27至40中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物为增加自哺乳动物获得的骨骼肌细胞的葡萄糖摄取的化合物。
43.一种降低哺乳动物中的血糖的方法，其包含向需要所述降低的哺乳动物提供或投用GPR131 GPCR的激动剂。
44.一种预防或治疗代谢病症的方法，其包含向需要所述预防或治疗的哺乳动物提供或投用GPR131 GPCR的激动剂，其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
45.根据权利要求34所述的方法，其中所述代谢病症为糖尿病。
46.根据权利要求34所述的方法，其中所述代谢病症为葡萄糖耐受性异常。
47.根据权利要求34所述的方法，其中所述代谢病症为胰岛素抗性。
48.根据权利要求34所述的方法，其中所述代谢病症为高胰岛素血症。
49.一种预防或治疗血糖浓度升高并发症的方法，其包含向需要所述预防或治疗的哺乳动物提供或投用GPR131 GPCR的激动剂，其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
50.根据权利要求27至35中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物为人类。
51.一种包含、基本上由或由RUP43 GPCR的调节物组成的医药组合物或生理学上可接受的组合物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。
52.一种包含RUP43 GPCR调节物和医药学上可接受的载剂的医药组合物，所述受体包含GPR131氨基酸序列。
53.根据权利要求52所述的医药组合物，其中所述调节物是根据权利要求18至23中任一权利要求所述。
54.根据权利要求52所述的医药组合物，其中所述RUP43 GPCR的调节物为所述RUP43 GPCR的激动剂。
55.根据权利要求52所述的医药组合物，其中所述调节物为根据权利要求24所述的化合物。
56.根据权利要求52所述的医药组合物，其中所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。
57.根据权利要求52至56中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述调节物为增加自哺乳动物获得的脂肪细胞的葡萄糖摄取的化合物。
58.根据权利要求52至56中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述调节物为增加自哺乳动物获得的骨骼肌细胞的葡萄糖摄取的化合物。
59.一种降低哺乳动物中的血糖的方法，其包含向需要所述降低的哺乳动物提供或投用根据权利要求52至58中任一权利要求所述的医药组合物。
60.一种预防或治疗代谢病症的方法，其包含向需要所述预防或治疗的哺乳动物提供或投用根据权利要求52至58中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
61.一种预防或治疗血糖浓度升高并发症的方法，其包含向需要所述预防或治疗的哺乳动物提供或投用根据权利要求52至58中任一权利要求所述的医药组合物，其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
62.根据权利要求59至61中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物为人类。
63.一种RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述调节物用于通过疗法来治疗人体或动物体的方法中。
64.一种RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述调节物用于通过疗法来降低人体或动物体中的血糖浓度的方法中。
65.一种RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述调节物用于通过疗法来预防或治疗人体或动物体中的代谢病症的方法中，其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
66.一种RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述调节物用于通过疗法来预防或治疗人体或动物体中的血糖浓度升高并发症的方法中，其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
67.根据权利要求63至66中任一权利要求所述的方法，其中所述动物为哺乳动物。
68.根据权利要求63至67中任一权利要求所述的调节物，其中所述调节物是根据权利要求18至23中任一权利要求所述。
69.根据权利要求63至67中任一权利要求所述的方法，其中所述RUP43 GPCR的调节物为所述RUP43 GPCR的激动剂。
70.根据权利要求63至67中任一权利要求所述的调节物，其中所述调节物为根据权利要求24所述的化合物。
71.根据权利要求63至67中任一权利要求所述的调节物，其中所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。
72.根据权利要求63至71中任一权利要求所述的调节物，其中所述调节物为增加自哺乳动物获得的脂肪细胞的葡萄糖摄取的化合物。
73.根据权利要求63至71中任一权利要求所述的调节物，其中所述调节物为增加自哺乳动物获得的骨骼肌细胞的葡萄糖摄取的化合物。
74.一种使用RUP43 GPCR调节物制备用于降低血糖浓度的药物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列。
75.一种使用RUP43 GPCR调节物制备用于预防或治疗代谢病症的药物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
76.一种使用RUP43 GPCR调节物制备用于预防或治疗血糖浓度升高并发症的药物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
77.根据权利要求74至76中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物是根据权利要求18至23中任一权利要求所述。
78.根据权利要求74至76中任一权利要求所述的方法，其中所述RUP43 GPCR的调节物为所述RUP43 GPCR的激动剂。
79.根据权利要求74至76中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物为根据权利要求24所述的化合物。
80.根据权利要求74至76中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。
81.根据权利要求74至80中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物为增加自哺乳动物获得的脂肪细胞的葡萄糖摄取的化合物。
