CN101005855A - 治疗由ccr2介导的疾病或紊乱的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了减少或维持患者例如人类和动物的体重和/或机体脂肪的方法，用于例如治疗超重或肥胖患者，或者用作在可食用动物例如牛、鸡、猪中生产瘦肉的方法；治疗糖尿病和/或葡萄糖耐受不良的方法；以及治疗有该需求的患者代谢综合症的方法；所述方法通过施用单独或者与第二治疗剂联合的CCR2治疗剂、用于上述治疗用途的试剂盒；以及鉴定用于上述治疗用途的CCR2治疗剂的方法。

Description

治疗由CCR2介导的疾病或紊乱的方法
技术领域
本发明涉及通过施用CC趋化因子受体2(CCR2)治疗剂以减少或维持患者体重和/或机体脂肪的方法。另外，本发明提供了通过施用CCR2治疗剂以治疗患者代谢综合症紊乱的方法。本发明还提供了通过施用CCR2治疗剂以治疗患者糖尿病或葡萄糖耐受不良的方法。
背景技术
目前肥胖症被认为是遍布世界各地的流行病，它也是一种慢性疾病，需要得到治疗以降低与其相关的健康风险。虽然重量减轻本身是很重要的治疗结果，但是糖尿病治疗方法的一个主要目标是降低与糖尿病有关的发病率和死亡率。已经发现，体重减轻5-10％基本上可以改善代谢和心血管数值，例如血糖、血压以及脂质浓度。因此，据信体重减轻5-10％可以降低发病率和死亡率。
诊断为肥胖或超重的个体罹患其它健康状况例如冠心病、中风、高血压、2型糖尿病、血脂异常、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、胆囊疾病、抑郁以及某些癌症(例如：子宫内膜、乳腺、前列腺和结肠癌)的风险将增加。肥胖症对健康的负面影响导致其在美国成为可预防性死亡的第二大原因，并成为对社会施加重要经济和社会心理效应的主要公众健康话题(McGinnis和Foege，(1993)JAMA 270，2207-2212，以及Calle，E.E.(2003)NEJM 348，1625-1638)。
此外，预防体重和/或机体脂肪增加或维持体重和/和机体脂肪有利于使个体保持良好的状态。
近来，有人提出某些趋化因子可能在脂肪组织的调节或脂肪组织的细胞组成中具有一定作用，并可作为治疗肥胖症、糖尿病和恶病质的基础(Gerhardt，C.C.等人，(2001)Mol.Cell.Endocrin.175，81-92)。
趋化因子构成了一组多种多样的分泌碱性小蛋白，其中这些蛋白可调节包括白细胞在内的许多细胞的趋药性移动和激活，尤其在炎症期间免疫响应的激活。最近已有人提出一种新的趋化因子分类方案(Zlotnik，A.和Yoshie O.(2000)Immunity12，121-127)。
对趋化因子显示出可趋药性应答并可通过趋化因子激活的细胞实例有嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞，还有B淋巴细胞和不同类型的T淋巴细胞(Oppenheim，J.J.等人，(1991)Annu.Rev.Immunol.9，617-48；Miller，M.D.和Krangel，S.K.(1992)Crit.Rev.Immunol. 12 17-46；以及Baggiolini，M.，等人，(1994)Adv.Immunol.55，97-179)。
趋化因子可按照在成熟的蛋白中参与二硫键形成的半胱氨酸残基的构型进行分类。第一组，CXC趋化因子或α-趋化因子的特征在于在氨基末端区域具有两个半胱氨酸残基，且这两个残基之间还存在一个氨基酸残基。CKC趋化因子主要作用于嗜中性白细胞，尤其是那些在其氨基末端携带有氨基酸序列Glu-Leu-Arg的CXC趋化因子。这些CXC趋化因子的实例包括白细胞介素-8(IL-8)、GRO-α，-β和-γ、NAP-2、ENA-78和GCP-2。
第二组，CC趋化因子或β-趋化因子的特征在于在氨基末端区域出现两个相邻的半胱氨酸。CC趋化因子作用于许多各种各样的白细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱细胞、以及T和B淋巴细胞。这些趋化因子的实例包括MCP-1、MCP-2、MCP-3、MIP-1α、MIP-1β、嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)、RANTES和I-309。
MCP-1、或者新分类的CCL2，可由单核细胞和各种组织细胞(例如内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、角化细胞、滑膜细胞、系膜细胞、成骨细胞、平滑肌细胞)以及多数肿瘤细胞产生(Baggiolini，M.，等人，(1994)Adv.Immunol.55，97-179)。近来还发现MCP-1可由脂肪细胞产生(Rollins，B.G.(1997)Blood 90，909-928以及Gerhardt，C.C.等人，(2001)Mol. Cell.Endocrinol.175，81-92)。
MCP-1在动脉粥样硬化的病变机理中可能具有一定作用。有人提出，通过从激活内皮释放出的MCP-1进行的活性单核细胞补充可能在脂肪条纹和动脉粥样硬化斑的形成中具有一定作用(Yla-Herttuala，S.，等人，(1991)PNAS 88，5252-5256；Schwartz，C.J.，等人，(1993)Am.J.Cardiol.71，9B-14B；以及Takeya，M.(1993)Hum.Pathol.24，534-9)。具有遗传性中断的MCP-1或其受体CCR2的高胆固醇小鼠，具有较低的粥样斑出现几率(Boring，L.等人，(1998)Nature 394，894-897)。
已经发现，相较于瘦的对照者而言，肥胖小鼠的白色脂肪组织和血浆中MCP-1的表达得到上调(Sartipsy，P.和Loskutoff，D.J.(2003)PNAS 100，7265-7270)。还发现，在减少饮食的肥胖小鼠中MCP-1的表达增加将导致血浆中MCP-1水平的上升(Takahashi，K.等人，(2003)J.Bio.Chem.278，46654-46660)。
越来越多的数据还指出炎症和胰岛素抗性之间存在相关性和可能的引发关系。啮齿动物肥胖症模型出现肥胖症的结果已经表明前炎细胞因子TNF-α可以调节胰岛素耐受性(Hotamisligil，G.S.(1994)Diabetes 43，1271-1278)。还注意到肥胖个体的脂肪组织的巨噬细胞中TNF-α表达有所增加(Weisburg，S.P.等人，(2003)J.Clin.Invest.112，1796-1808)。
