CN101019861A - 去甲斑蝥素及其衍生物在预防和治疗艾滋病中的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及去甲斑蝥素及其衍生物的新用途，实验研究发现，所说化合物对艾滋病病毒有显著的抑制作用，毒性小，与现有逆转录酶抑制药物、蛋白酶抑制药物具有不同的作用机制，有望开发成为临床有效的新型防治艾滋病新药。
Description
技术领域：
本发明涉及去甲斑蝥素在预防和治疗艾滋病中的应用；
本发明还涉及去甲斑蝥素衍生物在预防和治疗艾滋病中的应用。
背景技术：
自1981年发现艾滋病(AIDS)以来，全世界迅速蔓延开来。虽然全球合作采取了各种干预艾滋病的措施，但它还是以迅猛发展的速度严重威胁着人类的健康与生命。所引起的危害已经成为21世纪人类面临的最严峻的挑战。目前已有27种化学合成的抗HIV药物(包括蛋白酶抑制剂、逆转录酶抑制剂和膜融合抑制剂)。虽然联合用药成功地降低了AIDS的发病率和患者的死亡率，但仍存在如毒性、耐药性等诸多问题，且由于疫苗的研究尚未获得突破，因此研发具有防治HIV感染的新型药物就显得十分重要[Garber DA，Feinberg MB.AIDS vaccine development：the long and winding road.AIDS Rev.2003，5(3)：131-139]。
人类应用斑蝥医治疾病已有两千多年的历史。斑蝥为芫青科昆虫南方大斑蝥Mylabris p halerata Pall.或黄黑小斑蝥M.cichorii L.的干燥体。斑蝥素(Cantharidin)为斑蝥抗癌的基本有效成分，主要用于治疗肝癌、食管癌、肺癌及胃癌等恶性肿瘤，因其毒性较大，限制了其临床应用。去甲斑蝥素(Norcantharidin，Nd)为斑蝥素的衍生物，明显减轻了毒副作用，且增强了抗癌效果，为口服制剂，已在临床应用[吴建梅，任天池，虞梅.去甲基斑蝥素的药学研究与临床应用进展.中国药学杂志，2002，37(8)：566-569]。去甲斑蝥素及其衍生物具有抗癌作用，目前已有较多的文献报道[曾文南，卢懿.斑蝥素及其衍生物的合成与活性研究进展.有机化学，2006，26(5)：579-591]，如去甲斑蝥素金属元素配合物，在体内外也具有抗癌症的作用[武德柱，崔景荣.去甲斑蝥素-钕的合成.专利申请号：200510069072.2]。此外，去甲斑蝥素还对乙型肝炎病毒复制具有一定的抑制作用[谭知显，李聪贤，王广生.去甲基斑蝥素治疗乙型肝炎表面抗原携带者的疗效观察.药学通报，1988，23(1)：46]。但是迄今为止，尚未见有任何关于去甲斑蝥素及其衍生物用于治疗艾滋病的报道。近年来本实验室的研究结果表明，去甲斑蝥素及其衍生物具有显著的抗艾滋病毒活性且毒性很小。
本发明的目的在于，提供去甲斑蝥素在制备预防和治疗艾滋病药物中的新用途；
本发明的另一目的在于，提供去甲斑蝥素衍生物在制备预防和治疗艾滋病药物中的新用途。
发明内容：
本发明提供了去甲斑蝥素(结构式I)在制备防治艾滋病药物中的新用途。
结构式I(Nd)
本发明提供了去甲斑蝥素金属元素配合物(结构式II)在制备防治艾滋病药物中的新用途。
M＝金属元素；n＝1，2，3，4，5
结构式II(若金属元素为钕，则为实施例所说化合物NdR4)
本发明还提供了去甲斑蝥素-金属元素(结构式III)的制备方法，其技术方案包括以下步骤(2种方法)：
M＝金属元素，n＝1，2，3，4，5
结构式III(若金属元素为钕，则为实施例所说化合物NdR3)
方法1：将顺丁烯二酸酐于丙酮中，溶解后向其滴加呋喃。加毕后回流反应，再向其加入氢化钠后继续反应。过滤掉丙酮并用无水乙醚洗结晶。然后将产品于无水乙醇中后加入金属化合物，于室温下反应收集产品，并用无水乙醇洗产品三次，收产品去甲斑蝥素-金属元素。
方法2：将顺丁烯二酸酐于无水乙醚中，溶解后向其滴加呋喃。加毕后回流反应，再过滤掉乙醚并用无水乙醚洗结晶，收产品。取该产品于丙酮溶液中，然后向其加入氢化钠搅拌反应，分出晶体并用无水乙醚洗二次，收产品。将这一步所得产品于水中溶解后再向其加入金属化合物。然后反应，蒸出大部分水后再分离出产品并用乙醚洗产品，获得去甲斑蝥素-金属元素。
本发明又提供了去甲斑蝥素-金属元素化合物在制备防治艾滋病药物中的应用。
本发明还提供了去甲斑蝥素及其衍生物为活性成分与一种或多种药学上可接受的载体组成的药物组合物在制备预防和治疗艾滋病药物中的应用。
本发明还提供了去甲斑蝥素及其衍生物与逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等抗艾滋病制剂联合给药在治疗艾滋病中的应用。
