CN101022816A - 治愈伤口的方法及组合物 - Google Patents

Abstract

处理动物创伤的方法、装置及组合物，其包括低于常用浓度的过氧化氢。所述的方法、装置及组合物提高了治愈伤口的速度。

Description

治愈伤口的方法及组合物

技术领域

本申请要求在2004年6月18日提交的美国实用新型申请10/871158的优先权，其全文在此全部引入作为参考。

本发明一般涉及治疗伤口的方法及组合物。

背景技术

近年来人们已经确信活性氧物质(ROS)主要对活细胞具有损害作用。事实上，人们已经将具有氧化作用功效的ROS如过氧化氢和臭氧用作消毒剂。这些氧化作用是非特异性的。它们除了可以消灭不需要的微生物外，还产生了相当的间接损伤。因此，在消毒中常用剂量的过氧化氢可以破坏活体组织。

然而，人们已经发现低剂量的过氧化氢在治愈过程中具有令人吃惊的效果。本发明涉及低剂量过氧化氢用于治愈伤口的用途。

发明简述

本发明提供了提高哺乳动物中的创伤治愈速度的方法，所述方法包括向创伤施用约500纳摩尔至约50微摩尔的过氧化氢/每平方厘米创伤。在一些实施方式中，所述方法包括施用约1至约50微摩尔、约1至约10微摩尔、约1至约2微摩尔的过氧化氢/每平方厘米创伤。可以施用到所述创伤的所述过氧化氢的来源可以选自例如酶来源和化学来源。在一些实施方式中，所述过氧化氢的来源是化学来源，并且所述来源是过氧化氢。

本发明也提供了提高哺乳动物中的创伤治愈速度的方法，包括在约12小时至24小时的时间段里以每平方厘米创伤约500纳摩尔至约50微摩尔的比率施用过氧化氢。在一些实施方式中，以约1至10微摩尔的比率施用所述过氧化氢。所述过氧化氢可以以药学上可接受的组合物形式施用，所述药学上可接受的组合物选自例如凝胶、洗剂、油膏、霜、糊和液体的形式。

所述过氧化氢可以以药学上可接受的装置形式施用。所述药学上可接受的装置包括但不限于绷带、外科敷料、纱布、粘合带、外科卡钉、夹子、止血钳、子宫内装置、缝合用线、套管针、导管、管子和植入物。植入物包括但不限于药丸、小球、棒条、圆片、圆盘和药片。

所述装置可以包括聚合物材料，所述聚合物材料可以包括可吸收的材料。在一些实施方式中，所述可吸收的材料包括合成的材料。合成的材料可以选自纤维素聚合物、乙醇酸聚合物、甲基丙烯酸酯聚合物、乙烯-乙酸乙烯基酯聚合物、乙烯-乙烯醇共聚物、聚己内酰胺、聚乙酸酯、丙交酯和乙交酯的共聚物、聚二烷酮、丙交酯乙交酯共聚酯、聚卡普隆、聚葡糖酸盐、聚葡糖酸和它们的组合。在一些实施方式中，所述可吸收的材料包括非合成的材料。非合成的材料可以选自肠线、cargile膜、阔筋膜、凝胶、胶原和它们的组合。

所述装置可以包括聚合物材料，所述聚合物材料可以包括不可吸收的材料。在一些实施方式中，所述不可吸收的材料包括合成的材料。合成的材料可以选自尼龙、人造丝、聚酯、聚烯烃和它们的组合。在一些实施方式中，所述不可吸收的材料包括非合成的材料。非合成的材料可以选自丝、皮肤(dermal)丝、棉、亚麻和它们的组合。

所述方法可以用于治疗选自伤口、溃疡和烧伤的创伤。伤口可以选自急性伤口和慢性伤口。所述伤口可以选自全层伤口和部分层伤口。急性伤口可以选自例如外科伤口、渗透伤口、撕裂损伤、碾碎损伤、剪切损伤、烧伤、裂伤和咬伤的伤口。慢性伤口可以选自动脉溃疡、静脉溃疡、压力溃疡和糖尿病溃疡。

本发明也提供用于创伤给药的过氧化氢供给装置，所述装置包括过氧化氢和载体材料，所述装置在至少约12小时的时间段释放所述的过氧化氢，其中从所述装置中释放的过氧化氢的浓度不足以产生创面的坏死。在一些实施方式中，所述装置释放约0.5-50μmol过氧化氢/cm²伤口/12小时至约0.5-50μmol/cm²伤口/24小时。所述载体材料可以包括聚合物材料。在一些实施方式中，所述聚合物材料包括可吸收的材料。在一些实施方式中，所述聚合物材料包括合成的材料。

本发明还提供了治疗哺乳动物创伤的组合物，所述组合物包括过氧化氢和药学上可接受的载体，其中所述组合物的单位剂量包括约0.5至约50μmol过氧化氢/cm²伤口。在一些实施方式中，所述载体包括凝胶材料，并且在一些实施方式中，所述载体包括液体材料。