在研究炎症的发病机理时，已将CCR2-/-切除(KO)小鼠作为工具用来判断哪些情况是由CCR2拮抗剂改善或恶化的。
CCR2 KO小鼠已经显示出MCP-1诱导的白细胞对微脉管内皮的粘着力降低，以及白细胞溢出减少(Kuziel，W.A.(1997)，PNAS94，12053-12058)。此外，CCR2 KO小鼠还显示出在响应炎性药剂时降低了单核细胞的募集(Boring，L.等人，(1997)J.Clin.Invest.100，2252-2261)。
发明内容
本发明提供了一种通过向患者施用CCR2治疗剂、以及相关试剂盒(单独施用或与其他治疗剂联合施用)以减少或维持体重和/或机体脂肪的方法，以及筛选用于上述治疗用途的CCR2治疗剂的方法。本发明还提供了一种通过向患者施用CCR2治疗剂(单独施用或与其他治疗剂联合施用)以治疗代谢综合症的方法。此外，本发明提供了一种通过向患者施用CCR2治疗剂(单独施用或与其他治疗剂联合施用)以治疗糖尿病或葡萄糖耐受不良的方法。该CCR2治疗剂包括CCR2拮抗剂。其他的CCR2治疗剂包括CCR2抑制剂和CCR2配体抑制剂。
在一实施方案中，本发明提供一种治疗患者以减少体重和/或机体脂肪的方法，所述方法包括向有该需要的患者(subiect，对象)施用治疗有效量的CCR2治疗剂。在该实施方案中，该患者是人，该患者超重或肥胖或具有变成肥胖的倾向，以及该CCR2治疗剂是CCR2拮抗剂。其他的CCR2治疗剂包括CCR2抑制剂和CCR2配体抑制剂。
在第二实施方案中，本发明提供了一种治疗患者以维持和/或稳定体重和/或机体脂肪的方法，所述方法通过向有该需要的患者施用CCR2治疗剂。该CCR2治疗剂包括CCR2拮抗剂。其他的CCR2治疗剂包括CCR2抑制剂和CCR2配体抑制剂。
在第三实施方案中，本发明提供了一种治疗糖尿病或葡萄糖耐受不良的方法，所述方法包括向有该需要的患者施用治疗有效剂量的CCR2治疗剂。糖尿病患者可以是1型(IDDM)或2型(NIDDM)的糖尿病患者。在1型糖尿病中，CCR2治疗剂可以用来提高胰岛素敏感性。该CCR2治疗剂包括CCR2拮抗剂。其他的CCR2治疗剂包括CCR2抑制剂和CCR2配体抑制剂。
在第四实施方案中，本发明提供了一种治疗代谢综合症的方法，所述方法包括向有该需要的患者施用治疗有效剂量的CCR2治疗剂。
在第五实施方案中，所述方法还包括向患者施用第二种治疗剂，优选减肥药，例如利莫那班(rimonabant)、奥利司他(orlistat)、西布曲明(sibutramine)、溴麦角环肽、来普汀或肽YY3-36或其类似物。
本发明第二方面是一种鉴定可用于减少或维持体重和/或机体脂肪，或可治疗糖尿病、代谢综合症或葡萄糖耐受不良的药剂的方法，所述方法包括(i)向测试对象施用CCR2治疗剂，以及(ii)确定该CCR2治疗剂在该测试对象中对减少或维持体重和/或机体脂肪，或对治疗糖尿病、代谢综合症或葡萄糖耐受不良是否有效。该CCR2治疗剂包括CCR2拮抗剂。其他的CCR2治疗剂包括CCR2抑制剂和CCR2配体抑制剂。
作为相关方面，所述方法进一步包括在将CCR2拮抗剂施用给测试对象之前，测试CCR2治疗剂在体外测试中的CCR2治疗活性。
本发明的第三方面是一种鉴定可用于治疗1或2型糖尿病的治疗剂的方法，所述方法包括(i)向测试对象施用CCR2治疗剂，以及(ii)确定该CCR2治疗剂在该测试对象中对治疗糖尿病或葡萄糖耐受不良是否有效。作为相关方面，所述方法进一步包括在将CCR2拮抗剂施用给测试对象之前，测试CCR2治疗剂在体外测试中的CCR2治疗活性。
本发明的第四方面是一种鉴定可用于治疗代谢综合症的治疗剂的方法，该种方法包括(i)向测试对象施用CCR2治疗剂，以及(ii)确定该CCR2治疗剂在该测试对象中对治疗代谢综合症是否有效。作为相关方面，所述方法进一步包括在将CCR2拮抗剂施用给测试对象之前，测试CCR2治疗剂在体外测试中的CCR2治疗活性。
同样具有特色的是，本发明第五方面是一种试剂盒，其中包含CCR2治疗剂和用于将该治疗剂施用给患者以减少或维持患者的机体脂肪和/或体重的说明。作为本发明另一方面提到的是一种试剂盒，其中包含CCR2治疗剂和用于将该治疗剂施用给患者以治疗糖尿病或葡萄糖耐受不良的说明。作为本发明另一方面有特色的是一种试剂盒，其中包含CCR2治疗剂和用于将该治疗剂施用给患者以治疗代谢综合症紊乱的说明。该CCR2治疗剂包括CCR2拮抗剂。其他的CCR2治疗剂包括CCR2抑制剂和CCR2配体抑制剂。在其他实施方案中，所述试剂盒还可包括第二治疗剂，优选减肥药，例如利莫那班(rimonabant)、奥利司他(orlistat)、西布曲明(sibutramine)、溴麦角环肽、来普汀或肽YY3-36或其类似物。
本领域技术人员应该可以充分理解说明书和所附权利要求书中用于描述本发明的各种术语。尽管如此，除非另有指明，以下术语按照下文进行进一步描述。
术语“a”是指包括一个或多个。
术语“治疗”、“治疗方法”包括预防例如预防用药，以及姑息疗法或提供预防或姑息疗法的行为。
术语“患者”指的是受益于降低CCR2活性的任何患者或对象(例如人或动物)或个体。
“由CCR2介导的疾病或紊乱”指的是已知CCR2在其中起一定作用或具有某些效应的任何疾病、紊乱、有害病况或健康状态。
“治疗剂”是指能够调控CCR2或CCR2配体的药物成分，包括化学的，例如小分子或生物材料或分子(自然的或合成的)；该治疗剂可包括CCR2拮抗剂或如本文中定义的CCR2抑制剂或CCR2配体抑制剂。
“CCR2拮抗剂”或“CCR2抑制剂”是指直接或间接减少或减弱CCR2(例如一种或多种)生物活性的治疗剂。该治疗剂可包括蛋白例如抗-CCR2抗体；核酸例如反义CCR2或RNA干扰(RNAi)核酸；氨基酸；肽；碳水化合物；小分子(有机的或无机的)；或其他化合物或组合物。这些化合物或组合物可通过有效减少细胞中存在的CCR2的量，或通过减少CCR2配体与其相互作用的能力来降低CCR2多肽的活性。作为CCR2拮抗剂的化合物包括所有的溶剂化物、水化物、可药用盐、互变异构体、立体异构体以及这些化合物的前体药物。优选本发明使用的小分子CCR2拮抗剂具有小于10μM的IC50，更优选小于1μM，以及最优选小于0.1μM。可依据标准技术来制得抑制CCR2基因或mRNA表达的反义寡核苷酸(Agrawal等人，(1993)Methods in MolecularBiology：Protocols for oligonucleotides and Analogs，Vol.20)。类似地，还可利用具有降低CCR2受体表达功能的RNA干预分子(Hannon，(2002)Nature 418；244-251，Shi，(2003)Trends in Genetics 19：9-12，2003；以及Shuey等人，(2002)Drug Discovery Today 7：1040-1046)。
