CN101012152A - 一种从发酵液中分离2,3－丁二醇的双水相萃取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及从发酵液中提取分离2，3－丁二醇的双水相萃取技术。本发明的特征在于向2，3－丁二醇的发酵液中加入无机盐和亲水有机物形成新型双水相，从而达到萃取分离发酵液中2，3－丁二醇的目的。本发明的效果和益处是解决了目前发酵法生产2，3－丁二醇分离工艺中存在的产品难以分离、成本高等问题。该方法工艺简单，分离时间短，分离成本低，是一种具有工业应用前景的2，3－丁二醇分离方法。

Description

一种从发酵液中分离2，3-丁二醇的双水相萃取方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及到微生物发酵液的分离技术，特别涉及到从发酵液中分离2，3-丁二醇的方法。

背景技术

2，3-丁二醇是一种极具价值的液体燃料，并可以用来制造重要的工业有机溶剂甲乙酮；还可以用来生产2-丁烯和1，3-丁二烯等生产人造橡胶的单体物质；酯化形式的2，3-丁二醇是合成聚亚胺的前体，可应用于药物、化妆品等；通过催化脱氢得到的二乙酰化形式的2，3-丁二醇可以用来作为具有高价值香料的食品添加剂；2，3-丁二醇自身可以作为单体用来合成高分子化合物；左旋形式的2，3-丁二醇由于其较低的凝固点可用作抗冻剂；此外，2，3-丁二醇还在染料、炸药、香水、药物载体等领域显示出潜在的应用价值，但其昂贵的价格却阻碍了其应用。自从发酵法生产2，3-丁二醇成为可能以来，产物2，3-丁二醇的有效提纯一直是阻碍其大规模工业生产的一个重要原因，科研工作者一直努力探索一条既省事又可降低成本的分离方法。

由于2，3丁二醇本身的一些性质，如高沸点、高亲水性以及发酵液中溶解的其它杂质使得该提纯过程非常困难。目前研究较多的提纯方法有：减压蒸馏(精馏)、过蒸发、膜蒸馏、真空膜蒸馏和有机溶剂萃取。精馏是利用混合物中各组分挥发能力的差异，使混合物得到不断分离，但由于发酵液中成分非常复杂，在达到蒸馏温度之前，发酵液中的一些可溶部分就会浓缩成较厚的油状积块，从而减慢2，3-丁二醇的蒸发速率，因此不宜采用精馏的方法来提取。过蒸发即利用浓度梯度，通过非多孔膜进行组分的选择扩散；膜蒸馏即通过多孔疏水膜进行的蒸发过程，而真空膜蒸馏即为二者的结合。Qureshi等(Recovery of 2，3-butanediol byvacuum membrane distillation.Sep Sci Technol，1994，29：1733～1748)曾在真空膜蒸馏过程中使用一种具有微孔结构的聚四氟乙烯膜，这种膜可以允许水蒸气顺利通过，但阻止2，3-丁二醇通过，采用这种方法使2，3-丁二醇的最终质量浓度达到430g/L，但后续分离存在较大困难。另外，过蒸发、膜蒸馏、真空膜蒸馏对设备的要求比较高，膜成本高，而且存在膜污染、难以清洗等问题，所以很难在工业上得到广泛应用。有机萃取中使用的萃取剂有正丁烷、二乙基乙醚等。Tsao等(Conversion of biomass from agriculture into useful products.Final report，USDDE，ContractNo，EG-77-S-02-4298，1978-07-31)发现使用二乙基乙醚可回收发酵液中75％的2，3丁二醇，但这种方法因溶剂使用量较大且成本较高等只限于实验室规模，并不适合大规模工业化生产。

