CN100999721B - 从间叶干细胞产生心脏细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明揭示一种用以产生可供医学用途的心肌细胞的方法。在一个实施例中，提供一种用以产生心肌细胞的方法，其包含：将间叶干细胞培养在含有抗坏血酸的培养基中。在另一实施例中，所述方法还包含挑选快速生长的间叶干细胞群的步骤，之后再将所挑选出来的快速生长的间叶干细胞群培养在含有抗坏血酸的培养基中。

Description

从间叶干细胞产生心脏细胞的方法

技术领域

本发明涉及适用于细胞治疗的心肌细胞及产生所述细胞的方法。更具体地，本发明提供一种产生心肌细胞的方法，包含将骨髓间叶干细胞培养在含有抗坏血酸的培养基中。

背景技术

间叶干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)属于多能型(multipotent)或有限潜能型干细胞，其可分化成为至少一种以上源自间叶细胞谱系的细胞，例如脂肪细胞、心肌细胞及骨骼肌细胞(Galmiche等，(1993)Blood 82：66-76；以及Wakitani等，(1995)Muscle Nerve 18：1417-1426)。因此，越来越多的研究希望能将MSCs用在各种疾病、异常以及失能的治疗上，因为MSCs可取自自体提供细胞或组织充分的更新细胞来源，无免疫排斥作用；而且MSCs不像胚胎干细胞，当以MSCs进行治疗时，不会引起道德伦理上的争议。

已知可通过诸如5-氮杂胞苷(5-azacytidine)之类的DNA去甲基剂(DNAdemethylation agent)或通过与老鼠心肌细胞共同培养的方式，来使骨髓间叶干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化成为具有心脏功能的心肌谱系细胞(cardiomyocyte-linage cells)。但是，5-氮杂胞苷本身具有细胞毒性，而采用与老鼠心肌细胞共同培养的方式却可能使将来接受细胞移植的个体，受到异种污染的威胁。因此，提出以下数种改良的方法。

WO 2004/065589 A1揭示一种产生可供移植到心脏组织内的细胞的方法，其实施例1揭示先将分离出来的骨髓干细胞培养在一种可维持细胞自我更新能力且不会丧失其对分化剂(例如，生长因子)的反应性的培养基中，其包含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、100μM的L-抗坏血酸-2-磷酸盐、5-15ng/ml的白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)及20nM的地塞米松(dexamethasone)。再将骨髓干细胞培养在一种内含多种生长因子(50ng/ml的bFGF及25ng/ml的BMP-2)及IGF-1(2ng/ml)的培养基中2周，以诱发其分化成为心肌细胞。

WO 2005/056779揭示一种制备可供移植到哺乳动物心脏组织内的细胞的方法，其包含将骨髓干细胞培养在一种心脏专一性培养基中，所述心脏专一性培养基包含bFGF、BMP-2及IGF-1，且较佳是包含浓度各为200ng/ml的bFGF、BMP-2及IGF-1，且更包含2％至20％的FBS、1-1000μM的L-抗坏血酸-2-磷酸盐、5-15ng/ml的LIF及1-200nM的地塞米松(dexamethasone)。

美国专利第6,387,369号揭示一种在体内产生心肌细胞的方法，其是在诸如人个体的心脏中施用能产生足够量心肌细胞的间叶干细胞。所述间叶干细胞是以一种可注射到心脏的液体或是一种在注射后会变成固体或半固体基质的细胞制备物形式来施用。同时，6,387,369号专利说明书中也提示以生长因子及分化剂来处理间叶干细胞的步骤，以及将间叶干细胞暴露在机械刺激及电刺激下，以使其分化成为心肌细胞的方法。但是，其说明书中并未明确揭示适用的生长因子和/或分化剂种类。

Shim等人(Shim等，(2004)BBRC 324：481-488)揭示一种内含胰岛素、地塞米松及抗坏血酸的心脏分化培养基的用途，并以细胞是否会表达心肌细胞专一性蛋白质的方式来确认该分化的培养基的功效，这些心肌细胞专一性蛋白质包括第I型心肌钙蛋白(cardio troponin I)、原肌球蛋白(tropomyosin)及肌联蛋白(titin)。

