CN100532545C - 利用位点特异性重组生产重组病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了使用体外位点特异性重组生产重组病毒的方法。在本发明中，在体外将线形病毒基因组DNA消化成两个片段，并使之和旁侧有位点特异性重组酶位点的所需基因组物质发生位点特异性重组。根据本发明，由于位点特异性重组混合物可以应用于宿主细胞，而不需要进一步选择重组病毒基因组DNA的步骤，有可能同时快速获得多种重组病毒。因此，本发明可以用做高通量系统，以生产上百种或上千种重组病毒。

Description

利用位点特异性重组生产重组病毒的方法

技术领域

本发明涉及一种生产重组病毒和用于生产重组病毒的载体的方法。另外，本发明涉及用于该方法的DNA构建体和通过该方法产生的重组病毒。

背景技术

重组病毒载体是指基因工程化的载体、例如用于制备疫苗；分析一个基因、一组基因或基因组结构域的功能、生产蛋白质；和基因治疗。能够整合到病毒载体中的基因组物质包括诸如基因、cDNA、基因组DNA、编码肽或蛋白质的DNA序列、RNA、反义RNA、siRNA、siRNA的DNA、启动子、增强子等的任意基因组物质。用于制备载体的病毒包括腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、疱疹病毒和Vacxnia病毒等。

逆转录病毒已知是在基因治疗中最为广泛使用的病毒之一[参见Clive

Patience等，病毒学杂志(J Virol)，72：2671-2676，1998；Marshall，科学(Science)，269：1050-1055，1995]。逆转录病毒具有两个LTR、衣壳序列和3(三)个编码区(gag、pol和env)，已经公开了其制备方法和其在体外及体内的应用[WO9908692A1和EP453242]。但是逆转录病毒的临床应用具有以下缺点：它形成具有复制竞争力的逆转录病毒(RCR)(Sharon K.Powell等，病毒学杂志(J Virol)，73：8813-8816，1999)；它具有相对较低的基因表达水平，且该水平在体内持续下降；病毒滴度低。另外，逆转录病毒不能将基因转移至非分裂细胞中[Jaffe，E.M.癌症研究(Cancer Res.)，53：2221-2226，1993；Bender，M.A.等，病毒学杂志(J Virol)，61：1639-1646，1987]。

腺病毒具有线形基因组(大小约36 kb)，包括复制起点和靠近左侧反向末端区(ITR)(103bp)的衣壳信号[Shenk，腺病毒科：病毒和其复制，FieldsBN，Knipe DM Howley PM所编《病毒学》中，费城：Raven出版社，1996：2111-2148]。通常，通过删除病毒基因组中病毒复制所必需的E1位点来制备腺病毒载体。包括异源基因组物质替换E1位点的病毒转移到提供E1蛋白的包装细胞中。因此，病毒复制仅发生在包装细胞中。代表性的包装细胞包括，例如，HEK293细胞、911细胞和PER.C6细胞等[Hitt MM等，药理学进展(Advancesin Pharmacology)，40卷，137-206(1997)，Wang Y.和Huang S.，药物]。腺病毒载体具有以下优点，如安全性、和细胞的亲和力、感染分裂细胞的可能性和更高的滴度(10¹¹pfu/ml)。因此，腺病毒已经用于制备表达异源基因的载体。

腺相关病毒(大小约4700bp)在两端都具有用作复制起点的ITR(大小约145bp)。它可以安全、特异地整合到各种类型细胞的基因组DNA中。

为了将重组病毒用作载体，应该对之进行修饰，使它们自身不能在受感染细胞中复制。因此，通常使用缺失了基因组中病毒复制所必需区域的缺陷型病毒来制备重组病毒载体。例如在逆转录病毒的情况下，gag、pol和/或env基因缺失，这些区域置换为所需的基因组物质[Bender等，病毒学杂志(J Virol)，61，(1987)1639]。至于腺病毒，删除E1、E2和/或E4来制备病毒载体[Levrero等，基因(Gene)101(1991)195；Gosh-Choudhury等，基因(Gene)50(1986)161，Van der Vliet等，(1975)]。另一方面，仅由复制必需区域(如ITR和衣壳序列)组成的假病毒载体也已用来获得重组病毒(参见WO95/02697)。

更具体地说，制备腺病毒的常规方法可以分为以下3类：在第一类中，提供携带者载体(carrier vector)和腺病毒基因组DNA之间的同源重组，其中载体携带有所需的外源基因组物质[Hitt MM等，药理学进展(Advances inPharmacology)，40卷，137-206(1997)]。在该方法中，所需的外源基因组物质克隆到携带者载体中，然后和腺病毒载体基因组DNA一起导入包装细胞，以诱导同源重组。携带者载体通常包括一个诸如启动子的序列盒、用于基因克隆的限制酶靶位点和多聚(A)添加信号，用于外源基因组物质的表达。另外，携带者载体具有诱导同源重组的核酸序列。一般来说，该方法中使用缺失LITR、包装信号或E1位点的缺陷型腺病毒基因组。另一方面，Frank Graham等设计了一种能够在大肠杆菌E.coli中复制的质粒类型的载体，以解决所述方法存在的问题，即需要进一步从病毒中选择缺陷型腺病毒基因组的步骤的问题[Bett AJ等，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci USA)，91卷，8802-8806(1994)]。而且，Graham的方法还必须使用携带者载体和缺陷型腺病毒DNA之间的同源重组，包装细胞中同源重组的较低发生率也使该方法效率低。

第二类包括使用限制酶和连接酶将所需的外源基因组物质直接克隆到腺病毒基因组的特定区域。该方法解决了腺病毒基因组的结构复杂性(大小约30kb)所致的难题。在该方法中，所需基因的表达序列盒首先克隆到携带者载体中，再使用序列盒和病毒基因组中都存在的特异性限制酶位点将该载体克隆到病毒基因组中。然后，将克隆的序列盒和病毒基因组导入大肠杆菌E.coli中，选择所需克隆。随后，将选择的克隆导入包装细胞中。然后就可以从包装细胞中获得重组病毒[Mizuguchi H.和Kay MA.，人类基因治疗(Human GeneTherapy)，10卷，2013-2017(1999)]。在该类的另一个方法中，从病毒，而非从E.coli中提取在ITR末端区域具有pTP(死亡前蛋白质)的病毒DNA，以增加所需重组病毒的繁殖能力，将该病毒DNA和所需的基因组表达序列盒连接后转移至细胞系中[Okada T.等，核酸研究(Nucleic Acids Research)，26卷，1947-1950(1998)]。

在第三类中，一种方法使用具有相对较高同源重组效率的E.coli，以提高包装细胞中较低的重组发生率[Chartier C.等，病毒学杂志(Journal ofVirology)，70卷，4805-4810(1996)；He T.等，美国科学院院报(Proc.NatlAcad.Sci USA)，95卷，2509-2514(1998)]。根据该方法，虽然所需的基因组物质也克隆到携带者载体中，但通过和质粒类型腺病毒基因组一起感染细胞，有可能获得特殊E.coli中相对较高的同源重组发生率。因此，和上述方法相比可以获得具有较高繁殖能力的所需重组病毒。然而，在该方法中所需的基因组物质应当克隆到携带者载体中。且应当使用特殊的E.coli细胞系(例如BJ5183)。另外，在E.coli中表达的重组DNA应当加以筛选，且由于质粒在用于重组的E.coli中的不稳定性，筛选得到的重组DNA应当转移到另一种E.coli细胞系(例如DH5α)中。因此，人们认为这种方法非常复杂，且并不有效。

如上所述，用于制备重组病毒的常规方法具有以下缺点：i)所需的基因组物质应当克隆到携带者载体中；ii)因为应当在细胞中进行所需基因组物质的基因克隆，因此需要复杂且效率低的克隆步骤；iii)在大规模生产之前应当从宿主细胞中选择所需的重组病毒。因此，根据那些方法，需要花费很长时间来获得重组病毒，而其繁殖力较低。特别是ii)和iii)的缺点已经成为制备重组病毒过程中待解决的最重要问题，因此到目前为止人们一直致力于解决这些问题。另一方面，根据对重组病毒应用的开发，对更有效和快速制备重组病毒的方法的需求正日益增加。

因此，我们开展了研究以生产具有所需基因的重组病毒。通过使用体外位点特异性重组来提供重组病毒载体，我们已经完成了该发明。

发明内容

这里引用的任意出版物都在该申请中引用作为参考，以更全面地描述本发明所属领域的状态。

理解本发明重要的是应当注意到这里所用的所有技术和科学术语，除非另外说明，都具有本领域中的普通技术人员通常所理解的相同意思。除非另外说明，这里所采用的技术也是本领域中的普通技术人员所公知的。

涉及的具体缓冲液、培养基、试剂、细胞、培养条件等等，或其一些亚类并不能理解为限制性的，而应该理解为包括所有的相关物质，以使本领域的普通技术人员能够在存在讨论的具体上下文中认可其是感兴趣的或有价值的。例如，经常有可能将一种缓冲液系统或培养基替换为另一种，以便使用不同但公知的方式达到与使用所建议的方法、材料或组分所能达到的相同目的。

本发明的一个目的是提供更为快速且更为有效的生产重组病毒的方法。

为了完成本发明，本发明采用了通过体外特异性重组制备的重组病毒载体。更优选的是，用于本发明的病毒具有线形基因组DNA。

因此，本发明的另一个目的是使用体外位点特异性重组提供重组病毒载体。

在本发明中，将包含病毒基因组DNA的载体切割成两个或多个片段，然后应用于体外位点特异性重组，其中两个片段对于病毒复制都是必需的。将包括所需基因组物质的DNA片段特异性地插入到两个基因组DNA片段之间。这样，由于未结合的病毒基因组DNA片段自身不能够表达，只有具有所需DNA片段的病毒可以表达。因此，可以从宿主细胞中直接获得所需的重组病毒，而不需要进一步的步骤，如从中间宿主细胞中选择所需重组病毒的步骤。

至于位点特异性重组，是在各种生命有机体中天然发生的事件。用于位点特异性重组的酶不仅包含核酸内切酶活性，而且还包含连接酶活性。因此它们识别DNA序列的特定部分，并将之置换为任意的其他相关DNA序列[Yang W.和Mizuuchi K.，结构(Structure)，1997，5卷，1401-1406(9)]。λ噬菌体(bacterioλphage)的Int/att系统、P1噬菌体的Cre/LoxP系统和酵母的FLP-FRT系统都是充分开发的位点特异性重组系统。

位点特异性重组系统已经用于i)克隆进重组病毒中的所需基因组物质的表达控制；ii)制备辅助病毒(helper-virus)依赖型病毒时切除辅助病毒；iii)增加包装细胞中同源重组的效率；或iv)在包装细胞中诱导携带者载体和病毒基因组之间的位点特异性重组，以制备重组病毒[Philip NG等，生物技术(Biotechniques)，29卷，524-528(2000)；Philip NG等，人类基因治疗(HumanGene Therapy)，10卷，2667-2672(1999)；Hardy S等，病毒学杂志(Journalof Virology)，71卷，1842-1849(1997)；Parks RJ等，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci USA)，93卷，13565-13570(1996)]。但是，现有技术中公开的位点特异性重组的所述应用只是间接的，是体内或细胞系中的补充用途，而非体外用途。

因此，尚没有用于将所需基因组物质特异插入到线形病毒基因组DNA中以获得重组病毒载体的体外位点特异性重组的应用。具体地说，尚没有使用能够分离成两个片段的病毒基因组DNA的应用。

因此，本发明的特征在于在重组病毒载体的制备中采用体外位点特异性重组。和现有技术相比，它具有以下出乎意料的优点：i)通过采用体外位点特异性重组，它有可能更容易、更快速地获得重组病毒载体；ii)通过将病毒基因组DNA消化成两个片段、然后将它们应用于位点特异性重组，它不需要任何进一步的步骤，如用于从中间宿主细胞中选择所需重组病毒的噬斑分析；和iii)有可能将包括重组病毒载体的反应混合物应用于宿主细胞，而不需要进一步的步骤。

另外，根据本发明，不需要包装细胞中的同源重组。也不需要诱导E.coli中同源重组的特殊细胞系。图5说明了制备腺病毒(AdHT系统)的本发明方法和现有技术(AdEasy系统)中的方法之间从过程和周期方面进行比较的结果。从结果可以清楚地看出使用本发明中的方法可以更快速地获得所需的重组病毒。

