CN101006792A - 海棠抗病毒药物的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种海棠抗病毒药物的制备方法及其应用。本发明通过水提取或醇提取得到湖北海棠的水提物或醇提物，通过本发明提供方法得到的海棠抗病毒药物，有效地利用了海棠中有抗病毒活性成份，对为害大蒜、番茄、黄瓜、土豆植物的病毒中有很好的杀灭作用。

Description

海棠抗病毒药物的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种从海棠中得到抗植物病毒的药物制备方法，本发明还涉及从海棠中得到的提取物在抗大蒜、番茄、黄瓜、土豆等植物病毒中的应用。

背景技术

湖北海棠(Malus hapehensis)又名野海棠、野花红、花红茶、茶海棠，属蔷薇科苹果属落叶乔木。其嫩叶晒干可作茶叶饮用，称花红茶、林檎茶，在湖北、湖南、江西等地己有400多年的饮用历史。其果能消食并供酿酒。湖北海棠含有茶多酚、黄酮、蛋白质及Fe、Cu、Zn、Cr、Mn等多种矿物质。具有抗菌消炎、耐缺氧、抗疲劳、降血糖等作用。利用湖北海棠中的活性成份制成抗植物病毒的药物方面未见报道。

发明内容

本发明的目的是要提供一种从湖北海棠得到抗病毒药物的制备方法及其在抗植物病方面的应用。

本发明的目的是这样实现的：

一种海棠抗病毒药物的制备方法，取湖北海棠叶，称量，加入水，浸泡1小时，在温度70-100℃加热提取2-3次，每次1-3小时，滤液浓缩至1ml相当于生药5-10g，灌装，高压灭菌，得到海棠抗病毒液体药物。

一种海棠抗病毒药物的制备方法，取湖北海棠叶，称量，加入酒精至酒精含量50-70％，浸泡1-3小时，回流提取2-3次，每次1-3小时，过滤，滤液减压回收酒精后浓缩至1ml相当于生药5-10g，灌装，高压灭菌，得到海棠抗病毒液体药物。

将得到的液体药物用加热常压干燥、真空干燥、喷雾干燥等干燥方法干燥并粉碎成细粉，得到海棠抗病毒固体药物。

湖北海棠提取物在抗病大蒜病毒的药物中的应用。

湖北海棠提取物在抗番茄病毒的药物中的应用。

湖北海棠提取物在抗黄瓜病毒的药物中的应用。

湖北海棠提取物在抗土豆病毒的药物中的应用。

通过本发明提供方法得到的海棠抗病毒药物，有效地利用了海棠中有抗病毒活性成份，对为害大蒜、番茄、黄瓜、土豆等植物的病毒有很好的杀灭作用。

附图说明

图1是本发明提取物的色谱图。

图2是本发明中根皮苷对照品的色谱图。

具体实施方式

本发明涉及的药物的制备方法如下：

原料：湖北海棠：采自湖北省长阳土家自治县榔坪镇。

试剂：巯基乙醇：正丁醇；聚乙二醇6000；PBS液：氯化钠；地衣酚：浓盐酸；FeCl₃；乙醇等。

仪器：AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；DK-S26电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；KQ2200B型超声波清洗器；旋转蒸发器RE-52；WF2VV-2100型紫外分光光度剂；SIGMA3-18型高速冷冻离心机；LEICA ULTRACUTR超薄切片机；Motic体视解剖显微镜；JNOECXS-213生物显微镜；FuHua DB-3不锈钢电热板。高效液相色谱仪(Waters 2690)。

原植物形态：乔本，高可达7-8米，多为3-6米，小枝紫色至紫褐色，初有短柔毛，后脱落，叶片卵形或卵状椭圆形，长3-10厘米，宽1.5-5厘米。边缘有细锐锯齿，初疏生短柔毛，后脱落。叶柄长1-3.5厘米。伞形花序，有花4-6朵，花梗长3-6厘米，无毛，花粉白色或近白色，直径3.5-5厘米，萼裂片三角状卵形，渐尖或急尖，花瓣倒卵形，雄雌20，花柱3。梨果椭圆形或近球形，直径约1厘米，黄绿色稍带红晕，萼裂片脱落。生于海拔50-2900米的山坡丛林。