所有上述公开文献都是关于如何以心脏分化培养基来分化间叶干细胞的方法，此类分化培养基基本上是由多种成分所组成，包括：激素(例如，胰岛素)、生长因子(例如，bFGF或IGF-1)、血清及诸如免疫抑制剂(如，地塞米松及白血病抑制因子)及维生素(例如，抗坏血酸)之类的其他药剂。目前，也有人提出组成较为简单的可用来分化干细胞的分化培养基，但是，这种组成较简单的分化培养基目前仅用在胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)的分化上，而非间叶干细胞的分化上。举例来说，Takahashi等人(Takahashi等，(2003)Circulation，107：1912-1916)揭示以0.01mM的抗坏血酸来诱导ESCs分化成为心肌细胞(参见Takahashi等人文章第2图)；同时，文章中还揭示此抗坏血酸的分化效用并非来自抗坏血酸本身的抗氧化性，因为诸如N-乙醯半胱氨酸、1，2-二羟基苯-3，5-二磺酸钠(Tiron)或维生素E之类的其他抗氧化剂并无法模拟抗坏血酸这种诱导ESCs分化的效用(参见Takahashi等人文章图5)。但是，关于抗坏血酸在胚胎干细胞上的效果，目前仍未有定论。因为另一篇公开文献，WO 2005/065354中出现了与Takahashi等人文章内容相反的提示。WO 2005/065354揭示以一种限定基质来维持人ESCs在未分化状态下的生长，该限定基质中包含足够量的bFGF、胰岛素及抗坏血酸(参见WO 2005/065354号专利的权利要求1)。此外，WO 2005/065354号专利也揭示如何以一种标准分化培养基来诱导人ESCs分化成为心肌细胞的方法(参见WO 2005/065354号专利的实施例8)，该标准分化培养基是由KO-DMEM(80％)、限定FBS(20％)、L-谷胺酸(2mM)、MEM非必需胺基酸(1X)及β-氢硫乙醇(100μM)组成。在经过1周的培养后，即可观察到随着时间不断增加数目的跳动的心肌细胞，且其收缩性可维持2个月以上。换言之，WO 2005/065354号专利揭示抗坏血酸具有维持人ESCs未分化状态生长的效果，且其实施例8揭示可在不需要抗坏血酸的情况下将人ESCs分化成心肌细胞。

综上所述，迄今还没有任何一篇公开文献述及如何用抗坏血酸来诱导骨髓间叶干细胞分化成为心肌细胞，并且本领域亟需一种可从骨髓间叶干细胞制造出心肌细胞的改良方法，所述方法不仅使用上相当容易，且可在短时间内产生已分化的心肌细胞，以确保它的细胞治疗用途能够实现。

发明内容

本发明的目的在于提供适合用于细胞治疗(例如，组织移植)的心肌细胞。因此，本发明的目的之一在于提供一种产生心肌细胞的方法，所述方法不仅简单、安全且心肌细胞的产率在20％至35％间，较佳是25％。本发明的另一目的是提供用上述方法培养出来的心肌细胞，以治疗诸如心肌梗塞疾病之类的心脏疾病。

在一个较佳实施例中，本发明提供一种产生心肌细胞的方法，其是将间叶干细胞(MSCs)培养在含有抗坏血酸的培养基中。在本发明的方法中，所述间叶干细胞分离自骨髓且含有25％至35％的MSCs，较佳是25％的MSCs，在经过抗坏血酸的诱导后，会分化成为心肌细胞。较佳地，所述的培养基是I’MEM且其中添加有10％的胎牛血清(FBS)，且还包含浓度在100μM至10mM间，较佳的是1mM的抗坏血酸。

