CN100584941C - 一种生物除锰功能菌 - Google Patents
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Abstract
一种生物除锰功能菌，它涉及一种微生物。它解决了目前生物氧化除锰工程菌群靠自然选择建立，生化能力弱、除锰效果差；水处理除锰生物滤池的建立所需培养、驯化、启动时间长和工程菌群遭到破坏后恢复周期长的问题。生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)属于微小杆菌属，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCC No.2237；菌株MB4为革兰氏阳性微好氧菌，短杆菌，个体小，长为1～1.5μm，宽为0.5～0.8μm，细胞两端钝圆；在培养基上形成棕色菌落，不透明，中心颜色较深，四周颜色较浅，菌落为圆形；菌株MB4具有能源贮存颗粒，无芽胞和荚膜，N，N，N’，N’-四甲基对苯二胺染色为阳性。本发明生物除锰功能菌MB4具有去除水中Mn2+的能力，Mn2+去除率高于91%。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物。
背景技术
锰是地壳中含量丰富的金属元素，普通水体中锰离子的浓度为0.1～1mg/L，而厌氧地下水中溶解性的锰离子浓度可高达7～9mg/L。可溶性锰经充氧曝气能够生成不溶性沉淀物(如MnO2或MnOOH)。
MnO2是高度不可溶物质(δ-MnO2的溶解度kso仅为10-56)，呈深黑色，可导致供饮用的地下水出现明显的色度；因此饮用水中的锰必须去除。我国规定饮用水中锰离子的最高浓度为0.1mg/L，而欧盟已将饮用水中锰离子的最高浓度确定为0.05mg/L。
地下水中可溶性Mn(II)的去除通常伴随着锰离子的氧化、沉淀以及不溶性氧化产物的过滤分离。锰离子发生的非生物氧化反应如下：
表明Mn(II)的氧化伴随着MnOX的自催化反应，这种自催化作用在饮用水锰处理工艺中较为重要。
Mn(II)非生物氧化由氧作电子供体，通常在pH值大于9的条件下完成，低于9的pH条件下氧化反应速度极慢。绝大多数的饮用水pH在6～8之间，这种pH条件下Mn(II)不会发生氧化反应；因此饮用水中的锰不能通过简单的曝气和沉淀法去除。若加入化学药剂(如KMnO4和ClO2)虽然除锰效果较为理想，但增加了工艺运行费用、反应残留物和生成的副产物，引起二次污染。
生物氧化除锰具有良好的应用前景，但是目前生物氧化除锰主要利用自然选择建立工程菌群，因此工程菌群生化能力弱、除锰效果差，而且水处理过滤速度慢、不能超过10m/h。现有水处理除锰生物滤池的建立所需培养、驯化和启动时间长；一旦工程菌群遭到破坏(中毒等原因导致工程菌死亡)其恢复周期长，在此期间出水中锰含量剧增、出水质量难以保证，致使该水处理设施不能正常运转，严重的将威胁人民群众的正常生活和生态环境。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前生物氧化除锰工程菌群靠自然选择建立，生化能力弱、除锰效果差，过滤速度慢；水处理除锰生物滤池的建立所需培养、驯化、启动时间长和工程菌群遭到破坏后恢复周期长的问题，而提供的一种生物除锰功能菌。
生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)属于微小杆菌属，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCC No.2237；生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)为革兰氏阳性微好氧菌，短杆菌，个体小，长为1～1.5μm，宽为0.5～0.8μm，细胞两端钝圆；在培养基上形成棕色菌落，不透明，中心颜色较深，四周颜色较浅，菌落为圆形；生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)具有能源贮存颗粒，无芽胞和荚膜，N，N，N’，N’-四甲基对苯二胺(N，N，N’，N’-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)染色为阳性。
生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)能在pH值为4～10的环境中生长，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸盐还原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脱氨酶。
生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)细菌体内有类脂颗粒聚β-羟基丁酸(PHB)和异染颗粒聚合磷酸盐(Poly-P)，PHB和Poly-P都属于细菌细胞内的能源贮存颗粒，因此生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)可以更好的适应低温、贫营养生长环境，具有恶劣环境适应能力强的优点。
本发明生物除锰功能菌MB4通过16S rDNA基因序列比对分析与其最相近的种属是微小杆菌属的Exiguobacterium acetylicum(Genbank DQ019167.1)，同源性为99％，因此被命名为Exiguobacterium sp.。
本发明生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)具有去除水中Mn2+的能力，Mn2+去除率高于91％。本发明生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)的生化能力强、除锰效果好，可以直接投入使用，不仅缩短了水处理除锰生物滤池的建立时间，也可加快过滤速度，并且缩短了工程菌群遭到破坏后的恢复周期，可以在短暂的3～4小时内恢复水处理设施正常运行，保证了出水的质量。
Exiguobacterium sp.属于微小杆菌属(Exiguobacterium)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCC No.2237。
附图说明