“CCR2配体抑制剂”是指阻止或减少CCR2配体与其受体作用或相互作用的治疗剂。
“降低CCR2活性”指的是可控地降低CCR2的整个多肽活性，这种情况是由于基因中断或操纵CCR2基因功能导致细胞中CCR2多肽功能水平的降低的结果，或施用通过干扰与配体的相互作用来直接或间接影响CCR2活性的治疗剂的结果。
短语“可药用的”是指通常在化学和/或物理上与制剂中包括的其他成分相配伍的，并且在生理学上可与其受体相配伍的指定载体、媒介物、稀释剂、赋形剂和/或盐。
术语“前体药物”指的是药物的前体，其在给药后通过化学或生理过程(例如受生理PH作用或通过酶活性作用)在体内释出药物。关于前体药物的合成和用途的讨论可参见Higuchi和Stella撰写的Prodrugs as Novel Delivery Systems，vol.14 of the ACS SymposiumSeries，以及Bioreversible Carriers in Drug Design，ed.EdwardB.Roche，American Pharmaceutical Association and PergamonPress，1987。
术语“盐”和“可药用盐”指的是化合物、化合物立体异构体或化合物前体药物的有机或无机盐。
“超重”和更严重的“肥胖”病况指的是超过理想体重(更具体的是超过理想机体脂肪)的病况，其通常通过体重指数(BMI)来确定。体重指数与总机体脂肪和遭受相关风险有关，这种风险是由于作为超重或肥胖情况导致的疾病而过早死亡或劳动能力丧失。随着机体脂肪的过多增加，也增加了健康的风险。BMI通过重量的千克数除以身高的米数的平方(kg/m2)来计算，或者也可以通过重量的磅数乘以703，再除以身高的英寸数的平方(Ibs×703/in2)来计算。BMI介于25.0至29.9之间为典型的“超重”。“肥胖症”则典型地由30或更大的BMI来确定(参见例如国家心脏血液所(National Heart，Lung and BloodInstitute)，Clinical Guidelines on the Identification，Evaluation，and Treatment of Overweight and Obesity in Adults，The Evidence Report，Washington，DC：U.S.Department of Healthand Human Services，NIH publication no.98-4083，1998)。在具有大量肌肉的个体中，BMI、机体脂肪和疾病风险之间的相关性将弱于其他个体。因此，这些具有大量肌肉的个体是否是事实上的超重和肥胖的评定，可通过其他更精确的测定例如总机体脂肪的直接测定或腰与臀部比例的评定来确定。
本文中定义的“代谢综合症”依据成人治疗专家组III(ATP III)；美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)：发现、评测和治疗成人血胆固醇偏高专家组的第三份报告(成人治疗专家组III)，综合报告；Bethesda，MD，美国国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health)，国家心肺血液所(National Heart，Lung andBlood Institute)，2001(NIH pub.no.01-3670)，其出现在当一个人具有以下三种或更多种症状或紊乱时：
1.腹部肥胖症：男子腰围＞102cm以及女子腰围＞88cm；
2.高甘油三脂血症：≥150mg/dl(1.695 mmol/l)；
3.低HDL胆固醇：男子＜40mg/dl(1.036mmol/l)以及女子＜50mg/dl(1.295mmol/l)；
4.高血压：≥130/85 mmHg；
5.空腹血糖升高：≥110mg/dl(≥6.1mmol/l)；或者
根据世界卫生组织标准(Alberti and Zimmet，Diabet.Med.15：539-53，1998)，当一个人具有糖尿病、糖耐量低减、空腹血糖低减或胰岛素抵抗力加上两种或更多种下述异常时：
1.高血压：≥160/90 mmHg；
2.高脂血症：甘油三酯浓度≥150mg/dl(1.695mmol/l)和/或男子HDL胆固醇＜35mg/dl(0.9mmol/l)以及女子HDL胆固醇＜39mg/dl(1.0mmol/l)；
3.向心性肥胖：男子腰与臀部的比例＞0.90以及女子腰与臀部的比例＞0.85和/或BMI＞30kg/m2；
4.微量白蛋白尿：尿白蛋白排泄率≥20μg/min或白蛋白与肌酐的比例≥20mg/kg。
“治疗有效”是指产生相对于合适的指标来说减少了体重和/或机体脂肪的结果；和/或改善了糖尿病(NIDDM和/或IDDM)、代谢综合症或紊乱、和/或葡萄糖耐受不良的一个或多个症状的结果。
根据以下的详细说明和权利要求书，本发明的其他特征和优势将是显而易见的。当本发明结合特定的实施方案进行描述时，可以理解其他可应用的改变和修饰仍然是本发明的一部分，并且落入所附权利要求书范围之内。本申请意欲覆盖大体遵照本发明原理的所有等同物、变型、应用或修改，包括不同于本发明但是本领域技术人员已知或常规使用的，以及能够不需要过度实验而能够确定的所有等同物、变型、应用或修改。这里提到的所有出版物，包括已公布的专利申请和授权的专利，都将全文引入本文作为参考。
附图说明
图1用基线改变的百分率示出4个实验小组体重改变的时间过程。这4个小组是：低脂饮食(C57 LFD)的野生型(C57)小鼠；低脂饮食(KO LFD)的CCR2-/-knockout(KO)小鼠；高脂饮食(C57 HFD)的野生型小鼠以及高脂饮食(KO HFD)的CCR2 KO小鼠。C57 HFD小鼠显示出与C57 LFD相比增加的体重。然而，KO HFD小鼠并没有经历与KO LFD小鼠类似的体重增加。
图2是以4个实验小组体重的百分率示出附睾脂肪的时间过程的线性图。CCR2 KO小鼠与C57对照小鼠相比，在同样的饮食下显示出与体重有关的较小肥胖倾向。
图3A-3D示出了12周后4个实验小组脂肪组织的组织学片断的图像。
图4详解了使4个实验小组的体重增加而正常化的食物消耗的时间过程的柱状图。尽管如图1所示，KO HFD小鼠获得了较小的体重，但是与C57 HFD对照小鼠相比，KO HFD小鼠消耗了与HFD相等或稍微更大的量。