在另一实施例中，本发明的上述产生心肌细胞的方法，还包含挑选快速生长的MSCs细胞群，之后再将所选定的快速生长的MSCs细胞群培养在含有抗坏血酸的培养基中。依据此方法，所述快速生长的MSCs细胞群，其细胞数目倍增所需花费的时间低于25小时。通过组合挑选快速生长的MSCs细胞群及将所选定的MSCs细胞群培养在含有抗坏血酸的培养基中这两个培养步骤，且20％至35％的培养细胞是心肌细胞，较佳的25％的培养细胞是心肌细胞。

在另一较佳实施例中，本发明提供依据上述方法产生的心肌细胞，所述心肌细胞会表达出专一性的心肌细胞标记和/或蛋白质，且这些细胞适合用于移植及治疗心脏疾病。依据本发明方法所生成的心肌细胞，较在先技术中用去甲基剂(例如，5-氮杂胞苷)所生成的心肌细胞，更适合用于细胞治疗的用途上。

在参阅以下详细说明及实施例后，将能更清楚的了解上述本发明的各项目的及优点。应理解，上述的一般性描述及以下的详细说明，都是用于阐述本发明的例示性说明，而不是用于限制本发明的范围。

附图说明

图1显示依据本发明的一个较佳实施例方法，以5-氮杂胞苷(A)、抗坏血酸(B)、DMSO(C)、维生素A(D)、乙醇(E)及培养基(F)处理混合的猪MSCs后，其细胞外形的相位差照片；

图2显示依据本发明的一个较佳实施例方法培养的混合的MSC细胞群与经过挑选的MSC细胞群(第1至8群)，其细胞数目倍增所需时间的测量结果；

图3显示混合的MSC细胞群与经过挑选的MSC细胞群在以抗坏血酸处理之前(W1，左图)及之后(W4，右图)，其细胞外形的照片，其中(A)是细胞数目倍增所需时间为45小时的混合的MSC细胞群，(B)是细胞数目倍增时间低于25小时的第1群快速生长细胞，(C)是细胞数目倍增时间超过100小时的第8群慢速生长细胞，且(D)是没有经过抗坏血酸处理的对照组细胞，尺标＝80μm；

图4显示经过抗坏血酸诱导分化的MSC细胞内肌管的照片，其中(A)是细胞质中所形成的肌管(箭号所指示处)的相位差照片，(B)是共轭焦扫描照片，其中细胞内的多核结构经过PI染色后呈红色(箭头所示处)，肌管结构经过鬼笔目菌素染色后呈绿色(箭头所示处)，(C)是细胞以Hoechost 33342染色后的荧光显微镜照片，显示出具有两个细胞核的肌管结构，(D)是经过鬼笔目菌素染色确认后的具有多核结构的肌管结构照片，尺标＝80μm；

图5为有或无抗坏血酸处理的MSC细胞，其细胞标记表达模式的RT-PCR分析结果；且

图6为有或无抗坏血酸处理的MSC细胞，其心肌细胞谱系的细胞标记(即，第I型心肌钙蛋白与连接蛋白43)表达模式的Western印迹分析结果。

具体实施方式

所揭示实施例及名词仅作为说明之用，不是用以限制本发明的范围，且本发明也涵盖未在本发明中述及、但本领域现有技术人员在阅读过本发明后所能想到并用以实施本发明的其他实例。

本发明有关于产生适用于各种临床应用的心肌细胞的方法，所述临床应用包括组织移植及治疗心脏疾病等。

因此，本发明的一个目的在于提供一种产生心肌细胞的方法，其包括将间叶干细胞(MSCs)培养在含有抗坏血酸的培养基中。

间叶干细胞可通过从骨髓和/或脐带血中分离出单离(分离)可粘附性的单核细胞而取得。骨髓液可取自适当的捐赠者或由任何商业来源购得。脐带血则可在取得自然生产或剖腹产的女性的同意后，剪下附随在胎盘上的脐带后，用针筒将脐带中的血液抽出。依据Boyum A所述的方法(Scand.J.Clin.Lab.Invest.21 Suppl.97(Paper IV)：77-89，1968)，以离心方式由骨髓液或脐带血中制备出分离的单核细胞悬浮液。之后，将所获取的单核细胞种植在培养盘上，并于37℃、5％CO₂的环境下培养，使间叶干细胞可粘附生长。培养基可使用标准培养基质，例如，α-MEM(Gibco)，其中添加有100单位/毫升的盘尼西林(青霉素)、100微克/毫升的链霉素(Gibco)及20％的胎牛血清(FBS)，且可根据需求选择性地添加诸如纤维母细胞生长因子(FGF)之类的各种生长因子。