本发明将在之后的说明书中提供一部分另外的目的和优点，并且从说明书中部分是显而易见的，或者通过说明书的实践可以获知。本发明的目的和优点将通过特别在附加的权利要求中指出的元素和组合实现和获得。

可以理解，上述一般的描述和下面详细的描述都是示范性的，并且只是作为解释，并不是如权利要求所述的对本发明的限制。

附图简述

图1.ROS在伤口位点上的存在。

A.在伤口流体中的H₂O₂浓度。通过切割伤口将Hunt/Schilling丝网柱皮下插入5周龄C57BL/6小鼠的背部上。5天后，收集伤口流体，用如下面描述的实时电化学技术来测量在流体中的稳态H₂O₂浓度。在PBS中收集基线。在用箭头指示的时间将伤口流体(0.15ml)加入到DPBS(1ml)中。当用标准曲线时，在伤口流体中所测定的H₂O₂浓度为1.1μM。

B.从伤口洗涤液中测量的DMPO加合物的EPR光谱。所述光谱是由在0小时(假对照，上面的组)受伤12小时后(下面的组)从伤口空腔中收集的DMPO(100Mm，0.1ml)流出物获得的。在下面一组的光谱被鉴定为具有下列偶合常数的DMPO-OH的光谱：aN＝14.90G，aH＝14。90。获得数据的参数为：微波频率9.8682GHz、扫描宽度100G、微波功率20mW、调制幅度0.5G、调制频率100kHz、时间常数80msec。

C.在正常皮肤和伤口边缘的组织中产生超氧化物。在受伤12小时后采集伤口边缘试样并立即在OCT中冷冻。用DHE(0.01mM，20分钟，200x)孵育新鲜的30微米的切片以检测O^- ₂，并且通过共焦显微镜进行观察。

图2.过氧化氢酶过量表达减弱了愈合。将待受伤的皮肤在受伤前5天皮下注射一次过氧化氢酶、LacZ(对照)或腺病毒(10¹¹pfu)用于在伤口位点上过氧化氢酶最大限度的过量表达。在8周龄C57BL/6小鼠(图2)的背部皮肤上划2个8×16mm全厚度二级人为伤口。

A.显示出与用对照Ad LacZ病毒处理的侧面相比，用Ad过氧化氢酶(AdCat)病毒处理的侧面的过氧化氢酶过量表达的所感染的皮肤的蛋白质印迹。用β-肌动蛋白再次探测印记以显示试样的相等的负载。

B.显示出在所指示的受伤后天所测定的伤口闭合占起始伤口的面积的百分比。虚线代表未经病毒感染的用盐水处理的C57BL/6小鼠(空心圆○)的标准治愈的曲线。AdCat处理(实心三角形)，AdlacZ处理(实心圆●)，^*p＜0.05，与LacZ处理的侧面相比较。

C.在两个伤口都闭合的那天在取样的伤口位点，在用福尔马林固定的再生皮肤的石蜡切片上进行Masson三色染色。AdCat侧面显示出表示皮肤再生不完全(与对照相比)的较宽的HE区域，与缓慢的闭合是一致的。Es，焦痂；G，粒化组织；HE。

图3.在伤口愈合处局部施用H₂O₂：剂量是关键点。

在C57BL/6雄性小鼠(8周龄)的背部皮肤上划2个8×16mm全厚度外切伤口(插图)。两个伤口中的每一个局部用H₂O₂或盐水处理。

A.与用安慰剂(实心圆●)处理的侧面相比较，用低剂量H₂O₂(1.25微摩尔/伤口、或0.025ml 0.15％的溶液/伤口，每天一次，0-4天，空心圆○)处理适度地加快了伤口的愈合，^*p＜0.05。

B.用低剂量H₂O₂处理对于伤口微生物群是无毒的。为了测定表面的微生物群，用顶端具有藻酸盐的涂敷器擦洗(受伤24-48小时后)伤口20秒钟(用1.25微摩尔H₂O₂/伤口处理的，空心条或用盐水处理的，实心条)。对表面负载的细菌进行定量评估。对于深部组织伤口的微生物群，在受伤后48小时将焦痂组织除去，对于在焦痂下面的愈伤组织进行采样，并且进行细菌载量的定量评估。所显示的数值代表4个观察对象的CFU的平均值±SD。

C.用高剂量(高，25微摩尔/伤口、实心圆●或0.025ml 3％的溶液相与低，1.25微摩尔/伤口或0.025ml 0.15％，空心圆○，每天一次，0-4天比较)H₂O₂处理对于伤口的愈合具有不利的作用，与用低剂量H₂O₂处理比较，^*p＜0.05。用较高浓度(插图)的H₂O₂(62.5微摩尔/伤口，处理左侧；0.025ml的7.5％的溶液/伤口，在0天一次)处理引起组织坏死的损伤以及导致小鼠死亡的严重伤害。

图4.伤口以及H₂O₂诱导的与基因有关的血管生成、血管化和伤口边缘血流量的变化。将成对的外切伤口(图2)用安慰剂盐水或H₂O₂(1.25微摩尔/伤口，0-4天，每天一次)进行处理。在受伤后在指定的时间收集伤口边缘的组织。