图5示出了4个实验小组的耗氧量(VO2)。4个实验小组之间在代谢率上并无显著性差异。
图6示出了4个实验小组的静止耗氧量(VO2)。4个实验小组之间并无显著性差异。
图7示出了4个实验小组的空腹血浆胰岛素水平的线性图。由较低的胰岛素水平基础可知，HFD和LFD实验方案的CCR2 KO小鼠均显示了比C57对照小鼠更大的胰岛素敏感性。
图8A-8B示出了4个实验小组的口服葡萄糖耐量实验(OGGT)与胰岛素水平的结果的线性图。在OGGT期间CCR2 KO HFD小鼠与C57 HFD相比显示了明显降低的葡萄糖偏差。
图9示出了CCR2 KO小鼠与C57小鼠在正常饮食下的口服葡萄糖耐量实验(OGGT)结果的线性图。CCR2 KO小鼠与C57对照小鼠相比具有明显更大的葡萄糖耐受性。
发明详述
本发明着眼于降低动物体重和/或机体脂肪的方法，用于例如治疗超重或肥胖患者(例如人类或伴侣动物)，或者用作在可食用动物(例如牛、鸡、猪)中生产瘦肉的方法，所述方法通过在有该需要的患者中施用CCR2拮抗剂。
本发明还着眼于向有需要的患者(人类或动物)施用CCR2拮抗剂以治疗代谢综合症紊乱的方法。
本发明还着眼于向有需要的患者(人类或动物)施用CCR2拮抗剂以治疗非胰岛素依赖型糖尿病(胰岛素依赖型和/或非胰岛素依赖型)，和/或葡萄糖耐受不良的方法。
如这里的实施例所公开的，CCR2-/-knockout小鼠(KO)相对地能抵抗体重增加的发展以及能抵抗引起肥胖病的可能。数据也显示了在进入高脂饮食(HFD)后代谢综合症症状减轻。这些实施例说明促使CCR2活性降低是减少体重和/或机体脂肪的有效方法，可以改善代谢综合症的症状，并用于例如治疗具有超重、肥胖和/或遭受代谢综合症中的一种或多种症状的患者(人类或动物)，以及使可食用种类的动物产生瘦肉。
典型的趋化因子拮抗剂(抑制剂)
在本发明实施中非常有用的趋化因子拮抗剂(特别是CCR2拮抗剂)，可通过这里提到的分析方法进行鉴定，包括以下专利文件中公开的拮抗剂：WO 04/050024、WO 04/016769、WO 03/093266、WO03/093231、WO 03/092586、WO 03/051921、WO 01/51467、WO 00/69815、WO 00/69432、WO 00/46199、WO 98/25617、WO 98/25605、美国公开中请号2003144339、美国公开申请号20030165494、美国公开申请号2003008893、美国公开申请号US 2002042370、美国专利号6,737,435、美国专利号6,686,353、美国专利号613,760、美国专利号6,569,888、美国专利号6,479,527、美国专利号6,472,410、美国专利号6,451,842、美国专利号6,403,587、美国专利号6,441,004、美国专利号6,362,177、美国专利号6,387,912、美国专利号6,291,501、美国专利号6,288,103、美国专利号6,140,349、美国专利号6,140,338、美国专利号6,166,037、美国专利号6,136,827、美国专利号6,124,319、美国专利号6,084,075、美国专利号6,013,664、美国专利号5,962,462以及美国专利号5,719,776。
CCR2拮抗剂
本文中使用的术语“CCR2功能的拮抗剂”指的是可抑制CCR2的功能(例如一种或多种)的药剂(例如一种分子、一种化合物)。例如，CCR2功能的抑制剂可抑制一种或多种配体(例如MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4和MCP-5)偶联到CCR2上，和/或抑制通过CCR2介导的信号转导(例如经由与G蛋白相关的CCR2进行的GDP/GTP转换，细胞内钙通量)。因此，CCR2功能的拮抗剂可抑制以CCR2-介导的过程和细胞内应答(例如增殖、迁移、趋化应答、分泌或脱粒)。本文中使用的“CCR2”指的是自然存在的CC趋化因子受体2(例如哺乳动物的CCR2(例如人类(Homo sapiens)的CCR2))以及包括自然存在的变异体，例如等位变异、剪接变异(例如CC-趋化因子受体2a和/或CC-趋化因子受体2b)。
CCR2功能的拮抗剂是例如为小有机分子的化合物、天然产物、蛋白质(例如抗体、趋化因子、细胞因子)、肽或拟肽。
现有技术中已知多种分子可以对抗趋化因子受体(例如，CCR2)的一种或多种功能，包括有机分子；蛋白例如抗体(例如多克隆血清、单克隆、嵌合体的、人化的、人的)及其抗原结合片段；趋化因子突变体及类似物；以及肽。
CCR2功能的拮抗剂可以通过例如筛选分子标本库，例如本文所述的美国国立癌症研究院(National Cancer Institute)的化学储藏库或使用其他适宜的方法进行鉴定。
CCR2功能的拮抗剂的其他来源是组合物质库，其包括许多结构很特殊的分子种类。组合物质库可用于鉴定前沿Clead化合物或使先前鉴定过的前沿最优化。这种库可通过组合化学已知的方法建立，并通过适宜的方法进行筛选，例如本文所述的方法。
正如之前所提到的，其他CCR2拮抗剂包括CCR2选择性拮抗剂可通过本领域技术人员已知的标准分析方法进行鉴定。简而言之，鉴定CCR2选择性调节剂的一类筛选方法将使用细胞系，包括原始细胞或转染后的CCR2细胞。或者也可以使用动物模型。
在筛选分析CCR2拮抗剂或抑制剂时使用的CCR2蛋白优选是人类的(美国专利号5,707,815以及美国专利号6,132,987以及Charo等人的(1994)，PNAS，91：2752-2756)。其他哺乳动物种类的CCR2蛋白也是已知的，也可以在分析中使用。
另一个可选的分析抑制CCR2配体结合作用的方法是评估CCR2功能的抑制作用。
用于筛选CCR2治疗剂的实验药剂可分别选自：例如上述的专利文件或从化合物库中获得的药剂。这些药剂包括肽、来自组合化学的由下列物质构成的分子库：D-和/或L-构型氨基酸、磷酸肽、抗体、包括例如修饰蛋白的修饰生物物质、以及小的有机和无机化合物。这些库包括生物库、天然化合物库、类肽库(具有肽功能的分子库，但具有新颖的非肽骨架，对酶的降解作用有抵抗性，并且保持生物活性)(Zuckermann(1994)，J.Med.Chem.37；2678-85)、空间定位固相或溶液相库、需要去卷积的合成库方法、“单珠粒单化合物”库方法和利用亲和色谱选择的合成库方法。
合成分子库的方法的实例可在现有技术中获得(DeWitt等人，(1993)，PNAS.90；6909；Erd等人，(1994)PNAS91：11422；Zuckermann等人，(1994)，J.Med.Chem.37；2678；Cho等人，(1995)，Science，261：1303；以及Gallop等人，(1994)，J.Med.Chem.37：1233)。