82.根据权利要求74至80中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物为增加自哺乳动物获得的骨骼肌细胞的葡萄糖摄取的化合物。
83.一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含以下步骤：
(a)根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法鉴别所述受体的调节物；
以及
(b)使所述受体与(a)中所鉴别的所述调节物接触。
84.一种制备医药组合物或生理学上可接受的组合物的方法，其包含以下步骤：
(a)根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法鉴别RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列；以及
(b)混合载剂和(a)中所鉴别的所述调节物。
85.一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于降低需要降低血糖浓度的哺乳动物的血糖浓度，所述方法包含以下步骤：
(a)根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法鉴别所述受体的调节物；
以及
(b)使所述受体与治疗有效量的(a)中所鉴别的所述调节物接触。
86.一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于预防或治疗需要预防或治疗代谢病症的哺乳动物的代谢病症，所述方法包含以下步骤：
(a)根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法鉴别所述受体的调节物；
以及
(b)使所述受体与治疗有效量的(a)中所鉴别的所述调节物接触；
其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(i)糖尿病；
(ii)葡萄糖耐受性异常；
(iii)胰岛素抗性；和
(iv)高胰岛素血症。
87.一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于预防或治疗需要预防或治疗血糖浓度升高并发症的哺乳动物的血糖浓度升高并发症，所述方法包含以下步骤：
(a)根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法鉴别所述受体的调节物；
以及
(b)使所述受体与治疗有效量的(a)中所鉴别的所述调节物接触；
其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(i)综合症X；
(ii)动脉粥样硬化；
(iii)动脉粥样化疾病；
(iv)心脏病；
(v)高血压；
(vi)中风；
(vii)神经病；
(viii)视网膜病；
(ix)肾病；和
(x)周边血管疾病。
88.一种降低需要降低血糖浓度的哺乳动物的血糖浓度的方法，其包含以下步骤：
(a)根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法鉴别RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列；以及
(b)使治疗有效量的(a)中所鉴别的所述调节物与所述受体接触。
89.一种预防或治疗需要预防或治疗代谢病症的哺乳动物的代谢病症的方法，其包含以下步骤：
(a)根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法鉴别RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列；以及
(b)使治疗有效量的(a)中所鉴别的所述调节物与所述受体接触；其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(i)糖尿病；
(ii)葡萄糖耐受性异常；
(iii)胰岛素抗性；和
(iv)高胰岛素血症。
90.一种预防或治疗需要预防或治疗血糖浓度升高并发症的哺乳动物的血糖浓度升高并发症的方法，其包含以下步骤：
(a)根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法鉴别RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列；以及
(b)使治疗有效量的(a)中所鉴别的所述调节物与所述受体接触；其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(i)综合症X；
(ii)动脉粥样硬化；
(iii)动脉粥样化疾病；
(iv)心脏病；
(v)高血压；
(vi)中风；
(vii)神经病；
(viii)视网膜病；
(ix)肾病；和
(x)周边血管疾病。
91.一种降低哺乳动物中的血糖的方法，其包含以下步骤：
(a)根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法鉴别RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列；以及
(b)向需要所述降低的哺乳动物提供或投用(a)中所鉴别的所述调节物。
92.一种预防或治疗代谢病症的方法，其包含以下步骤：
(a)根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法鉴别RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列；以及
(b)向需要所述预防或治疗的哺乳动物提供或投用(a)中所鉴别的所述调节物；
其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(i)糖尿病；
(ii)葡萄糖耐受性异常；
(iii)胰岛素抗性；和
(iv)高胰岛素血症。
93.一种预防或治疗血糖浓度升高并发症的方法，其包含以下步骤：
(a)根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法鉴别RUP43 GPCR的调节物，所述受体包含GPR131氨基酸序列；以及
(b)向需要所述预防或治疗的哺乳动物提供或投用(a)中所鉴别的所述调节物；
其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(i)综合症X；
(ii)动脉粥样硬化；
(iii)动脉粥样化疾病；
(iv)心脏病；
(v)高血压；
(vi)中风；
(vii)神经病；
(viii)视网膜病；
(ix)肾病；和
(x)周边血管疾病。
94.根据权利要求85至93中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物为人类。
95.一种使用RUP43 GPCR调节物制备用于降低血糖浓度的药物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含执行根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法以由此鉴别所述调节物的步骤。