A.核糖核酸酶保护试验(RPA)显示在安慰剂处理的伤口中与血管生成有关的mRNA表达的动力学。

B.用低剂量H₂O₂处理伤口进一步增加了如用RPA测定那样的伤口诱导的Flt-1和VEGF mRNA的表达。

C.用激光-多普勒血流成像装置非侵入地进行了伤口的血流量成像。显示出反映愈合后组织的血流量(右组)和数字照片(感兴趣区域，左组)的图像。出现的数据，即血流量的平均值±SD(条形图)。平均值代表在感兴趣区域内象素的所有有效血流量值的算术平均值。结果显示出所述的处理导致增加的血流量，一种增加的血管生成的功能性结果。

D.在受伤后第8天，将伤口边缘低温切割，通过用CD31(红色，若丹明)和DAP(蓝色，核)染色来估算血管生成；与对照相比(顶部)，由H₂O₂处理侧面(底部)所获得的在切片中更高丰度的CD31红色着色反映出更好的血管生成。

图5.在微血管内皮细胞和伤口边缘组织中H₂O₂诱导的焦点粘连激酶的磷酸化。采用指定的剂量和时间用H₂O₂对人类微血管内皮细胞(HMEC-1)进行处理。用蛋白质印迹和抗FAK的位点特异性抗体的磷酸化来检测FAK的磷酸化。天然的FAK或β-肌动蛋白被着上印迹以显示相等的负载。

A.不同剂量的H₂O₂处理对FAK的磷酸化(Ty925)状态的影响。

B.用H₂O₂(0.1mM)处理后在HMEC细胞中FAK的位点特异性活化磷酸化的动力学。

C.将成对的外切伤口(图2)用安慰剂盐水或H₂O₂(1.25微摩尔/伤口)处理。在受伤后30分钟收集伤口边缘的组织。用蛋白质印迹测定在伤口边缘组织中FAK的磷酸化。显示出三个动物(#1-#3)的数据。

图6.MCP-1和p47phox的缺少消弱了皮肤的愈合。在8周龄C57BL/6、MCP-1或p47phoxKO小鼠的背部皮肤上划2个外切伤口(图2)。两个伤口中的每一个用盐水或H₂O₂(1.25微摩尔/伤口、0-4天)处理。

A.RPA显示在用安慰剂处理的野生类型(C57BL/6)小鼠的伤口中，与mRNA表达有关的单核细胞/巨噬细胞趋化蛋白的动力学。

B.将用盐水(实心圆●)处理的C57BL/6伤口以及H₂O₂(实心三角形)或盐水(空心圆○)处理的MCP-1 KO小鼠伤口愈合显示为占起始伤口的面积百分比，^*p＜0.05，与盐水处理的C57BL/6相比较；#，p＜0.05；与盐水处理的KO相比较。

C.将用盐水(实心圆●)处理的C57BL/6伤口以及H₂O₂(实心三角形)或盐水(空心圆○)或p47Phox KO小鼠处理伤口的愈合显示为占起始伤口的面积百分比，^*p＜0.05，与盐水处理C57BL/6相比较，#，p＜0.05；与盐水处理KO相比较。

D.在受伤后第18天愈合后从伤口位点收集的p47Phox KO小鼠皮肤中角蛋白14(荧光绿)的表达。注意到与H₂O₂处理的侧面比较，在对照面中角蛋白14的表达更高，表明了愈合正在对照面发生，而H₂O₂处理的面显示出角蛋白的表达与正常皮肤是可比较的。

实施方式的描述

本发明将通过参考更详细的实施方式进行描述。但是，本发明可以通过不同的形式体现，并且不应当理解为被这里提出的实施方式所限制。更正确的，提供的这些实施方式使得这种公开是彻底和完全的，并且本领域技术人员将完全理解本发明的范围。

除非有相反的指示，这里使用的所有的技术和科学术语与属于与本发明相同技术领域的技术人员通常理解的含义是相同的。本发明说明书这里所使用的术语只是用于描述特定的实施方式，并不试图限制本发明。如本发明说明书和附加的权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”也包括复数形式，除非本文清楚表明有相反的含义。这里提及的所有的出版物、专利申请、专利和其他的参考文献的全文引入参考。

除非有相反的指示，在说明书和权利要求书中所使用的表达成分数量的数字和反应条件被理解当在所有实例中被术语“约”所修饰。相应地，除非有相反的指示，在下面说明书和附加的权利要求书中提出的数字参数是近似的，可以通过根据本发明欲获得的理想的特性进行变化。最后，并不试图限制将等同物原则应用到权利要求的保护范围，每一个数字参数应当参考有效数字的数目和通常的舍入方法来理解。

尽管阐明本发明宽泛范围的数值范围和参数是近似的，但是所报道的在特定实施例中提出的数值是尽可能精确的。但是，任何数值本身包含由于在它们各自的测试中发现的标准偏差而导致的必要的某些错误。本说明书中所给出的每个数值范围将包括落入在这样更宽泛数值范围内的每一狭小的范围，好像这样狭小的数值范围都在这里被书面表达了。

