CN1008369B - 制造水溶性铁葡聚糖的方法 - Google Patents

Abstract

制取水溶性的，具有铁含量为27至33重量百分数的和葡聚糖组分的平均克分子质量为2000至4000的铁葡聚糖的方法，其特征在于，向一水溶液中该水溶液，在每1000单位的α(1→6)-右旋-葡糖基转移酶中，含有多于200毫克分子的右旋-萄葡糖，在265至310K和pH-值为4.5至8时，加入一蔗糖水溶液，其数量为蔗糖与葡萄糖的分子比为2.0至5.0，在蔗糖消耗以后，分离出葡萄糖，放出的果糖和不希望的低聚糖，这样净化的葡聚糖与新沉淀的三价铁的氢氧化物进行转化，并且有时进一步净化。

Description

铁葡聚糖制剂在动物医疗中，主要是用于静脉的和肌肉的注射，治疗缺铁性的贫血症。该制剂作为葡聚糖的络合物，是通过与胶体的氢氧化铁反应制成的。

特别是用于静脉注射给药的制剂，对于溶液的稳定性和铁的生物可利用性提出了很高的要求。当具有高铁含量的铁葡聚糖（也就是说，在每克干物质中含有20%或更多的铁），在制造时要使用具有过高的平均分子量的葡聚糖时，这样的要求是不能实现的。由于在不同的葡聚糖分子间通过铁原子而形成了分子间络合物的结果，而形成了胶体和沉淀物。因此通常是使用4000-5000低分子量的葡聚糖来合成铁葡聚糖。这样的分子量范围的葡聚糖，是通过自然的高分子的葡聚糖的酸化水解作用作为副产品而得到的，例如在生产医用平均分子量为40000-75000的葡聚糖时，生产出来的。

但这种副产的葡聚糖的分子量分布范围是很宽的，并且一般从葡萄糖的分子量至高达大约50000分子量。因此一般的作法是，在碱性条件下，使葡聚糖与三价的铁盐反应得到粗的铁葡聚糖，通过使用溶剂进行复杂的分级沉降或通过薄膜分离方法，使粗的铁葡聚糖从不需要的较高分子量的组分中分离出来。

若医用葡聚糖生产的废料部份中含有过多的葡萄糖和异麦芽糖-低聚糖类其分子量大约不超过1000，这些糖类在反应成铁葡聚糖之前，也必须去掉，因为在反应条件下，能进一步分解生成有毒的产物。

由于所谈到的原因，所以希望制造出一种溶于水的具有高铁含量的铁葡聚糖，也就是说，人们所用的葡聚糖必须是平均分子量为2000至 4000，分子量分布窄的葡聚糖。

这个难题，通过本发明的方法得到了解决，该方其特征在于，向一种水溶液中（该溶液中每含1000单位α（1→6）-D-葡糖基转移酶就含有多于200毫克分子的D-葡萄糖，较好是含有400-600毫克分子的D-葡萄糖），在265至310K和pH值为4.5至8时，加入如下数量的蔗糖水溶液，即其中的蔗糖与葡萄糖的克分子比为2.0至5.0;在消耗了蔗糖的葡萄糖后，分离释出的果糖和不需要的低聚糖类，将这样纯化的具有一平均克分子质量为2000至4000的葡聚糖，与新沉淀出的氢氧化铁反应，如有需要可进一步纯化。

以这种方式成功的制出了一种水溶性的具有铁含量为27至33重量百分数的和葡聚糖组份的平均克分子质量为2000至4000的铁葡聚糖。

较好的是将反应混合物保持在290至300K和pH值在5至6.5的范围内，此二个参数对生成的产物的结构有影响。

按照“酶委员会”的分类，把使蔗糖的D-吡喃葡糖基转移到适当的受体上的酶，称作α（1→6）-D-葡糖基转移酶。这样一种细胞外的酶是葡聚糖蔗糖酶（E.C.2.4.1.5），该酶是由特定种类的乳酸杆菌族的菌株，例如肠膜状明串珠菌，特别是菌株B-512，葡聚糖明串珠菌，链球菌和乳酸杆菌所构成。在制取天然的葡聚糖时，首先使用蔗糖作受体，并且在链聚合作用中起链引发剂的作用，在此聚合作用中，由蔗糖通过连续的转移D-吡喃葡萄糖基团到增长着的多糖类的链上，构成具有数百万克分子质量的葡聚糖类，而同时每个反应的蔗糖分子，释出一分子果糖。