另外，根据本发明，许多种类的所需基因组物质在体外精确地整合到病毒基因组DNA的位点中，可以在多孔板(如96-孔和384-孔板)中同时从相同种类的病毒表达各种基因组物质。同样，由于使用了来自各种类型的病毒[如腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、噬菌体、单纯疱疹病毒、CMV(巨细胞病毒)、EBV(EB病毒)或VZV(水痘带状疱疹病毒)等]多种病毒基因组，通过使用包含所需基因组物质的常用载体(pMaster载体)，可以从各种类型的病毒表达相同种类的基因组物质。

因此，本发明还为研究功能基因组提供了极有用的工具，由于基因组计划的完成，对这种工具的需求一直在大幅度增加[Wang Y.和Huang S.，今日药物发现(Drug Discovery Today)，5卷，10-16(2000)]。

在一个实施方案中，本发明提供了基因组DNA为线形形式的重组腺病毒。如图2所示，首先将病毒的基因组DNA切割成两个片段，其中两个片段分别为病毒复制和包装所必需。然后，使用切割的片段作为模板，包含位点特异性重组位点的所需基因组物质通过同源重组进行整合。更具体地说，将E1位点缺失的腺病毒消化成两个片段，将重组位点引入每个片段中，以诱导体外位点特异性重组。将其他的相应位点特异性重组位点引入所需基因组物质中。

如图2所示，腺病毒基因组左侧的片段包括ITR和包装信号；右侧片段包括病毒复制所必需的其他基因，然而两个切割片段中只有一个存在时，重组和病毒包装不会独自发生(因为右侧片段缺少颗粒形成的信号，左侧片段太短而不能形成病毒颗粒)。因此，只有包含所需基因组物质、通过位点特异性重组整合的病毒基因组可以在包装细胞中用作复制模板。

另一方面，下面公开的方法可用于获得病毒基因组DNA的两个片段。在第一种方法中，用限制酶将病毒基因组DNA切割成两个片段，其中每个片段为病毒包装所必需，且具有位点特异性重组位点(参见图2)。更具体地说，首先将一个或多个限制酶识别位点克隆到病毒基因组DNA中(参见图1)，然后通过限制酶处理获得两个或多个病毒DNA片段。包括限制酶位点的病毒基因组DNA可以以质粒的形式从E.coli获得，或直接从病毒获得。获得的质粒(pAdHTS)具有如图1所述的构建体。然后，通过限制酶处理将pAdHTS(SEQ.ID No：1)切割成三个片段。除了和位点特异性重组和病毒复制不相关的片段外，另外两个片段用于制备重组病毒载体(参见图2)。

在第二种方法中，可以防止亲本病毒的形成。如实施例3所公开的，病毒DNA的左侧片段和右侧片段分别以质粒的形式产生，然后制成线形形式，其中两个片段具有彼此不同的位点特异性重组位点。如图3所示，左侧片段具有为病毒复制所必需的核酸。每个片段都具有使DNA在E.coli中复制的复制起点(如PBr322起点或pUC起点等)、便于检测和/或选择的至少一种选择标记

(如Ampr、Kanr、Cmr等)。这些片段可以分别来源于其他质粒。

本发明的病毒基因组DNA片段可以是线形形式或环形形式。优选的是，它们是线形形式。例如，如果通过限制酶处理产生的线形DNA片段在体外整合到pMaster载体中，可以获得如图4所述的线形形式的重组病毒基因组。因此，在环形质粒DNA的情况下，首先用限制酶如PacI对它们进行处理，以形成线形DNA片段，从而获得线形病毒基因组(参见图4)，然后将它们导入包装细胞中以诱导病毒复制。

在一个实施方案中，启动子插入到病毒基因组DNA的一个位点上以诱导所需基因组物质的表达(参见图1和图2)。当通过位点特异性重组导入基因组物质时，在切割的DNA片段中不起作用的启动子诱导基因组物质的表达。在图6中，绿色荧光蛋白(GFP)和Gus基因不在未经历位点特异性重组的细胞群中表达。

可以用于本发明的启动子包括用于持续基因表达的CMV启动子、RSV(呼吸道合胞病毒)启动子、SV(猿病毒)启动子、仅在特定环境下诱导基因表达的启动子系统、包含对相应激素应答而发挥作用之ERE的启动子系统、对蜕皮素应答而发挥作用的启动子系统和对四环素应答而发挥作用的启动子系统等。启动子典型地控制表达，可选地和操纵子序列一起控制表达。

在另一个实施方案中，两个病毒基因组DNA片段中的attR位点和包括外源基因组物质的携带者载体中的attL位点反应，形成attB和attP位点。更具体地说，当在λ整合酶、作为辅助因子的IHF和Xis存在的条件下，两个病毒基因组DNA片段用具有所需基因组物质的携带者载体处理时，产生作为主要产物的attB。在反应混合物中还产生作为副产物的具有attP位点的载体DNA片段。可以使用来源于各种生物体的多种系统，例如λ噬菌体的整合酶/att系统、P1噬菌体的Cre/LoxP系统和啤酒酵母2μ环形质粒的FLP/FRT系统。

如果混合物直接转移至期望表达重组病毒的适当宿主细胞，只有包含attB1-[所需基因组物质]-attB2的病毒基因组DNA可以复制，形成病毒颗粒。彼此不反应的病毒DNA片段和载体DNA，以及具有attP位点的载体DNA片段不形成病毒颗粒。

如图6所示，病毒基因组DNA中左侧片段的消失说明了具有attR位点的DNA被重组。在图7中，PCR产物表明所需基因组物质确实插入到了病毒基因组的适当位点中。使用能够扩增病毒基因组特定区域的引物(Adeno-F引物和Adeno-R引物)对重组反应之前和之后的收集的两种样品进行PCR反应。

Adeno-F引物：5′-GGTCTATATA AGCAGAGCTG-3′(SEQ.ID No.：2)

Adeno-R引物：5′-GTATGGCTGA TTATGATCAG-3′(SEQ.ID No.：3)

使用DNA测序对PCR产物进行的分析表明病毒基因组和所需基因组物质整合到了靶位点上，产生了[病毒基因组的左侧片段-attB1-所需基因组物质-attB2-病毒基因组的右侧片段](参见图2)。

用包括位点特异性重组病毒载体的反应混合物感染诸如293细胞的包装细胞之后，观察到了病毒复制和包装。这些结果表明本发明的体外混合物可直接应用于宿主细胞以生产重组病毒，而不需要进一步的选择步骤。也就是说，根据本发明，不使用诸如E.coli之类的中间宿主细胞来选择适当的基因组DNA就可以快速生产所需的重组病毒。

在图8中示出了AdHTP载体和pMater克隆的位点特异性重组。和现有技术中的方法(Ad-GFP对照)相比，本发明方法中GFP的表达效率更高。Gus蛋白的活性分析表明本发明的方法对所表达蛋白质活性没有不利影响。因此，本发明中生产的重组病毒适于从受感染的宿主细胞表达所需基因组物质。

附图说明

图1表示pAdHTS载体的构建体。

图2表示pAdHTS载体和pMaster克隆之间在体外的位点特异性重组过程。

图3表示pAd-左侧和pAd-右侧的构建体。

图4表示pAd-左侧/pAd-右侧和pMaster克隆之间在体外的位点特异性重组过程。

图5表示与现有技术中方法比较，使用AdHTS生产重组腺病毒的过程和周期。

图6所示为琼脂糖凝胶电泳分析，表示了pAdHTS载体和pMaster克隆之间在体外的位点特异性重组结果。

图7所示为表明pAdHTS载体和pMaster克隆进行位点特异性重组的PCR结果。

图8所示为pAdHTS载体和pMaster克隆进行位点特异性重组的结果。pMaster克隆中的所需基因组物质转移至腺病毒基因组以表达所需蛋白质。

图9所示为表明AdHTS和pMaster-GFP在96-孔板中进行位点特异性重组的PCR结果。

图10所示为说明AdHTS和pMaster-GFP在96-孔板中进行位点特异性重组的结果。插入到了pMaster克隆中的GFP基因转移至腺病毒基因组中以表达所需蛋白质。

下面的实施例中描述了本发明优选的实施方案。考虑了这里所公开的本发明的说明书或本发明实践，这里的权利要求书保护范围内的其他实施方案对于本领域的技术人员来说是显而易见的。说明书和实施例应当认为只是示例性的，并且本发明的范围和实质由实施例后面的权利要求书表明。这里的实施例意味着举例说明实施本发明的各个方面，并不以任意方式限制本发明的范围。实施例不包括诸如基因组DNA分离、PCR和测序步骤中所采用的常规方法的详细说明。这些方法对于本领域的技术人员来说是公知的，在许多出版物中都有介绍。另外，这里引用的所有出版物都作为参考并入本文。

实施例

实施例1：使用pAdHTS的位点特异性重组

制备具有旁侧为attL位点的所需基因组物质的pMaster载体(参见图2)。然后，制备具有旁侧为attR位点的病毒基因组DNA的pAdHTS(参见图1)。通过删除腺病毒基因组DNA中的E3位点，并将E1位点置换为诱导重组的所需基因组物质表达的[CMV-启动子]-attR1-[λ填充片段DNA]-attR2-[Poly A添加信号]表达序列盒，从而产生用于本研究的pAdHTS载体(参见图1和图2)。通过扩增具有限制性位点的PCR引物并将它们克隆而制备λ填充片段DNA，以包含诸如SwaI、ClaI或PacI的限制酶识别位点。然后，用SwaI和/或ClaI处理DNA以产生两个片段，其中每个片段对于病毒复制和包装是必需的。Att位点具有如James L等设计的相同核酸序列[参见Hartley JL.等，基因组研究(Genome Research)，10卷，1788-1795(2000)]。使用重组方法将旁侧为突变attL位点(attL1和attL2)的pMaster载体分别用GFP cDNA和Gus cDNA克隆(参见图2，pMaster载体的基因-X位点)。结果，产生了包含attL1-[所需基因组物质]-attL2表达序列盒的质粒载体。

用SwaI和/或ClaI酶处理后，使用酚/氯仿纯化pAdHTS DNA(1μg)。包含GFP cDNA的pMaster-GFP(100ng)、包含Gus cDNA的pMaster-Gus(100ng)、整合酶(100ng)、IHF(10ng)和Xis(10ng)在缓冲液(50mMTris，pH7.8，16.5mM NaCl，35mM KCl，5mM亚精胺，0.25mM EDTA，3％甘油)中于25℃反应1hr。然后，根据通用方法从大肠杆菌E.coli除去整合酶、IHF和Xis[Kotewicz M等，生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)，1980，255卷，2433-2439；Nash HA.和Robertson CA.，生物化学杂志，256卷，9246-9253(1981)；Cho EH等，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)，182卷，5807-5812(2000)]。琼脂糖凝胶电泳分析结果表明，用PacI处理的pAdHTS产生了三个DNA片段(32kb、4.5kb和1.8kb)(图7泳道1)。发生位点特异性重组的情况下，观察到一个片段(大小约1.8kb)消失(图7泳道2和3)。为了证实这一点，使用adeno-F引物和adeno-R引物进行PCR，因此在诱导了位点特异性重组的情况下可以观察到所需大小的PCR产物(约32kb和约4.5kb)(参见图6)。

从琼脂糖凝胶中分离PCR产物，并对PCR产物进行DNA测序。结果，明确了泳道2、3和4的PCR产物是来源于腺病毒基因组未充分切割的λDNA；明确了泳道5的PCR产物是attB1-GFP-attB2，泳道6的PCR产物是attB1-Gus-attB2。也就是说，诱导了腺病毒基因组片段和一个pMaster克隆之间的重组。

实施例2：使用pAdHTS制备病毒

将从实施例1获得的2微升反应混合物(100ng DNA)导入293包装细胞中。然后，将293细胞转移至加有DMEM(5％胎牛血清)的24-孔板中(5×10⁴细胞/孔)。24hr后，根据生产商的方案将重组诱导的反应混合物(2微升)和LipofectAmine2000(0.5微升)(Invitrogen公司)转移至细胞中。转移7天后，在显微镜下观察到了CPE，表明细胞中病毒形成。此时，收获细胞，并加以离心。所得沉淀悬浮于100微升DMEM10％胎牛血清中。这些细胞于-70℃处理1hr，然后于37℃处理5min。重复冻融3次。通过离心除去裂解物，以生成病毒混合物。然后，用病毒混合物感染293细胞。进行噬斑分析以检测适当病毒的形成。