96.一种使用RUP43 GPCR调节物制备用于预防或治疗代谢病症的药物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含执行根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法以由此鉴别所述调节物的步骤；
其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
97.一种使用RUP43 GPCR调节物制备用于预防或治疗血糖浓度升高并发症的药物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含执行根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法以由此鉴别所述调节物的步骤；
其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
98.根据权利要求85至97中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物是根据权利要求18至23中任一权利要求所述。
99.根据权利要求85至97中任一权利要求所述的方法，其中所述RUP43 GPCR的调节物为所述RUP43 GPCR的激动剂。
100.根据权利要求85至97中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物为根据权利要求24所述的化合物。
101.根据权利要求85至97中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物为化合物1、化合物2或化合物3。
102.根据权利要求85至101中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物为增加自哺乳动物获得的脂肪细胞的葡萄糖摄取的化合物。
103.根据权利要求85至101中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物为增加自哺乳动物获得的骨骼肌细胞的葡萄糖摄取的化合物。
104.一种制备医药组合物的方法，其包含混合根据权利要求24所述的化合物和医药学上可接受的载剂。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述化合物为化合物1、化合物2或化合物3。
106.一种医药组合物，其包含根据权利要求24所述的化合物和医药学上可接受的载剂。
107.根据权利要求106所述的医药组合物，其中所述化合物为化合物1、化合物2或化合物3。
108.一种调节RUP43 GPCR的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使所述受体与根据权利要求24所述的化合物或根据权利要求106或权利要求107所述的医药组合物接触。
109.一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于降低需要降低血糖浓度的哺乳动物的血糖浓度，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的根据权利要求24所述的化合物或根据权利要求106或权利要求107所述的医药组合物接触。
110.一种调节RUP43 GPCR活性的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于预防或治疗需要预防或治疗代谢病症的哺乳动物的代谢病症，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的根据权利要求24所述的化合物或根据权利要求106或权利要求107所述的医药组合物接触，其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
111.一种调节RUP43 GPCR的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述调节是用于预防或治疗需要预防或治疗血糖浓度升高并发症的哺乳动物的血糖浓度升高并发症，所述方法包含使所述受体与治疗有效量的根据权利要求24所述的化合物或根据权利要求106或权利要求107所述的医药组合物接触，其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
112.一种降低需要降低血糖浓度的哺乳动物的血糖浓度的方法，其包含使治疗有效量的根据权利要求24所述的化合物或根据权利要求106或权利要求107所述的医药组合物与RUP43 GPCR接触，所述受体包含GPR131氨基酸序列。
113.一种预防或治疗需要预防或治疗代谢病症的哺乳动物的代谢病症的方法，其包含使治疗有效量的根据权利要求24所述的化合物或根据权利要求106或权利要求107所述的医药组合物与RUP43 GPCR接触，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
114.一种预防或治疗需要预防或治疗血糖浓度升高并发症的哺乳动物的血糖浓度升高并发症的方法，其包含使治疗有效量的根据权利要求24所述的化合物或根据权利要求106或权利要求107所述的医药组合物与RUP43 GPCR接触，所述受体包含GPR131氨基酸序列，其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
115.一种降低血糖浓度的方法，其包含向需要所述降低的哺乳动物提供或投用治疗有效量的根据权利要求24所述的化合物或根据权利要求106或权利要求107所述的医药组合物。
116.一种预防或治疗代谢病症的方法，其包含向需要所述预防或治疗的哺乳动物提供或投用治疗有效量的根据权利要求24所述的化合物或根据权利要求106或权利要求107所述的医药组合物，其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
117.一种预防或治疗血糖浓度升高并发症的方法，其包含向需要所述预防或治疗的哺乳动物提供或投用治疗有效量的根据权利要求24所述的化合物或根据权利要求106或权利要求107所述的医药组合物，其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
118.根据权利要求109至117中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物为人类。
119.根据权利要求108至118中任一权利要求所述的方法，其中所述化合物为化合物1、化合物2或化合物3。
120.根据权利要求108至119中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物为增加自哺乳动物获得的脂肪细胞的葡萄糖摄取的化合物。
121.根据权利要求108至119中任一权利要求所述的方法，其中所述调节物为增加自哺乳动物获得的骨骼肌细胞的葡萄糖摄取的化合物。
122.根据权利要求24所述的化合物，其用于通过疗法来治疗人体或动物体的方法中。
123.根据权利要求24所述的化合物，其用于通过疗法来降低人体或动物体中的血糖浓度的方法中。