若在这个反应中应用了其他的单、双或三糖类作为受体，就会通过消耗葡聚糖而在很小的程度上生成低聚糖。在使用葡萄糖作为受体时，生成大约78%的天然葡聚糖和大约13%作为副产物的二聚糖和低聚糖不超过IM-12。（Robyt和EKlund，糖类研究，121，（1983）279-286页）。典型地是生成的低聚糖类随着聚合度的增加，其数量则逐渐减少。

在本发明的反应条件下控制由蔗糖上转移葡萄糖基团到葡萄糖上，使其不生成天然的葡聚糖，这是可能做到的，但是具有15至25葡萄糖酐单元的异麦芽糖低聚糖类却有很高的产率。在这当中出乎预料的是，异麦芽糖-低聚糖类的形成。随着聚合度的增加，其数量不再是逐渐减少，而是取决于反应的蔗糖量，主要得到的是一种特定的聚合度。

根据本发明的方法，为取得所希望的异麦芽糖-低聚糖类的高产率，可采用一种以这样的速度连续的添加蔗糖的水溶液，即所加入的蔗糖量是存在的酶量能够立即转化的量，这样就能避免蔗糖在反应混合物中聚集，这种聚集可以导致没有控制地生产高分子的葡聚糖。无论如何，在反应混合物中，碳水化合物干基物质的果糖重量组份，在连续反应的平衡状态下，不应超过25%。

如果不用纯的葡聚糖-蔗糖酶，也可以使用由酶和生产该酶的细菌组成的混合物。

此合成作用可以描述如下：

葡萄糖+n蔗糖 (葡聚糖蔗糖酶)/() 异麦芽糖-（n+1）-糖类+n果糖

在这里n是表示蔗糖克分子数，它的D-吡喃葡萄糖基团用于构成低分子的葡聚糖，而同时放出相应克分子数目的果糖。

根据本发明可以用这样的方法控制这个反应，以得到具有所希望的分子量的异麦芽糖-低聚糖或多糖。在特定的温度和氢离子浓度的条件下，在反应中所达到的分子量取决于以特定的酶活性为基础的受体的克分子量和加到受体中的蔗糖总量的克分子比。

酶活性单位U（＝单位）是在pH5.2和298K时，每分钟能转化1μ克分子蔗糖的α（1→6）-D-葡萄糖基转移酶的数量。

若加入的蔗糖量比存在的酶活性所能转化的蔗糖还多，那么控制分子的大小就不可能了。

若以酶活性1000单位为基础，那么在蔗糖添加总量为1000毫克分子和葡萄糖每1000单位为100至500毫克分子，特别是200至500毫克分子时，可得到所希望的具有一平均分子量大约为2000至4000的低聚糖的混合物。

因此也可能，在几个探索试验中在预先确定α（1→6）-D-葡糖基转移酶活性（例如1000单位）的特定范围内用变换葡萄糖分子数量和以一恒定的蔗糖数量（例如1000毫克分子），即其添加量为使其可被酶直接转化的量，来控制蔗糖的D-吡喃葡萄糖基团连接到作为受体的葡萄糖上，使其能够以高产率合成所希望的具有窄分子量分布的各个异麦芽糖-低聚糖或多糖类的成份。

可以提供必需的葡萄糖的总量，或当保持其余的反应条件，特别是浓度比例时，连续地替换葡萄糖，至它作为受体的消耗程度。因此，使合成反应连续地进行也是可能的。

本发明方法的一个预想不到的优点是，在反应混合物的干基物中碳水化合物的含量可以是很高的，它可以是30至50%，特别是40至50%。

虽然本发明的酶催化的合成反应是无菌进行的，正如例如在合成天然葡聚糖的通常作法一样，为避免不受欢迎的酵母生长，可以向反应混合物添加抗有丝分裂剂（mytosis抑制剂），如亚硫酸，其数量不超过1000毫克/公斤，特别是400至600毫克/公斤。