对于噬斑分析来说，将2×10⁵细胞转移至6-孔板中。转移24hr后，10微升病毒混合物和400微升DMEM400混合，铺在细胞上1hr以诱导病毒吸附。用3ml加有1％低熔点琼脂糖(SeaPlaque琼脂糖；FMC)的DMEM使细胞凝固，然后持续两周分析病毒噬斑。病毒滴度测定为每1ml病毒混合物形成的病毒噬斑数目。2周后，为了检测所需重组病毒的产率，500μg作为Glu蛋白底物的X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸)加入到凝固的琼脂糖中。24hr后，计算蓝色噬斑的数目。病毒的滴度为10⁶～10⁷PFU每1ml。通过表达Gus基因的重组病毒确定重组病毒的产率。观察到所有的病毒都为蓝色噬斑，说明本发明获得的病毒100％为重组病毒。也就是说，只有包括所需基因组物质的病毒基因组才能复制并形成病毒颗粒。即使位点特异性重组的发生率不是100％，但单独的分离DNA片段自身和位点特异性重组的副产物不能够复制，因此本发明获得的病毒100％为重组病毒。

如图8所示，如上所述制备分别表达GFP和Gus的重组病毒。用重组病毒感染293细胞。然后，在荧光显微镜下(对于GFP来说)或通过加入X-Gluc底物(对于Gus来说)检测所需蛋白质(GFP或Gus)的表达。如图8所示，只有加入了位点特异性重组酶的病毒群才能产生重组病毒，并表达所需蛋白质(参见图8泳道4和5)。

实施例3：使用pAd-左侧和pAd-右侧制备重组病毒

制备pAd-左侧(SEQ.ID No.：4)和pAd-右侧(SEQ.ID No.：5)。首先，用PacI和/或SwaI处理pAdHTS载体。然后，包含LITR和包装信号的左侧片段和PCR扩增得到的Amp-Ori DNA连接，以形成pAd-左侧。同样，右侧片段(大小约33kb)和Amp-Ori DNA连接以形成pAd-右侧。在该研究中，Amp-Ori的PCR引物包括PBr322 DNA的氨苄青霉素抗性基因、用于扩增复制起点的区域，和用于克隆限制酶识别位点的PacI和/或SwaI接头。获得的pAd-左侧和pAd-右侧的质粒DNA从DH5α产生(Qiagen，Midiprep试剂盒)，其又用SwaI和/或PacI进行消化。使用分别的质粒DNA，如实施例1和2中所公开的那样诱导重组，以生成重组病毒。简而言之，在存在具有GFP cDNA的pMaster-GFP(100ng)、整合酶(100ng)、IHF(10ng)和Xis(10ng)的缓冲液中，pAd-左侧的线形DNA(100ng DNA)和pAd-右侧的线形DNA(800ng DNA)反应1hr。如实施例2中所公开的那样将所得混合物转移至293包装细胞。7天后，从细胞碎片中获得病毒，并进行噬斑分析。

实施例4：AdHTS-末端蛋白复合物的分离和操作

为了获得AdHTS病毒，用限制酶PacI对pAdHTS进行消化，并将之转移至293包装细胞中以诱导病毒包装。通过将约5×10⁵293细胞和DMEM(5％胎牛血清)一起转移至30个细胞培养皿(直径为150mm)中，进行AdHTS病毒的大规模生产。24hr后，AdHTS病毒感染至5MOI。病毒感染48hr后，用细胞刮器从培养皿中收获细胞，然后对细胞进行离心。随后，将沉淀物悬浮于含有10mM Tris和1mM MgCl₂的溶液中。悬液于-70℃处理1hr，然后于37℃处理5min。重复冻融3次。将细胞裂解物离心，除去沉淀以获得病毒混合物。为了获得感染性的病毒颗粒，采用CsCl梯度超速离心。将1.4g/ml CsCl溶液倒入一个管(BeckMan)中，然后再往溶液中加入1.2g/ml CsCl。在维持浓度梯度的同时往溶液中加入20ml病毒混合物，溶液于25,000rpm超速离心2hr，从而从缺陷型病毒颗粒和细胞碎片中分离1×10¹²感染性病毒颗粒。

使用了两种不同的方法从AdHTS病毒中制备DNA-末端蛋白复合物。在第一种方法中，将6M盐酸胍加入等量的AdHTS病毒溶液中，然后加入1mg溴化乙锭和饱和的CsCl/4M盐酸胍溶液，使终体积至5ml。接着，将溶液于650,000g超速离心4hr。使用365nm的紫外线检测分离的病毒DNA-末端蛋白复合物条带，然后提取对应于该条带的DNA。将提取的DNA脱盐，用于下面的研究。在第二种方法中，将具有6M盐酸胍和等量AdHTS病毒溶液的混合物的腺病毒溶液转移至superdex16/30HR S-200柱(Amersham-Pharmacia)上。在溶液以0.4ml/min的流速扩展的同时，在260nm和280nm处持续检测获得的每个后续2ml级分。在1％琼脂糖凝胶上从峰级分收集物中检测AdHTSDNA-末端蛋白复合物。

用SwaI(NEB)对上述两种方法获得的AdHTS DNA-末端蛋白复合物进行消化，于-70℃保存，用于其他研究。

实施例5：对用pMaster-GFP进行位点特异性重组获得的病毒进行的噬斑分析

来自实施例2的10μl pAdHTS载体的体外反应混合物和pMaster-GFP如实施例2所公开的那样转移至293包装细胞中。7天后，对从细胞裂解物中提取的病毒进行噬斑分析。以同样的方式，对于实施例3的pAd-左侧/pAd-右侧及实施例4的AdHTS-DNA-TPC进行噬斑分析，结果在下面的表1中给出。

表1.对腺病毒载体和pMaster-GFP之间进行位点特异性重组获得的病毒进行噬斑分析的结果。

实施例6：重组腺病毒的多孔板生产

将实施例4中的45ng/孔SwaI处理的AdHTS-DNA-末端蛋白复合物转移至96-孔PCR板的每个孔中，然后如实施例1所述进行位点特异性重组。简而言之，100ng整合酶、10ng IHF、和10ng Xis、反应缓冲液(50mM Tris，pH7.8，16.5mM NaCl，35mM KCl，5mM亚精胺，0.25mM EDTA，3％甘油)和5ng包含GFP cDNA的pMaster-GFP转移至每个孔中。作为对照，包含Gus cDNA的5ng pMaster-Gus分别转移至4(四)个孔中，反应持续1hr。为了证实位点特异性重组，使用Adeno-F引物和Adeno-R引物进行PCR反应。结果，在除了对照之外的88个孔中都检测到了对应于GFP的PCR产物(参见图9)。和实施例2相似，确认为包括位点特异性重组的10μl(DNA50ng)反应混合物转移至96-孔板中，其中每个孔都包含孵育了24hr的约5×10³个292包装细胞，其中每个孔都被覆有聚L-细胞溶解酶。包含DNA的细胞表现出荧光。转移后4～7天观察到了EPE，标志着病毒的形成。在转移第10天，96-孔板于-70℃处理1hr，然后于37℃处理5min。重复冻融3次以获得细胞裂解物。细胞裂解物于2,500rpm离心10min。然后，用上清液感染96-孔板中的293细胞以证实表达GFP的病毒的形成(参见图10)。以相同的方式，在96-孔板中分别测定其他病毒如pAdHTS和pAd-左侧/pAd-右侧的重组病毒表达效率，重组病毒的平均效率在下面的表2中给出。

表2.96-孔板中重组蛋白的表达效率

工业应用

如上所述，本发明采用体外位点特异性重组来制备重组病毒的载体。在本发明中，所需的外源基因组物质插入到病毒基因组DNA的适当位点中，并快速地、以位点特异性方式消化成两个或多个片段。另外，病毒基因组DNA和所需基因组物质的反应可以在体外直接应用于宿主细胞，而不需要进一步选择重组病毒基因组DNA。因此，根据本发明，有可能同时获得多种重组病毒。

另外，本发明可以几乎完全防止病毒的自我复制。因此，本发明提供了用于生产上百或上千种重组病毒以进行各种基因组研究的高通量系统。

<110>Neurogenex有限公司

一种使用位点特异性重组生产重组病毒的方法

<130>PN0022781.00

<150>KR10-2002-0012633

<151>2002-03-09

<160>5

<170>Kopatentln 1.71

<210>1

<211>34573

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pAdHTS载体

<220>

<221>misc_特征

<222>(3181)..(30681)

<223>Ad5

<220>

<221>启动子

<222>(400)..(930)

<223>CMV启动子

<220>

<221>misc_特征

<222>(33318)..(34112)

<223>卡那霉素

<220>

<221>rep_起点

<222>(31716)..(32493)

<223>pBR322 ori

<220>

<221>misc_特征

<222>(31536)..(31638)

<223>RITR

<220>

<221>polyA_位点

<222>(1747)..(1868)

<223>SV40 polyA

<220>

<221>misc_特征

<222>(197)..(345)

<223>Ad5 psi

<220>

<221>misc_特征

<222>(1464)..(1588)

<223>attR2s ite

<220>

<221>misc_特征

<222>(949)..(1073)

<223>attR1位点

<400>1

taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg   60

agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag   120

tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt   180

ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg       240

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aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata       900

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ccgctgcagc caccgcccgc gggattgtga ctgactttgc tttcctgagc ccgcttgcaa       2220

gcagtgcagc ttcccgttca tccgcccgcg atgacaagtt gacggctctt ttggcacaat       2280

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ggaggtagca ccactgcaga gcttcatgct gcggggtggt gttgtagatg atccagtcgt      2640

agcaggagcg ctgggcgtgg tgcctaaaaa tgtctttcag tagcaagctg attgccaggg      2700

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tttccatgca ttcgtccata atgatggcaa tgggcccacg ggcggcggcc tgggcgaaga      3000

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cgccgcccag cgatagcagt tcttgcaagg aagcaaagtt tttcaacggt ttgagaccgt       3480

ccgccgtagg catgcttttg agcgtttgac caagcagttc caggcggtcc cacagctcgg       3540

tcacctgctc tacggcatct cgatccagca tatctcctcg tttcgcgggt tggggcggct       3600

ttcgctgtac ggcagtagtc ggtgctcgtc cagacgggcc agggtcatgt ctttccacgg       3660

gcgcagggtc ctcgtcagcg tagtctgggt cacggtgaag gggtgcgctc cgggctgcgc       3720

gctggccagg gtgcgcttga ggctggtcct gctggtgctg aagcgctgcc ggtcttcgcc       3780

ctgcgcgtcg gccaggtagc atttgaccat ggtgtcatag tccagcccct ccgcggcgtg       3840

gcccttggcg cgcagcttgc ccttggagga ggcgccgcac gaggggcagt gcagactttt       3900

gagggcgtag agcttgggcg cgagaaatac cgattccggg gagtaggcat ccgcgccgca       3960

ggccccgcag acggtctcgc attccacgag ccaggtgagc tctggccgtt cggggtcaaa       4020

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tccacgctcg gtgacgaaaa ggctgtccgt gtccccgtat acagacttga gaggcctgtc       4140

ctcgagcggt gttccgcggt cctcctcgta tagaaactcg gaccactctg agacaaaggc       4200

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gattggtttg taggtgtagg ccacgtgacc gggtgttcct gaaggggggc tataaaaggg       4380

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gggtgagtac tccctctgaa aagcgggcat gacttctgcg ctaagattgt cagtttccaa       4500

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catctggtca gaaaagacaa tctttttgtt gtcaagcttg gtggcaaacg acccgtagag       4620

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cccctcgcct ggcgggtttg gctggtggtc ttctacttcg gctgcttgtc cttgaccgtc     6600