化合物库可存在于溶液(Houghten，(1992)Biotechniques，13：412-421)，或小球(Lam，(1991)Nature 354：82-841)，碎片(Fodor(1993)，Nature 364；555-556)；细菌或孢子(Ladner，美国专利号5,223,409)，质粒(Cull等人，(1992)，PNAS 89：1865-1869)或噬菌体(Scott等人，(1990)，Science 249：386-390；Devlin(1990)，Science 249：404-406；Cwirla等人，(1990)PNAS 87：6378-6382；以及Felici(1991)，J. Mol.Biol.222：301-310)中。
筛选方法
如上所述，本发明还包括鉴定可用于本文所述的治疗方法中的药剂的筛选方法。这些方法包括通过确认这种药剂是否能够有效减少或维持体重和/或机体脂肪来判断其是否能调节(直接地或间接地)CCR2、配体偶联或功能。还可以确认其是否能够有效治疗代谢综合症的紊乱或症状；以及确认其是否能够有效治疗糖尿病、胰岛素依赖性或非胰岛素依赖性，和/或葡萄糖耐受不良。在糖尿病的情况中，治疗剂的有效性可通过葡萄糖耐受性实验来判断。可选的简单筛选方法是选择已知在这些治疗方法中有效的CCR2治疗剂的测试剂。
可利用现有技术中已知的方法(Charo等人，(1994)PNAS 91，2752-2756)检测药剂在改变CCR2活性中的功效。
这些活性化合物的治疗功效可通过细胞培养或动物模型的标准治疗程序来确定，例如确定ED50(产生最大功效的50％时的化合物浓度)。一旦确定一种药剂是CCR2拮抗剂，或检测的是已知的CCR2拮抗剂，该药剂可随后进一步确认其在本文所述的治疗方法中是否有效。这种检测可通过在本文所述的情况中使用适当的动物模型系统来进行。例如，用该种治疗剂治疗遗传性肥胖小鼠(例如C57BL(ob/ob))、饮食导致肥胖症的小鼠(例如DIO小鼠)或大鼠，可通过与本文所述的状态相关的各种参数与在类似条件下进行喂养而没有给予治疗剂的动物的参数进行相比，从而获知药剂的效果。为了上述目的而检测的参数包括，例如体重、机体脂肪、胰岛素、葡萄糖、甘油三酯、游离脂肪酸、脂联素、血色素Alc、胆固醇、来普汀和/或果糖胺。以下的实施例中提供了这些参数中的一些实例。然后本领域熟练技术人员可以选出对这些参数具有积极影响的治疗剂来进行临床前或临床研究。
CCR2拮抗剂的表征
已发现对与本文讨论的治疗方法相关的参数具有积极影响的CCR2拮抗剂，可以按照本领域技术人员可确定的那样在临床前或临床研究中进行测定。
从细胞培养实验和动物模型获得的数据可用于确定其在人体中使用时的剂量范围。这种剂量随不同的给药形式以及给药途径而不同。对于本发明的方法中使用的任意化合物或药剂来说，可由最初的细胞培养实验评估获得有效的治疗剂量。还可通过动物模型获得包括IC50的循环血浆浓度范围来确定剂量。这样的信息可用于更精确地确定人体使用时的有效剂量。可通过例如高效液相法测量血浆水平。
治疗方法
确定为CCR2拮抗剂的治疗剂将以足以减少或维持体重和/或机体脂肪的剂量进行给药，例如在通过减少脂肪储脂量的肥胖患者的情况中或意欲维持体重和/机体脂肪的个体中。这种治疗有效剂量可利用常规的优化技术进行确定，其中该技术依赖于例如患者(人类或动物的状况)、给药途径、剂型、医生的判断以及其他对本领域技术人员来说在本发明指引下显而易见的因素。
适用于本发明用途的CCR2治疗剂可单独施用，但是在人体的治疗中，通常是与相对于所需给药途径和标准制药习惯相适宜的药用赋形剂、稀释剂或载体一起的混合物形式进行给药。
例如，适用于本发明用途的CCR2拮抗剂或其盐或其溶剂化物可以片剂、胶囊剂(包括软胶囊剂)、多微粒剂、凝胶剂、膜剂、胚珠制剂、酏剂、溶液剂或混悬剂形式，通过口服、口腔或舌下给药用于直接、延迟、修饰、缓释、双重、控释或脉冲式递送给药应用。这些化合物可经由快速分散或快速溶解的形式或以高能量分散剂或以包衣颗粒形式给药。适宜的药用制剂可根据需要被包衣或不被包衣。
这些固体药物组合物，例如片剂可以包含：赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、甘氨酸以及淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)；崩解剂，例如淀粉羟乙酸钠、交联羧甲纤维素钠以及某些复杂的硅酸盐；以及成粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯(HPMCAS)、蔗糖、明胶以及阿拉伯胶。另外，还可包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山萮酸甘油酯以及滑石粉。
类似的固体组合物在明胶胶囊或HPMC胶囊中还可具有填充物。在该情形中，赋形剂可包括乳糖、淀粉、纤维素、奶糖或高分子量的聚乙二醇。  对于水性悬浮液和/或酏剂来说，CCR2拮抗剂化合物可与各种甜味剂或调味剂、色素或染料、乳化剂和/或悬浮剂以及稀释剂例如水、乙醇、丙二醇以及甘油及其混合物进行组合。
改良(修饰)的释放和脉冲式释放剂量的药物形式可包含赋形剂，例如在立即释放剂量的形式中描述过的与另外的可发挥释放速率改良(修饰)剂的赋形剂的组合，赋形剂可被包覆和/或包含在装置中主体中。释放速率改良剂包括但不排他性限于HPMC、HPMCAS、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素、聚环氧乙烷、黄原胶、卡波姆、季胺基甲基丙烯酸酯共聚物、氢化蓖麻油、卡洛巴蜡、石蜡、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸共聚物及其混合物。改良的释放和脉冲式释放剂量的药物形式可包含一种或组合的释放速率改良剂。释放速率改良赋形剂还可存在于剂型中，例如在基质中，和/或在剂型上例如在其表面或以包衣的形式。
快速分散或溶解剂量的制剂(FDDFs)可包含以下成分：天冬酰苯丙氨酸甲酯、乙酰氨基磺酸钾、柠檬酸、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、diascorbic acid、乙基丙烯酸酯、乙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、甲基丙烯酸酯、薄荷香料、聚乙二醇、烟雾硅胶、二氧化硅、羟基乙酸淀粉钠、延胡索酸硬脂酰钠、山梨醇、木糖醇。这里使用的术语“分散”或“溶解”用来描述FDDF可根据使用的药物成分溶解性的不同而不同，例如，在药物成分是不溶的情况下，可以制备快速分散的剂量药物，以及在药物成分是可溶的情况下可以制备快速溶解的剂量药物。