本发明一般涉及过氧化氢或它的来源在治愈创伤中的用途。在一些实施方式中，治愈的速率提高了。在一些实施方式中，伤痕减少了。本发明一般可以用于治疗在发生身体自然修复中的活体的损伤。本发明可以用于治疗如哺乳动物，特别包括人类的动物创伤。

这里使用的术语“创伤”，在一般含义上，是指它包括所有类型的伤口和损伤。一般含义可以使用的“伤口”是指它包括伤口、烧伤、溃疡等。“伤口”和“创伤”在这里可以互换使用，除非有相反的指示，在这里没有区别。创伤可以是伤口、烧伤、溃疡等。创伤/伤口可以是急性或慢性的。伤口可以是全厚度的，即穿透所有的皮肤层，或部分厚度的，即穿透少于所有的皮肤层。急性伤口的实例包括，但不限于外科伤口、渗透伤口、撕裂损伤、碾碎损伤、剪切损伤、烧伤、裂伤和咬伤。慢性伤口的实例包括，但不限于如动脉溃疡、静脉溃疡、压力溃疡和糖尿病溃疡的溃疡。当然，急性伤口可以变成慢性伤口。

施用于待治疗的创伤的组合物包括过氧化氢或过氧化氢来源。施用于创伤的过氧化氢的浓度少于常用的量，在一些实施方式中，少于对于微生物或其他活细胞产生氧化效果的量。在一些实施方式中，少于被接触组织产生坏死效应的量。在一些实施方式中，向每平方厘米(cm²)的创伤施用约500纳摩尔(nmol)至约50微摩尔(μmol)的过氧化氢。在一些实施方式中，向每立方厘米(cm³)的创伤施用约5μmol-约50μmol的过氧化氢。

向创伤施用过氧化氢的量可以在每平方厘米(cm²)约500、600、700、800或900nmol、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、或约10μmol或更高至约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、或约50μmol范围内。在一些实施方式中，向每立方厘米(cm³)的创伤施用约5μmol-约50μmol的过氧化氢。每平方厘米(cm²)创伤的所述量可以在1-50、1-25、1-10或1-2μmol范围内。向创伤施用过氧化氢的量可以在每立方厘米(cm³)约5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或约100μmol或更高至或20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、或约500μmol范围内。每立方厘米(cm²)创伤的所述量可以在10-500、10-250、10-100、或10-20μmol范围内。

施用于创伤的过氧化氢的浓度可以在约10、15、20、25、30、35、40、45、50、或约75mM至约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100mM或更高。因而，过氧化氢的浓度可以在约10至100mM、或在约25至约75mM、或在约40至约60mM范围内。

过氧化氢可以通过媒介物或载体的形式被施用，所述的载体包括但不限于液体、凝胶、洗剂、膏、霜、糊和液体。应用的方式将取决于过氧化氢采取的形式：例如液体可以被喷雾或倾倒；例如凝胶、洗剂、霜、糊和油膏可以被摩擦或按摩。在出版物如Remington的Pharmaceutical Science和其他相似的出版物中描述了用于供给过氧化氢的这些和其他的剂型和/或载体/媒介物。

传送的形式可以是均匀的，如在溶液中的过氧化氢的形式，或不均匀的，如在脂质体或微球中包含的过氧化氢的形式。所述的形式可以产生即时的效果，可替换地，或另外的，产生延迟的效果。例如，脂质体或微球或提供过氧化氢延迟释放的其他相似的方式可以在将过氧化氢暴露在创伤上期间用于延迟的作用。非包囊的过氧化氢也可以提供即时效果。

传送的形式也可以采用装置的形式，它可以在理想的时间将过氧化氢传送到创伤上。装置，包括但不限于绷带、外科敷料、纱布、粘合带、外科卡钉、夹子、止血钳、子宫内装置、缝合用线、套管针、导管、管子和植入物。植入物包括但不限于药丸、小球、棒条、圆片、圆盘和药片。

根据本发明的装置可以根据已知的方法制备，可以包括聚合物材料或由聚合物材料制造。在一些实例中，所述的聚合物材料是可吸收的材料。在另一些实例中，所述的聚合物材料是不可吸收的材料。当然，装置可以既包括可吸收的材料又包括不可吸收的材料。

可吸收的材料可以包括合成的材料和非合成的材料。可吸收的合成材料包括但不限于纤维素聚合物、乙醇酸聚合物、甲基丙烯酸酯聚合物、乙烯-乙酸乙烯基酯聚合物、乙烯-乙烯醇共聚物、聚己内酰胺、聚乙酸酯、丙交酯和乙交酯的共聚物、聚二烷酮、丙交酯乙交酯共聚酯、聚卡普隆和它们的组合。可吸收的非合成材料包括但不限于肠线、cargile膜、阔筋膜、凝胶、胶原和它们的组合。