为诱发间叶干细胞分化成为心肌细胞，将依据上述方法进行分离及培养的间叶干细胞的培养基换成其内添加有10％FBS的I’MEM(Gibco)，并在此I’MEM中培养1天，之后，再加入抗坏血酸进行处理；较佳是添加约100μM至约10mM的抗坏血酸，更佳是添加约1mM的抗坏血酸，处理期间至少为4周。经过4周后，已分化的间叶干细胞会彼此交错相连融合并形成肌管(myotubes)。可用相位差显微镜和/或经过适当染色后用荧光显微镜，看到心肌细胞特有的多核结构及肌管结构。在一个较佳实施例中，肌肉细胞特有的肌管结构及多核结构是利用诸如鬼笔目菌素(phallacidine)及碘化丙啶之类的荧光染料加以染色后，来显露出所形成的肌管结构及多核结构。

此外，还可利用是否表达出心肌谱系的细胞标记来鉴别已分化的间叶干细胞。这些细胞标记包括，但不限于，GATA4、Nkx 2.5、ACTA、ACTC、肌原蛋白(myogenin)、Tef-1及诸如Mef-2c及Mef-2d之类的肌球蛋白强化因子(myosin enhancingfactor)。在一个较佳实施例中，经过抗坏血酸的处理后，细胞中ACTA、Mef-2d及肌原蛋白的表达量均升高了。此外，还可利用细胞是否表达出心肌分化标记的方式，来鉴别出分化后的心肌细胞，这类心肌分化标记包括肌球蛋白重链(myosinheavy chain，MHC)、肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)、第I型心肌钙蛋白(cardiac troponin I)、T型心肌钙蛋白(cardiac troponin T)、α-心肌动蛋白、α-辅肌蛋白(α-actinin)及连接蛋白43(connexin 43)。在一个较佳实施例中，抗坏血酸处理可提高细胞中第I型心肌钙蛋白的表达量。这些心肌细胞相关的细胞标记可利由诸如报导基因、RNA(可利用RT-PCR或Northern印迹法)或蛋白质(可利用免疫荧光分析、Western印迹法及流式细胞仪)等的表达方式来加以鉴别。所有这些分析方法均是本领域中具有常规知识的人员所熟悉的分析工具，因此任一现有技术人员均可在无需过度实验的情况下，来操作这些分析工具以获得所需的结果。

在一个较佳实施例中，这些已分离出来的可粘附性的单核细胞(也即，间叶干细胞)可进一步经过挑选，选出其中快速生长的间叶干细胞群，之后再将所选定的快速生长的间叶干细胞群培养在含有抗坏血酸的培养基中。依据该方法，所述快速生长的间叶干细胞群，其细胞数目倍增所需花费的时间低于25小时。本发明人发现，所培养的间叶干细胞事实上是由两群不同生长速率的细胞群所组成：其中一群是快速生长的细胞群，其细胞数目倍增所需花费的时间低于25小时；另一群则是慢速生长的细胞群，其细胞数目倍增所需花费的时间则超过100小时。通过组合挑选快速生长的间叶干细胞群及将所选定的间叶干细胞群培养在含有抗坏血酸的培养基中这两个培养步骤，可显著地提高心肌细胞的分化效率，且其中20％至35％的培养细胞是心肌细胞，较佳的是其中25％的培养细胞是心肌细胞。

