CN100546654C - 一种壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为基因载体应用的用途。本发明通过细胞相容性实验、载体包裹质粒DNA实验、琼脂糖凝胶电泳实验、壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合体的制备及体外转染实验,表明该壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料是一种细胞相容性好、安全低毒、高效的基因载体。
Description
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为基因载体应用的用途,属于医学材料领域。
背景技术
20世纪90年代以来,随着“人类基因组计划”的实施,基因技术、纳米技术的发展,人们对于癌症的发生机理有了更加深入的认识与研究,众多科学工作者开始尝试从癌细胞的产生根源——基因变异上寻找治疗癌症的方法。人们开始关注并致力于研究一种新的癌症治疗技术——基因治疗。
基因治疗,是指通过有效的基因传递系统,将质粒DNA插入到目标细胞中,进行转录,最终将所携带的基因信息传递给所连接的细胞中,从而达到治疗疾病的目的。而具备高效,安全的基因载体是基因治疗的关键。
由于病毒载体有较大的安全隐患,非病毒载体在被利用,如阳离子脂质体,阳离子多聚物,SiO2等。但它们都有各自的局限性:阳离子脂质体具有一定的细胞毒性;阳离子多聚物生物相容性差,可降解性不高;SiO2需进行阳离子聚合物或氨基硅烷化等功能化修饰,程序化较复杂。因此,寻找新型安全高效的基因载体是基因治疗的当务之急。
壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料是目前一种刚研制出不久的新型纳米复合材料,已被证实具有较好的药物包封率和缓释效果,但对其用途的研究还处于开发阶段,目前尚未有将壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为基因载体应用的任何报导。
发明内容
本发明的目的是开拓壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的新用途,将壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为基因载体应用,为基因治疗技术提供一种新型的、安全有效的基因载体材料——壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料。
实现本发明目的的技术方案是将壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料用作基因载体。
且所用壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料中的壳聚糖季铵盐与累托石重量比分别为1∶2、1∶1、2∶1或4∶1。
并且,以壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为质粒DNA的载体,两者形成的纳米颗粒复合物为携带基因药物,用于基因治疗。
并且通过调节壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料与质粒DNA的比例确定最佳转染剂量。
本发明将壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为基因载体应用,是因为该纳米复合材料的细胞相容性良好,它是有机、无机纳米复合物的典型杂化材料,通过二者的耦合作用而产生许多优异的性能。而且由于纳米粒子较小的尺寸、大的比表面产生的量子效应,赋予纳米复合材料许多特殊的功能。它有效地结合保护DNA,良好的内吞性,强质子海绵特性提高了细胞的转染率。它分散性良好,满足了基因载体的有效性。
本发明通过细胞相容性实验、载体包裹质粒DNA实验、琼脂糖凝胶电泳实验、壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合体的制备和载体-质粒DNA复合体体外转染实验,证明作为壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为基因载体时具有细胞相容性好、安全低毒、DNA包载量大的优点,是一种安全有效的基因载体。
附图说明
图1细胞相容性结果图。
图2载体包裹质粒DNA实验结果图。图中壳聚糖季铵盐与累托石重量比分别为1∶2,1∶1,2∶1和4∶1,分别标记为HR1,HR2,HR3及HR4。
图3琼脂糖凝胶电泳实验结果照片。
图4壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合体照片。
图5载体-质粒DNA复合体体外转染实验中转染72h后荧光显微镜照片。
图6A载体-质粒DNA复合体体外转染实验中细胞流失仪对照孔图。
图6B载体-质粒DNA复合体体外转染实验中转染96h后细胞流失仪检测结果图。
图7A载体-质粒DNA复合体体外转染实验中转染120h后激光共聚焦暗视野照片。
图7B载体-质粒DNA复合体体外转染实验中转染120h后激光共聚焦明视野照片。
具体实施方式
壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料细胞相容性实验、载体包裹质粒DNA实验、琼脂糖凝胶电泳实验、壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合体的制备和体外转染实验的具体过程如下:
(1)壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料细胞相容性实验
取一定量的壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料溶于水中,加入磁子搅拌之其完全溶解。接种HCCLM7于96孔板中,10000个/孔,24h待细胞贴壁后,加入壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料溶液,使其浓度为0.1,0.5,1.0,2.5,5,25,50,100μg/孔。在温箱中培养24h后,吸出培养液,PBS洗三次;每孔加入100ul无血清培养基,并加入MTT 20μl/孔,4h后小心吸干孔内液体,每孔加入DMST 150ul酶标仪测量490nm吸光度。细胞相容性结果见如图1。