不可吸收的合成材料包括但不限于尼龙、人造丝、聚酯、聚烯烃和它们的组合。不可吸收的非合成的材料包括但不限于丝、皮肤(dermal)丝、棉、亚麻和它们的组合。

也可考虑上述的装置和载体/媒介物的组合。例如，过氧化氢凝胶或膏剂可以通过浸入到绷带或伤口敷料里来将过氧化氢传送到需要的位置。作为另一个实例，可以给可插入的可吸收的装置负载过氧化氢溶液，并且在所需要的时间里将其从所述的装置中释放。用于传送所述过氧化氢的物理形式不是关键的，这样的装置的选择或设计也完全在本领域的技术人员的水平内。

传送到需要的靶点的过氧化氢可以是过氧化氢本身，或被传送的可以是前体。例如，将超氧化物通过超氧化物歧化酶转变成过氧化氢，所述的超氧化物歧化酶是天然存在在动物中的。因此，过氧化氢可以通过给药超氧化物而被供给到靶点上，所述超氧化物被转变成过氧化氢。

与过氧化氢类似的过氧化物可以通过传送例如特丁基过氧化氢来传送。所有这些类型的来源可以被看作是过氧化氢的化学来源。

过氧化氢也通过在身体内在血红蛋白和氧气之间进行反应产生超氧化物而自然地形成，然后通过超氧化物歧化酶将所述的超氧化物转变成过氧化氢。所述的过氧化氢在体内被一种称为过氧化氢酶的酶自然地分解。可以通过将过氧化氢酶抑制剂给药到靶点而使过氧化氢在创伤位点上积累。也可以通过给药另外的超氧化物歧化酶而引起过氧化氢的积累。人们认为这种将过氧化氢传送到创伤位点的方式是通过酶促源完成的。这种也可以被认为是一种过氧化氢的自然来源，与外源相反。

过氧化氢也可以作为大量反应的副产物而产生，包括，例如：1)葡萄糖+葡萄糖氧化酶；2)黄嘌呤+黄嘌呤氧化酶；3)次黄嘌呤+黄嘌呤氧化酶；和4)抗坏血酸+抗坏血酸氧化酶。过氧化氢的浓度也可以通过体内rac1、rac2、NADPH氧化酶和超氧化物歧化酶的过量表达而增加。所有这些被认为是过氧化氢的酶源，并且在本发明的范围内。

将过氧化氢供给到理想的位点上至少一次。在一些实施方式中，将过氧化氢传送到靶点上2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。所述的供给可以每2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或更多小时一次。如果需要重复的剂量，可以将装置或载体“程序化”以需要的次数来释放过氧化氢的量。例如，微球制剂可以包括未包囊的过氧化氢以在给药时具有即时的效果；在24小时释放第二剂量的包囊成分，在48小时释放第三剂量。这种处理策略由从业者处理。装置和载体的设计等在本领域技术水平内。

在本发明的实践中提供其他的条件也许是需要的。例如，确保创伤的靶点区域充分地含氧是需要的。一般而言，存在大气中的氧气是足够的。保持理想的湿度以及特定的温度也是需要的。在一些实施方式中，温暖、潮湿的环境是理想的。当不需要时建立或维持灭菌环境是理想的。

此外，在制剂中包括有益的治疗试剂是理想的。例如，所述媒介物或载体也可以包括保湿剂或湿润剂以保持处理环境的理想的湿度。其他的可能性包括如麻醉剂或抗生素，它们提供其他理想的效果。并且，所有的可能性是不加以限制的，并且留给从业者决定。

提供下面的实施例以更清楚地描述和解释本发明。

实施例

实施例1：ROS在伤口位点的存在。

在伤口流体中H₂O₂的浓度。通过内切伤口将Hunt/Schilling丝网柱皮下植入5周龄C57BL/6小鼠的背部上。5天后，收集伤口流体，用如在Liu和Zweier(自由基生物医学。2001，10月，1；31(7)：894-901)中描述的实时电化学技术来测量在流体中的稳态H₂O₂浓度。在PBS中收集基线。结果在图1A中显示。

在用箭头指示的时间将伤口流体(0.15ml)加入到DPBS(1ml)中。当用标准曲线时，在愈伤流体中所测定的H₂O₂浓度为1.1μM。这个结果是与血浆的量来比较的，血浆并未显示出可测量的过氧化氢。

在伤口边缘处检测H₂O₂。

使用自旋阱溶液清洗暴露的伤口通过在伤口空腔中检测过氧化氢自由基印迹来测定在伤口边缘处的过氧化氢。在受伤后12小时，用自旋阱、DMPO(5，5-二甲基-吡咯烷-1-氧基)处理位点。为了得到对照数据，将新产生的伤口进行同样的自旋阱处理。在15分钟后，将自旋阱溶液从伤口空腔中去除并且进行电子顺磁性共振(EPR)分析。