依据上述方法制备而成的具有心脏功能的细胞，比现有技术中用具有细胞毒性的5-氮杂胞苷之类的DNA去甲基剂所分化而成心肌细胞，更适合用于细胞治疗的用途。因此，依据本发明方法制备而成的心肌细胞可作为细胞治疗时的细胞来源，以修复受损的心脏组织和/或进行组织移植。所述心肌细胞可通过数种途径来施用，包括(但不限于)，直接心肌注射，其是将心肌细胞悬浮在可供直接注射的液体或是注射后可在受损心肌部位变成半固体形式的生物相容基质中；血管内注射；或涉及直接切开以接触心脏的手术方式。

应理解，如果没有特别在上下文中清楚记述其他意义，则说明书内容及所附权利要求中所使用的如“一(“a”或“an”)”与“该(the)”等特定用语均包含其复数形态。

应理解，在实施例或其他内容中所显示的成分用量、反应条件等数字或本申请说明书内容所使用的数字均为大约数值。因此，除非文中特别注明，本说明书的上述数字参数均为近似值，其可根据所需获得的本发明结果而加以变化。并且，这些参数并非用来限定与本发明权利要求均等的原理，而是应用正常操作技术下所得到的较佳数据。

虽然上述用来指出本发明的最大范围的数据范围及参数均为近似值，但上述特定较佳实施例中所记述的数据值已尽可能地精确。然而各个测量实验均有其标准偏差，因此任何数据值必有部分误差。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料都可应用于本发明的方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

在本申请书中所提到的所有参考文献均全体纳入参考，以揭示并叙述所述文献所记载的相关方法和/或材料。此外，文中所讨论的文献仅揭示本发明申请日前的现有技术。并且无任何文献显示本发明内容曾被现有技术所揭示。本发明内容所得到的实际数据会因个别的实施条件而与本发明揭示于说明书内容中的数据有所不同。

各种实施本发明的方法技术和/或实验程序(统称“方法”)包含任何可达成相同目的的现有方法，但不能限定为本说明书的特定的方法范例。此外，虽已在说明书的特定内容中叙述部分方法，但是这些方法是用于示范本发明，并非用来限定本发明的内容。

实施例

以下将通过实施例来阐述本发明，以帮助本领域现有技术人员来实施本发明，应理解，所揭示的实施例，仅是用于阐述本发明，本发明的范围并不局限于所揭示的这些实例。

实施例1

分离与培养骨髓间叶干细胞(BMSCs)

1.1分离与培养猪的骨髓间叶干细胞

依据Haynesworth等人所揭示的方法(Haynesworth等，(1992)Bone 13(1)，81-8)来分离及纯化猪的骨髓单核细胞。简单而言，以内含6,000单位肝素的针筒从3头约6-8个月大的Lee-sung迷你猪(Luh等，(2000)Transplantation 69(10)，2019-2027)(30-45公斤)的后骼脊骨中抽出骨髓液。以1∶1的比例用HBSS(Gibco)加以稀释后，放入到内含1.073克/毫升Ficoll溶液(Amersham)的50毫升离心管中，于室温下在2,000rpm转速下离心40分钟。收集位于上层及溶液介面间的单核细胞，并再次以HBSS(Gibco)溶液清洗两次。之后，将细胞培养在添加有20％胎牛血清(Gibco，Lot No.：1149239)、100单位/毫升的盘尼西林、100微克/毫升的链霉素(Gibco)的α-MEM基质中(Hyclone)，并将细胞置于37℃、5％CO₂及饱和湿度的环境中培养。经过一系列连续培养后，以培养基冲洗的方式将未粘附于培养盘的细胞去除。所获得的细胞称为混合的间叶干细胞，可直接用于后续的分化实验(例如，实施例1.3)中，这些细胞可连续培养至少2个月。

1.2分离快速生长的单一间叶干细胞细胞群

将实施例1.1所分离出来的混合的间叶干细胞，以限定稀释方式培养在培养盘中。简单而言，在96-孔培养盘的每一培养孔中放入1×10⁴个单核细胞，以HBSS(Gibco)溶液清洗两次后，再培养在添加有20％胎牛血清的α-MEM基质中(Hyclone)，于37℃、5％CO₂及饱和湿度的环境中培养。以培养基冲洗的方式将未粘附于培养盘的细胞去除，并在显微镜下检视粘附在培养盘底部的细胞。从各个培养孔中挑选出仅由一个单一细胞粘附于底部生长繁殖的细胞进行后续培养。挑选出来的细胞经过3次培养后，即可冷冻于液态氮中，直到后续分化实验时再融解使用。

