CN100529200C - 中药等天然产物混合物药物筛选备选库的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了适用于以蛋白质晶体结构为基础进行药物筛选的天然产物混合物药物筛选备选库的制备方法及该药物筛选备选库在以蛋白质晶体结构为基础进行药物筛选中的应用。本发明的制备方法高效、快捷、准确、可靠、实用。通过对原药材的优化，避免了干扰成份，而又使原药材的其它成分得到完整的保留。本发明的药物筛选备选库，可方便的获取靶分子与靶蛋白复合体精细三维结构。

Description

中药等天然产物混合物药物筛选备选库的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及药物筛选备选库的制备方法及其应用，更具体而言，涉及用于以蛋白质晶体结构为基础进行药物筛选的、来源于中药等的天然产物混合物药物筛选备选库的制备方法及其应用。

背景技术

天然产物又称次级代谢产物(Secondary Metabolites)，具有结构的多样性和生物活性的多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一(Newman DJ，GraggGM，Snader KM.Nat Prod Rep，2000，17(3)：215-234；Lee K-H.J NatProd.2004，67(2)：273-283)。但是，在过去10年中，制药工业对天然产物的研究兴趣有所降低，这主要是由于传统的天然产物粗提物库与常规的高通量的筛选方法缺乏兼容性(Frank E.and Guy T.Nature Rev.Drug Discov.2005，4：206-220)。

上个世纪90年代组合化学(Combichem)的出现，使得从天然产物中发现新药的研究被冷落了多年。组合化学能够合成数目巨大的化合物(理论上据估计有10¹⁸到10²⁰⁰个化合物，通常认为是10⁶⁰个)，这就为常规的高通量的筛选方法提供了理想的筛选化合物库，因此，组合化学这一技术的出现，使得大部分制药公司都转向了以组合化学库为基础的高通量筛选路线上，他们期待采用这种技术手段能够大大加快活性化合物的发现速度。然而，近年来制药工业的新药产出率并没有像预期的那样提高，而是持续下跌。造成这种结果的原因很多，一个最主要的原因可能就是由于制药工业采用组合化学技术之后，对天然产物研发的兴趣有所降低(David J.et al.J.Nat.Prod.2003，66，1022-1037)。组合化学方法是从共同的结构模板出发，选择具有相同功能的多种组建模块，通过同种键反应实现分子结构多样性。这样合成的化合物的结构骨架缺乏多样性。因此，组合化学作为药物发现的工具目前仍有其局限性，有待进一步发展和完善。而天然产物在药物研发中的独特作用，近年来重新引起人们的关注。

美国国立癌症研究院的调查显示，1981-2002年上市的877种小分子新化学实体药物中，来源于天然产物的占61％。其中，6％直接来源于天然产物，27％为天然产物的衍生物，5％来源于天然产物药效团的合成物，23％是根据天然产物结构进行模拟设计的合成物(David J.et al.J.Nat.Prod.2003，66，1022-1037)。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾，每年都会有大量结构新颖的化合物被发现提供出来，这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉，在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。

目前，用于药物筛选的天然产物库共有三种形式，一是天然产物粗提物库，为混合物库，一般包含有10-100种组分；二是天然产物提取组分，半纯品库，一般包含有5-10种组分；三是纯品库，单一组分(Frank E.and Guy T.NatureReviews Drug discovery.2005，4：206-220)。

现有的天然产物粗提物库虽然保留了原药材所含成分的完整性且简单易得，但其成分较复杂且其各个成分的浓度并不确定，有可能相差10倍、100倍甚至更多。因此，对于那些浓度低的组分，可能在常规的高通量的活性筛选中被忽略掉，而含量较丰富的组分有可能表现出非特异性的抑制，比如破坏检测体系的pH值或者其它的物理特性，造成假阳性结果(Frank E.and Guy T.NatureReviews Drug discovery.2005，4：206-220)。天然产物半成品库虽然部分地去除了干扰因素，也提高了所含受试成分的相对浓度，但是却丧失了原药材所含成分的完整性，并且往往在不同的色谱操作中造成对原药材所含成分的损失。对于天然产物纯品库，命中物(hit)的检测方法与人工化学合成的纯品库相同，可以用于常规的高通量的筛选方法中。然而，对于每一种天然产物粗提物来说，分离得到其每种成分的纯品化合物，需要较长的周期和大量的工作，并带有明显的盲目性，获得有效化合物的准确性非常低。

对于天然产物尤其是来源于中药等的天然产物的研究是很有必要的，因为中药在我国已有数千年应用的历史，是一个伟大的宝库。但是中药所含的化学成分复杂，有效成分也往往含量低微。对中药有效成分的阐释是中药现代化的重要内容，因为不确定具体何种成分在起作用，就无法为药材种植、药材炮制、成药的质量标准以及相关的药理、毒理、临床实验等提供依据。中药化学成分的分离、纯化和鉴定则需要反复运用各种色谱方法和多种波谱方法去完成，一味中药的化学成分研究已经是一项周期长、工作量大的工作，这还是仅限那些含量相对较大的成分。在结构清楚的各种成分里面寻找有效成分，又得对其进行各种生物活性测试，现今用于常规的高通量筛选的生物活性测试模型主要是一些简单的体外测试模型这其实是一种盲目的筛选模式，往往大多数分离得到的纯品化合物是无效的，而且这种简单的生物活性测试模型能说明的问题也是有限的。即使我们能够确定那些有效成分，那么这些成分是如何对某些疾病起到治疗作用的，它们是如何通过与机体的相互作用而对机体进行调节的，也很少有关于这些小分子成分与体内生物大分子相互作用细节的阐述。