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ccggcggcgg tggtggaggc gcgcggaaag tcgcggacgc ggttccagat gttgcgcagc       8880

ggcaaaaagt gctccatggt cgggacgctc tggccggtca ggcgcgcgca atcgttgacg       8940

ctctaccgtg caaaaggaga gcctgtaagc gggcactctt ccgtggtctg gtggataaat       9000

tcgcaagggt atcatggcgg acgaccgggg ttcgagcccc gtatccggcc gtccgccgtg       9060

atccatgcgg ttaccgcccg cgtgtcgaac ccaggtgtgc gacgtcagac aacgggggag      9120

tgctcctttt ggcttccttc caggcgcggc ggctgctgcg ctagcttttt tggccactgg      9180

ccgcgcgcag cgtaagcggt taggctggaa agcgaaagca ttaagtggct cgctccctgt      9240

agccggaggg ttattttcca agggttgagt cgcgggaccc ccggttcgag tctcggaccg      9300

gccggactgc ggcgaacggg ggtttgcctc cccgtcatgc aagaccccgc ttgcaaattc      9360

ctccggaaac agggacgagc cccttttttg cttttcccag atgcatccgg tgctgcggca      9420

gatgcgcccc cctcctcagc agcggcaaga gcaagagcag cggcagacat gcagggcacc      9480

ctcccctcct cctaccgcgt caggaggggc gacatccgcg gttgacgcgg cagcagatgg      9540

tgattacgaa cccccgcggc gccgggcccg gcactacctg gacttggagg agggcgaggg      9600

cctggcgcgg ctaggagcgc cctctcctga gcggtaccca agggtgcagc tgaagcgtga      9660

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cgaggagatg cgggatcgaa agttccacgc agggcgcgag ctgcggcatg gcctgaatcg      9780

cgagcggttg ctgcgcgagg aggactttga gcccgacgcg cgaaccggga ttagtcccgc      9840

gcgcgcacac gtggcggccg ccgacctggt aaccgcatac gagcagacgg tgaaccagga      9900

gattaacttt caaaaaagct ttaacaacca cgtgcgtacg cttgtggcgc gcgaggaggt       9960

ggctatagga ctgatgcatc tgtgggactt tgtaagcgcg ctggagcaaa acccaaatag       10020

caagccgctc atggcgcagc tgttccttat agtgcagcac agcagggaca acgaggcatt       10080

cagggatgcg ctgctaaaca tagtagagcc cgagggccgc tggctgctcg atttgataaa       10140

catcctgcag agcatagtgg tgcaggagcg cagcttgagc ctggctgaca aggtggccgc       10200

catcaactat tccatgctta gcctgggcaa gttttacgcc cgcaagatat accatacccc       10260

ttacgttccc atagacaagg aggtaaagat cgaggggttc tacatgcgca tggcgctgaa       10320

ggtgcttacc ttgagcgacg acctgggcgt ttatcgcaac gagcgcatcc acaaggccgt       10380

gagcgtgagc cggcggcgcg agctcagcga ccgcgagctg atgcacagcc tgcaaagggc       10440

cctggctggc acgggcagcg gcgatagaga ggccgagtcc tactttgacg cgggcgctga       10500

cctgcgctgg gccccaagcc gacgcgccct ggaggcagct ggggccggac ctgggctggc       10560

ggtggcaccc gcgcgcgctg gcaacgtcgg cggcgtggag gaatatgacg aggacgatga       10620

gtacgagcca gaggacggcg agtactaagc ggtgatgttt ctgatcagat gatgcaagac       10680

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gacgactggc gccaggtcat ggaccgcatc atgtcgctga ctgcgcgcaa tcctgacgcg      10800

ttccggcagc agccgcaggc caaccggctc tccgcaattc tggaagcggt ggtcccggcg      10860

cgcgcaaacc ccacgcacga gaaggtgctg gcgatcgtaa acgcgctggc cgaaaacagg      10920

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tacaacagcg gcaacgtgca gaccaacctg gaccggctgg tgggggatgt gcgcgaggcc      11040

gtggcgcagc gtgagcgcgc gcagcagcag ggcaacctgg gctccatggt tgcactaaac      11100

gccttcctga gtacacagcc cgccaacgtg ccgcggggac aggaggacta caccaacttt      11160

gtgagcgcac tgcggctaat ggtgactgag acaccgcaaa gtgaggtgta ccagtctggg      11220

ccagactatt ttttccagac cagtagacaa ggcctgcaga ccgtaaacct gagccaggct      11280

ttcaaaaact tgcaggggct gtggggggtg cgggctccca caggcgaccg cgcgaccgtg      11340

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agtggcagcg tgtcccggga cacataccta ggtcacttgc tgacactgta ccgcgaggcc      11460

ataggtcagg cgcatgtgga cgagcatact ttccaggaga ttacaagtgt cagccgcgcg      11520

ctggggcagg aggacacggg cagcctggag gcaaccctaa actacctgct gaccaaccgg      11580

cggcagaaga tcccctcgtt gcacagttta aacagcgagg aggagcgcat tttgcgctac      11640

gtgcagcaga gcgtgagcct taacctgatg cgcgacgggg taacgcccag cgtggcgctg      11700

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cgcctaatgg actacttgca tcgcgcggcc gccgtgaacc ccgagtattt caccaatgcc      11820

atcttgaacc cgcactggct accgccccct ggtttctaca ccgggggatt cgaggtgccc      11880

gagggtaacg atggattcct ctgggacgac atagacgaca gcgtgttttc cccgcaaccg      11940

cagaccctgc tagagttgca acagcgcgag caggcagagg cggcgctgcg aaaggaaagc      12000

ttccgcaggc caagcagctt gtccgatcta ggcgctgcgg ccccgcggtc agatgctagt      12060

agcccatttc caagcttgat agggtctctt accagcactc gcaccacccg cccgcgcctg      12120

ctgggcgagg aggagtacct aaacaactcg ctgctgcagc cgcagcgcga aaaaaacctg      12180

cctccggcat ttcccaacaa cgggatagag agcctagtgg acaagatgag tagatggaag      12240

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cacgaccgtc agcggggtct ggtgtgggag gacgatgact cggcagacga cagcagcgtc      12360

ctggatttgg gagggagtgg caacccgttt gcgcaccttc gccccaggct ggggagaatg      12420

ttttaaaaaa aaaaaagcat gatgcaaaat aaaaaactca ccaaggccat ggcaccgagc      12480

gttggttttc ttgtattccc cttagtatgc ggcgcgcggc gatgtatgag gaaggtcctc      12540

ctccctccta cgagagtgtg gtgagcgcgg cgccagtggc ggcggcgctg ggttctccct      12600

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tgaccacggt cattcaaaac aatgactaca gcccggggga ggcaagcaca cagaccatca      12840

atcttgacga ccggtcgcac tggggcggcg acctgaaaac catcctgcat accaacatgc      12900

caaatgtgaa cgagttcatg tttaccaata agtttaaggc gcgggtgatg gtgtcgcgct      12960

tgcctactaa ggacaatcag gtggagctga aatacgagtg ggtggagttc acgctgcccg      13020

agggcaacta ctccgagacc atgaccatag accttatgaa caacgcgatc gtggagcact      13080

acttgaaagt gggcagacag aacggggttc tggaaagcga catcggggta aagtttgaca      13140

cccgcaactt cagactgggg tttgaccccg tcactggtct tgtcatgcct ggggtatata     13200

caaacgaagc cttccatcca gacatcattt tgctgccagg atgcggggtg gacttcaccc     13260

acagccgcct gagcaacttg ttgggcatcc gcaagcggca acccttccag gagggcttta     13320

ggatcaccta cgatgatctg gagggtggta acattcccgc actgttggat gtggacgcct     13380

accaggcgag cttgaaagat gacaccgaac agggcggggg tggcgcaggc ggcagcaaca     13440

gcagtggcag cggcgcggaa gagaactcca acgcggcagc cgcggcaatg cagccggtgg     13500

aggacatgaa cgatcatgcc attcgcggcg acacctttgc cacacgggct gaggagaagc     13560

gcgctgaggc cgaagcagcg gccgaagctg ccgcccccgc tgcgcaaccc gaggtcgaga     13620

agcctcagaa gaaaccggtg atcaaacccc tgacagagga cagcaagaaa cgcagttaca     13680

acctaataag caatgacagc accttcaccc agtaccgcag ctggtacctt gcatacaact     13740

acggcgaccc tcagaccgga atccgctcat ggaccctgct ttgcactcct gacgtaacct     13800

gcggctcgga gcaggtctac tggtcgttgc cagacatgat gcaagacccc gtgaccttcc     13860

gctccacgcg ccagatcagc aactttccgg tggtgggcgc cgagctgttg cccgtgcact     13920

ccaagagctt ctacaacgac caggccgtct actcccaact catccgccag tttacctctc     13980

tgacccacgt gttcaatcgc tttcccgaga accagatttt ggcgcgcccg ccagccccca     14040

ccatcaccac cgtcagtgaa aacgttcctg ctctcacaga tcacgggacg ctaccgctgc     14100

gcaacagcat cggaggagtc cagcgagtga ccattactga cgccagacgc cgcacctgcc     14160

cctacgttta caaggccctg ggcatagtct cgccgcgcgt cctatcgagc cgcacttttt     14220

gagcaagcat gtccatcctt atatcgccca gcaataacac aggctggggc ctgcgcttcc     14280

caagcaagat gtttggcggg gccaagaagc gctccgacca acacccagtg cgcgtgcgcg     14340

ggcactaccg cgcgccctgg ggcgcgcaca aacgcggccg cactgggcgc accaccgtcg     14400

atgacgccat cgacgcggtg gtggaggagg cgcgcaacta cacgcccacg ccgccaccag     14460

tgtccacagt ggacgcggcc attcagaccg tggtgcgcgg agcccggcgc tatgctaaaa     14520

tgaagagacg gcggaggcgc gtagcacgtc gccaccgccg ccgacccggc actgccgccc     14580

aacgcgcggc ggcggccctg cttaaccgcg cacgtcgcac cggccgacgg gcggccatgc     14640

gggccgctcg aaggctggcc gcgggtattg tcactgtgcc ccccaggtcc aggcgacgag     14700

cggccgccgc agcagccgcg gccattagtg ctatgactca gggtcgcagg ggcaacgtgt     14760

attgggtgcg cgactcggtt agcggcctgc gcgtgcccgt gcgcacccgc cccccgcgca     14820

actagattgc aagaaaaaac tacttagact cgtactgttg tatgtatcca gcggcggcgg     14880

cgcgcaacga agctatgtcc aagcgcaaaa tcaaagaaga gatgctccag gtcatcgcgc     14940

cggagatcta tggccccccg aagaaggaag agcaggatta caagccccga aagctaaagc     15000

gggtcaaaaa gaaaaagaaa gatgatgatg atgaacttga cgacgaggtg gaactgctgc     15060

acgctaccgc gcccaggcga cgggtacagt ggaaaggtcg acgcgtaaaa cgtgttttgc     15120

gacccggcac caccgtagtc tttacgcccg gtgagcgctc cacccgcacc tacaagcgcg     15180

tgtatgatga ggtgtacggc gacgaggacc tgcttgagca ggccaacgag cgcctcgggg     15240

agtttgccta cggaaagcgg cataaggaca tgctggcgtt gccgctggac gagggcaacc     15300

caacacctag cctaaagccc gtaacactgc agcaggtgct gcccgcgctt gcaccgtccg     15360

aagaaaagcg cggcctaaag cgcgagtctg gtgacttggc acccaccgtg cagctgatgg     15420

tacccaagcg ccagcgactg gaagatgtct tggaaaaaat gaccgtggaa cctgggctgg     15480

agcccgaggt ccgcgtgcgg ccaatcaagc aggtggcgcc gggactgggc gtgcagaccg     15540

tggacgttca gatacccact accagtagca ccagtattgc caccgccaca gagggcatgg     15600

agacacaaac gtccccggtt gcctcagcgg tggcggatgc cgcggtgcag gcggtcgctg     15660

cggccgcgtc caagacctct acggaggtgc aaacggaccc gtggatgttt cgcgtttcag     15720

ccccccggcg cccgcgcggt tcgaggaagt acggcgccgc cagcgcgcta ctgcccgaat     15780

atgccctaca tccttccatt gcgcctaccc ccggctatcg tggctacacc taccgcccca     15840

gaagacgagc aactacccga cgccgaacca ccactggaac ccgccgccgc cgtcgccgtc     15900

gccagcccgt gctggccccg atttccgtgc gcagggtggc tcgcgaagga ggcaggaccc     15960

tggtgctgcc aacagcgcgc taccacccca gcatcgttta aaagccggtc tttgtggttc     16020

ttgcagatat ggccctcacc tgccgcctcc gtttcccggt gccgggattc cgaggaagaa     16080

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agagacactg attaaaaaca agttgcatgt ggaaaaatca aaataaaaag tctggactct     16320