双水相萃取技术始于20世纪60年代，双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于水中并达到一定浓度时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的分子空间阻碍作用，无法相互渗透，从而形成不互溶的两相，称为双水相，其常用的体系为聚乙二醇/葡聚糖和聚乙二醇/无机盐等。由于双水相萃取条件温和，容易放大，可连续操作，因此该技术已成功地应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化中，也有抗生素、中药有效成分等小分子分离方面的尝试。但由于水溶性高聚物大多黏度较大，难以挥发，需要反萃取，使后续的分离较为麻烦，且所用高聚物一般价格比较昂贵，使工业化应用受到限制。近几年一些研究者在进行溶剂析出结晶研究时发现，在适当温度条件下，如果体系中无机盐、有机溶剂和水的浓度适当，这类体系中的盐可能不会析出结晶，而是出现液液分相现象。如果所用有机溶剂是亲水的低分子物质，如甲醇、乙醇、丙酮等，就可以形成一种新型的双水相萃取体系。与传统的高分子聚合物双水相体系相比，这种新型的双水相体系分相更清晰，成本更低，萃取相不含黏度大、难处理的聚合物。尽管这方面研究在国内外刚刚起步，但已表现出良好的分离性能，如Louwrier用磷酸氢二钾/乙醇体系萃取牛血清蛋白、α-酪蛋白、核糖核酸酶等生物质大分子(Biotechnology Techniques，1998，12(5)：363-365)，李全民、高云涛等人用丙酮/氯化钠体系萃取金属络合物或金属离子(应用化学，2001，18(3)：241-243；分析测试学报，2002，21(3)：75-77)均得到相当满意的结果。亲水有机物/无机盐双水相体系在发酵液中多元醇的分离方面尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是针对目前从发酵液中分离2，3-丁二醇存在的分离能力小，总体收率低，成本高等问题，提供了一种采用双水相萃取的方法从发酵液中分离2，3-丁二醇。

本发明的技术方案：

2，3-丁二醇发酵液可以用絮凝、过滤、微滤或离心的方法进行预处理，除去菌体得到清液，也可以是未经预处理的发酵原液，或者是经过浓缩的原液或清液，其中2，3-丁二醇的浓度范围为20～700g/L。向上述发酵液或清液中添加一种或二种以上可溶性无机盐，所加盐为固体或浓盐溶液，加盐后发酵液中盐的饱和度达到10％～100％；然后加入醇类或酮类亲水性有机物，含盐发酵液和亲水性有机物的体积比为1∶0.1～1∶5。

一种或二种以上可溶性无机盐是氯化钠、硫酸铵、碳酸钠、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等。

醇类或酮类亲水性有机物为乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇或丙酮等。

亲水性有机物可以选择甲醇，使用甲醇时，发酵液中添加无机盐的阴离子为三价；阴离子为三价的无机盐为磷酸氢二钾/钠、磷酸钾/钠等或其混合物。

将此含盐发酵液和亲水性有机物的混合液充分混合，静置至分相，上相即为富含2，3-丁二醇的溶剂相或萃取相，下相为富盐相或萃余相。用蒸馏或精馏法从溶剂相或萃取相中回收溶剂，并得到2，3-丁二醇粗品和固体盐；富盐相或萃余相经蒸馏浓缩得到的浓盐液可以循环使用，也可以加入回收的有机溶剂使盐结晶析出。

萃取操作方式可以是间歇的，也可以是连续的；对于分配系数较小的体系可以采用多级萃取的方式。

如果发酵液不经预处理直接进行萃取操作，这时往往在上下相之间形成一个富含菌体的固相层，有时也在下相底部形成固相层，这个系统被称为多相系统。

萃取操作一般在低于溶剂易挥发的温度下进行。为了使2，3-丁二醇尽可能多地分配到上相，蛋白、核酸、多糖等大分子和无机盐尽可能保留在下相，可以调节体系的pH值或者向体系中添加络合剂。pH值范围一般在3-10之间，络合剂可以是无机盐类，也可以是有机化合物，如磷酸三丁酯(TBP)、辛酸、己酸等。