适用于本发明的CCR2拮抗剂还可通过非肠道给药，例如海绵体内、静脉内、动脉内、腹膜内、胸内、心室内、尿道内、膜内、颅骨内、肌肉内或皮下给药，或它们可通过输液或无针技术给药。对于这些非肠道给药，它们最好是以无菌水溶液形式进行，水溶液中可能包含其他物质，例如足够的盐或葡萄糖使溶液与血液等渗。如果需要，水溶液还可被适当缓冲(优选pH为大约3-9)。本领域技术人员可使用已知的常规制药技术来完成适宜的非肠道制剂在无菌条件下的制备。
对患者(人类或动物)的口服和非肠道给药来说，本发明使用的CCR2拮抗剂的每天剂量水平通常是1-500mg(单独或分开的剂量)。剂量范围是大约1mg-100mg。剂量可以是单剂量、分开的日剂量或多日剂量的。或者，连续剂量给药，例如控释(例如，慢的)剂量形式可以以天为基础给药或一次性给数天的量。
因而，例如适用于本发明的CCR2拮抗剂的片剂或胶囊可包含1mg-250mg活性化合物，其可适当地单独给药或每次给药两个或更多。优选的片剂或胶囊包含大约1mg-50mg活性化合物，其可适当地单独给药或每次给药两个或更多。无论如何，由医生决定每个患者最适合的实际用量，这个用量可能随每个特定患者的年龄、体重以及反应不同而不同。在这之中当然会出现个别施用很高或很低剂量的情况，这些都是落入本发明的范围的。
适用于本发明的CCR2拮抗剂可通过鼻内或吸入给药，以干燥粉末吸入剂或气雾剂的形式从密闭式容器、泵、喷雾器或雾化器中利用适当的推进剂方便地给药，推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、四氟二氯乙烷、例如1，1，1，2-四氟乙烯(HFA 134ATM或1，1，1，2，3，3，3-七氟代丙烷(HFA 227EATM)的氢化氟代烃，二氧化碳或其他适宜的气体。在加压气雾的情况中，可利用真空管来确定剂量单元来施用一定计量的量。密闭加压式容器、泵、喷雾器或雾化器可包含活性化合物的溶液或悬浮液，例如利用乙醇和推进剂作为溶剂，还可另外的包含润滑剂，例如去水山梨糖醇三油酸酯。可用于吸入器或吹药器中的胶囊和弹药筒(由例如明胶制得)可制成包含本发明的化合物与适宜的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
优选使用气雾剂或干燥粉末制剂，从而向接受治疗的动物施用包含1-50mg CCR2拮抗剂的每个计量的量或“一掀”。气雾剂的全天剂量可在1-50mg的范围内，可通过一次剂量给药，或在全天中分剂量
多次给药。
适用于本发明的CCR2拮抗剂可制成适合喷雾器给药。喷雾器装置的制剂可包含以下成分作为增溶剂、乳化剂或悬浮剂：水、乙醇、甘油、丙二醇、低分子量聚乙二醇、氯化钠、碳氟化合物、聚乙二醇醚、去水山梨糖醇三油酸酯、油酸。
或者，适用于本发明的CCR2拮抗剂可以以栓剂或阴道栓的形式给药，或它们还可以以凝胶、水凝胶、洗剂、溶液、面霜、药膏或爽身粉的形式局部施用。适用于本发明的CCR2拮抗剂还可以皮肤给药或透过皮肤给药，例如利用皮肤贴剂。它们还可通过肺部或直肠途径给药。
CCR2拮抗剂还可通过眼用途径给药。对于眼科用途来说，混合物可制成等渗的、已调节pH的、无菌盐水的微粉化的悬浮液，或优选制成等渗的、已调节pH的、无菌盐水的溶液，任选将其与例如苯扎氯铵的防腐剂联用。可选地，它们还可制成例如凡士林的软膏。
对于皮肤的局部应用来说，适用于本发明的CCR2拮抗剂可制成包含悬浮或溶解的活性成分的软膏，例如一种或多种以下成分的混合物：矿物油、液体矿脂、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙稀化合物、酯类乳化剂、以及水。可选地，它们可制成适宜的面霜或洗剂，悬浮或溶解于例如一种或多种以下成分的混合物：矿物油、去水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇以及水。
适用于本发明的CCR2拮抗剂还可与环糊精组合使用。已知环糊精可以与药物分子形成包合和非包合的混合物。药物-环糊精复合物的制剂可改善溶解性、分散速率、生物利用度和/或药物分子的稳定性。药物-环糊精复合物通常可用于大多数的剂量形式和给药途径。作为直接与药物复合的可选的方式，环糊精用作辅助添加剂，例如作为载体、稀释剂或增溶剂。最常使用的环糊精是α-、β-和γ-环糊精，在下列PCT公开号WO 91/11172、WO 94/02518和WO 98/5514 中描述了适宜的一些实例。
通常在人体中，口服给药是首选的途径，也是最方便的。在接受者遭受吞咽紊乱或口服给药后药物吸收受损的情况中，药物可通过非肠道、舌下或口腔给药。在药剂口服时无活性的情况中，可利用非肠道方式给药。
对于兽医用途而言，CCR2抑制剂可按照常规兽医实施的适宜可接受的制剂进行给药，兽医可针对特定的动物决定最合适的给药剂量方案和途径。这种动物包括超重的、肥胖的或具有超重或肥胖风险的伴侣动物。可依据本发明治疗的其他动物是可食用的动物，使其生产出比获得依据本发明的肥胖治疗前更瘦的肉。
适用于本发明的CCR2拮抗剂还可与本文所述的其他疾病、状况和/或紊乱的治疗药物联合使用。可选择对患者的治疗具有协同功效的第二种药剂。因此，还提供了包括将CCR2拮抗剂与其他药物联合施用的治疗方法。可与本发明化合物联合使用的适宜的药物包括选样的减肥药，其包括载脂蛋白-B分泌物/微粒体甘油三酯转移蛋白(apo-B/MTP)抑制剂、11β-羟基类固醇脱氢酶-1(11β-HSD1型)抑制剂、肽YY3-36或其类似物，MCR-4激动剂、缩胆囊肽-A(CCK-A)激动剂、单胺氧化酶再摄取抑制剂(例如西布曲明(sibutramine))、大麻素受体-1拮抗剂(例如利莫那班(rimonabant))、拟交感神经药、β3肾上腺素的受体激动剂、多巴胺激动剂(例如溴麦角环肽)、黑素细胞-刺激性激素类似物、5 HT2c激动剂、黑色素浓缩激素拮抗剂、来普汀(OB蛋白)、来普汀类似物、来普汀受体拮抗剂、甘丙肽拮抗剂、脂肪酶抑制剂(例如四氢脂酶抑制素(tetrahydrolipstatin)，例如奥利司他(orlistat))、减肥药(例如铃蟾肽激动剂)、神经肽-Y受体剂(例如NPY Y2激动剂)；以下专利号中描述过的指定化合物：美国专利号6,566,367、美国专利号6,649,624、美国专利号6,638,942、美国专利号6,605,720、美国专利号6,495,559、美国专利号6,462,053、美国专利号6,388,077、美国专利号6,335,345、以及美国专利号6,326,375、美国公开号20020151456以及美国公布号2003036652、以及PCT申请号：WO03/010175、WO 03/082190和WO 02/048152，甲状腺类似物、脱氢异雄甾酮或其类似物；指定的糖皮质激素受体剂、食欲素受体拮抗剂、胰高血糖素-样肽-1受体激动剂、睫状神经营养因子(例如可从Regeneron Pharmaceuticals，Inc.，Tarrytown，NY获得的AxokineTM)、人体刺鼠-相关蛋白抑制剂(AGRP)、格瑞林(ghrelin)受体拮抗剂、组胺3受体拮抗剂或反向激动剂、神经介素U受体激动剂及类似物。其他减肥药包括之前提到的药剂，都是已知的或对本领域普通技术人员来说在已经公开的内容的指引下是显而易见的。