采用具有TM110孔的在X带操作的Bruker ER300EPR分光计进行EPR测量。图1B显示出在伤口洗涤液中测量的DMPO加合物的EPR光谱。.所述光谱是由在0小时(假性对照，上面组)受伤后12小时(下面组)从伤口空腔收集的DMPO(100Mm，0.1ml)流出物获得的。在下面组的光谱被鉴定为具有下列偶合常数的DMPO-OH的光谱：aN＝14.90G、aH＝14.90。获得的数据参数为：微波频率9.8682GHz、扫描宽度100G、微波功率20mW、调制幅度0.5G、调制频率100kHz、时间常数80msec。

当假性处理的自旋阱溶液未显示出任何显著的自旋加合物时，在受伤后12小时从伤口清洗液得到的光谱显示出清晰的1:2:2:1的四重峰图案。通过模拟将单独的成分鉴定为DMPO-OH(羟基自由基加合物)。

在正常皮肤和伤口边缘组织中产生超氧化物。作为NADPH氧化酶活性的功能性结果，O^- ₂的产生通常是采用二氧乙锭(DHE)作为ROS敏感性荧光染料来从低温切口组织中测量的。简言之，在受伤后12小时采集伤口边缘试样并且立即在OCT中冷冻。用DHE(0.01mM，20分钟，200x)孵育新鲜的30微米的切片以检测O^- ₂，并且通过共焦显微镜进行观察。结果在图1C中显示。

应用这种方法，可以清楚地观察到与新切割的正常皮肤比较，伤口组织着色更显著。这个发现结果进一步支持了在伤口位点富含ROS。

同时，这些试验清楚地表明包括过氧化氢在内的ROS存在于伤口愈合组织中。

实施例2：过量的过氧化氢酶对伤口愈合的影响。

因为已经显示过氧化氢存在于伤口愈合组织中，所以进行试验以确定是否降低它的浓度将阻止伤口的愈合。过氧化氢酶是水解过氧化氢的天然的酶，因此将它被引入待实验的伤口中。

简言之，使用腺病毒媒介体通过它的过量表达将过氧化氢酶引入到伤口中。允许这个媒介体在鼠的皮肤上高效地过量表达。将待弄伤的皮肤在受伤前5天用过氧化氢酶或LacZ(对照)腺病毒(10¹¹pfu)皮下注射一次使得在伤口位点的过氧化氢酶最大限度地过量表达。在8周龄的C57BL/6的小鼠的背部皮肤划2个8×16mm的全厚度二级人为伤口。

图2A显示出与用对照Ad-LacZ病毒处理的侧面比较，在用Ad-过氧化氢酶(AdCat)病毒处理的侧面中表示过氧化氢酶过量表达的被感染的蛋白质印迹。用β-肌动蛋白对印迹重新探测以显示样品的相等的负载。

图2B显示出用在受伤后指定的天所测定的占起始伤口面积的百分比来表示的伤口的愈合。虚线代表未经过感染的用盐水处理的C57BL/6(空心圆○)的标准治愈的曲线。AdCat处理(实心三角形)，AdlacZ处理(实心圆●)，^*p＜0.05，与LacZ处理的侧面相比较。

图2C显示出在两个伤口都愈合的那天在伤口位点采集的再生皮肤的用福尔马林固定的石蜡切片上进行的Masson三色染色。AdCat侧面显示出指示皮肤的不完全再生(与对照相比)的较宽的HE区域，与缓慢的愈合是一致的。Es，焦痂；G，粒状组织；HE，过度增值的上皮细胞。

实施例3：过氧化氢对伤口愈合的影响

已清楚地表明过氧化氢存在于愈合的伤口中(实施例1)，并且如果愈合伤口中缺少过氧化氢将减弱愈合的过程(实施例2)，所以进行试验以检查增加过氧化氢的效果。

简言之，在C57BL/6雄性小鼠(8周龄)的背部皮肤上划2个8×16mm全厚度切口(图3，插图)。两个伤口的每一个都局部用H₂O₂或盐水处理。

图3A表明与用安慰剂(实心圆●)处理的侧面相比较，用低剂量H₂O₂(1.25微摩尔/伤口、或0.025ml 0.15％的溶液/伤口，每天一次，0-4天，空心圆○)处理加快了伤口的愈合，^*p＜0.05。

图3B表示用低剂量H₂O₂处理对伤口的微生物群未产生影响。为了测定表面的微生物群，用顶端具有藻酸盐的涂敷器擦洗(受伤24-48小时后)伤口20秒钟(用1.25微摩尔H₂O₂/伤口，空心条或盐水，实心条)。对表面的细菌载量进行定量评估。对于深部组织伤口的微生物群，在受伤后48小时将焦痂组织除去，对于在焦痂下面的愈伤组织进行采样，并且进行细菌载量的定量评估。所显示的数值代表4个观察对象的CFU的平均值±SD。

图3C显示用高剂量(高，25微摩尔/伤口、实心圆●或0.025ml 3％的溶液相对于低，1.25微摩尔/伤口或0.025ml 0.15％，空心圆○，每天一次，0-4天)H₂O₂处理对于伤口的愈合具有不利的作用，与用低剂量H₂O₂处理比较，^*p＜0.05。用较高浓度(插入)的H₂O₂(62.5微摩尔/伤口，左侧处理；0.025ml的7.5％的溶液/伤口，在0天一次)处理引起坏死性的组织损伤以及导致小鼠死亡的严重伤害。