随着基因组学、生物信息学等的快速发展，产生了基于分子生物学、结构生物学的药物筛选方法。人类以及微生物的基因组计划提供了数量空前的潜在药物靶标，仅仅在人类基因组的工作草图完成后不到1年的时间内就发现了1778个疾病基因。这些工作推动了蛋白质表达(蛋白质组学)以及蛋白质结构(结构生物学)的研究，与人类疾病相关基因的识别、鉴定及其所表达的蛋白质的结构与功能的研究为药物筛选与发现开拓了不可限量的前景，给新药发现带来了契机。随着科学技术的进一步发展，研究者开始使用X射线晶体学等生物物理的技术以蛋白质晶体结构为基础进行药物筛选，这类筛选方法主要包括：

(1)基于蛋白质三维结构的虚拟药物筛选和设计(计算机辅助的药物设计)

分子生物学和结构生物学的发展，提供了许多靶点蛋白质的三维结构，因此，按照互补性原则，根据蛋白质的三维结构的药物设计方法已被广泛使用。它与传统的药物化学方法不同，是根据蛋白质的三维结构，在结合位点找到与之相适配的小分子结构。一般可分为两种途径：一是基于数据库搜寻的也称为虚拟筛选，即按照受体结合部位的形状和结构特征，将有机分子库的化合物以其三维结构逐一对接到受体结合部位，找出与结合部位相适配的分子。另一种方法称为全新药物设计，即按照受体结合部位的形状和结构特征，由原子、化学基团或片断拼接成与之互补的配体分子。事实上，前者相当于在许多已有的钥匙中寻找可开启锁的钥匙，而后者是按照锁的结构制造新的钥匙。

可是，目前用于虚拟筛选的小分子库主要是剑桥小分子库，此库中新化合物种类较少，而且许多化合物的成药性较差。全新药物设计的方法能够解决上述问题，计算机全新药物设计可以在靶标蛋白质的活性口袋内放置片断，然后通过优化静电、范德华和氢键作用“生长”出适合活性口袋的分子。但这种方法又往往产生难于合成的分子，并且其可靠性还得接受实验的检验。

(2)基于片断(fragment-based)的筛选

基于片断筛选中的片断指的是分子量小于200Da的小分子基团，通常是组成化合物的基本基团，如萘醌、苯环等等。通常，这种小分子片断对靶标蛋白具有较低的结合力，因此常常不被常规的高通量筛选方法所发现。

但是这种方法也存在着本身的局限性：首先，分子量较小的基团在低分辨率(低于2.5

的分辨率)的电子密度中不易与结晶溶液中本身存在的小分子(如DMSO等)、离子(如酸根离子等)等区别开，因此对靶标蛋白的晶体质量要求较高，极大的限制了靶蛋白的范围；其次，能够稳定存在的、分子量在200Da水平上的小分子基团种类有限，目前使用较多用于结构筛选的备选库中也只有数百至数千种成分，这就极大的限制了命中的可能性；再次，这种筛选方法将很多不能够合成、无法分解为基本基团的天然产物排除在药物筛选的范围之外，限制了筛选范围。

截至到目前为止，现有技术中没有描述以蛋白质的晶体结构为基础，从来源于中药等的天然产物混合物药物筛选备选库中高效、全面地筛选药物的方法。对于具有结构多样性和生物活性多样性的天然产物的研究，仍然以传统方式进行，即用药物靶蛋白筛选粗提物，如果发现有活性，就将该提取物分割成若干组分，再分离和鉴定活性化合物。这个过程不仅缓慢、效率低、劳动强度大，而且也不能保证筛选出的化合物在化学上是可行的。因此，有待发展一种全新的天然产物药物研发模式，并迫切需要建立一种新的、能满足蛋白质体外活性测定和X射线晶体学技术需要的来源于中药等的天然产物混合物药物筛选备选库，其能够用于以蛋白质晶体结构为基础进行药物筛选的方法，从阐明小分子与大分子相互作用细节的角度入手，进行快速、高效、可靠的药物筛选。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效、快捷、准确、可靠、实用的适用于以蛋白质晶体结构为基础进行药物筛选的天然产物混合物药物筛选备选库的制备方法及该药物筛选备选库在以蛋白质晶体结构为基础进行药物筛选中的应用。

具体而言，本发明的天然产物混合物药物筛选备选库的制备方法，是从一种新的角度去研究中药现代化和生物学。由于天然产物粗提物所含的成分是相当复杂的，因此必须对天然产物的粗提物进行优化，目的是去除干扰因素如蛋白、多糖等，保留成药性较好的小分子并使之尽量集中，提高相对浓度，以制备适用于以蛋白质晶体结构为基础进行药物筛选的药物筛选备选库。本发明为实现这一目的，采用如下所述的技术方案制备药物筛选备选库，其基本原理为：对初级原料提取后，提取物先使用不同极性的溶剂如乙酸乙酯进行萃取、萃取后的水相再用大孔树脂分离的方法进行处理，这样既能保证去除蛋白、多糖等干扰因素，又能利用两种不同分离机制的差别，使小分子集中到极性不同的段位，由此得到含有适中分子量的并能够用于以蛋白质晶体结构为基础进行药物筛选的天然产物混合物药物筛选备选库。

本发明的来源于中药等的天然产物混合物药物筛选备选库的制备方法包括如下步骤：

(a)、制备提取物(粗提物)浸膏：

取初级原料，回流提取，合并提取液，浓缩得浸膏；

(b)、制得有机溶剂萃取部分：

称取所得浸膏，双蒸水悬浮，用有机溶剂萃取，分离有机溶剂相和水相；合并水相，备用；合并有机溶剂萃取物，蒸除有机溶剂，得到干膏状有机溶剂相成分，备用；

(c)、制得水相大孔树脂50％乙醇和95％乙醇洗脱部分：

蒸除步骤(b)得到的水相中的有机溶剂，用大孔树脂柱层析分离，用水为流动相洗脱，弃去水洗部分；再用乙醇溶液洗脱；将乙醇溶液洗脱部分蒸除溶剂，得干膏状样品备用；

(d)、制得天然产物混合物药物筛选备选库：

上述步骤(b)中制得的干膏状有机溶剂相部分、步骤(c)中制得的干膏状样品分别为制得的天然产物混合物备选样品，所有初级原料制得的天然产物混合物备选样品即组成天然产物混合物药物筛选备选库。