在挑选快速生长的骨髓间叶干细胞时，将单核细胞种植到1,000个培养孔中，之后再以限定稀释方式培养(1×10⁴个/孔)，最后可获得120个细胞群，每一细胞群都衍生自每一培养孔中单一个分离的单核细胞。以形态而言，所有这些细胞群的细胞在生长至将满状态时，均具有类似纤维母细胞的外形，待长至全满时，则呈现多边形且形成紧密堆叠的单层细胞群。依据细胞群的生长速率可鉴别出两群细胞：一群为高度增生的间叶干细胞群(如，图2中的第1-4群细胞)，其细胞数目倍增所需花费的时间低于25小时(分别为20.2、21.7、19.2及16.2小时)；另一群则为慢速增生的细胞群(如，图2中的第5-8群细胞)，其细胞数目倍增所需花费的时间超过100小时。一般来说，无论是快速生长或慢速生长的细胞群，其细胞外形都像是纤维母细胞一样的长型细胞，即先前公开文献所揭示的粘附性纤维状细胞(Ringe等，(2002)Cell Tissue Research(307)，321-327)。

实施例2

诱发骨髓间叶干细胞分化成为心肌细胞

2.1以抗坏血酸诱导BMSCs分化成为心肌细胞

将实施例1.1的BMSCs(1×10⁴个细胞/平方厘米)培养在其中添加有20％的胎牛血清(FBS)的α-MEM(Hyclone)中2天，之后，将培养基换成其内添加有10％FBS的I’MEM(Gibco)，并在此I’MEM中培养1天，之后，再加入各种分化剂，包括5-氮杂胞苷(3uM)、抗坏血酸(1mM)、二甲亚砜(0.5％)、或维生素A(10^-9M)，以诱发肌管的形成。经过4周在有上述分化剂的培养后，已分化的间叶干细胞外观可由细胞质中所形成的肌管(myotubes)结构获得证实，培养在5-氮杂胞苷(图1A)及抗坏血酸(图1B)之下的间叶干细胞，其细胞分化比例分别约为10％(5～15％)及25％(20～35％)；至于神经细胞系分化剂-维生素A(图1D)、乙醇(用以溶解维生素A的溶剂，约1∶1000倍稀释，图1E)及培养基(图1F)，则都对心肌细胞的分化不具任何效果。

为检测由单一骨髓间叶干细胞衍生的细胞群分化成为具有心肌细胞的能力，将实施例1.1的混合的骨髓间叶干细胞及实施例1.2的分离的单一骨髓间叶干细胞群(包括第1-4群的快速生长细胞群及第5-8群的慢速生长细胞群)培养在含有1 mM抗坏血酸的培养基中4周，图3显示了所述培养结果的一个代表性实例。在进行抗坏血酸处理之前，在混合的骨髓间叶干细胞群(图3A)、快速生长的骨髓间叶干细胞群(图3B)及慢速生长的骨髓间叶干细胞群(图3B)三群细胞之间，细胞外观形态并无明显差异。相反的，经过抗坏血酸处理之后，所述混合的骨髓间叶干细胞群(图3A)及第1群快速生长的骨髓间叶干细胞群(图3B)，从第3周即开始形成类似肌管的结构；而对照组细胞(无抗坏血酸处理，图3D)及第8群慢速生长的骨髓间叶干细胞群(有抗坏血酸处理，图3C)，则到了第4周仍然维持其原先类似纤维母细胞的细胞形态。所述结果显示快速生长的骨髓间叶干细胞群是骨髓间叶干细胞在抗坏血酸诱导下，真正具有可分化成为心肌细胞的细胞群。