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gccccgcgac acggctcgcg cccgttcatg ggaaactggc aagatatcgg caccagcaat     16440

atgagcggtg gcgccttcag ctggggctcg ctgtggagcg gcattaaaaa tttcggttcc     16500

accgttaaga actatggcag caaggcctgg aacagcagca caggccagat gctgagggat     16560

aagttgaaag agcaaaattt ccaacaaaag gtggtagatg gcctggcctc tggcattagc     16620

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accggagtgc tgggccagca cacacccgta acgctggacc tgcctccccc cgccgacacc     16920

cagcagaaac ctgtgctgcc aggcccgacc gccgttgttg taacccgtcc tagccgcgcg     16980

tccctgcgcc gcgccgccag cggtccgcga tcgttgcggc ccgtagccag tggcaactgg     17040

caaagcacac tgaacagcat cgtgggtctg ggggtgcaat ccctgaagcg ccgacgatgc     17100

ttctgaatag ctaacgtgtc gtatgtgtgt catgtatgcg tccatgtcgc cgccagagga     17160

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ggtcttacat gcacatctcg ggccaggacg cctcggagta cctgagcccc gggctggtgc     17280

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gtcaaacacc taaatatgcc gataaaacat ttcaacctga acctcaaata ggagaatctc     17820

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gggacaattt tattggtcta atgtattaca acagcacggg taatatgggt gttctggcgg     18240

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accagctttt gcttgattcc attggtgata gaaccaggta cttttctatg tggaatcagg     18360

ctgttgacag ctatgatcca gatgttagaa ttattgaaaa tcatggaact gaagatgaac     18420

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ctcccgggtt agtggactgc tacattaacc ttggagcacg ctggtccctt gactatatgg     18780

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tgggcaatgg tcgctatgtg cccttccaca tccaggtgcc tcagaagttc tttgccatta     18900

aaaacctcct tctcctgccg ggctcataca cctacgagtg gaacttcagg aaggatgtta     18960

acatggttct gcagagctcc ctaggaaatg acctaagggt tgacggagcc agcattaagt     19020

ttgatagcat ttgcctttac gccaccttct tccccatggc ccacaacacc gcctccacgc     19080

ttgaggccat gcttagaaac gacaccaacg accagtcctt taacgactat ctctccgccg     19140

ccaacatgct ctaccctata cccgccaacg ctaccaacgt gcccatatcc atcccctccc     19200

gcaactgggc ggctttccgc ggctgggcct tcacgcgcct taagactaag gaaaccccat     19260

cactgggctc gggctacgac ccttattaca cctactctgg ctctataccc tacctagatg     19320

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gctggcctgg caatgaccgc ctgcttaccc ccaacgagtt tgaaattaag cgctcagttg     19440

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gctggaaaag tccacccaaa gcgtacaggg gcccaactcg gccgcctgtg gactattctg     20460

ctgcatgttt ctccacgcct ttgccaactg gccccaaact cccatggatc acaaccccac     20520

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ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct     32580

tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt     32640

aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc     32700

tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg     32760

gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag     32820

atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt     32880

tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag     32940

ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctgcagccat gagattatca aaaaggatct     33000

tcacctagat ccttttcacg tagaaagcca gtccgcagaa acggtgctga ccccggatga     33060

atgtcagcta ctgggctatc tggacaaggg aaaacgcaag cgcaaagaga aagcaggtag     33120

cttgcagtgg gcttacatgg cgatagctag actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac     33180

cggaattgcc agctggggcg ccctctggta aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga     33240

tggctttctc gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc aagctctgat caagagacag     33300

gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt     33360

gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg     33420

ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg     33480

gtgccctgaa tgaactgcaa gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg     33540

ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg     33600

gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca     33660

tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc     33720

accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc     33780

aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca     33840

aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga     33900

atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg     33960

cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg     34020

aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg     34080

ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gaattttgtt aaaatttttg ttaaatcagc     34140

tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aacatccctt ataaatcaaa agaatagacc     34200

gcgatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac     34260

tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca     34320

cccaaatcaa gttttttgcg gtcgaggtgc cgtaaagctc taaatcggaa ccctaaaggg     34380

agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag     34440

aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc     34500

accacacccg cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc cattcgccat tcaggatcga     34560

attaattctt aat                                                       34573

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Adeno-F引物

<400>2

ggtctatata agcagagctg                                                20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Adeno-R引物

<400>3

gtatggctga ttatgatcag                                               20

<210>4

<211>4752

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pAd-左侧

<220>

<221>misc_特征

<222>(1227)..(2087)

<223>R Amp

<220>

<221>启动子

<222>(400)..(930)

<223>F CMV启动子

<220>

<221>rep_起点

<222>(2235)..(2902)

<223>R pBR322 Ori

<220>

<221>misc_特征

<222>(197)..(345)

<223>F Ad5 psi

<220>

<221>misc_特征

<222>(4)..(106)

<223>F LITR

<220>

<221>misc_特征

<222>(949)..(1073)

<223>F attR1

<400>4

taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg     60

agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag     120

tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt     180

ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg     240

tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga     300

ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatactgta atagtaatca     360

attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta     420

aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat     480

gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg     540

taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac     600

gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt     660

cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg     720

cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc     780

attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt     840

aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata     900

agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccac aagtttgtac     960

aaaaaagctg aacgagaaac gtaaaatgat ataaatatca atatattaaa ttagattttg     1020

cataaaaaac agactacata atactgtaaa acacaacata tccagtcact atggcggccg     1080

catttaaata tcgatcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt     1140

tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc     1200

ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc     1260

ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa     1320

aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg     1380

gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag     1440

ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc     1500

gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta     1560

cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg     1620

cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca     1680

acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac     1740

caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat     1800

taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg     1860

ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata     1920

aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta     1980

agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa     2040

atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag     2100

tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg     2160

tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact     2220

gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg     2280

taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc     2340

aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata     2400

ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta     2460

catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc     2520

ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg     2580

ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac     2640

agcgtgagca ttgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg     2700

taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt     2760

atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct     2820

cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg     2880

ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata     2940

accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca     3000

gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc     3060

tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat     3120

agttaagcca gtatacactc cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg cgccccgaca     3180

cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag     3240

acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa     3300

acgcgcgagg cagctgcggt aaagctcatc agcgtggtcg tgaagcgatt cacagatgtc     3360

tgcctgttca tccgcgtcca gctcgttgag tttctccaga agcgttaatg tctggcttct     3420

gataaagcgg gccatgttaa gggcggtttt ttcctgtttg gtcacttgat gcctccgtgt     3480

aagggggaat ttctgttcat gggggtaatg ataccgatga aacgagagag gatgctcacg     3540

atacgggtta ctgatgatga acatgcccgg ttactggaac gttgtgaggg taaacaactg     3600

gcggtatgga tgcggcggga ccagagaaaa atcactcagg gtcaatgcca gcgcttcgtt     3660

aatacagatg taggtgttcc acagggtagc cagcagcatc ctgcgatgca gatccggaac     3720

ataatggtgc agggcgctga cttccgcgtt tccagacttt acgaaacacg gaaaccgaag     3780

accattcatg ttgttgctca ggtcgcagac gttttgcagc agcagtcgct tcacgttcgc     3840

tcgcgtatcg gtgattcatt ctgctaacca gtaaggcaac cccgccagcc tagccgggtc     3900

ctcaacgaca ggagcacgat catgcgcacc cgtggccagg acccaacgct gcccgagatg     3960

cgccgcgtgc ggctgctgga gatggcggac gcgatggata tgttctgcca agggttggtt     4020

tgcgcattca cagttctccg caagaattga ttggctccaa ttcttggagt ggtgaatccg     4080

ttagcgaggt gccgccggct tccattcagg tcgaggtggc ccggctccat gcaccgcgac     4140

gcaacgcggg gaggcagaca aggtataggg cggcgcctac aatccatgcc aacccgttcc     4200

atgtgctcgc cgaggcggca taaatcgccg tgacgatcag cggtccagtg atcgaagtta     4260

ggctggtaag agccgcgagc gatccttgaa gctgtccctg atggtcgtca tctacctgcc     4320

tggacagcat ggcctgcaac gcgggcatcc cgatgccgcc ggaagcgaga agaatcataa     4380

tggggaaggc catccagcct cgcgtcgcga acgccagcaa gacgtagccc agcgcgtcgg     4440

ccgccatgcc ggcgataatg gcctgcttct cgccgaaacg tttggtggcg ggaccagtga     4500

cgaaggcttg agcgagggcg tgcaagattc cgaataccgc aagcgacagg ccgatcatcg     4560

tcgcgctcca gcgaaagcgg tcctcgccga aaatgaccca gagcgctgcc ggcacctgtc     4620

ctacgagttg catgataaag aagacagtca taagtgcggc gacgatagtc atgccccgcg     4680

cccaccggaa ggagctgact gggttgaagg ctctcaaggg catcgtcgag acgaggatcc     4740

atgcatgtta at                                                        4752

<210>5

<211>33855

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pAd-右侧

<220>

<221>来源

<222>(1)..(3657)

<223>F pAd-Easy1

<220>

<221>misc_特征

<222>(2666)..(3526)

<223>F Amp

<220>

<221>rep_起点

<222>(1851)..(2518)

<223>F pBR322 0ri

<220>

<221>misc_特征

<222>(33750)..(33852)

<223>F RITR

<220>

<22t>polyA_位点

<222>(3961)..(4082)

<223>F SV40 polyA

<220>

<221>misc_特征

<222>(3678)..(3802)

<223>R attR2

<400>5

attaacatgc atggatcctc gtctcgacga tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct     60

ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc ttctttatca     120

tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc tctgggtcat tttcggcgag gaccgctttc     180

gctggagcgc gacgatgatc ggcctgtcgc ttgcggtatt cggaatcttg cacgccctcg     240

ctcaagcctt cgtcactggt cccgccacca aacgtttcgg cgagaagcag gccattatcg     300

ccggcatggc ggccgacgcg ctgggctacg tcttgctggc gttcgcgacg cgaggctgga     360

tggccttccc cattatgatt cttctcgctt ccggcggcat cgggatgccc gcgttgcagg     420

ccatgctgtc caggcaggta gatgacgacc atcagggaca gcttcaagga tcgctcgcgg     480

ctcttaccag cctaacttcg atcactggac cgctgatcgt cacggcgatt tatgccgcct     540

cggcgagcac atggaacggg ttggcatgga ttgtaggcgc cgccctatac cttgtctgcc     600

tccccgcgtt gcgtcgcggt gcatggagcc gggccacctc gacctgaatg gaagccggcg     660

gcacctcgct aacggattca ccactccaag aattggagcc aatcaattct tgcggagaac     720

tgtgaatgcg caaaccaacc cttggcagaa catatccatc gcgtccgcca tctccagcag     780

ccgcacgcgg cgcatctcgg gcagcgttgg gtcctggcca cgggtgcgca tgatcgtgct     840

cctgtcgttg aggacccggc taggctggcg gggttgcctt actggttagc agaatgaatc     900

accgatacgc gagcgaacgt gaagcgactg ctgctgcaaa acgtctgcga cctgagcaac     960

aacatgaatg gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg gaaacgcgga agtcagcgcc     1020

ctgcaccatt atgttccgga tctgcatcgc aggatgctgc tggctaccct gtggaacacc     1080

tacatctgta ttaacgaagc gctggcattg accctgagtg atttttctct ggtcccgccg     1140

catccatacc gccagttgtt taccctcaca acgttccagt aaccgggcat gttcatcatc     1200

agtaacccgt atcgtgagca tcctctctcg tttcatcggt atcattaccc ccatgaacag     1260

aaattccccc ttacacggag gcatcaagtg accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg     1320

gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg cttctggaga aactcaacga gctggacgcg     1380

gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc     1440

tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg     1500

gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg     1560

ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat     1620

actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg     1680

aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc     1740

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg     1800

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag     1860

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc     1920

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag     1980

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga     2040

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc     2100

aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg     2160

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt     2220

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca     2280

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca     2340

ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag     2400

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca     2460

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg     2520

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa     2580

aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta     2640

tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag     2700

cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga     2760

tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac     2820

cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc     2880

ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta     2940

gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tgcaggcatc gtggtgtcac     3000

gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat     3060

gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa     3120

gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg     3180

tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag     3240

aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc     3300

cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct     3360

caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat     3420

cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg     3480

ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc     3540

aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta     3600

tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgatc     3660

gatatttaaa tgtcgaccat agtgactgga tatgttgtgt tttacagtat tatgtagtct     3720

gttttttatg caaaatctaa tttaatatat tgatatttat atcattttac gtttctcgtt     3780

cagctttctt gtacaaagtg gtctcgagcc taagcttcta gataagatat ccgatccacc     3840

ggatctagat aactgatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta     3900

aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt     3960

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca     4020

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct     4080

taacgcggat ctgggcgtgg ttaagggtgg gaaagaatat ataaggtggg ggtcttatgt     4140

agttttgtat ctgttttgca gcagccgccg ccgccatgag caccaactcg tttgatggaa     4200

gcattgtgag ctcatatttg acaacgcgca tgcccccatg ggccggggtg cgtcagaatg     4260

tgatgggctc cagcattgat ggtcgccccg tcctgcccgc aaactctact accttgacct     4320

acgagaccgt gtctggaacg ccgttggaga ctgcagcctc cgccgccgct tcagccgctg     4380

cagccaccgc ccgcgggatt gtgactgact ttgctttcct gagcccgctt gcaagcagtg     4440

cagcttcccg ttcatccgcc cgcgatgaca agttgacggc tcttttggca caattggatt     4500

ctttgacccg ggaacttaat gtcgtttctc agcagctgtt ggatctgcgc cagcaggttt     4560

ctgccctgaa ggcttcctcc cctcccaatg cggtttaaaa cataaataaa aaaccagact     4620

ctgtttggat ttggatcaag caagtgtctt gctgtcttta tttaggggtt ttgcgcgcgc     4680

ggtaggcccg ggaccagcgg tctcggtcgt tgagggtcct gtgtattttt tccaggacgt     4740

ggtaaaggtg actctggatg ttcagataca tgggcataag cccgtctctg gggtggaggt     4800

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agcgctgggc gtggtgccta aaaatgtctt tcagtagcaa gctgattgcc aggggcaggc     4920

ccttggtgta agtgtttaca aagcggttaa gctgggatgg gtgcatacgt ggggatatga     4980

gatgcatctt ggactgtatt tttaggttgg ctatgttccc agccatatcc ctccggggat     5040

tcatgttgtg cagaaccacc agcacagtgt atccggtgca cttgggaaat ttgtcatgta     5100

gcttagaagg aaatgcgtgg aagaacttgg agacgccctt gtgacctcca agattttcca     5160

tgcattcgtc cataatgatg gcaatgggcc cacgggcggc ggcctgggcg aagatatttc     5220

tgggatcact aacgtcatag ttgtgttcca ggatgagatc gtcataggcc atttttacaa     5280

agcgcgggcg gagggtgcca gactgcggta taatggttcc atccggccca ggggcgtagt     5340

taccctcaca gatttgcatt tcccacgctt tgagttcaga tggggggatc atgtctacct     5400

gcggggcgat gaagaaaacg gtttccgggg taggggagat cagctgggaa gaaagcaggt     5460

tcctgagcag ctgcgactta ccgcagccgg tgggcccgta aatcacacct attaccgggt     5520

gcaactggta gttaagagag ctgcagctgc cgtcatccct gagcaggggg gccacttcgt     5580

taagcatgtc cctgactcgc atgttttccc tgaccaaatc cgccagaagg cgctcgccgc     5640

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gctctacggc atctcgatcc agcatatctc ctcgtttcgc gggttggggc ggctttcgct     5820

gtacggcagt agtcggtgct cgtccagacg ggccagggtc atgtctttcc acgggcgcag     5880

ggtcctcgtc agcgtagtct gggtcacggt gaaggggtgc gctccgggct gcgcgctggc     5940

cagggtgcgc ttgaggctgg tcctgctggt gctgaagcgc tgccggtctt cgccctgcgc     6000

gtcggccagg tagcatttga ccatggtgtc atagtccagc ccctccgcgg cgtggccctt     6060

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gtagagcttg ggcgcgagaa ataccgattc cggggagtag gcatccgcgc cgcaggcccc     6180

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gtttccccca tgctttttga tgcgtttctt acctctggtt tccatgagcc ggtgtccacg     6300

ctcggtgacg aaaaggctgt ccgtgtcccc gtatacagac ttgagaggcc tgtcctcgag     6360

cggtgttccg cggtcctcct cgtatagaaa ctcggaccac tctgagacaa aggctcgcgt     6420

ccaggccagc acgaaggagg ctaagtggga ggggtagcgg tcgttgtcca ctagggggtc     6480

cactcgctcc agggtgtgaa gacacatgtc gccctcttcg gcatcaagga aggtgattgg     6540

tttgtaggtg taggccacgt gaccgggtgt tcctgaaggg gggctataaa agggggtggg     6600

ggcgcgttcg tcctcactct cttccgcatc gctgtctgcg agggccagct gttggggtga     6660

gtactccctc tgaaaagcgg gcatgacttc tgcgctaaga ttgtcagttt ccaaaaacga     6720

ggaggatttg atattcacct ggcccgcggt gatgcctttg agggtggccg catccatctg     6780

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ccatggcatg gggtgggtga gcgcggaggc gtacatgccg caaatgtcgt aaacgtagag     7320

gggctctctg agtattccaa gatatgtagg gtagcatctt ccaccgcgga tgctggcgcg     7380

cacgtaatcg tatagttcgt gcgagggagc gaggaggtcg ggaccgaggt tgctacgggc     7440

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aggcaatttt ttaagttcct cgtaggtgag ctcttcaggg gagctgagcc cgtgctctga     8220

aagggcccag tctgcaagat gagggttgga agcgacgaat gagctccaca ggtcacgggc     8280

cattagcatt tgcaggtggt cgcgaaaggt cctaaactgg cgacctatgg ccattttttc     8340

tggggtgatg cagtagaagg taagcgggtc ttgttcccag cggtcccatc caaggttcgc     8400

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gaagggcacg agctgcttcc caaaggcccc catccaagta taggtctcta catcgtaggt     8520

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ccaattggag gagtggctat tgatgtggtg aaagtagaag tccctgcgac gggccgaaca     8640

ctcgtgctgg cttttgtaaa aacgtgcgca gtactggcag cggtgcacgg gctgtacatc     8700

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ctcgagggga gttacggtgg atcggaccac cacgccgcgc gagcccaaag tccagatgtc     8880

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ggcaggagct ggtgctgcgc gcgtaggttg ctggcgaacg cgacgacgcg gcggttgatc     9300

tcctgaatct ggcgcctctg cgtgaagacg acgggcccgg tgagcttgag cctgaaagag     9360

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tctcctgagt tgtcttgata ggcgatctcg gccatgaact gctcgatctc ttcctcctgg     9480

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aggcgctcca tggcctcgta gaagtccacg gcgaagttga aaaactggga gttgcgcgcc     9840

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cgctcaaagg ctacaggggc ctcttcttct tcttcaatct cctcttccat aagggcctcc     9960

ccttcttctt cttctggcgg cggtggggga ggggggacac ggcggcgacg acggcgcacc     10020

gggaggcggt cgacaaagcg ctcgatcatc tccccgcggc gacggcgcat ggtctcggtg     10080

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tgggttggcg gggggctgcc atgcggcagg gatacggcgc taacgatgca tctcaacaat     10200

tgttgtgtag gtactccgcc gccgagggac ctgagcgagt ccgcatcgac cggatcggaa     10260

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gcatctcttg catctatcgc tgcggcggcg gcggagtttg gccgtaggtg gcgccctctt     10620

cctcccatgc gtgtgacccc gaagcccctc atcggctgaa gcagggctag gtcggcgaca     10680

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tcttccaaca taaggcgatg atatccgtag atgtacctgg acatccaggt gatgccggcg     11040

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cccccctcct cagcagcggc aagagcaaga gcagcggcag acatgcaggg caccctcccc     11700

tcctcctacc gcgtcaggag gggcgacatc cgcggttgac gcggcagcag atggtgatta     11760

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tgaggcgtac gtgccgcggc agaacctgtt tcgcgaccgc gagggagagg agcccgagga     11940

gatgcgggat cgaaagttcc acgcagggcg cgagctgcgg catggcctga atcgcgagcg     12000

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acacgtggcg gccgccgacc tggtaaccgc atacgagcag acggtgaacc aggagattaa     12120

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gctcatggcg cagctgttcc ttatagtgca gcacagcagg gacaacgagg cattcaggga     12300

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tggcacgggc agcggcgata gagaggccga gtcctacttt gacgcgggcg ctgacctgcg     12720

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gccagaggac ggcgagtact aagcggtgat gtttctgatc agatgatgca agacgcaacg     12900

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tggcgccagg tcatggaccg catcatgtcg ctgactgcgc gcaatcctga cgcgttccgg     13020

cagcagccgc aggccaaccg gctctccgca attctggaag cggtggtccc ggcgcgcgca     13080

aaccccacgc acgagaaggt gctggcgatc gtaaacgcgc tggccgaaaa cagggccatc     13140

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agcggcaacg tgcagaccaa cctggaccgg ctggtggggg atgtgcgcga ggccgtggcg     13260

cagcgtgagc gcgcgcagca gcagggcaac ctgggctcca tggttgcact aaacgccttc     13320

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caggcgcatg tggacgagca tactttccag gagattacaa gtgtcagccg cgcgctgggg     13740

caggaggaca cgggcagcct ggaggcaacc ctaaactacc tgctgaccaa ccggcggcag     13800

aagatcccct cgttgcacag tttaaacagc gaggaggagc gcattttgcg ctacgtgcag     13860

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aacgatggat tcctctggga cgacatagac gacagcgtgt tttccccgca accgcagacc     14160

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ttgggaggga gtggcaaccc gtttgcgcac cttcgcccca ggctggggag aatgttttaa     14640

aaaaaaaaaa gcatgatgca aaataaaaaa ctcaccaagg ccatggcacc gagcgttggt     14700

tttcttgtat tccccttagt atgcggcgcg cggcgatgta tgaggaaggt cctcctccct     14760

cctacgagag tgtggtgagc gcggcgccag tggcggcggc gctgggttct cccttcgatg     14820

ctcccctgga cccgccgttt gtgcctccgc ggtacctgcg gcctaccggg gggagaaaca     14880

gcatccgtta ctctgagttg gcacccctat tcgacaccac ccgtgtgtac ctggtggaca     14940

acaagtcaac ggatgtggca tccctgaact accagaacga ccacagcaac tttctgacca     15000

cggtcattca aaacaatgac tacagcccgg gggaggcaag cacacagacc atcaatcttg     15060

acgaccggtc gcactggggc ggcgacctga aaaccatcct gcataccaac atgccaaatg     15120

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cctacgatga tctggagggt ggtaacattc ccgcactgtt ggatgtggac gcctaccagg     15600

cgagcttgaa agatgacacc gaacagggcg ggggtggcgc aggcggcagc aacagcagtg     15660

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aggccgaagc agcggccgaa gctgccgccc ccgctgcgca acccgaggtc gagaagcctc     15840

agaagaaacc ggtgatcaaa cccctgacag aggacagcaa gaaacgcagt tacaacctaa     15900

taagcaatga cagcaccttc acccagtacc gcagctggta ccttgcatac aactacggcg     15960

accctcagac cggaatccgc tcatggaccc tgctttgcac tcctgacgta acctgcggct     16020

cggagcaggt ctactggtcg ttgccagaca tgatgcaaga ccccgtgacc ttccgctcca     16080

cgcgccagat cagcaacttt ccggtggtgg gcgccgagct gttgcccgtg cactccaaga     16140

gcttctacaa cgaccaggcc gtctactccc aactcatccg ccagtttacc tctctgaccc     16200

acgtgttcaa tcgctttccc gagaaccaga ttttggcgcg cccgccagcc cccaccatca     16260

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gcatcggagg agtccagcga gtgaccatta ctgacgccag acgccgcacc tgcccctacg     16380

tttacaaggc cctgggcata gtctcgccgc gcgtcctatc gagccgcact ttttgagcaa     16440

gcatgtccat ccttatatcg cccagcaata acacaggctg gggcctgcgc ttcccaagca     16500

agatgtttgg cggggccaag aagcgctccg accaacaccc agtgcgcgtg cgcgggcact     16560

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cagtggacgc ggccattcag accgtggtgc gcggagcccg gcgctatgct aaaatgaaga     16740

gacggcggag gcgcgtagca cgtcgccacc gccgccgacc cggcactgcc gcccaacgcg     16800

cggcggcggc cctgcttaac cgcgcacgtc gcaccggccg acgggcggcc atgcgggccg     16860

ctcgaaggct ggccgcgggt attgtcactg tgccccccag gtccaggcga cgagcggccg     16920

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tgcgcgactc ggttagcggc ctgcgcgtgc ccgtgcgcac ccgccccccg cgcaactaga     17040

ttgcaagaaa aaactactta gactcgtact gttgtatgta tccagcggcg gcggcgcgca     17100

acgaagctat gtccaagcgc aaaatcaaag aagagatgct ccaggtcatc gcgccggaga     17160

tctatggccc cccgaagaag gaagagcagg attacaagcc ccgaaagcta aagcgggtca     17220

aaaagaaaaa gaaagatgat gatgatgaac ttgacgacga ggtggaactg ctgcacgcta     17280

ccgcgcccag gcgacgggta cagtggaaag gtcgacgcgt aaaacgtgtt ttgcgacccg     17340

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atgaggtgta cggcgacgag gacctgcttg agcaggccaa cgagcgcctc ggggagtttg     17460

cctacggaaa gcggcataag gacatgctgg cgttgccgct ggacgagggc aacccaacac     17520

ctagcctaaa gcccgtaaca ctgcagcagg tgctgcccgc gcttgcaccg tccgaagaaa     17580

agcgcggcct aaagcgcgag tctggtgact tggcacccac cgtgcagctg atggtaccca     17640

agcgccagcg actggaagat gtcttggaaa aaatgaccgt ggaacctggg ctggagcccg     17700

aggtccgcgt gcggccaatc aagcaggtgg cgccgggact gggcgtgcag accgtggacg     17760

ttcagatacc cactaccagt agcaccagta ttgccaccgc cacagagggc atggagacac     17820

aaacgtcccc ggttgcctca gcggtggcgg atgccgcggt gcaggcggtc gctgcggccg     17880

cgtccaagac ctctacggag gtgcaaacgg acccgtggat gtttcgcgtt tcagcccccc     17940

ggcgcccgcg cggttcgagg aagtacggcg ccgccagcgc gctactgccc gaatatgccc     18000

tacatccttc cattgcgcct acccccggct atcgtggcta cacctaccgc cccagaagac     18060

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ccgtgctggc cccgatttcc gtgcgcaggg tggctcgcga aggaggcagg accctggtgc     18180