经鉴定：其原植物为湖北海棠Malus hupehensis(pamp.)Rehd.。

制备方法1：取湖北海棠叶，称100g，加入500ml水，浸泡1小时。加热提取2-3次，温度70-100℃，每次1-3小时，滤液浓缩至1ml相当于生药5-10g，灌装，高压灭菌，备用。用时加水稀释至原生药量的10-50倍，进行喷洒。

制备方法2：取湖北海棠叶，称100g，加入酒精至酒精含量50-70％，浸泡1-3小时，回流提取2-3次，每次1-3小时，过滤，滤液减压回收酒精后浓缩至1ml相当于生药5-10g，灌装，高压灭菌，备用。用时加水稀释至原生药量的20-100倍，进行喷洒。

制备方法3：将由方法1或方法2得到水提物浓缩液、醇提物浓缩液等液态药物用加热常压干燥、真空干燥、喷雾干燥等干燥方法干燥并粉成细粉，备用。用时加水稀释至原生药量的10-50倍，进行喷洒。

药物性状：本品深棕色瓶装液体，或深棕色粉未。

含量：本品瓶装液体含根皮苷不小于0.05g/ml，粉未含根皮苷不小于0.2g/g

药物高效液相色谱具有下列特征：

供试样品制备：称取本品0.1g或0.2ml，加50％甲醇5ml浸泡1.5h，超声波10min，0.45μ滤膜过滤，供测定用。

色谱条件：色谱柱为YMC-Pack AQ C18，250×4.6mmI.D；流动相为乙腈-水(30∶70)；进样量为10μl，流速为1.0ml/min；柱温为25℃，检测波长为284nm。

色谱图见附图1及图2。图中保留时间5.8±0.5min的峰为根皮苷的特征峰。

1、抗大蒜病毒的应用

1.1大蒜体内病毒粗提取

选取具有病毒症状的大蒜，采样，自然干燥。随机取大蒜十个，随机取蒜瓣一个加入50mlPBS(PH7.2，含1％巯基乙醇)研碎，0.45μ滤膜过滤。

1.2电镜标本的制备

将已提取的大蒜病毒液滴于铺有Formar膜的铜网上，吸附5min后用滤纸吸去多余液体，双蒸水洗涤。铜网(有膜的一面向上)用2％磷钨酸(PTA)负染3～5min，吸去多余溶液。

1.3电镜观察

待铜网干燥后立即置HITACHI.H7500型透射电镜下观察病毒粒体形态。病毒粒体形态多呈线状，粒体长度约为300～720nm，直径18～20nm。

1.4湖北海棠成分分离

取200g硅胶(200-300目)湿法装柱。取湖北海棠醇提物干法样。以乙酸乙酯-甲醇(5∶1)常压洗脱，每30ml为一流分，共得到40流分。换成70％乙醇常压洗脱，每30ml为一流分，共得到20流分。经TLC检测，合并相同流分，重结晶，分别在流分7~10和12~14得到化合物1和2。

化合物1为黄色针状晶体，化合物2为白色针状晶体，微显黄色。由于其它流分未分纯，将不含化合物1和2的所有流分合并。

经鉴定化合物1为5-羟基7-O-β-D木糖4’-甲氧基二氢黄酮(5-hydroxy-7-O-β-D-Xylopyranoside-4’-methoxy flavanone)。化合物2为根皮苷(Phloridzin)。

1.5大蒜脱毒处理

称量带毒新鲜大蒜约200g，除去外皮，在制备好的提取液中分别放入30g大蒜，另加一个清水对照。大蒜根部需完全浸没在提取液中。25℃培养3天。

将上述经提取液和清水浸泡处理的大蒜分别加入30mlPBS(PH7.2，含1％巯基乙醇)研碎，双层纱布过滤。经电镜观察。所用铜网均为200目。每个铜网上随机选取10个网孔，每个网孔中随机选取一个视野(每例样品共10个视野计数)，进行病毒颗粒的计数。记录结果如下：

电镜检测大蒜病毒的含量(x±s)(n＝10)

样品	剂量(生药g/ml)	病毒数
			水提物	0.1	2.8±1.5**
醇提物	0.1	2.1±1.9**
			化合物1	3mg/ml	3.0±1.8**
根皮苷	3mg/ml	5.0±2.7**