本发明的效果和益处：

克服了目前从微生物发酵液中提取分离2，3-丁二醇工艺存在的诸多弊端，使工艺得以简化，分离时间短，成本降低，经济可行。具体表现在：亲水性有机溶剂和无机盐形成的双水相对2，3-丁二醇较好的萃取效果，解决了传统萃取剂萃取效率较低的难题；双水相萃取可以直接处理发酵液，免除了菌体分离步骤，并且可以将发酵液中大量的核酸、蛋白、多糖除掉，解决了超滤除杂动力消耗较大、需要对膜进行清洗、菌体浓缩液中残留较多的2，3-丁二醇无法回收等问题。

具体实施方式

以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例。

本实施例中所用克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)购自中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，菌种保藏号：1.1736。培养基中必须具备微生物生长所需的营养成分，如甘油或葡萄糖等碳源，酵母浸膏或酵母粉等氮源，钠、钾、氨、镁、钙等阳离子和磷酸根、硫酸根、氯离子等阴离子，以及锌、铁、锰、铜、钴、硼、和钼等微量元素。发酵液是采用克雷伯氏杆菌批式流加葡萄糖发酵得到的，其中2，3-丁二醇的浓度为27g/L。

实施例一：

用切割分子量为5,000道尔顿、有效面积为1.5m²的乙酸纤维素超滤膜(日本NIPRO公司的产品，型号FB-150AGA)处理发酵液，得到澄清的滤液。在滤液中加入三水磷酸三钾配置成含磷酸三钾浓度为600g/L的溶液，取此含盐发酵液100mL，再加入40mL 95％乙醇，混合、静置、分相，得萃取相66mL，萃余相74mL。2，3-丁二醇的分配系数为30.8，回收率为96.5％。

实施例二：

取100mL发酵液，加入80g磷酸氢二钾，待盐溶解后再加入50mL的甲醇，混合、静置，体系分为三相。上相体积为65mL，其中2，3-丁二醇含量较高；中间相主要为菌体和蛋白，体积为35mL；下相中盐浓度较高，体积为75mL。将中间相取出在3000转/分下低速离心后又分为三相，上相中2，3-丁二醇含量较高，体积为13mL；中间相为菌体和蛋白，体积为40mL；下相中盐浓度较高，体积为17mL。将两个上相合并得清液78mL，即为萃取相，2，3-丁二醇的分配系数为7.78。回收率为86.8％。

Claims (7)

1.一种从发酵液中分离2，3-丁二醇的双水相萃取方法，其特征是向2，3-丁二醇的发酵液中添加一种或二种以上可溶性无机盐以及亲水有机物形成双水相体系或多相系统；加盐后发酵液中盐的饱和度达到10％～100％，亲水性有机物为醇类或酮类；含盐发酵液与亲水性有机物的体积比为1∶0.1～1∶5。

2.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离2，3-丁二醇的双水相萃取方法，其特征是其中的发酵液是未经预处理含有菌体的发酵液、未经预处理含有菌体的浓缩液、去除菌体的清液或去除菌体的浓缩液，发酵液中2，3-丁二醇的浓度为20～700g/L。

3.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离2，3-丁二醇的双水相萃取方法，其特征是可溶性无机盐为氯化钠、硫酸铵、碳酸钠、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。

4.根据权利要求1所述的一种从发酵液中分离2，3-丁二醇的双水相萃取方法，其特征是醇类或酮类亲水性有机物为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇或丙酮。

5.根据权利要求1所述一种从发酵液中分离2，3-丁二醇的双水相萃取方法，其特征是萃取时pH值为3～10，添加的络合剂是无机盐类或有机化合物。

6.根据权利要求1所述一种从发酵液中分离2，3-丁二醇的双水相萃取方法，其特征是双水相萃取是间歇的或连续的；对于分配系数较小的体系采用多级萃取。

7.根据权利要求3所述的可溶性无机盐，其特征是可溶性无机盐为固体的或浓盐溶液。