可以按照原为已知的方法，例如通过用乙醇分级沉淀法通过分离不反应的葡萄糖、释放出的果糖和少于6葡糖酐单位的异麦芽糖-低聚糖，由反应的混合物中，回收其平均分子量2000至4000的葡聚糖。

通过用一充满强酸性的阳离子交换剂的柱色谱分离副产品，已证明是很适宜的方法。

为了制取铁葡聚糖，将异麦芽糖-低聚糖混合物的水的悬浮液，与新沉淀的经洗过的氢氧化铁一起加热至温度升至373K，直到氢氧化铁溶解于溶剂中。建议像由西德专利说明书1768912所知的那样。在有柠檬酸或碱性柠檬酸存在的情况下进行这种反应。

为了去掉在反应以后还含在铁葡聚糖的溶液中的阴离子或阳离子，可使溶液通过阳离子交换剂和阴离子交换剂来处理。

例1

向43克三氯化铁六水合物的250毫升的水溶液中，逐滴加入将28克苏打溶于600ml水中的溶液，沉淀出氢氧化铁。将此氢氧化铁过滤分离出来，并用蒸馏水洗涤，再将此氢氧化铁倒入一立升搅拌烧瓶中，与15克通过色谱取得的、其平均克分子物质为3000克/克分子的低聚糖混合物，和0.5克柠檬酸相混合。

在加入9毫升的20%的NaOH溶液以后，将该混合物在368-373K的条件下进行搅拌，直到氢氧化铁完全溶解。

将生成的铁葡聚糖的深红色溶液进行冷却至室温，并利用离子交换剂彻底脱盐。

在无菌过滤以后，通过蒸发使溶液浓缩至含量为10%铁/毫升，并无菌装入安瓿中。以干物质为基准，铁含量为29.5%。

将如此取得的铁葡聚糖溶液，按照英国兽医的1965年法典，进行有关的毒性检验。

为此试验，使用了平均体重为20克的MM1-老鼠[品种：温克勒曼柏得堡（winkelmann    Paderborn，）]。

试验用的物质剂量为0.25毫升/动物，在注射完后，此试验物质立即引起试验动物发生轻微的共济失调，但这种失调，在每次注射后1小时以内又完全缓和。在余下的后观察期中，没有再发现其他的症状，也没有出现死亡。

例2

将7.3公斤结晶葡萄糖于298K时溶于16立升的葡聚糖蔗糖酶的水溶液中（其活性为5400单位/立升）。溶液的pH值为5.4。向此溶液中连续用泵输入2.6公斤/小时40%的pH值为5.4的蔗糖溶液。48小时以后，停止添加蔗糖，再经2小时后通过加热反应混合物至70℃使酶失去活性。

通过凝胶色谱将单糖和双糖组份由反应混合物的一个样品中分离，并按照索毛克义-磷酸盐法（Somogyi-Phosphate    method，碳水化合物化学的方法，卷1（1962），384-386页），测定低聚糖成份分子量的平均值Mn。测定出的Mn＝2540，这与平均的聚合度为15.7葡萄糖酐单位相当。在碳水化合物的干基物质中的果糖组份为45.0%（重量），葡萄糖组份为3.6%（重量）。将45立升这种糖溶液，加到一色谱分离装置中，该装置含有400立升强酸性的、载以钠离子的阳离子交换剂树脂，并通过加入43立升/小时蒸馏水，由柱子中洗提出各个个别的糖类。

在第一轮的60立升以后，在接着的22立升内，由分离柱洗提出异麦芽糖-低聚糖混合物，该混合物的平均克分子质量为300克/克分子。

试验报告

一胎产的仔猪，分成二个对照组，每4只小猪为一组，在小猪出生后的第三天，对一个组的小猪每只注射2毫升按照英国专利说明书1，200，902的铁葡聚糖。对另一组的小猪则每只注射2毫升本发明的铁葡聚糖。在注射后，注射点的组织出现了变色，在一天以后，所有的那些用本发明的铁葡聚糖注射的小猪，在注射后发生的组织变色都消失了。相反，对于用市售的铁葡聚糖注射的小猪，这种变色还清楚可见。直到打针后的第二天，这些小猪的注射点的组织变色才消失。