(2)载体包裹质粒DNA实验
取10μgDNA分别与不同质量比壳聚糖季铵盐/累托石的复合物以1∶1;1∶2;1∶4;1∶8混合,振荡器上振荡2h,离心机上7000rpm 5分钟,紫外分光光度计测定上清中DNA浓度,由此可以得出壳聚糖季铵盐/累托石复合材料所包裹的DNA量。载体包裹质粒DNA实验结果见图2。从图2可以看出,HR3显示了最好的包裹能力,可以确定最佳转染剂量为质粒DNA与壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的质量比为2∶1。说明通过调节壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料与质粒DNA的比例能确定最佳转染剂量
(3)琼脂糖凝胶电泳实验
称取0.8g琼脂糖放入0.5×TBE缓冲液100ml中,加热30min至完全溶化,取出摇匀,待琼脂糖凝胶溶液冷却到50℃左右,再加入10μl浓度为5μg/ml的EB,在第一泳道加入裸质粒DNA,其他泳道加入10μl不同比例壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合物,电泳条件是电压60V时间90min。琼脂糖凝胶电泳实验结果见图3。
(4)壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合体的制备
取10ug的壳聚糖季铵盐/累托石复合物和5ug的质粒DNA混合,室温振荡器上振荡2h,-20℃保存。所得壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合体照片见图4。
(5)载体-质粒DNA复合体体外转染实验
将LCCM7细胞以2×105接种在六孔板中,每孔中加入3ml培养液(含10%血清的RPMI1640),置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24h;
转染前去掉培养液,用0.01mol/L(pH 7.4)PBS洗涤一次,每孔中先分别加入1ml无血清的RPMI1640,再加入10μl不同质量比的壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合物;转染24h后,去掉培养液,细胞用PBS洗涤两次后,每孔中再加入3ml培养液(含10%血清的RPMI1640);再培养48h后,去掉培养液,用PBS洗涤三次后,以75%的乙醇固定15min;再用PBS洗涤三次,每次10min;然后将浓度为4μg/ml的PI分别加入到六孔板中,室温避光染色15min后,再次用PBS洗涤三次,每次约15min,最后取出六孔板中的盖玻片,用50%的缓冲甘油封片备用。
细胞表达的GFP通过荧光显微镜,流式细胞仪,激光共聚焦荧光显微镜进行检测。GFP采用波长为488nm的氖激光激发,其荧光发射波长为495-550nm。载体-质粒DNA复合体体外转染实验结果照片见图5、图6A、图6B、图7A和图7B。
从上述实验结果可知本发明用作基因载体的壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的细胞相容性好,能100%包裹质粒DNA,载体-质粒DNA复合体稳定分散,在激光共聚焦显微镜下,约80%细胞表达绿色荧光,壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为质粒DNA的载体,两者形成的纳米颗粒复合物为携带基因药物,能用于基因治疗。
Claims (4)
1.一种壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的用途,其特征在于:将壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料用作基因载体。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的用途,其特征在于:壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料中的壳聚糖季铵盐与累托石重量比分别为1∶2、1∶1、2∶1或4∶1。
3.根据权利要求1或2所述的壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的用途,其特征在于:壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为质粒DNA的载体,两者形成的纳米颗粒复合物为携带基因药物,用于基因治疗。
4.根据权利要求3所述的壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的用途,其特征在于:最佳转染剂量为质粒DNA与壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的质量比为2∶1。
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Cited By (1)
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CN101735486B (zh) * | 2009-12-17 | 2012-05-09 | 华南理工大学 | 羧甲基壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料及其制备方法 |
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RNA壳聚糖纳米载体的制备及其酶降解保护作用. 张红菱等.武汉工业学院学报,第24卷第1期. 2005 |
RNA壳聚糖纳米载体的制备及其酶降解保护作用. 张红菱等.武汉工业学院学报,第24卷第1期. 2005 * |
Cited By (1)
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CN101735486B (zh) * | 2009-12-17 | 2012-05-09 | 华南理工大学 | 羧甲基壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料及其制备方法 |
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