本发明天然产物混合物备选库的制备方法优选方案为：

(a)制备提取物(粗提物)浸膏：

当所选用的初级原料为除微生物外的任一种物质时：

取一定量的初级原料，其中所用乙醇与原料的质量比为6∶1-12∶1。用实验用乙醇回流提取，最好回流提取2-4次，每次1-3小时，合并提取液，浓缩得浸膏。其中所述的实验用乙醇浓度最好为70％-95％乙醇，最优选95％乙醇；回流提取次数最优选为3次，每次优选2小时。

对于中药处方的提取物浸膏的制备，则按照处方中规定的药材种类和1-6倍按照处方中规定的用量组成初级原料，分别用70％-95％乙醇按上述同样的方法制得浸膏一；另外，同样则按照处方中规定的药材种类和1-6倍用量组成初级原料，最好用双蒸水煎煮3次，每次1-3小时，煎煮液合并，浓缩得浸膏二。浸膏一和浸膏二都作为中药处方的提取物浸膏进行下一步的处理。

对于微生物的提取物制备，则是将含有适量微生物的培养液过滤，得到固体微生物菌丝体和培养液滤液，菌丝体再超声破碎，最好用80％丙酮超声破碎20-60分钟，过滤，滤液浓缩得浸膏，此浸膏与培养液滤液都作为微生物的提取物进行下一步的处理。

(b)制得有机溶剂萃取部分：

萃取用有机溶剂最好为乙酸乙酯或氯仿；浸膏与双蒸水的质量比最好为1∶5-1∶15，优选1∶10；萃取用有机溶剂的体积与悬浮用水的体积比最好为6∶1-10∶1，优选8∶1。

当初级原料为微生物外的任何一种物质时，可将步骤(a)中的浸膏，用双蒸水悬浮，倾入分液漏斗中(分液漏斗选用适宜的分液漏斗，例如，如果加入100ml水，则选用1000ml的分液漏斗)，用乙酸乙酯或氯仿萃取4-6次，萃取时需充分振摇，静置5-8小时分层后，分离有机溶剂相和水相；合并每次有机溶剂相萃取物，用旋转蒸发仪蒸除有机溶剂，得到干膏状有机溶剂相成分，备用。

对于微生物提取物的培养液滤液部分直接用有机溶剂萃取，最好萃取4-6次，合并每次有机溶剂萃取物，蒸除有机溶剂，得到干膏状有机溶剂相成分，备用。

(c)制得水相大孔树脂50％乙醇和95％乙醇洗脱部分：

将步骤(b)中萃取后的水相部分蒸除水中溶解的少量有机溶剂，用大孔树脂柱层析分离，依次用水、50％乙醇、95％乙醇为流动相洗脱，水洗脱6-10次，优选7次，每次洗脱用水为2-4倍体积量的步骤2中悬浮用水量，弃去水洗部分；50％乙醇和95％乙醇各洗脱4-6次，优选5次，每次洗脱用乙醇量为2-4倍体积量的步骤2中悬浮用水量。将50％乙醇和95％乙醇洗脱部分分别使用旋转蒸发仪蒸除溶剂，得干膏状样品备用。

其中，所述的旋转蒸发仪优选EYELA N1001型旋转蒸发仪；所述的洗脱用悬浮用水量和洗脱用乙醇量优选为3倍体积量的步骤2中悬浮用双蒸水；所述的大孔树脂优选HP-20型，优选地，大孔树脂用180毫升，玻璃柱规格30×300mm。

(d)制得天然产物混合物药物筛选备选库：

上述步骤(b)中制得的有机溶剂相部分的干膏状样品、步骤(c)中制得的水相50％乙醇洗脱部分的干膏状样品以及水相95％乙醇洗脱部分的干膏状样品，构成本发明的天然产物混合物药物筛选备选库的源自一份初级原料的三种备选样品(每一种备选样品都是由许多天然产物小分子组成的混合物，也称为天然产物混合物备选样品)；当初级原料为中药处方或微生物时，按上述方法，每一份初级原料可得到六种备选样品；所有初级原料提供的每种备选样品即组成了本天然产物混合物药物筛选备选库。

上述天然产物混合物药物筛选备选库的组成示于图1

天然产物混合物药物筛选备选库初级原料的选取范围很广泛，本发明可选取传统中药作为天然产物混合物药物筛选备选库的初级原料，因为传统中药在我国已有几千年的应用，至今还用于各种疾病的治疗。

本发明也可选取藏药等少数民族药材及潜在的药用动植物作为本发明的天然产物混合物药物筛选备选库的初级原料。

本发明也可选取传统经方、验方等中药处方作为本发明的天然产物混合物药物筛选备选库的初级原料。

本发明也可选取海藻、海绵等海洋生物作为本发明的天然产物混合物药物筛选备选库的初级原料，因为海洋生物能提供新颖结构分子巨大的生物资源，由于生态环境与陆地截然不同，导致体内生物合成过程不同，使得海洋生物与陆地生物相比，具有更丰富的生物分子多样性。

本发明也可选取微生物作为本发明的天然产物混合物药物筛选备选库的初级原料，因为其具有特有的生理过程和生长环境，也含有极其丰富的特有天然产物。

总之，本发明提供的制备方法中，所用的初级原料可选自以下述的任一种或几种：传统药材、按中药处方规定的药材种类和用量组成的混合药材、还未进行药用开发的动植物品种、海洋生物、微生物。比如，《中药药典》、《中华本草》、《中国植物志》收录的中药材品种、藏药。