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atatggccct cacctgccgc ctccgtttcc cggtgccggg attccgagga agaatgcacc     18300

gtaggagggg catggccggc cacggcctga cgggcggcat gcgtcgtgcg caccaccggc     18360

ggcggcgcgc gtcgcaccgt cgcatgcgcg gcggtatcct gcccctcctt attccactga     18420

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actgattaaa aacaagttgc atgtggaaaa atcaaaataa aaagtctgga ctctcacgct     18540

cgcttggtcc tgtaactatt ttgtagaatg gaagacatca actttgcgtc tctggccccg     18600

cgacacggct cgcgcccgtt catgggaaac tggcaagata tcggcaccag caatatgagc     18660

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aagaactatg gcagcaaggc ctggaacagc agcacaggcc agatgctgag ggataagttg     18780

aaagagcaaa atttccaaca aaaggtggta gatggcctgg cctctggcat tagcggggtg     18840

gtggacctgg ccaaccaggc agtgcaaaat aagattaaca gtaagcttga tccccgccct     18900

cccgtagagg agcctccacc ggccgtggag acagtgtctc cagaggggcg tggcgaaaag     18960

cgtccgcgcc ccgacaggga agaaactctg gtgacgcaaa tagacgagcc tccctcgtac     19020

gaggaggcac taaagcaagg cctgcccacc acccgtccca tcgcgcccat ggctaccgga     19080

gtgctgggcc agcacacacc cgtaacgctg gacctgcctc cccccgccga cacccagcag     19140

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cgccgcgccg ccagcggtcc gcgatcgttg cggcccgtag ccagtggcaa ctggcaaagc     19260

acactgaaca gcatcgtggg tctgggggtg caatccctga agcgccgacg atgcttctga     19320

atagctaacg tgtcgtatgt gtgtcatgta tgcgtccatg tcgccgccag aggagctgct     19380

gagccgccgc gcgcccgctt tccaagatgg ctaccccttc gatgatgccg cagtggtctt     19440

acatgcacat ctcgggccag gacgcctcgg agtacctgag ccccgggctg gtgcagtttg     19500

cccgcgccac cgagacgtac ttcagcctga ataacaagtt tagaaacccc acggtggcgc     19560

ctacgcacga cgtgaccaca gaccggtccc agcgtttgac gctgcggttc atccctgtgg     19620

accgtgagga tactgcgtac tcgtacaagg cgcggttcac cctagctgtg ggtgataacc     19680

gtgtgctgga catggcttcc acgtactttg acatccgcgg cgtgctggac aggggcccta     19740

cttttaagcc ctactctggc actgcctaca acgccctggc tcccaagggt gccccaaatc     19800

cttgcgaatg ggatgaagct gctactgctc ttgaaataaa cctagaagaa gaggacgatg     19860

acaacgaaga cgaagtagac gagcaagctg agcagcaaaa aactcacgta tttgggcagg     19920

cgccttattc tggtataaat attacaaagg agggtattca aataggtgtc gaaggtcaaa     19980

cacctaaata tgccgataaa acatttcaac ctgaacctca aataggagaa tctcagtggt     20040

acgaaactga aattaatcat gcagctggga gagtccttaa aaagactacc ccaatgaaac     20100

catgttacgg ttcatatgca aaacccacaa atgaaaatgg agggcaaggc attcttgtaa     20160

agcaacaaaa tggaaagcta gaaagtcaag tggaaatgca atttttctca actactgagg     20220

cgaccgcagg caatggtgat aacttgactc ctaaagtggt attgtacagt gaagatgtag     20280

atatagaaac cccagacact catatttctt acatgcccac tattaaggaa ggtaactcac     20340

gagaactaat gggccaacaa tctatgccca acaggcctaa ttacattgct tttagggaca     20400

attttattgg tctaatgtat tacaacagca cgggtaatat gggtgttctg gcgggccaag     20460

catcgcagtt gaatgctgtt gtagatttgc aagacagaaa cacagagctt tcataccagc     20520

ttttgcttga ttccattggt gatagaacca ggtacttttc tatgtggaat caggctgttg     20580

acagctatga tccagatgtt agaattattg aaaatcatgg aactgaagat gaacttccaa     20640

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aaacaggtca ggaaaatgga tgggaaaaag atgctacaga attttcagat aaaaatgaaa     20760

taagagttgg aaataatttt gccatggaaa tcaatctaaa tgccaacctg tggagaaatt     20820

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ggttagtgga ctgctacatt aaccttggag cacgctggtc ccttgactat atggacaacg     21000

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atggtcgcta tgtgcccttc cacatccagg tgcctcagaa gttctttgcc attaaaaacc     21120

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tttacctcaa ccacaccttt aagaaggtgg ccattacctt tgactcttct gtcagctggc     21600

ctggcaatga ccgcctgctt acccccaacg agtttgaaat taagcgctca gttgacgggg     21660

agggttacaa cgttgcccag tgtaacatga ccaaagactg gttcctggta caaatgctag     21720

ctaactacaa cattggctac cagggcttct atatcccaga gagctacaag gaccgcatgt     21780

actccttctt tagaaacttc cagcccatga gccgtcaggt ggtggatgat actaaataca     21840

aggactacca acaggtgggc atcctacacc aacacaacaa ctctggattt gttggctacc     21900

ttgcccccac catgcgcgaa ggacaggcct accctgctaa cttcccctat ccgcttatag     21960

gcaagaccgc agttgacagc attacccaga aaaagtttct ttgcgatcgc accctttggc     22020

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cgagtcactc ctgcgccgta gcgccattgc ttcttccccc gaccgctgta taacgctgga     22620

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tcgcaaccag gaacagctct acagcttcct ggagcgccac tcgccctact tccgcagcca     22860

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tactagagac actttcaata aaggcaaatg cttttatttg tacactctcg ggtgattatt     22980

tacccccacc cttgccgtct gcgccgttta aaaatcaaag gggttctgcc gcgcatcgct     23040

atgcgccact ggcagggaca cgttgcgata ctggtgttta gtgctccact taaactcagg     23100

cacaaccatc cgcggcagct cggtgaagtt ttcactccac aggctgcgca ccatcaccaa     23160

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ggtcttgttg ctggtgaagg tcagctgcaa cccgcggtgc tcctcgttca gccaggtctt     23940

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ctcttcctct tcctcttgcg tccgcatacc acgcgccact gggtcgtctt cattcagccg     24180

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cgcagaggca aacgaggaac aagtcgggcg gggggacgaa aggcatggcg actacctaga     24900

tgtgggagac gacgtgctgt tgaagcatct gcagcgccag tgcgccatta tctgcgacgc     24960

gttgcaagag cgcagcgatg tgcccctcgc catagcggat gtcagccttg cctacgaacg     25020

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cccgcgcctc aacttctacc ccgtatttgc cgtgccagag gtgcttgcca cctatcacat     25140

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cataatggaa gacgtgagcg gtgacggtct actggagtgt cactgtcgct gcaacctatg     26340

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tacctttgag ctgcagggtc cctcgcctga cgaaaagtcc gcggctccgg ggttgaaact     26460