醇提物(除去化合物1，2)	0.1	3.2±2.1**
			清水	/	12.7±3.7

注：与清水处理相比**p＜0.01

结果显示，湖北海棠有显著的抗大蒜病毒作用。其水提物、醇提物及其主要成分根皮苷均有作用。表明湖北海棠中多种成分具有抗病毒作用，水提物、醇提物中主要含黄酮类成分，黄酮类成分是其主要抗病毒成分。

2、对番茄、黄瓜、土豆等植物病毒的作用

2.1、病毒提取

将有病毒特征的对番茄、黄瓜、土豆叶各收集1000g，加入1000mlPBS(PH7.2，含1％巯基乙醇)研碎，纱布过滤后，按每100ml抽提液中加8ml的比例分别加入正丁醇，搅拌15min；5000g离心25min，取上清。再按4gPEG6000/100ml分别加入PEG，搅拌使其溶解，5000g离心30min，取沉淀。分别用60ml 0.01mol/L PBS悬液，4000g离心20min，取上清。按每10ml上清加0.4gNaCl、0.4gPEG6000分别加入NaCl和PEG6000，边加边搅拌，待PEG6000溶解后5000g离心20min，取沉淀。沉淀用少量0.01mol/L PBS悬浮，4000g离心15min，取上清。得病毒提取液放入4℃冰箱保存。

病毒提取液负染色经电镜观察。所有病毒提取液均含有病毒颗粒。

2.2、病毒转染及观察

病毒提取液10倍稀释，选取相应健康植株进行叶面喷洒，每3天1次，共3次。第3次喷洒3天后，选择发病较均匀植株，取湖北海棠醇提物用冷开水配成0.1g/L溶液叶面喷洒。共施药3次，每10天1次，第3次喷洒10天后进行药效调查。

每小区对角线五点取样，每点选2株，观察防治效果。叶片无明显症状或轻度花叶为有效，叶片明显呈花叶，或叶片皱缩、变窄甚至畸型为无效。

结果湖北海棠对对番茄、黄瓜、土豆毒病均有良好抗病毒作用。

大蒜、番茄、黄瓜、土豆等病毒病是由几种病毒复合侵染的结果。为害大蒜的主要病毒有洋葱黄矮病毒(OYDV)，韭葱黄条纹病毒(LYSV)，青葱潜隐病毒(SLV)，大蒜普通潜隐病毒(GCLV)，洋葱螨传潜隐病毒(OMbLV)等。为害番茄的主要病毒有番茄花叶病毒(TOMV)也叫烟草花叶病毒(TMV)，黄瓜花叶病毒(CMV)，马铃薯X病毒(PVX)，番茄斑萎病海(TSWV)等。为害土豆的主要病毒有马铃薯X病毒(PVX)，马铃薯Y病毒(PVY)。马铃薯卷叶病毒(PLRV)，马铃薯S病毒(PVS)，马铃薯A病毒(PVA)。实验表明湖北海棠对大蒜、番茄、黄瓜、土豆等多种植物的多种毒病有抗病毒作用，是一种广谱高效抗植物病毒药物。

湖北海棠中多种成分具有抗病毒作用，其中黄酮类化合物抗病毒活性较强。根皮苷是湖北海棠的主要成分，有抗病毒作用。可作为质量控制指标。

Claims (7)

1、一种海棠抗病毒药物的制备方法，其特征在于：取湖北海棠叶，称量，加入水，浸泡1小时，在温度70-100℃加热提取2-3次，每次1-3小时，滤液浓缩至1ml相当于生药5-10g，灌装，高压灭菌，得到海棠抗病毒液体药物。

2、一种海棠抗病毒药物的制备方法，其特征在于：取湖北海棠叶，称量，加入酒精至酒精含量50-70％，浸泡1-3小时，回流提取2-3次，每次1-3小时，过滤，滤液减压回收酒精后浓缩至1ml相当于生药5-10g，灌装，高压灭菌，得到海棠抗病毒液体药物。

3、根据权利要求1或2所述的海棠抗病毒药物的制备方法，其特征在于：将得到的液体药物加热常压干燥、真空干燥、喷雾干燥等干燥方法干燥并粉碎成细粉，得到海棠抗病毒固体药物。

4、湖北海棠提取物在抗病大蒜病毒的药物中的应用。

5、湖北海棠提取物在抗番茄病毒的药物中的应用。

6、湖北海棠提取物在抗黄瓜病毒的药物中的应用。

7、湖北海棠提取物在抗土豆病毒的药物中的应用。