这个结果证明，来自本发明的铁葡聚糖的铁比来自市售的铁葡聚糖 的铁较快地被构成血液的组织所利用。

Claims (20)

1、一种制取水溶性的、具有铁含量为27至33重量百分数和葡聚糖组分的平均克分子质量为2000至4000的铁葡聚糖的方法，其特征在于，向一水溶液中，在该溶液中每含1000单位α(1→6)-D-葡糖基转移酶就含有多于200毫克分子D-葡萄糖，在265至310K和pH值为4.5至8时加入一种蔗糖水溶液，在此水溶液中蔗糖与葡萄糖的克分子比为2.0至5.0；在蔗糖消耗以后，分离出释出的果糖和不需要的低聚糖；使如此纯化的葡聚糖与新沉淀的氢氧化铁反应，如有需要的话可进一步纯化。

2、根据权利要求1的方法，其特征在于，在此葡萄糖的水溶液中，每含1000单位的酶，就含有200至500毫克分子的葡萄糖。

3、根据权利要求1、2之一的方法，其特征在于，反应是在290至300K时进行的。

4、根据权利要求1、2之一的方法，其特征在于，反应混合物的pH值为5至6.5。

5、根据权利要求1、2之一的方法，其特征在于，蔗糖对葡萄糖的分子比为3.0至4.0。

6、根据权利要求1、2之一的方法，其特征在于，连续地加入蔗糖溶液。

7、根据权利要求1、2之一的方法，其特征在于，用这样一种速度加入蔗糖溶液，使蔗糖直接被α（1→6）-D-葡糖基转移酶转化掉。

8、根据权利要求1、2之一的方法，其特征在于，反应混合物所含的碳水化合物的干重为30%至50%。

9、根据权利要求8的方法，其特征在于，反应混合物所含的碳水化合物的干重为40%至50%。

10、根据权利要求1、2之一的方法，其特征在于，使用了由细菌肠膜状明串珠菌排出的葡聚糖蔗糖酶，作为α（1→6）-D-葡糖基转移酶。

11、根据权利要求1、2之一的方法，其特征在于，使用了由细菌肠膜状明串珠菌属的菌株B-512排出的葡聚糖蔗糖酶作为α（1→6）-D-葡糖基转移酶。

12、根据权利要求1、2之一的方法，其特征在于，使用了由细菌明串珠菌属的葡聚糖菌排出的葡聚糖蔗糖酶，作为α（1→6）-D-葡糖基转移酶。

13、根据权利要求1、2之一的方法，其特征在于，连续地替换D-葡萄糖，达到的程度与它作为受体被消耗的程度一样。

14、根据权利要求1、2之一的方法，其特征在于，将抗有丝分裂剂（mytosis抑制剂）加到反应混合物中，以避免不需要的酵母生长。

15、根据权利要求14的方法，其特征在于，加入亚硫酸，其数量可高至1000毫克/公斤。

16、根据权利要求15的方法，其特征在于，加入亚硫酸，其数量为400至600毫克/公斤。

17、根据权利要求1、2之一的方法，其特征在于，由单糖、双糖和低聚糖组成的混合物中，通过分级沉淀或色谱法，分离出平均克分子质量为2000至4000的葡聚糖。

18、根据权利要求1、2之一的方法，其特征在于，将异麦牙糖-低聚糖混合物的水悬浮液和沉淀的氢氧化铁一起加热至温度升至373K，直到氢氧化铁溶解于溶液中。

19、根据权利要求18的方法，其特征在于在柠檬酸或碱性柠檬酸盐存在的情况下，进行转化反应。

20、根据权利要求19的方法，其特征在于，反应后得到的铁葡聚糖的溶液，用阴离子交换剂和阳离子交换剂进行处理。