实施例4：伤口以及H₂O₂诱导的与血管生成有关的基因、血管化和伤口边缘血流量的变化。

进行进一步的试验以研究低剂量过氧化氢增加伤口治愈速率的机制。

将成对的外切伤口用安慰剂盐水或H₂O₂(1.25微摩尔/伤口，0-4天，每天一次)进行处理。在受伤后指定的时间收集伤口边缘的组织。图4A表示核糖核酸酶保护试验(RPA)，该试验显示在安慰剂处理的伤口中与血管生成有关的mRNA表达的动力学。图4B显示用低剂量H₂O₂(1.25微摩尔/伤口，0-4天，每天一次)处理伤口如何进一步增加了伤口诱导的Flt-1和VEGF mRNA表达，如用RPA测定的那样。图3C显示出用激光多普勒血流图像装置非侵入地进行了伤口的血流成像。显示出反映愈合后组织的血流量(右组)和数字照片(感兴趣区域，左组)的图像。出现的数据，即血流量的平均值±SD(条形图)。平均值代表在感兴趣区域内所有有效血流量象素的算术平均数。结果显示出所述的处理导致血流量增加，增加了血管生成的功能性结果。图4D显示出在受伤后第8天的结果。伤口边缘低温切割，并且用CD31(红色，若丹明)和DAP(蓝色，DAP，核)染色来估算血管生成；与对照相比(顶部)，由H₂O₂处理侧面(底部)所获得的在切片中大量的CD31红色着色反映出血管生成得更好。

实施例5：在微血管内皮细胞和伤口边缘组织中H₂O₂诱导的焦点粘连激酶的磷酸化。

采用用于指定的剂量和时间的H₂O₂处理人类微血管内皮细胞(HMEC-1)。用蛋白质印迹和抗FAK的位点特异性的抗体的磷酸化来检测FAK的磷酸化。天然的FAK或β-肌动蛋白被着上印迹以显示相等的负载。

图5A.显示用不同剂量的H₂O₂处理对FAK的磷酸化(Ty925)状态的影响。图5B显示在用H₂O₂(0.1mM)处理的HMEC细胞的FAK的位点特异性的活化磷酸化的动力学。

在图5C中，将成对的外切伤口用安慰剂盐水或H₂O₂(1.25微摩尔/伤口)处理。在受伤后30分钟收集伤口边缘的组织。用蛋白质印迹测定在伤口边缘的组织中的FAK的磷酸化。显示出三个动物(#1-#3)的数据。

实施例6：MCP-1和p47phox的缺少消弱了皮肤的治愈。

通过吸引生产过氧化氢的巨噬细胞，单核细胞/巨噬细胞的化学吸引剂/趋化蛋白-1(MCP-1)在应答受伤的急性炎症反应的发展和分辨中起关键的作用。P47^phox是参与ROS生产的NADPH氧化酶的调节亚基。因为这些因子在ROS生产和治愈伤口中的重要性，所以进行试验以检测在缺少这些因子的动物中过氧化氢是如何影响伤口的。

简言之，在8周龄的C57BL/6、MCP-1或p47phox敲除小鼠的背部皮肤上划2个切口。将两个伤口中的每一个用盐水或H₂O₂(1.25微摩尔/伤口、0-4天)处理。

图6A表示显示在用安慰剂处理的野生类型(C57BL/6)小鼠的伤口中，与单核细胞/巨噬细胞趋化蛋白有关的mRNA表达的动力学的RNA酶保护试验。图6B表示用盐水(实心圆●)处理C57BL/6伤口以及H₂O₂(实心三角形)或盐水(空心圆○)处理MCP-1敲除小鼠的伤口的愈合用占起始伤口的面积百分比显示，(^*p＜0.05，与盐水处理C57BL/6相比较；#，p＜0.05；与盐水处理KO相比较)。图6C表示用盐水(实心圆●)处理C57BL/6伤口以及H₂O₂(实心三角形)或盐水(空心圆○)或p47^Phox敲除小鼠处理的伤口的愈合用占起始伤口的面积百分比来显示，p＜0.05，与盐水处理C57BL/6相比较，#，p＜0.05；与盐水处理KO相比较。

角蛋白14支持表皮的分化和再生，并且通过皮肤受伤引发它的表达。图6D显示在受伤后第18天在愈合后从伤口位点收集的p47^Phox敲除小鼠皮肤中角蛋白(荧光绿)的表达。注意与用H₂O₂处理的侧面比较，在对照侧面中的角蛋白14的表达更高，这种现象表明对照侧面的伤口正在愈合并且不完全。而用H₂O₂处理的侧面显示出角蛋白14的表达与正常皮肤是可比较的，表明完全愈合了。