2.2以免疫组织化学法来检测肌管结构

为进一步确认由抗坏血酸诱导所形成的肌管构造，以能够与F-肌动蛋白结合的荧光染料鬼笔目菌素将已分化的骨髓间叶干细胞染色，以显露出新形成的肌管构造，并分别以相位差显微镜(图4A)和/或荧光显微镜(图4B、4C及4D)来观察细胞结构。简单而言，先以PBS于3分钟内清洗细胞3次，并以4％多聚甲醛来固定细胞15分钟，之后以0.1M甘胺酸冲洗5分钟，再以0.1％Tween 20处理1分钟使细胞膜产生通透性。接着，以共轭有鬼笔目菌素的alexa four 488(购自MolecularProbes)在室温下处理细胞约20分钟，来确认是否有形成肌管。接着，再以PBS清洗细胞2或多次。至于多核细胞结构则可通过在室温下以碘化丙啶(Sigma)对细胞染色5分钟的方式来确认。经过清洗后，以共轭焦镭射扫描显微镜来观察细胞，可看到心肌细胞特有的多核结构及肌管结构。

2.3在诱发肌管分化之后相关心肌基因与蛋白质的表达

分别通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)(图5)及Western印迹法(图6)来评估抗坏血酸对于心肌相关基因与蛋白质表达的影响。

RT-PCR  以RNA迷你试剂盒(Qiagen)从已分化的骨髓间叶干细胞中抽取出细胞内全部的RNA。之后，以ThermoScript RT-PCR试剂盒(Invitrogen)由1μg的总抽取RNA来合成出cDNA。以Taq DNA聚合酶(Invitrogen)来执行该RT-PCR反应。参照表1，分别在已分化的细胞样本中执行包括ACTA、ACTC(Kubalak等，(1994)J.Biol.Chem.269(24)，16961-16970)、mef-2c、mef-2d(Skerjanc等，(1998)J.Biol.Chem.273(52)，34904-34910)、肌原蛋白(Wright等，(1989)Cell 56(4)，607-617)、nkx2.5(Lints等，(1993)Transplantation 69(10)，2019-2027)及Tef-1(Chen等，(1994)Genes Dev 8(19)，2293-2301)在内的心肌相关基因的反转录聚合酶链反应；并以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的相对表达量作为每一样品的内部对照组，以猪的心脏肌肉及骨骼肌肉组织细胞作为分化路径的正对照组。分别以光度计(Amersham Bioscience)与Aglient 2100生物分析仪(AgilentTechnologies)来测量总RNA浓度及完整性，结果见图5。

表1 PCR引物对序列

基因	基因库登录号	引物对序列/产物大小(bp)
			ACTAACTCGAPDH	U16368NM_009608/NM_005159AF017079	5’-GTGGATCACCAAGCAGGAGT-3’5’-GCAGCATAACAGAATGGCT-3’3095’-TCGGGACCTCACTGACTACCT-3’5’-GCCAGCAGATTCCATACCAAT-3’2745’-GGGCATGAACCATGAGAAGT-3’5’-AAGCAGGGATGATGTTCTGG-3’230

Mef-2cMef-2d肌原蛋白Nkx 2.5Tef-1

NM_025282/NM_002397AJ519843U14331NM_008700/NM_4378L13853/NM_63896

5’-TTGACAGCTTGAGCAGCTGTA-3’5’-CATGTTGCCCATCCTTCAGA-3’1595’-CCTGCTGGAGGACAAGTACC-3’5’-GTGAGCTCTGATTGGACACG-3’1375’-CCACTTCTATGACGGGGAAA-3’5’-GGTCCACAGACACGGACTTC-3’2035’-AAGAGCTGTGCGCGCTGCAG-3’5’-AGAGTCTGGTCCTGCGCGTG-3’2735’-TCAACTTCATCCACAAGCTCA-35’-TATCCCTGTTTGTTACCACCA-3’99