124.根据权利要求24所述的化合物，其用于通过疗法来预防或治疗人体或动物体中的代谢病症的方法中，其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
125.根据权利要求24所述的化合物，其用于通过疗法来预防或治疗人体或动物体中的血糖浓度升高并发症的方法中，其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
126.根据权利要求122至125中任一权利要求所述的化合物，其中所述化合物为化合物1、化合物2或化合物3。
127.根据权利要求122至126中任一权利要求所述的化合物，其中所述动物为哺乳动物。
128.一种使用根据权利要求24所述的化合物制备用于降低血糖浓度的药物的方法。
129.一种使用根据权利要求24所述的化合物制备用于预防或治疗代谢病症的药物的方法，其中所述代谢病症选自由下列病症组成的群组：
(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性异常；
(c)胰岛素抗性；和
(d)高胰岛素血症。
130.一种使用根据权利要求24所述的化合物制备用于预防或治疗血糖浓度升高并发症的药物的方法，其中所述并发症选自由下列病症组成的群组：
(a)综合症X；
(b)动脉粥样硬化；
(c)动脉粥样化疾病；
(d)心脏病；
(e)高血压；
(f)中风；
(g)神经病；
(h)视网膜病；
(i)肾病；和
(j)周边血管疾病。
131.根据权利要求128至130中任一权利要求所述的方法，其中所述化合物为化合物1、化合物2或化合物3。
132.一种鉴别一种或一种以上作为结合至RUP43 GPCR的化合物的候选化合物的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含以下步骤：
(a)在所述候选化合物存在或不存在下，使所述受体与所述受体的可检测标记的已知配体接触；和
(b)测定所述经标记的已知配体与所述受体的结合是否在所述候选化合物存在下受到抑制；
其中所述抑制作用指示所述候选化合物为结合至所述RUP43 GPCR的化合物。
133.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPR131氨基酸序列选自由下列序列组成的群组：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其附带条件为所述RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ ID NO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；
(d)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(e)SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
(f)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(g)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(h)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代，其附带条件为所述RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ IDNO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；以及
(j)由在严格条件下与SEQ ID NO：1的互补体杂交的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
134.根据权利要求132或权利要求133所述的方法，其中所述接触包含与表达所述GPCR的宿主细胞接触或与所述宿主细胞的细胞膜接触。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码所述受体的多核苷酸。
136.根据权利要求132至135中任一权利要求所述的方法，其中所述已知配体为化合物1、化合物2或化合物3。
137.一种检测结合至RUP43 GPCR的配体的方法，所述受体包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含以下步骤：
(a)在允许所述受体与测试配体之间相互作用的条件下，使所述测试配体与表达所述受体的宿主细胞接触或与所述宿主细胞的细胞膜接触；和
(b)检测结合至所述受体的配体。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述GPR131氨基酸序列选自由下列序列组成的群组：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其附带条件为所述RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ ID NO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；
(d)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(e)SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
(f)由包含核酸序列的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列，所述核酸序列可通过包含使用引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8对人类DNA样品执行PCR的方法而获得；
(g)SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(h)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代；
(i)SEQ ID NO：2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸位置223的丙氨酸由赖氨酸取代，其附带条件为RUP43 G蛋白偶合受体不包含在SEQ ID NO：2的氨基酸位置1的甲硫氨酸残基；以及
(j)由在严格条件下与SEQ ID NO：1的互补体杂交的多核苷酸编码的G蛋白偶合受体的氨基酸序列。
139.根据权利要求137或权利要求138所述的方法，其中所述接触包含与表达所述GPCR的宿主细胞接触或与所述宿主细胞的细胞膜接触。
140.根据权利要求139所述的方法，其中所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码所述受体的多核苷酸，其中所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码所述受体的多核苷酸。
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