体外实验结果表明，去甲斑蝥素及其衍生物在MT-4细胞培养中具有明显的抗HIV的活性，其抑制HIV复制的作用机制与现有逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的抗HIV作用机制不同，属于新型抗HIV的药物。小鼠口服或腹腔注射试验证明毒付作用小。
发明效果：
本发明的优点与积极效果在于，所说的去甲斑蝥素及其衍生物在细胞培养中具有抑制艾滋病病毒感染和复制的活性，且与现有的逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂具有不同的抗艾滋病的作用机理。若制备成药物，或与现有艾滋病治疗药物联合使用，将可增添预防/治疗艾滋病病毒感染的新手段，这对防治艾滋病的蔓延具有重要的现实意义。
具体实施方案：
下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
<实施例1>：去甲斑蝥素-钕的合成(方法1)
将5克顺丁烯二酸酐于20ml丙酮中，溶解后向其滴加5克呋喃。加毕后回流反应过夜，再向其加入1克氢化钠后继续反应10小时。过滤掉丙酮并用无水乙醚洗结晶。然后将产品于30毫升无水乙醇中再加入2.6克氯化钕，于室温下反应15小时后收集产品，并用无水乙醇洗产品三次，得到去甲斑蝥素-钕(NdR3)。
<实施例2>：去甲斑蝥素-钕的合成(方法2)
将15克顺丁烯二酸酐于50毫升无水乙醚中，溶解后向其滴加15克呋喃。加毕后回流反应过夜，再过滤掉乙醚并用无水乙醚洗结晶，收产品26克。取该产品5克于20毫升丙酮溶液中，然后向其加入1克氢化钠搅拌反应过夜，分出晶体并用无水乙醚洗二次，收产品4.8克。将这一步得的产品3克于20毫升水中溶解后再向其加入2.1克氯化钕。然后于室温下反应16小时，蒸出大部分水后再于室温下分离出产品并用乙醚洗产品三次，收2.3克去甲斑蝥素-钕(NdR3)。
<实施例3>：目标化合物在MT-4细胞中抑制HIV-1P24抗原活性试验
MT-4细胞预先用100TCID50 HIV-1IIIB吸附感染1.5小时，制成细胞浓度为2×105/ml的细胞悬液，接种100μl于96孔细胞培养板内，同时分别加入100μl不同浓度的化合物，或阳性对照药齐多夫定(AZT)，每浓度2孔，设细胞和病毒对照组。置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养，于加药96小时吸出上清液，以抗原试剂盒测定P24抗原含量，用Reed-Muench法计算药物半数有效浓度(EC50)。培养板内细胞用MTT染色，在酶标仪上测定波长为570nm的OD570nm值，用Reed-Muench法计算药物半数有毒浓度(CC50)。并计算治疗指数(SI)，结果见表1。
表1目标化合物对MT-4细胞毒性和在MT-4细胞培养中抑制HIV-1P24抗原活性
| 药物 | CC50 | EC50 | SI |
| NdR3 | ＞1000(μg/ml) | 1.679(μg/ml) | ＞596 |
| NdR4 | 28.09(μg/ml) | 0.354(μg/ml) | 79.4 |
| Nd | 13.92(μg/ml) | 0.258(μg/ml) | 54.0 |
| AZT | ＞0.625(μg/ml) | 0.0364ng/ml | ＞17200 |
结果表明，目标化合物在细胞内具有明显的抗HIV-1的作用。
<实施例4>：目标化合物口服或腹腔注射给药对小鼠的毒性
取昆明种小鼠，18-20g，雌雄各半，目标化合物不同剂量灌胃或腹腔注射小鼠1次后，观察药物对小鼠的急性毒性，记录小鼠死亡情况，结果表明，目标化合物的毒性很小，如表2所示。
| 给药途径 | 药物 | 剂量 | 鼠数(只) | 死亡数(只) |
| 灌胃 | NdR4 | 200mg/kg | 6 | 6 |
| 50mg/kg | 6 | 1 | ||
| Nd | 200mg/kg | 6 | 6 | |
| 50mg/kg | 6 | 2 | ||
| NdR3 | 200mg/kg | 6 | 0 | |
| 腹腔注射 | NdR4 | 30mg/kg | 6 | 5 |
| 10mg/kg | 6 | 1 | ||
| Nd | 30mg/kg | 6 | 5 |
| 10mg/kg | 6 | 2 | ||
| NdR3 | 30mg/kg | 6 | 0 |
<实施例5>：目标化合物抑制HIV-1逆转录酶(RT)活性试验