从说明书的理解以及这里所公开的本发明的实践中，本发明的其他实施方式对于本领域技术人员是显而易见的。详述和实施例只是视为示范性的，通过下列的权利要求表明本发明的真正的范围和精神。

Claims (37)

1.提高哺乳动物中的创伤治愈速度的方法，包括向创伤施用约500纳摩尔至约50微摩尔的过氧化氢/每平方厘米创伤。

2.根据权利要求1的方法，包括施用约1至约50微摩尔的过氧化氢/每平方厘米创伤。

3.根据权利要求2的方法，包括施用约1至约10微摩尔的过氧化氢/每平方厘米创伤。

4.根据权利要求3的方法，包括施用约1至约2微摩尔的过氧化氢/每平方厘米创伤。

5.根据权利要求1的方法，其中施用创伤上的所述的过氧化氢的来源选自酶来源和化学来源。

6.根据权利要求5的方法，其中所述过氧化氢的来源是化学来源，并且所述来源是过氧化氢。

7.提高哺乳动物中的创伤治愈速度的方法，包括在约12小时至24小时的时间段里以每平方厘米创伤约500纳摩尔至约50微摩尔的过氧化氢的比率向所述的创伤施用过氧化氢。

8.根据权利要求7的方法，其中以约1至10微摩尔的比率施用过氧化氢。

9.根据权利要求7的方法，其中所述过氧化氢是以药学上可接受的组合物形式被施用的。

10.根据权利要求9的方法，其中所述药学上可接受的组合物以选自凝胶、洗剂、油膏、霜、糊和液体的形式存在。

11.根据权利要求7的方法，其中所述过氧化氢是以药学上可接受的装置形式施用的。

12.根据权利要求11的方法，其中所述药学上可接受的装置选自绷带、外科敷料、纱布、粘合带、外科卡钉、夹子、止血钳、子宫内装置、缝合用线、套管针、导管、管子和植入物。

13.根据权利要求12的方法，其中所述植入物选自药丸、小球、棒条、圆片、圆盘和药片。

14.根据权利要求11的方法，其中所述装置包括聚合物材料。

15.根据权利要求14的方法，其中所述聚合物材料包括可吸收的材料。

16.根据权利要求15的方法，其中所述可吸收的材料包括合成材料。

17.根据权利要求16的方法，其中所述合成材料选自纤维素聚合物、乙醇酸聚合物、甲基丙烯酸酯聚合物、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物、乙烯-乙烯醇共聚物、聚己内酰胺、聚乙酸酯、丙交酯和乙交酯的共聚物、聚二烷酮、丙交酯乙交酯共聚酯、聚卡普隆、聚葡糖、聚葡糖酸盐和它们的组合。

18.根据权利要求15的方法，其中所述可吸收材料包括非合成材料。

19.根据权利要求18的方法，其中所述非合成材料选自肠线、cargile膜、阔筋膜、凝胶、胶原和它们的组合。

20.根据权利要求14的方法，其中所述聚合物材料包括不可吸收的材料。

21.根据权利要求20的方法，其中所述不可吸收的材料包括合成的材料。

22.根据权利要求21的方法，其中所述合成的材料选自尼龙、人造丝、聚酯、聚烯烃和它们的组合。

23.根据权利要求20的方法，其中所述不可吸收的材料包括非合成的材料。

24.根据权利要求23的方法，其中所述非合成的材料选自丝、皮肤丝、棉、亚麻和它们的组合。

25.根据权利要求7的方法，其中所述创伤选自伤口、溃疡和烧伤。

26.根据权利要求25的方法，其中所述伤口选自急性伤口和慢性伤口。

27.根据权利要求25的方法，其中所述伤口选自全厚度伤口和部分厚度伤口。

28.根据权利要求26的方法，其中所述急性伤口选自外科伤口、渗透伤口、撕裂损伤、碾碎损伤、剪切损伤、烧伤、裂伤和咬伤。

29.根据权利要求26的方法，其中所述慢性伤口选自动脉溃疡、静脉溃疡、压力溃疡和糖尿病溃疡。

30.用于向创伤给药的过氧化氢传送装置，包括过氧化氢和载体材料，所述装置释放所述的过氧化氢至少约12小时，其中从所述装置中释放的过氧化氢的浓度不足以产生创面的坏死。

31.根据权利要求30所述的过氧化氢供给装置，其中所述装置释放约0.5-50μmol过氧化氢/cm²伤口/12小时至约0.5-50μmol过氧化氢/cm²伤口/24小时。

32.根据权利要求31所述的过氧化氢供给装置，其中所述载体材料包括聚合物材料。

33.根据权利要求32所述的过氧化氢供给装置，其中所述聚合物材料包括可吸收的材料。

34.根据权利要求32所述的过氧化氢供给装置，其中所述聚合物材料包括合成的材料。

35.用于治疗哺乳动物中的创伤的组合物，包括过氧化氢和药学上可接受的载体，其中所述组合物的单位剂量包括约0.5至约50μmol过氧化氢/cm²伤口。

36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述载体包括凝胶材料。

37.根据权利要求35所述的组合物，其中所述载体包括液体材料。

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