特别优选的减肥药选自：奥利司他(orlistat)、西布曲明(sibutramine)、溴麦角环肽、来普汀、利莫那班(rimonabant)、肽YY3-36或其类似物；以及2-氧代-N-(5-苯基乙酰基)螺环-[异苯并呋喃-1(3H)，4′-哌啶]-1′-氨甲酰。本发明的化合物以及组合治疗剂优选与运动和合理的饮食一起使用。
在组合物、药物和本发明方法中使用的代表性减肥药可根据本领域技术人员公知的方法制得，例如可如美国专利号4,929,629中的描述制备西布曲明(sibutramine)、可如美国公布号美国专利号3,752,814和美国专利号3,752,888中的描述制备溴麦角环肽、  可如美国专利号5,274,143、美国专利号5,420,305、美国专利号5,540,917和美国专利号5,643,874中的描述制备奥利司他(orlistat)、可如美国专利号5,624,941中的描述制备利莫那班(rimonabant)、可如美国公开号20020141985和PCT申请号WO03/027637中的描述制备PYY3-36(包括其类似物)、以及可如美国公开号20020151456中的描述制备NPY Y5受体拮抗剂2-氧基-N-(5-苯基吡嗪基)螺环[异苯并呋喃-1(3H)，4′-哌啶]-1′-氨甲酰。
试剂盒
本发明还提供了试剂盒或药物包装，其中包括可用本发明以及本文所述的疾病和状况的CCR2拮抗剂。除了一种或多种例如片剂、胶囊或冻干粉形式的CCR2拮抗剂之外，试剂盒或药物包中还可以包括使用拮抗剂以预防或治疗这些疾病和状况的说明。拮抗剂在试剂盒或药物包中可以以瓶装或其他适合形式存在(例如泡罩包装)。任选地，试剂盒或药物包还可包括其他药物活性剂(参见例如前面列举的药物，例如减肥药)，和/或给药时使用的材料，例如稀释剂、针头、针管、涂药器及类似物。
本发明的一部分以实验结果为基础。在将本发明与特定的实施例结合进行描述的同时，可以理解，其他的改变和修饰同样是实施本发明的一部分，同时也落入所附权利要求书的范围中。本申请意欲覆盖大体遵守本发明原理的，包括超出本说明书但对本领域技术人员来说是已知或常规使用的，无需过度的实验就可以毫无疑义获得的本发明的所有等同物、变型、用途或适应性变化。
实施例
由J.David Gladstone Institutes的Dr.Israel Charo提供CCR2(KO)(-/-)小鼠。可用胚胎干细胞的同源重组繁殖具有CCR2靶向分裂的小鼠(还可参见Kuziel，W.A.等人(1997)PNAS 94，12053-12058和Boring，L.等人(2001)J. Clin.Invest.100，2252-2561)。使年龄匹配的雄性CCR2(KO)(-/-)小鼠(n＝20)和野生型(+/+)(C57)同窝对照(n＝20)在研究开始之前先适应两周并施用自由取用的水以及啮齿动物颗粒饲料(Purina 5001 rodent chow)(Purina，Brentwood，MO)。
将小鼠单独居住并分成两组：在15周的研究过程中，第一组施用含有10kcal％脂肪(低脂饮食(LFD))的饮食，第二组施用含有45kcal％脂肪(高脂饮食(HFD))的饮食(D12331 Rodent Diet，Research Diets，Inc.，New Brunswick，NJ)。小鼠可自由取用水。24小时和5天/周的周期(周一到周五)进行测量动物的食物摄取量。第0天以及其后的每一周都测量体重。
研究进一步比较CCR2 KO小鼠和C57小鼠同样用普通的饲料(Purina 5001 rodent chow，Purina，Brentwood MO)喂养后空腹血浆胰岛素水平的差异。
利用Oxymax系统(Columbus Instruments，Columbus，OH)来测定能量消耗和耗氧量。小鼠在标准实验室环境下居住并食用实验的饮食。使小鼠适应量热器的密封室(8”x4”x5.5”)(每个室一只小鼠)。将这些室处于起动的监控器中。在使用前校准量热器，气流调节到1.6liters/min，并且分别将系统设定和取样时间设置成60秒和15秒。在4小时的时期中每10分钟测一次耗氧量、二氧化碳产生量和运动的活性。
在研究的第16周后对4个实验小组的小鼠进行口服葡萄糖耐受性实验(OGGT)。前一夜的禁食后的8:30am(计时起点)左右取第一个样本。在计时起点收集后眼窝血液样本，记录，然后施用2 g/kg体重的口服葡萄糖量。在后一葡萄糖攻击量后的30、60、120和180分钟收集其他的血液样本。将25μL血液加入含有100μL的0.025％肝素化盐的微管(Denville Scientific，Inc.，Metuchen，NJ)中。在Microfuge12(Beckman Coulter，Fuller ton，CA)中以最高的设定旋转这些管2分钟。
在研究的最后一天早上，称量体重，然后经眶窦后取血液样本测定血糖。然后杀死小鼠，收集大约1毫升血液在有肝素锂的Microtainer血浆分离管中(Becton-Dickinson，Inc.，FranklinLakes，NJ)。在Beckman Microfuge 12中以最大的设置旋转5分钟。将血浆收集在1.5ml的Eppendorf管中，在液氮中冷冻。移出附睾的脂肪部分，称量，在液氮中速冻。所有样本-80℃储存。
利用制造厂商提供的试剂用商业可购的设备测定血糖(Roche/Hitachi 912 Clinical  Chemistry Analyzer， RocheDiagnostics Corp.，Indianapolis，IN)。
依据制造者的说明书使用由ALPCO诊断学(Windham，NH)提供的Mercodia ELISA胰岛素试剂盒来评估血浆胰岛素。