Western印迹法  以内含1倍蛋白酶抑制剂鸡尾酒配方(Roche)的细胞分解液(Pierce)来抽取已分化的骨髓间叶干细胞中全部的蛋白质，接着以Bio-Rad蛋白质分析试剂盒来测定蛋白质浓度。将样品于100℃下加热5分钟后，施以12.5％的聚丙烯胺凝胶电泳。将凝胶中的蛋白质转移到聚二氟乙烯薄膜(PVDF，Millipore)上，在4℃下于内含0.01％SDS及10％甲醇的25mM Tris、190mM甘胺酸(pH 8.3)溶液中过夜。在该PVDF薄膜上施以5％脱脂牛奶处理，来防止非专一性结合，之后，再与三种主要抗体之一一起培养。如下所述，于室温下，以可抗第I型心肌钙蛋白(稀释比为1∶1000)及连接蛋白43(稀释比为1∶2000)(Chemicon)(Makino等，(1999)J.Clin.Invest.103(5)，697-705)的主要抗体染色1小时。并以抗-肌动蛋白抗体(稀释比为1∶1000)(Lab Vision)做为每一样品的内部对照组。未结合的抗体是以4次PBS-0.1％Tween 20缓冲液(pH 7.4)冲洗来除去，每一次冲洗时间持续5分钟。已结合的抗体可再以辣根过氧化酶-共轭山羊抗-小鼠IgG及ECL试剂(Pierce)来识别，并由化学冷光呈像法(Chemiluminescent detection)进行检测。

由图5结果可清楚知道细胞内ACTA、mef-2d及肌原蛋白基因的表达量在经过抗坏血酸的处理后，明显增高许多。同时，在细胞培养期间出现自发性诱导Tef-1基因表达的结果。某些心肌相关蛋白质，例如ACTA、nkx2.5及mef-2c的表达量，则是在整个分化过程中，并无明显变化。所述基因表达模式分别与骨髓基质细胞经过5-氮杂胞苷处理或胚胎干细胞经过抗坏血酸处理后被诱发成为心肌细胞时，所表现出来的基因模式类似(Makino等，(1999)J.Clin.Invest.103(5)，697-705；and Takahashi等，(2003)Circulation 107(14)，1912-1916)。这些结果显示抗坏血酸具有诱发猪骨髓间叶干细胞分化成为心肌谱系细胞(包括，心肌细胞)的能力。

图6通过测量快速生长的间叶干细胞群(第1群)中心肌专一性蛋白质(也即，第I型心肌钙蛋白)的表达，来进一步确认抗坏血酸诱导间叶干细胞分化成心肌细胞的功效。相反的，在未经过抗坏血酸处理的细胞中或是在不会形成肌管的细胞中，几乎不会表达第I型心肌钙蛋白或是连接蛋白43。

产业利用性

本发明的优点在于可提供一种可产生心肌细胞的改良方法，其不仅简单、安全且容易使用，同时在所培养的细胞中有20％至35％可分化为心肌细胞，较佳的是25％为心肌细胞。本发明的另一优点在于依据所揭示的改良方法而产生的心肌细胞适合作为细胞治疗用途时所需的细胞来源，以充分供应所需的心肌细胞来修复受损的心脏组织和/或治疗心脏疾病。

说明书中所引用的参考资料均清楚记载，并在此处将其全文纳入作为参考。本说明书内的较佳实施例仅用于说明本发明的较佳实施例，并非用以限制本发明范围。现有技术人员需明白，本发明还涵盖多种其他的较佳实施例，且说明书与实施例仅用于示范，其实际精神与范围由所附的权利要求所界定。

序列表

<110>财团法人工业技术研究院

<120>从间叶干细胞产生心脏细胞的方法

<130>05A439

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

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<213>人工序列

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tatccctgtt tgttaccacc a              21

Claims (2)

1.一种产生哺乳类动物心肌细胞的方法，包含

培养间叶干细胞，得到：一快速生长的间叶干细胞群，其细胞数目倍增所需时间低于25小时；和一慢速生长的间叶干细胞群，其细胞数目倍增所需时间超过100小时；

挑选该快速生长的间叶干细胞群，之后利用在培养基中添加浓度在1mM至10mM的抗坏血酸作为分化剂来诱发该快速生长的间叶干细胞分化成为心肌细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗坏血酸的用量为1mM。

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