将标定浓度的基因工程HIV逆转录酶(p66/51)和不同浓度药液及含有3H-dTTP反应缓冲液加入96孔细胞培养板后，混合，37℃反应30分钟，0℃终止反应。反应液滴加于滤纸片上，冷三氯乙酸洗涤、乙醇脱水后烤干。液闪仪测定CPM值。同时设酶对照、阴性对照及阳性有效药物NVP对照，用Reed-Muench法计算IC50，结果见表3。
<实施例6>：目标化合物抑制HIV-1整合酶(IN)活性试验
将供体底物包被COVALINK NH酶标板加入反应缓冲液和不同浓度药液及标定浓度的基因工程HIV整合酶，同时设酶对照、阴性对照和实验有效的阳性对照(S-y)，37℃反应1小时。加入靶底物DNA，37℃反应1小时；加入BSA(牛血清蛋白)，室温30分钟；加入碱性磷酸酶标记的亲和素，室温反应1小；加显色底物显色30分钟，加0.1N NaOH终止显色反应。酶标仪405nm测定OD值。用Reed-Muench法计算IC50，结果见表3。
<实施例7>：目标化合物抑制HIV-1蛋白酶(PR)活性试验
制备优化组合的提供水解环境的反应混合物，在96孔培养板孔中加入不同浓度药液，同时设酶对照、阴性对照和阳性有效药IND对照。于37℃反应20分钟后，加入HIV-1蛋白酶开始反应。在荧光检测仪中以355nm激发光和490nm发射光连续进行6分钟测定荧光读数，用Reed-Muench法计算IC50，结果见表3。
表3目标化合物抑制HIV-1复制酶活性。
| HIV复制酶 | 药物 | IC50 |
| 整合酶(IN) | S-y | 0.748±0.007μg/ml |
| NdR3 | ＞100μg/ml | |
| NdR4 | ＞100μg/ml | |
| Nd | ＞100μg/ml | |
| 蛋白酶(PR) | IND | 3.45nM |
| NdR3 | ＞100μg/ml | |
| NdR4 | ＞100μg/ml | |
| Nd | ＞100μg/ml |
| 逆转录酶(RT) | NVP 0.119±0.009μg/ml |
| NdR3 0.875±0.013μg/ml | |
| NdR4 12.285±0.265μg/ml | |
| Nd ＞100μg/ml |
Claims (10)
1.去甲斑蝥素(结构式I)在制备预防和治疗艾滋病药物中的应用。
结构式I
2.去甲斑蝥素金属元素配合物(结构式II)在制备预防和治疗艾滋病药物中的应用。
M＝金属元素；n＝1，2，3，4，5
结构式II
3.去甲斑蝥素金属元素结构如式III所示，
其中
M＝金属元素；n＝1，2，3，4，5
结构式III
其制备方法包括以下步骤(2种方法)：
方法1：将顺丁烯二酸酐于丙酮中，溶解后向其滴加呋喃，加毕后回流反应，再向其加入氢化钠继续反应，过滤掉丙酮并用无水乙醚洗结晶，然后将产品于无水乙醇中再加入金属化合物，于室温下反应后收集产品，并用无水乙醇洗产品，收产品去甲斑蝥素-金属元素；
方法2：将顺丁烯二酸酐于无水乙醚中，溶解后向其滴加呋喃，加毕后回流反应，再过滤掉乙醚并用无水乙醚洗结晶，收产品；取该产品于丙酮溶液中，然后向其加入氢化钠搅拌反应，分出晶体并用无水乙醚洗二次，收产品；将这一步所得产品于水中溶解后再向其加入金属化合物，然后反应，蒸出大部分水后再分离出产品并用乙醚洗产品，获得去甲斑蝥素-金属元素。
4.权利要求3所说去甲斑蝥素—金属元素在制备预防和治疗艾滋病药物中的应用。
5.权利要求1所述化合物为活性成分与一种或多种药学上可接受的载体组成的药物组合物在制备预防和治疗艾滋病药物中的应用。
6.权利要求2所述化合物为活性成分与一种或多种药学上可接受的载体组成的药物组合物在制备预防和治疗艾滋病药物中的应用。
7.权利要求3所述化合物为活性成分与一种或多种药学上可接受的载体组成的药物组合物在制备预防和治疗艾滋病药物中的应用。
8.权利要求1所述化合物与逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等抗艾滋病药物联用在制备预防和治疗艾滋病药物中的应用。
9.权利要求2所述化合物与逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等抗艾滋病药物联用在制备预防和治疗艾滋病药物中的应用。
10.权利要求3所述化合物与逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等抗艾滋病药物联用在制备预防和治疗艾滋病药物中的应用。
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2007
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