实施例1：CCR2抑制剂对高脂饮食(HFD)喂养的雄性小鼠的体重、机体脂肪和代谢率的功效
当施用高脂饮食(HFD)时，CCR2 KO(KO)小鼠的CCR2基因分裂导致对形成肥胖的抗性的强大表现型。与低脂饮食(LFD)C57小鼠相比，HFD的野生型(C57)小鼠显示出体重的增长，然而与CCR2 KO LFD小鼠相比，CCR2 KO HFD小鼠维持了相同的体重。如图1所示，CCR2 KO HFD小鼠的肥胖症-抗性表现型无疑是显然的。与C57 HFD小鼠形成对比，该种小鼠仅仅在7周中就增长了大约体重基线之上的30-35％的体重，CCR2 KO HFD小鼠的体重在其体重基线之上仅仅增长了5-10％的体重。同样的增长结果出现在CCR2 KO LFD小鼠和C 5 7 LFD小鼠之间的比较中。
图2所示的用体重的百分比来表示的附睾的脂肪组织的测量结果证明了由于增加的肥胖症的导致C57 HFD小鼠重量增加。虽然在整个研究过程中CCR2 KO HFD小鼠体重不断增加，但它们仍然保持了明显低于由同样的饮食(分别是总体重的3.2％vs.5.0％)喂养的C57小鼠的增长。
脂肪组织、胰脏和肝脏切片的组织学检测
C57小鼠和CCR2 KO小鼠(n＝5/小组)用LFD或HFD喂食12周。这段时期结束后，解剖动物，收集小鼠的脂肪组织、胰脏和肝脏用于生理学的检验。称量白色脂肪组织，计算其与体重的百分比。
用Mac2，一种巨噬细胞标记物对脂肪组织切片进行染色，以及通过多变量分析来测定染色的量以及脂肪细胞的大小。将Mac 2的最终染色量进行脂肪细胞的大小的校正。
脂肪组织切片：
器官的重量：如表1所记录的高脂饮食(HFD)的C57小鼠和KO小鼠的附睾的脂肪组织重量均有增加。这种增重在C57小鼠(2.6xvs2.1x)中更为明显。在低脂饮食(LFD)小组中，KO小鼠脂肪组织的重量稍微低于C57小鼠。
表1
附睾的脂肪组织数据(用总体重的a％表示，n＝5/小组)
周 C57 LFD SEM C57 HFD SEM KO LFD SEM KO HFD  SEM
715 2.45 38    0.18258542.504612   0.2494071 4.0554    0.62916374.954     0.5481387 1.253    0.18209831.748    0.2324091 2.1594    0.1182673.212     0.379017
微观检验：HFD的C57小鼠和KO小鼠的脂肪细胞均变大。将图3B和3D(HFD小鼠)与图3A和3C(LFD小鼠)进行比较。C57小鼠中去除的脂肪细胞的尺寸看上去比KO小鼠的更大。将图3A和3B(C57小鼠)与图3C至3D(KO小鼠)进行比较。这个观察结果通过多变量分析得到证实，器官的重量也具有一致的结果。
C57 HFD小鼠的脂肪组织中具有增加的大量巨噬细胞，这与脂肪组织尺寸的增大相关。与此相反，KO HFD小鼠显示了在其附睾的脂肪组织中具有数量减少的巨噬细胞。这种观察结果也通过多变量分析得到证实。
上述组织化学的数据显示了C57 HFD小鼠和KO HFD小鼠的脂肪细胞尺寸均增大了。这种增大在C57小鼠中更为急剧。这种增大与渗透在脂肪中的巨噬细胞有关。
C57 HFD小鼠和KO HFD小鼠之间的体重差异并不能通过KO小鼠中降低的食物消耗量进行解释。与C57对应者相比，CCR2 KO小鼠消耗了相同量的HFD(图4)。
在HFD喂养的CCR2 KO小鼠中代谢率并无明显变化。在HFD喂养的KO小鼠中，耗氧量(VO2)(测量了总VO2(图5)或呼吸交换率(图6))并无显著差异。HFD和LFD的C57小鼠的静止VO2值与CCR2 KO HFD和LFD小鼠相等。
这些结果证明降低CCR2活性是减少体重和/或机体脂肪和治疗与可能引起的肥胖症相关的紊乱的有效方法。
实施例2：CCR2在高脂饮食喂养的小鼠的代谢参数的效应
CCR2 KO小鼠具有较低的胰岛素基础水平，意味着减少的葡萄糖偏差显示了胰岛素敏感性的改善(图7)，以及在OGTT期间的对葡萄糖上升的抗性(图9)。此外，与C57 HFD小鼠相反，CCR2 HFD KO小鼠并无高胰岛素血症和葡萄糖耐受不良方面的发展(图8A和8B)。
这些结果证明CCR2治疗剂对治疗与糖尿病、葡萄糖耐受不良或胰岛素抗性有关的紊乱是有效的。CCR2治疗剂对治疗与代谢综合症有关的疾病是有效的。另外，CCR2治疗剂对减少或维持体重和/或机体脂肪，以及对治疗与可能引起的肥胖症有关的紊乱也是有效的。

Claims (14)

1.治疗患者以减少或维持机体脂肪和/或体重的方法，包括向需要减少或维持机体脂肪和/或体重的患者施用治疗有效量的CC趋化因子2(CCR2)治疗剂。
2.治疗患者以治疗糖尿病或葡萄糖耐受不良的方法，包括向需要治疗糖尿病或葡萄糖耐受不良的患者施用治疗有效量的CC趋化因子2(CCR2)治疗剂。
3.治疗患者以治疗代谢综合症紊乱的方法，包括向需要治疗代谢综合症紊乱的患者施用治疗有效量的CC趋化因子2(CCR2)治疗剂。
4.权利要求1、2或3的方法，其中所述CCR2治疗剂是CCR2拮抗剂。
5.权利要求1、2或3的方法，其中所述CCR2治疗剂是CCR2配体抑制剂。
6.鉴定可用于减少机体脂肪和/或体重的药剂的方法，包括(i)向测试对象施用CCR2治疗剂，以及(ii)确定该CCR2治疗剂对减少或维持测试对象的机体脂肪和/或体重是否有效。
7.鉴定可用于治疗糖尿病或葡萄糖耐受不良的药剂的方法，包括(i)向测试对象施用CCR2治疗剂，以及(ii)确定该CCR2治疗剂对治疗测试对象的糖尿病或葡萄糖耐受不良是否有效。
8.鉴定可用于治疗代谢综合症紊乱的药剂的方法，包括(i)向测试对象施用CCR2治疗剂，以及(ii)确定该CCR2治疗剂对治疗测试对象的代谢综合症紊乱是否有效。
9.权利要求6、7或8的方法，其中所述CCR2治疗剂是CCR2拮抗剂。
10.权利要求6、7或8的方法，其中所述CCR2治疗剂是CCR2配体抑制剂。
11.权利要求1、2或3中任一项的方法，进一步包括在将CCR2拮抗剂施用给测试对象之前，测试CCR2治疗剂在体外测试中的CCR2治疗活性。
12.试剂盒，其中包括CCR2治疗剂和用于将该治疗剂施用给患者以减少或维持患者的机体脂肪和/或体重的说明。
13.试剂盒，其中包括CCR2治疗剂和用于将该治疗剂施用给患者以治疗所述患者的糖尿病和/或葡萄糖耐受不良的说明。
14.试剂盒，包含CCR2治疗剂和用于将该治疗剂施用给患者以治疗所述患者的代谢综合症紊乱的说明。
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