本发明提供的天然产物混合物药物筛选备选库，具有广泛的应用。

本发明提供了以蛋白质晶体结构为基础，从该备选库中进行药物筛选的方法。

本发明提供的方法，包括以蛋白质晶体结构为基础从该备选库中获取靶分子与靶蛋白复合体精细三维结构。

本发明提供的以靶蛋白质晶体结构为基础，从该备选库中获取靶分子与靶蛋白复合体精细三维结构的方法可包括如下步骤：将靶标蛋白晶体与天然产物混合物备选样品接触，分析将靶标蛋白的晶体与天然产物混合物备选样品接触后的晶体的X射线衍射数据，获得与靶标蛋白结合的靶分子的电子密度，鉴定靶分子，进而获得靶分子与靶蛋白复合体的精细三维结构。对于得到的靶分子，可以进一步优化和进行生物学实验。

本发明提供了以蛋白质晶体结构为基础，从该备选库中进行抗SARS药物筛选；或从该备选库中进行抗HCV感染的药物筛选。

本发明提供的以蛋白质晶体结构为基础，从本发明的药物筛选备选库中获取靶分子与靶蛋白复合体精细三维结构的方法可包括如下步骤：

(1)选取靶标蛋白质

用X射线晶体学的方法解析出其三维结构的蛋白质都可以成为本实施方案的靶标蛋白质，优先选取与人类重要疾病或重要病毒相关的蛋白质；在确定了靶标蛋白之后，可以采用从公司购买、由合作者提供或从cDNA文库中克隆的方法，参照已经发表的关于该靶标蛋白的克隆、表达、纯化文献中的方法，得到正确的构建(construct)，并参照已发表文献中报道的方法进行该靶标蛋白质的表达和纯化；

(2)制备靶标蛋白质的晶体；

使用上述经过纯化的靶标蛋白，参照已报道的该靶标蛋白的结晶条件或经过自己优化的该靶标蛋白的结晶条件(优化靶标蛋白的结晶条件包括改变靶标蛋白的结晶浓度，改变靶标蛋白的结晶池液的组成等)，生长大量、衍射能力强的晶体，备用。

(3)制备天然产物混合物药物筛选备选库(上文已述)；

(4)天然产物备选样品对靶标蛋白体外抑制活性的测定

步骤(1)中所选取的靶标蛋白若已报道其具有成熟的体外活性测定方法，在进行靶标蛋白晶体与天然产物混合物药物筛选备选库中的样品(称为天然产物混合物备选样品)的浸泡实验之前，最好将天然产物混合物备选样品对靶标蛋白进行体外活性的测定(靶标蛋白活性测定方法参照相关文献(如SARS冠状病毒主蛋白酶，参见：Yang H，Xie W等人.2005 PloS Biol 3(10)：e324))，从不同的天然产物混合物备选样品中选取出对靶标蛋白具有抑制活性的样品(命名为“有抑制活性”的样品)，进行下一步的晶体浸泡或共结晶工作，这样可以针对性的选取出对特定靶标蛋白有抑制活性的天然产物混合物备选样品，减少下面步骤5中晶体浸泡或共结晶的次数，从而有效减少工作量，并提高命中率。

对于其他的、试图通过本实施方案的方法进行功能探索的靶标蛋白(如SARS非结构蛋白nsp10)，可不考虑此步骤，直接实施步骤(5)，以确定是否在靶标蛋白上结合有靶分子，用来研究该靶标蛋白的功能。

(5)靶标蛋白质的晶体与天然产物混合物备选样品接触；

对于已报道具有体外活性测定方法的靶蛋白，在步骤4中得到“有抑制活性”的样品(可能是一种，也可能是多种，设为N1种)之后，使用步骤2中制备的靶标蛋白的晶体与“有抑制活性”的样品的浸泡实验或者使用步骤1得到的经过纯化后的靶标蛋白与“有抑制活性”的样品进行共结晶实验。主要目的是获得靶标蛋白与靶分子(该靶分子为“有抑制活性”的样品中可能存在的靶标蛋白的配体分子)复合体的能够稳定存在，并具有可供X射线衍射实验的衍射能力的晶体。

使用的方法主要包括晶体浸泡和共结晶，优选晶体浸泡的方法，采用如下步骤：

(1)将步骤4中得到的N1种“有抑制活性”的样品溶解于靶标蛋白的结晶池液(结晶池液是靶蛋白晶体生长的溶液，通常由沉淀剂和缓冲溶液组成)(例如SARS主蛋白酶的结晶缓冲液组成为：1.8～12％的PEG 6000，3％二甲基亚砜(DMSO)，1mM DTT，100mM MES缓冲液(pH 5.0～PH6.0)中，制得晶体浸泡液。

(2)利用尼龙晶体环等工具，将晶体从结晶池液中取出，分别加入至上述(1)中所述的晶体浸泡液中浸泡2小时至48小时不等。

(6)晶体X射线衍射数据的收集和分析；

在步骤4、5的基础之上，使用具备较好衍射能力(通常指的是最高分辨率不低于3

)的靶标蛋白质的晶体与天然产物混合物备选样品接触后的晶体，进行X射线衍射数据的收集和分析。数据收集时，首先使用Hampton Research公司的尼龙晶体环，从晶体浸泡液中获取浸泡一定时间(2小时至48小时)的晶体；并迅速使用Rigaku公司的冷却系统或Oxford Cyrosystem公司的冷却系统，将晶体在以上所述的两种冷冻系统产生的低温氮气流中冷冻至-150℃--180℃；使X射线通过晶体，使用旋进法收集X射线衍射数据。

在收集到将靶标蛋白质的晶体与天然产物混合物备选样品接触后的晶体的X射线衍射数据后，按照下述步骤进行相应的数据处理：

首先，使用HKL2000等(包括Mosflm、D^*trek等)衍射数据处理程序包等本领域已知的常用的数据处理的方法，对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；

其次，使用CNS或者CCP4程序包中的Phaser、Molrep等各种分子置换(Molecular Replacement)程序等本领域已知的常用的数据处理方法，利用分子置换(Molecular Replacement)的方法，以靶标蛋白的母体晶体结构为初始模型，得到候选的靶标蛋白与靶分子的复合体的精细三维结构；