图1是生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)的原子力显微镜图片；图2是生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)的原子力显微镜图片；图3是生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)中类脂颗粒染色后观察图；图4是生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)中异染颗粒染色后观察图；图5是生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)去除水中Mn2+的时间曲线图，图5中“■”表示水中Mn2+浓度曲线，“◆”表示Mn2+去除率曲线。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)属于微小杆菌属，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCC No.2237；生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)为革兰氏阳性微好氧菌，短杆菌，个体小，长为1～1.5μm，宽为0.5～0.8μm，细胞两端钝圆(如图1和图2所示)；在培养基上形成棕色菌落，不透明，中心颜色较深，四周颜色较浅，菌落为圆形；生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)具有能源贮存颗粒，无芽胞和荚膜，N，N，N′，N′-四甲基对苯二胺(N，N，N′，N′-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)染色为阳性。
生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)能在pH值为4～10的环境中生长，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸盐还原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脱氨酶。
生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)趋向于形成3～5个或更多的细胞组成的链。
具体实施方式二：本实施方式生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)是从辽宁省沈阳市张士生物除锰水厂的生物除锰滤池曝气池壁取泥中筛选得到的。筛选用1L培养基由0.8g蛋白胨、0.2g酵母浸膏，0.1g MnSO4.H2O，0.1g K2HPO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.2g NaNO3，0.1g CaCl2，0.1g(NH4)2CO3，0.01g FeSO4·7H2O和余量的蒸馏水制成；然后灭菌。
本实施方式采用平板划线与平板涂布法相结合进行分菌，采用TMPD法(Vandenabeele J，D de Beer et al.Manganese oxidation by microbial consortiafrom sand filters.Microb.Ecol.1992，24：91-108.)对分离所得菌种进行初筛。本实施方式采用TMPD法的原理是N，N，N′，N′-四甲基对苯二胺(N，N，N′，N′-Tetramethyl-p-Phenylenedia，TMPD)可与四价锰反应生成蓝色物质Wurster Blue，利用分光光度法通过测Wurster Blue在420nm处的OD值可推知菌落具有Mn2+氧化能力的强弱(菌落无颜色变化的为阴性、无生物除锰功能)。
本实施方式生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)16S rDNA测序工作由生物工程公司完成；其中PCR扩增正向引物BSF8/20：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物BSR1541/20：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。本实施方式生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本实施方式生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)生理生化分析结果如表1所示。
表1生物除锰功能菌MB4生理生化实验分析结果
| 试验名称 | 试验结果 | 结果所说明的问题 |
| 乙酰甲基醇试验 | - | 没有发酵葡萄糖产生乙酰四基甲醇的能力 |
| 甲基红试验 | - | 不能在糖代谢过程中分解葡萄糖产生丙酮酸 |
| 淀粉水解试验 | +++ | 能产生能够水解淀粉的淀粉酶 |
| 产氨试验 | - | 不能产生脱氨酶 |
| 油脂水解试验 | - | 不能产生脂肪酶，将脂肪分解成甘油和脂肪酸 |
| 硝酸盐还原试验 | + | 具有硝酸还原盐能力 |
| 氧化酶试验 | + | 有可以和细胞色素a、b、c构成氧化酶系的氧化酶 |
| 产吲哚试验 | - | 不具有能分解色氨酸使之形成吲哚的色氨酸酶 |
| 明胶液化试验 | - | 没有分解蛋白质的能力 |
| 产硫化氢试验 | - | 不能分解含硫有机物产生硫化氢 |
| PH值试验 | pH4～10 | pH4～10均可生长，尤其适于在中性和偏碱性环境中生长(pH7～10) |
| 生长温度试验 | 20～37℃ | 一般温度下都可以正常生长 |
| 需氧性的测定 | 上部生长，较弱 | 微好氧型的细菌 |
生理生化实验结果表明生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)是微好氧菌株，可以在较宽pH范围内生长，中性或偏碱性环境下生长更好；具淀粉酶和氧化酶；不具有脂肪酶、色氨酸酶、脱氨酶；没有发酵葡萄糖产生乙酰四基甲醇的能力；不能在糖代谢过程中分解葡萄糖产生丙酮酸；生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)有脂质颗粒聚β-羟基丁酸(PHB)和异染颗粒聚合磷酸盐(Poly-P)，脂质颗粒PHB和异染颗粒Poly-P都属于能源贮存颗粒。生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)中脂质颗粒染色后观察图如图3所示，生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)中异染颗粒染色后观察图如图4所示。
生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)的发酵上清液具有较高的除锰活性，试验表明生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)能够分泌大量的除锰胞外蛋白酶。
接菌培养生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)，液体培养液pH值为7.5，在12℃低温条件下培养48h，然后向培养液中加入高浓度Mn2+溶液使培养液中Mn2+的浓度为24mg/L，液体培养液中Mn2+的浓度随时间的变化曲线如图5所示；36h内Mn2+浓度迅速下降由24mg/L降至2.79mg/L，36h后趋于稳定维持在2.43mg/L左右；72h内Mn2+去除率高达91.25％。实验证明，生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)具有较高的生物除锰性能，且具有较高的胞外酶活性，通过48h的低温培养菌株向胞外分泌大量活性蛋白，活性蛋白与Mn2+相结合，使Mn2+转化为MnOX，得以去除。
序列表
<110>哈尔滨工业大学
<120>一种生物除锰功能菌
<160>3
<210>1
<211>1554