cactccgggg ctgtggacgt cggcttacct tcgcaaattt gtacctgagg actaccacgc     26520

ccacgagatt aggttctacg aagaccaatc ccgcccgcca aatgcggagc ttaccgcctg     26580

cgtcattacc cagggccaca ttcttggcca attgcaagcc atcaacaaag cccgccaaga     26640

gtttctgcta cgaaagggac ggggggttta cttggacccc cagtccggcg aggagctcaa     26700

cccaatcccc ccgccgccgc agccctatca gcagcagccg cgggcccttg cttcccagga     26760

tggcacccaa aaagaagctg cagctgccgc cgccacccac ggacgaggag gaatactggg     26820

acagtcaggc agaggaggtt ttggacgagg aggaggagga catgatggaa gactgggaga     26880

gcctagacga ggaagcttcc gaggtcgaag aggtgtcaga cgaaacaccg tcaccctcgg     26940

tcgcattccc ctcgccggcg ccccagaaat cggcaaccgg ttccagcatg gctacaacct     27000

ccgctcctca ggcgccgccg gcactgcccg ttcgccgacc caaccgtaga tgggacacca     27060

ctggaaccag ggccggtaag tccaagcagc cgccgccgtt agcccaagag caacaacagc     27120

gccaaggcta ccgctcatgg cgcgggcaca agaacgccat agttgcttgc ttgcaagact     27180

gtgggggcaa catctccttc gcccgccgct ttcttctcta ccatcacggc gtggccttcc     27240

cccgtaacat cctgcattac taccgtcatc tctacagccc atactgcacc ggcggcagcg     27300

gcagcggcag caacagcagc ggccacacag aagcaaaggc gaccggatag caagactctg     27360

acaaagccca agaaatccac agcggcggca gcagcaggag gaggagcgct gcgtctggcg     27420

cccaacgaac ccgtatcgac ccgcgagctt agaaacagga tttttcccac tctgtatgct     27480

atatttcaac agagcagggg ccaagaacaa gagctgaaaa taaaaaacag gtctctgcga     27540

tccctcaccc gcagctgcct gtatcacaaa agcgaagatc agcttcggcg cacgctggaa     27600

gacgcggagg ctctcttcag taaatactgc gcgctgactc ttaaggacta gtttcgcgcc     27660

ctttctcaaa tttaagcgcg aaaactacgt catctccagc ggccacaccc ggcgccagca     27720

cctgtcgtca gcgccattat gagcaaggaa attcccacgc cctacatgtg gagttaccag     27780

ccacaaatgg gacttgcggc tggagctgcc caagactact caacccgaat aaactacatg     27840

agcgcgggac cccacatgat atcccgggtc aacggaatcc gcgcccaccg aaaccgaatt     27900

ctcttggaac aggcggctat taccaccaca cctcgtaata accttaatcc ccgtagttgg     27960

cccgctgccc tggtgtacca ggaaagtccc gctcccacca ctgtggtact tcccagagac     28020

gcccaggccg aagttcagat gactaactca ggggcgcagc ttgcgggcgg ctttcgtcac     28080

agggtgcggt cgcccgggca gggtataact cacctgacaa tcagagggcg aggtattcag     28140

ctcaacgacg agtcggtgag ctcctcgctt ggtctccgtc cggacgggac atttcagatc     28200

ggcggcgccg gccgtccttc attcacgcct cgtcaggcaa tcctaactct gcagacctcg     28260

tcctctgagc cgcgctctgg aggcattgga actctgcaat ttattgagga gtttgtgcca     28320

tcggtctact ttaacccctt ctcgggacct cccggccact atccggatca atttattcct     28380

aactttgacg cggtaaagga ctcggcggac ggctacgact gaatgttaag tggagaggca     28440

gagcaactgc gcctgaaaca cctggtccac tgtcgccgcc acaagtgctt tgcccgcgac     28500

tccggtgagt tttgctactt tgaattgccc gaggatcata tcgagggccc ggcgcacggc     28560

gtccggctta ccgcccaggg agagcttgcc cgtagcctga ttcgggagtt tacccagcgc     28620

cccctgctag ttgagcggga caggggaccc tgtgttctca ctgtgatttg caactgtcct     28680

aaccttggat tacatcaaga tcctctagtt ataactagag tacccgggga tcttattccc     28740

tttaactaat aaaaaaaaat aataaagcat cacttactta aaatcagtta gcaaatttct     28800

gtccagttta ttcagcagca cctccttgcc ctcctcccag ctctggtatt gcagcttcct     28860

cctggctgca aactttctcc acaatctaaa tggaatgtca gtttcctcct gttcctgtcc     28920

atccgcaccc actatcttca tgttgttgca gatgaagcgc gcaagaccgt ctgaagatac     28980

cttcaacccc gtgtatccat atgacacgga aaccggtcct ccaactgtgc cttttcttac     29040

tcctcccttt gtatccccca atgggtttca agagagtccc cctggggtac tctctttgcg     29100

cctatccgaa cctctagtta cctccaatgg catgcttgcg ctcaaaatgg gcaacggcct     29160

ctctctggac gaggccggca accttacctc ccaaaatgta accactgtga gcccacctct     29220

caaaaaaacc aagtcaaaca taaacctgga aatatctgca cccctcacag ttacctcaga     29280

agccctaact gtggctgccg ccgcacctct aatggtcgcg ggcaacacac tcaccatgca     29340

atcacaggcc ccgctaaccg tgcacgactc caaacttagc attgccaccc aaggacccct     29400

cacagtgtca gaaggaaagc tagccctgca aacatcaggc cccctcacca ccaccgatag     29460

cagtaccctt actatcactg cctcaccccc tctaactact gccactggta gcttgggcat     29520

tgacttgaaa gagcccattt atacacaaaa tggaaaacta ggactaaagt acggggctcc     29580

tttgcatgta acagacgacc taaacacttt gaccgtagca actggtccag gtgtgactat     29640

taataatact tccttgcaaa ctaaagttac tggagccttg ggttttgatt cacaaggcaa     29700

tatgcaactt aatgtagcag gaggactaag gattgattct caaaacagac gccttatact     29760

tgatgttagt tatccgtttg atgctcaaaa ccaactaaat ctaagactag gacagggccc     29820

tctttttata aactcagccc acaacttgga tattaactac aacaaaggcc tttacttgtt     29880

tacagcttca aacaattcca aaaagcttga ggttaaccta agcactgcca aggggttgat     29940

gtttgacgct acagccatag ccattaatgc aggagatggg cttgaatttg gttcacctaa     30000

tgcaccaaac acaaatcccc tcaaaacaaa aattggccat ggcctagaat ttgattcaaa     30060

caaggctatg gttcctaaac taggaactgg ccttagtttt gacagcacag gtgccattac     30120

agtaggaaac aaaaataatg ataagctaac tttgtggacc acaccagctc catctcctaa     30180

ctgtagacta aatgcagaga aagatgctaa actcactttg gtcttaacaa aatgtggcag     30240

tcaaatactt gctacagttt cagttttggc tgttaaaggc agtttggctc caatatctgg     30300

aacagttcaa agtgctcatc ttattataag atttgacgaa aatggagtgc tactaaacaa     30360

ttccttcctg gacccagaat attggaactt tagaaatgga gatcttactg aaggcacagc     30420

ctatacaaac gctgttggat ttatgcctaa cctatcagct tatccaaaat ctcacggtaa     30480

aactgccaaa agtaacattg tcagtcaagt ttacttaaac ggagacaaaa ctaaacctgt     30540

aacactaacc attacactaa acggtacaca ggaaacagga gacacaactc caagtgcata     30600

ctctatgtca ttttcatggg actggtctgg ccacaactac attaatgaaa tatttgccac     30660

atcctcttac actttttcat acattgccca agaataaaga atcgtttgtg ttatgtttca     30720

acgtgtttat ttttcaattg cagaaaattt caagtcattt ttcattcagt agtatagccc     30780

caccaccaca tagcttatac agatcaccgt accttaatca aactcacaga accctagtat     30840

tcaacctgcc acctccctcc caacacacag agtacacagt cctttctccc cggctggcct     30900

taaaaagcat catatcatgg gtaacagaca tattcttagg tgttatattc cacacggttt     30960

cctgtcgagc caaacgctca tcaagtgata ttaataaact ccccgggcag ctcacttaag     31020

ttcatgtcgc tgtccagctg ctgagccaca ggctgctgtc caacttgcgg ttgcttaacg     31080

ggcggcgaag gagaagtcca cgcctacatg gggggagagt cataatcgtg catcaggata     31140

gggcggtggt gctgcagcag cgcgcgaata aactgctgcc gccgccgctc cgtcctgcag     31200

gaatacaaca tggcagtggt ctcctcagcg atgattcgca ccgcccgcag cataaggcgc     31260

ttgtcctccg ggcacagcag cgcaccctga tctcacttaa atcagcacag taactgcagc     31320

acagcaccac aatattgttc aaaatcccac agtgcaaggc gctgtatcca aagctcatgg     31380

cggggaccac agaacccacg tggccatcat accacaagcg caggtagatt aagtggcgac     31440

ccctcataaa cacgctggac ataaacatta cctcttttgg catgttgtaa ttcaccacct     31500

cccggtacca tataaacctc tgattaaaca tggcgccatc caccaccatc ctaaaccagc     31560

tggccaaaac ctgccccgcc gggntataca ctgcagggaa ccgggacttg gacaatgaca     31620

agtgggagag cccaggactc gtaaccatgg atcatcatgc tcgtcatgat atcaatgttg     31680

gcacaacaca ggcacacgtg catacacttc ctcaggatta caagctcctc ccgcgttaga     31740

accatatccc agggaacaac ccattcctga atcagcgtaa atcccacact gcagggaaga     31800

cctcgcacgt aactcacgtt gtgcattgtc aaagtgttac attcgggcag cagcggatga     31860

tcctccagta tggtagcgcg ggtttctgtc tcaaaaggag gtagacgatc cctactgtac     31920

ggagtgcgcc gagacaaccg agatcgtgtt ggtcgtagtg tcatgccaaa tggaacgccg     31980

gacgtagtca tatttcctga agcaaaacca ggtgcgggcg tgacaaacag atctgcgtct     32040

ccggtctcgc cgcttagatc gctctgtgta gtagttgtag tatatccact ctctcaaagc     32100

atccaggcgc cccctggctt cgggttctat gtaaactcct tcatgcgccg ctgccctgat     32160

aacatccacc accgcagaat aagccacacc cagccaacct acacattcgt tctgcgagtc     32220

acacacggga ggagcgggaa gagctggaag aaccatgttt ttttttttat tccaaaagat     32280

tatccaaaac ctcaaaatga agatctatta agtgaacgcg ctcccctccg gtggcgtggt     32340

caaactctac agccaaagaa cagataatgg catttgtaag atgttgcaca atggcttcca     32400

aaaggcaaac ggccctcacg tccaagtgga cgtaaaggct aaacccttca gggtgaatct     32460

cctctataaa cattccagca ccttcaacca tgcccaaata attctcatct cgccaccttc     32520

tcaatatatc tctaagcaaa tcccgaatat ttaagtccgg gccattgtaa aaaatttggc     32580

tccagagcgc cctccacctt cagcctcaag cagcgaatca tgattgcaaa aattcaggtt     32640

cctcacagac ctgtataaga ttcaaaagcg gaacattaac aaaaataccg cgatcccgta     32700

ggtcccttcg cagggccagc tgaacataat cgtgcaggtc tgcacggacc agcgcggcca     32760

cttccccgcc aggaaccatg acaaaagaac ccacactgat tatgacacgc atactcggag     32820

ctatgctaac cagcgtagcc ccgatgtaag cttgttgcat gggcggcgat ataaaatgca     32880

aggtgctgct caaaaaatca ggcaaagcct cgcgcaaaaa agaaagcaca tcgtagtcat     32940

gctcatgcag ataaaggcag gtaagctccg gaaccaccac agaaaaagac accatttttc     33000

tctcaaacat gtctgcgggt ttctgcataa acacaaaata aaataacaaa aaaacattta     33060

aacattagaa gcctgtctta caacaggaaa aacaaccctt ataagcataa gacggactac     33120

ggccatgccg gcgtgaccgt aaaaaaactg gtcaccgtga ttaaaaagca ccaccgacag     33180

ctcctcggtc atgtccggag tcataatgta agactcggta aacacatcag gttgattcat     33240

cggtcagtgc taaaaagcga ccgaaatagc ccgggggaat acatacccgc aggcgtagag     33300

acaacattac agcccccata ggaggtataa caaaattaat aggagagaaa aacacataaa     33360

cacctgaaaa accctcctgc ctaggcaaaa tagcaccctc ccgctccaga acaacataca     33420

gcgcttcaca gcggcagcct aacagtcagc cttaccagta aaaaagaaaa cctattaaaa     33480

aaacaccact cgacacggca ccagctcaat cagtcacagt gtaaaaaagg gccaagtgca     33540

gagcgagtat atataggact aaaaaatgac gtaacggtta aagtccacaa aaaacaccca     33600

gaaaaccgca cgcgaaccta cgcccagaaa cgaaagccaa aaaacccaca acttcctcaa     33660

atcgtcactt ccgttttccc acgttacgta acttcccatt ttaagaaaac tacaattccc     33720

aacacataca agttactccg ccctaaaacc tacgtcaccc gccccgttcc cacgccccgc     33780

gccacgtcac aaactccacc ccctcattat catattggct tcaatccaaa ataaggtata     33840

ttattgatga tgtta                                                     33855

Claims (14)

1.一种制备线形重组病毒载体的方法，其中通过体外位点特异性重组将所需的DNA插入到病毒基因组DNA中，该方法包括：

i)提供包含位点特异性重组位点和对于病毒复制和包装必需的碱基序列的病毒基因组DNA片段；

ii)提供包括至少一种所需DNA和位点特异性重组位点的携带者载体；和

iii)在体外使i)的DNA片段和ii)的携带者载体反应。

2.如权利要求1所述的制备线形重组病毒载体的方法，其中i)的病毒基因组DNA片段由两个DNA片段组成，这两个DNA片段分别是病毒复制和包装所必需的，包括位点特异性重组序列。

3.如权利要求1所述的制备线形重组病毒载体的方法，其中病毒基因组DNA来源于选自腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、噬菌体、冠状病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和水痘带状疱疹病毒的任意病毒。

4.如权利要求3所述的制备线形重组病毒载体的方法，其中病毒基因组DNA来源于腺病毒。

5.如权利要求4所述的制备线形重组病毒载体的方法，其中腺病毒的特征是缺失E1、E2、E3和/或E4位点。

6.如权利要求1所述的制备线形重组病毒载体的方法，其中位点特异性重组位点是att位点。

7.根据权利要求1至6中所述的任一方法制备的线形重组病毒载体。

8.一种制备具有线形基因组DNA的重组病毒的方法，包括下列步骤：

i)提供包含位点特异性重组位点和对于病毒复制和包装必需的碱基序列的病毒基因组DNA片段；

ii)提供包括至少一种所需DNA和位点特异性重组位点的携带者载体；和

iii)在体外，使用位点特异性重组酶使i)的DNA片段和ii)的携带者载体反应，以生成包含表达性线形重组病毒载体的混合物；和

iv)将iii)的混合物转染宿主细胞。

9.如权利要求8所述的制备具有线形基因组DNA的重组病毒的方法，其中i)的病毒基因组DNA片段由两个DNA片段组成，这两个DNA片段分别是病毒复制和包装所必需的，并包括位点特异性重组序列。

10.如权利要求8所述的制备具有线形基因组DNA的重组病毒的方法，其中病毒是选自腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、噬菌体、冠状病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和水痘带状疱疹病毒中的任一种。

11.如权利要求10所述的制备具有线形基因组DNA的重组病毒的方法，其中病毒是腺病毒。

12.如权利要求11所述的制备具有线形基因组DNA的重组病毒的方法，其中腺病毒的特征是缺失E1、E2、E3和/或E4位点。

13.如权利要求8所述的制备具有线形基因组DNA的重组病毒的方法，其中位点特异性重组位点是att位点。

14.根据权利要求8至13中所述方法的任一项制备的具有线形基因组DNA的重组病毒。

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