再次，使用程序O、COOT、XtalView等可视化程序包等本领域已知的常用的数据处理的方法，观测可能的靶标蛋白与抑制剂或者配体小分子复合体的电子密度。如果此时发现，在靶标蛋白相应的活性位点，有不属于蛋白质分子本身的、不属于溶剂分子的、不属于结晶溶液中存在的分子的未知电子密度存在，并且该电子密度与靶标蛋白的活性位点的氨基酸有包括氢键作用、共价作用等在内合理的化学环境，则可以确认此天然产物混合物备选样品中，有抑制剂小分子等配体分子与靶标蛋白结合。

(7)鉴定靶分子，获得靶分子与靶蛋白复合体的精细三维结构。

一旦在步骤6中发现结合在靶标蛋白质分子上的未知电子密度，一般来说可按照下面两种方法进行进一步工作，以确定结合小分子的具体成分等：

(1)对于分辨率较高的复合体的晶体结构，通常指分辨率超过2.5

可以通过直接观察分析电子密度，分析结合小分子与靶标蛋白质分子的化学作用，并结合该天然产物混合物备选样品研究，对结合小分子的成分和结构进行合理的推测(可能是一种、也可能是多种)，然后通过购买、合成等途径获取可能的小分子，并进行对照实验，以确定小分子的最终成分。

(2)对于分辨率较低的复合体的晶体结构，通常指分辨率低于2.5

。首先，利用质谱的方法，对蛋白质和天然产物混合物备选样品进行分析，确定结合小分子的分子量。其次，通过查阅相关文献等手段，对该备选样品的已有的成分进行具体分析，统计在上述用质谱方法确定的分子量左右(通常指分子量±10以内)可能存在的化合物(可能是一种，也可能是多种)。然后，通过合成、购买等手段获取该种或者这些化合物，并进行对照实验，以确定小分子的最终成分。

(8)靶分子的优化和进一步的生物学实验。

一旦按照步骤1-步骤7的方法，从某种天然产物混合物备选样品中获得了靶标蛋白质分子与靶分子结合的复合体的结构，并确定靶分子的具体成分和结构式之后，可以根据获得的复合体结构对靶分子进行结构上的设计和优化。以期得到能够设计并合成出与靶标蛋白质分子活性位点更加匹配、结合能力更高的小分子化合物，称为优化的靶分子。在得到优化的靶分子之后，可以对靶分子、优化的靶分子进行进一步的生物学实验，包括体外活性测定、细胞学实验、动物实验等生物学实验，进一步测定它们的生物学参数(如结合常数、酶动力学参数、细胞毒性等等)，以及对活体动物的疗效，以便为进一步的临床实验做好准备，进而进行潜在的药物开发。

同现有的天然产物粗提物库、半成品库以及纯品库(Frank E.and Guy T.Nature Reviews Drug discovery.2005，4：206-220)相比较，本发明的药物筛选备选库具有明显的优点。现有的天然产物粗提物库虽然保留了原药材所含成分的完整性，但其中也含有如蛋白质、多糖等许多对筛选造成干扰的成分，它们会造成假阳性或假阴性结果；同时，由于药材内所含成分之间含量差别大，受取样等因素的限制，那些活性好、含量低的成分往往达不到检测限需要的相对浓度。天然产物半成品库虽然部分地去除了干扰因素，也提高了所含成分的相对浓度，但是却丧失了原药材所含成分的完整性，并且往往在不同的色谱操作中造成对原药材所含成分的损失；而天然产物纯品库虽然最大限度地提高了测试的准确性，但却需要周期较长的分离、纯化以及结构鉴定过程，并且受人力、技术的限制，能提供的化合物数量也是有限的；而本发明的药物筛选备选库经过对原药材的适当优化，比如优选95％乙醇作为提取溶剂，可以提取出更多的亲脂性化合物；提取物先用有机溶剂萃取，水相再用大孔树脂分离的方法，则充分利用两种不同的分离机制，使极性不同的化合物集中到不同的部位中去，提高了它们的相对浓度并充分避免了交叉；水相大孔树脂水洗部分因主要含有蛋白质、多糖等亲水性成分，弃去不用则避免了它们对筛选造成的干扰，而原药材的其它成分得到了完整的保留。

本发明药物筛选备选库与现有的其它几种药物筛选备选库的比较见表1。

表1本药物筛选备选库与现有的其它几种药物筛选备选库的比较

	现有的天然产物粗提物库	现有的天然产物半成品库	现有的天然产物纯品库	本发明的药物筛选备选库
					能否保持原药材所含受试成分的完整性	能	否	否	能
能否去除对筛选体系干扰的组分并提高受试成分的相对浓度	否	能	能	能
					能否简化准备步骤，节省

成本

能

否

否

能

本发明人发明的来源于中药等的天然产物混合物药物筛选备选库，充分考虑到在以蛋白质晶体结构为基础进行药物筛选过程中的蛋白质体外活性测定实验和X射线晶体学技术的要求，经过对原药材的适当优化，不仅保持了受筛对象所含成分的完整性，保证了最大受筛量，而且去除了对筛选体系造成干扰的组分，提高了受试成分的相对浓度。另外，本药物筛选备选库的制备方法步骤简化，成本低，操作快速简便，且符合X射线晶体学筛选的要求，能快速、高效、准确地进行药物筛选。

显然，使用本发明的天然产物混合物药物筛选备选库中的混合物样品以X射线晶体学技术的筛选方法进行筛选，能够高效、准确的寻找与靶蛋白特异性结合的包括抑制剂小分子在内的配体小分子，提高了筛选的效率和准确性。

在本发明中，如果没有特定的说明，其中的方法、装置或物质等为本领域常规的，或者本领域技术人员根据本申请说明书的描述按照本领域常规技术可选用的。本文将在本发明中所引用的出版物、发明、文献等以其全部内容引入作为参考。