<212>DNA
<213>生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)
<220>
<223>生物除锰功能菌MB416S rDNA基因序列
<400>1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
gctggaaact gacggaactc ttcggaggga aggtagcgaa atgagcggcg gacgggtgag 120
taacacgtaa ggaacctgcc tcaaggattg ggataactcc gagaaatcgg agctaatacc 180
ggatagttca tcggaccgca tggtccgttg atgaaaggcg cttcggcgtc accttgagat 240
ggccttgcgg tgcattagct agttggtggg gtaacggccc accaaggcga cgatgcatag 300
ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 360
ggcagcagta gggaatcttc cacaatggac gaaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt 420
gatgaaggtt ttcggatcgt aaaactctgt tgtaagggaa gaacacgtac gagagggaat 480
gctcgtacct tgacggtacc ttacgagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 540
gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggc 600
cttttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggccattgg aaactggaag 660
gcttgagtac agaagagaag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 720
ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctt tggtctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag 780
cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctag 840
gtgttggggg gtttccgccc ctcagtgctg aagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 900
agtacggccg caaggctgaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcggtggagc 960
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccaac tcttgacatc ccattgaccg 1020
cttgagagat caagttttcc cttcggggac aatggtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1080
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaacccct atccttagtt 1140
gccagcattc agttgggcac tctagggaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1200
atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgag ttgggctaca cacgtgctac aatggacggt 1260
acaaagggca gcgagaccgc gaggtggagc caatcccata aagccgttcc cagttcggat 1320
tgcaggctgc aactcgcctg catgaagtcg gaatcgctag taatcgcagg tcagcatact 1380
gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgcaac 1440
acccgaagcc ggtgaggtaa ccgcaaggag ccagccgtcg aaggtggggt agatgattgg 1500
ggtgaagtcg taacaaggta gccgtatcgg aaggtgcggc tggatcacct cctt 1554
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据E.coli 16S rRNA基因8～20bp设计PCR扩增正向引物BSF8/20序列。
<400>2
agagtttgat cctggctcag 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据E.coli 16S rRNA基因1520～1541bp设计PCR扩增正向引物BSR1541/20序
列。
<400>3
aaggaggtga tccagccgca 20
Claims (2)
1、一种生物除锰功能菌，其特征在于生物除锰功能菌MB4属于微小杆菌属(Exiguobacterium sp.)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年10月30日，保藏号为CGMCC No.2237；生物除锰功能菌MB4为革兰氏阳性微好氧菌，短杆菌，个体小，长为1～1.5μm，宽为0.5～0.8μm，细胞两端钝圆；在培养基上形成棕色菌落，不透明，中心颜色较深，四周颜色较浅，菌落为圆形；生物除锰功能菌MB4具有能源贮存颗粒，无芽胞和荚膜，N，N，N’，N’-四甲基对苯二胺染色为阳性。
2、根据权利要求1所述的一种生物除锰功能菌，其特征在于生物除锰功能菌MB4能在pH值为4～10的环境中生长，具有淀粉酶、氧化酶和硝酸盐还原性，不具有脂肪酶、色氨酸酶和脱氨酶。
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Non-Patent Citations (4)
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| Mn2+氧化细菌的微生物学研究. 张杰等.给水排水，第23卷第1期. 1997 |
| Mn2+氧化细菌的微生物学研究. 张杰等.给水排水，第23卷第1期. 1997 * |
| 生物固锰除锰机理与生物除铁除锰技术. 杨宏等.中国给水排水，第19卷第6期. 2003 |
| 生物固锰除锰机理与生物除铁除锰技术. 杨宏等.中国给水排水，第19卷第6期. 2003 * |
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