附图说明

图1本发明的来源于中药等的天然产物混合物药物筛选备选库的组成示意图。

图2-图3本发明的鱼腥草，野菊花，大青叶，芦根，金银花，连翘，黄芩，知母，四季青，穿心莲，鸭跖草，栀子，射干，山豆根，马勃，玄参，地骨皮的水相50％乙醇洗脱样品对SARS主蛋白酶的抑制活性曲线图。样品浓度：100μg/mL

图4-图5本发明的鱼腥草，野菊花，大青叶，芦根，金银花，连翘，黄芩，知母，四季青，穿心莲，鸭跖草，栀子，射干，山豆根，马勃，玄参，地骨皮的乙酸乙酯萃取样品对SARS主蛋白酶的抑制活性曲线图。样品浓度：100μg/mL图6本发明的鱼腥草、山豆根、栀子、知母、黄芩的乙酸乙酯萃取样品对SARS主蛋白酶的抑制活性曲线图。样品浓度：10μg/mL

图7本发明的川藏香茶菜乙酸乙酯萃取样品、水相50％乙醇洗脱样品对SARS主蛋白酶的抑制活性曲线图。样品浓度：100μg/mL

图8本发明的川藏香茶菜乙酸乙酯萃取样品、水相50％乙醇洗脱样品对SARS主蛋白酶的抑制活性曲线图。样品浓度：10μg/mL

图9本发明的SARS主蛋白酶活性位点附近电子密度对比图。

图10本发明的川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物样品中的存在的小分子的电子密度与SARS主蛋白酶活性位点Cys145残基电子密度形成共价键的显示图

图11本发明的SARS主蛋白酶与川藏香茶菜提取物乙酸乙酯萃取样品作用前后的质谱图。

图1220μM的川藏香茶菜丙素对SARS主蛋白酶的抑制活性曲线图

图132μM的川藏香茶菜丙素对SARS主蛋白酶的抑制活性曲线图

图14紫草、板蓝根、香附、荔枝核、山药、地骨皮、石韦、天花粉、百部、辛夷、荔枝、虎帐12种药材的乙酸乙酯萃取样品对HCV NS5B蛋白的抑制活性曲线图

图15HCVNS5B蛋白His502活性位点附近电子密度对比图

图16乙酰紫草素与未知电子密度的吻合

具体实施方式

下述实施具体实施例仅仅用于天然产物混合物药物筛选备选库的制备方法及其应用，其不应当理解为以任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员根据本发明的描述，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可对本发明做出各种改变和变型。

实施例1

天然产物混合物药物筛选备选库中的样品的制备(初级原料为传统药材或未进行药用开发的药材的天然产物)

源自川藏香茶菜(I.pharicus(Prain)Murata)的天然产物混合物备选样品的制备1制备提取物浸膏：

取500克干燥粉碎的川藏香茶菜药材，用4500毫升95％乙醇回流提取，提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩得浸膏；

2制得乙酸乙酯部分：

称取此浸膏10.5克，用85毫升双蒸水悬浮，倾入1000毫升分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取。每次萃取用乙酸乙酯850毫升，充分振摇，静置6小时分层。共萃取6次，合并各次乙酸乙酯萃取物。萃取后得到乙酸乙酯相和水相。乙酸乙酯萃取物用EYELAN1001型旋转蒸发仪蒸除溶剂，得干膏状样品备用；3制得大孔树脂50％乙醇和95％乙醇洗脱部分：

萃取后的水相部分用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除水中溶解的少量乙酸乙酯，用HP-20型大孔树脂柱层析分离(大孔树脂用170毫升，玻璃柱规格30×300mm)，依次用水、50％乙醇、95％乙醇为流动相洗脱。水洗脱8次，每次洗脱250毫升，弃去水洗部分。50％乙醇和95％乙醇各洗脱5次，每次洗脱300毫升。每部分均使用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除溶剂，得干膏状样品备用；

4得到川藏香茶菜提供的天然产物混合物备选样品：

上述步骤(2)制得的乙酸乙酯相部分、步骤(3)制得的50％乙醇洗脱部分和95％乙醇洗脱部分等3部分即组成了初级原料川藏香茶菜提供的3份混合物备选样品。

源自其它传统药材或未进行药用开发的药材的天然产物混合物备选样品的制备按照源自川藏香茶菜的天然产物混合物备选样品的制备方法制备。

实施例2

以中药处方为初级原料制备天然产物混合物药物筛选备选库中的样品

源自中药方剂“五味消毒饮”(清朝吴谦著《医宗金鉴》中处方)的天然产物混合物备选样品的制备

1.制备提取物浸膏：

按照“五味消毒饮”处方中规定药材种类和3倍用量：金银花60g，野菊花45g，蒲公英45g，紫花地丁45g，紫背天葵子45g组成初级原料，用2000毫升95％乙醇回流提取，提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩得浸膏一；另按照处方中规定药材种类和用量组成初级原料，用2000毫升双蒸水煎煮3次，每次1-3小时，煎煮液合并，浓缩得浸膏二。浸膏一和浸膏二都分别作为中药处方的提取物浸膏进行下一步的处理。

2制得乙酸乙酯部分：

称取浸膏一10.0克，用100毫升双蒸水悬浮，倾入1000毫升分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取。每次萃取用乙酸乙酯800毫升，充分振摇，静置5小时分层。共萃取6次，合并各次乙酸乙酯萃取物。萃取后得到乙酸乙酯相一和水相一；称取浸膏二10.0克，用同样的方法得到乙酸乙酯相二和水相二。乙酸乙酯相一和二均使用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除溶剂，得干膏状样品备用；

3制得大孔树脂50％乙醇和95％乙醇洗脱部分：

萃取后的水相一部分用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除水中溶解的少量乙酸乙酯，用HP-20型大孔树脂柱层析分离(大孔树脂用180毫升，玻璃柱规格30×300mm)，依次用水、50％乙醇、95％乙醇为流动相洗脱。水洗脱7次，每次洗脱300毫升，弃去水洗部分。50％乙醇和95％乙醇各洗脱5次，每次洗脱300毫升，得到50％乙醇洗脱部分一和95％乙醇洗脱部分一。萃取后的水相二部分用同样的方法得到50％乙醇洗脱部分二和95％乙醇洗脱部分二。每部分均使用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除溶剂，得干膏状样品备用；

4制得“五味消毒饮”提供的天然产物备选样品：

步骤(2)中制得的乙酸乙酯相一和二部分、步骤(3)中制得的50％乙醇洗脱一和二部分和95％乙醇洗脱一和二部分等6部分是初级原料“五味消毒饮”提供的天然产物混合物备选样品。

源自其它中药处方的天然产物混合物备选样品的制备按照源自中药方剂“五味消毒饮”的天然产物混合物备选样品的制备方法制备。

实施例3

源自海洋生物的天然产物混合物药物筛选备选库中的样品的制备

源自松节藻的天然产物混合物备选样品的制备

1.制备提取物浸膏：

取600克干燥粉碎的海藻-松节藻，用4800毫升95％乙醇回流提取，提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩得浸膏；

2制得乙酸乙酯部分：

称取此浸膏10.0克，用100毫升双蒸水悬浮，倾入1000毫升分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取。每次萃取用乙酸乙酯800毫升，充分振摇，静置5小时分层。共萃取6次，合并各次乙酸乙酯萃取物。萃取后得到乙酸乙酯相和水相；乙酸乙酯相部分使用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除溶剂，得干膏状样品备用；

3制得大孔树脂50％乙醇和95％乙醇洗脱部分：

萃取后的水相部分用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除水中溶解的少量乙酸乙酯，用HP-20型大孔树脂柱层析分离(大孔树脂用180毫升，玻璃柱规格30×300mm)，依次用水、50％乙醇、95％乙醇为流动相洗脱。水洗脱7次，每次洗脱300毫升，弃去水洗部分。50％乙醇和95％乙醇各洗脱5次，每次洗脱300毫升。每部分均使用EYELA N1001型旋转蒸发仪蒸除溶剂，得干膏状样品备用；

4制得备选样品：

步骤(2)中制得的上述乙酸乙酯相部分、步骤(3)中制得的50％乙醇洗脱部分和95％乙醇洗脱部分等3部分是松节藻提供的天然产物混合物备选样品。

源自其它海洋生物的天然产物混合物备选样品的制备按照源自松节藻的天然产物混合物备选样品的制备方法制备。

实施例4

以SARS冠状病毒主蛋白酶晶体结构为基础，使用按照本发明的天然产物混合物药物筛选备选库中的样品的制备方法制备的天然产物混合物备选样品进行抗SARS药物筛选

1.靶标蛋白质的选取：SARS冠状病毒主蛋白酶

2003年，全球大范围爆发了SARS疫情，而引起SARS的病原体最终被确认为一种未知的冠状病毒-SARS冠状病毒(Drosten，C.，Gunther，S.，Preiser，W.等人.N Engl J Med.2003，348：1967-76)。进一步的研究发现，SARS冠状病毒的基因组编码了两个大的复制酶多蛋白(replicase polyproteins)pp1a(486kDa)和pp1ab(790kDa)，这两个蛋白被水解后产生病毒复制复合体的很多功能亚基。在水解过程中，SARS冠状病毒的主蛋白酶起到了非常关键的作用。在主蛋白酶的作用下，复制酶多蛋白pp1a和pp1ab被水解成十多个功能肽段，从而进一步发挥作用。如果能够抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的水解作用，那么将会有效地抵御SARS冠状病毒对人体的侵染。因此，SARS冠状病毒的主蛋白酶是抗SARS药物筛选的一个主要靶标蛋白。SARS冠状病毒主蛋白酶(氨基酸序列见序列表部分1)在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达后进行进一步分离纯化(参见：Yang H et al.2003.The Crystal Structures of SARS Virus Main Protease Mproand Its Complex with an Inhibitor.PNAS，100(23)：13190-13195)。

2 SARS冠状病毒主蛋白酶的晶体生长

SARS病毒的主蛋白酶的结晶参见Yang H et al.2003.The Crystal Structuresof SARS Virus Main Protease Mpro and Its Complex with an Inhibitor.PNAS，100(23)：13190-13195。我们在1.8-12％的PEG 6000，3％二甲基亚砜(DMSO)，1mM DTT，100mM MES缓冲液(pH 5.0-6.0)以及蛋白浓度为9-12mg/ml的情况下获得了适合衍射的SARS冠状病毒主蛋白酶的晶体。

3天然产物混合物备选样品的制备

按照与制备源自川藏香茶菜的天然产物混合物备选样品的制备方法制备源自其它17种(鱼腥草，野菊花，大青叶，芦根，金银花，连翘，黄芩，知母，四季青，穿心莲，鸭跖草，栀子，射干，山豆根，马勃，玄参，地骨皮)的天然产物混合物备选样品。

4.天然产物混合物备选样品对SARS主蛋白酶抑制活性的测定SARS主蛋白酶的活性测定是使用荧光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(纯度大于95％，上海吉尔生化有限公司)来完成的。用于荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent荧光仪(ThermoLabsystems，Helsinki，Finland)，激发光和发射光的波长分别为320nm和405nm。

将实施例1-3中得到的干膏状天然产物混合物备选样品溶于二甲基亚砜(DMSO)中使其终浓度为50mg/mL

在缓冲溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，1mM EDTA(含或不含DTT))中加入SARS主蛋白酶(终浓度0.5μM)，天然产物混合物备选样品的DMSO溶解物(如川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物样品的DMSO溶解物)使其终浓度为：100μM/mL，底物浓度为20μM，298K放置10分钟后，迅速加入荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFRL(DNP)L-NH2，终浓度20μM)。激发波长和发射波长分别为330nM和395nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数。

对照：不加入备选样品，其余条件相同。结果示于图2-图8中。

图2-图5以及图7为18种中药制得的天然产物混合物备选样品对SARS主蛋白酶抑制活性的测定结果，其中每种备选样品的浓度为100μg/mL。

由以上图2-图8可以看出，其中大部分备选样品均对SARS主蛋白酶有抑制活性，其中抑制活性较好的有6种，分别是黄芩、鱼腥草、山豆根、栀子、知母、川藏香茶菜的乙酸乙酯萃取物样品。

图6和图8是以上6种抑制活性较好的：黄芩、鱼腥草、山豆根、栀子、知母、川藏香茶菜的乙酸乙酯萃取物样品的浓度稀释至10μg/mL时的对SARS主蛋白酶抑制活性测定结果，可以发现，将黄芩、鱼腥草、山豆根、栀子、知母、川藏香茶菜的乙酸乙酯萃取物浓度为10μg/mL时，对SARS主蛋白酶仍有较强的抑制活性。

这就说明在这5种中药的乙酸乙酯萃取样品中可能含有某种成分能够有效的抑制SARS主蛋白酶的活性，也说明这5种中药有可能成为治疗SARS冠状病毒的有效药物。为了了解它们对SARS主蛋白酶抑制作用确切的分子机理，我们可以选择这5种中药的乙酸乙酯萃取样品进行SARS主蛋白酶的晶体浸泡或共结晶实验。

5.SARS主蛋白酶晶体浸泡川藏香茶菜乙酸乙酯萃取样品

以川藏香茶菜乙酸乙酯萃取样品为例，采用晶体浸泡的方法用来获得SARS主蛋白酶与川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物样品接触之后的晶体。

采用如下方法制备晶体浸泡液：将川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物DMSO的溶解物10倍稀释至晶体生长池液(1.8～12％的PEG 6000，3％二甲基亚砜(DMSO)，1mM DTT，100mM MES缓冲液(pH 5.0～PH6.0))中，13000-15000rpm高速离心，之后取上清液，得浸泡液，备用。

浸泡时，利用尼龙晶体环等工具，将已生长好的SARS主蛋白酶的晶体从结晶池液中取出，加入浸泡液中，浸泡4-6小时后，制得SARS主蛋白酶与川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物接触后的晶体。

6.晶体衍射数据的收集和分析

使用Hampton Research公司的尼龙晶体环，从浸泡液中获取浸泡一定时间(通常为2-48小时)的晶体；并迅速使用Rigaku公司的冷却系统将晶体在冷冻系统产生的低温氮气流中冷冻至-150℃--180℃；使X射线通过晶体，使用旋进法收集X射线衍射数据。

选择衍射质量好的晶体(分辨率最好大于2.6)进行数据收集、处理，检测是否有小分子的结合。

通过观察相同角度的SARS主蛋白酶母体和复合体活性位点电子密度图(图9)(蓝色是蛋白质本身的电子密度)，可以发现，在复合体的活性位点能够观察到清晰的非蛋白质本身的电子密度(青色表示)，提示可能有小分子结合在蛋白质分子上。图9a中显示的是SARS主蛋白酶母体结构的活性位点附近的电子密度，图9b为SARS主蛋白酶与川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物样品浸泡后晶体活性位点附近的电子密度。

仔细观察该处的电子密度(如图9所示)，我们可以发现存在于川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物样品中的未知小分子的电子密度与SARS主蛋白酶活性位点处Cys145的电子密度紧密结合在一起，提示我们这应该是小分子与Cys145的γ硫原子形成了共价键，从而抑制了SARS主蛋白酶的活性(如图10所示)。

7.结合小分子的分析与鉴定

我们将SARS主蛋白酶(浓度为12mg/ml的SARS主蛋白酶水溶液)与川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物样品按照质量浓度比1∶1-1∶4的比例混合，并在4℃-16℃下作用6-18小时。将作用后的样品，13,000-15,000rpm高速离心，弃去沉淀后，采用MALDI(matrix-assisted laser-desorption ionization)谱对样品进行分析，结果参见图11。

从质谱的结果我们可以发现，在加入川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物样品后，分子量出现了明显的偏移，这主要是因为蛋白质分子与川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物样品中的小分子结合的原因。通过质谱结果可以计算(用较高的质谱峰值减去较低的质谱峰)发现，结合的小分子分子量约为390Da。

通过分析已有的川藏香茶菜成分，我们发现，在该分子量水平上，主要存在如下所示的化合物

我们可以发现在川藏香茶菜的主要成分中，在该分子量范围内，主要成分以二萜类化合物为主，包括川藏香茶菜甲、乙、丙、丁、戊、己素(分别对应上面PseurataA、PseurataB、PseurataC、PseurataD、PseurataE、PseurataF)，Isodomedin和Dihydropseurata)等。又由于结合在SARS主蛋白酶活性口袋处的小分子，和Cys145的γ硫原子形成了共价键，推知该小分子为Michael受体类小分子，具有α，β共轭不饱和双键。

基于分子量和化学环境的分析，得出结论：结合的小分子为川藏香茶菜丙素或者Isodomedin。

为了进一步验证，我们从中国科学院云南昆明植物所获得了川藏香茶菜丙素及Isodomedin的纯化合物，按照以上所述的方法制备川藏香茶菜丙素以及Isodomedin与SARS主蛋白酶复合体的晶体，并进行了数据收集及分析。通过观察电子密度，我们只在川藏香茶菜丙素浸泡过的SARS主蛋白酶的晶体发现了相似的电子密度，如图9.c所示。因此可以确定，从川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物样品中发现的与SARS主蛋白酶相结合的抑制剂小分子应为川藏香茶菜丙素。8川藏香茶菜丙素对SARS主蛋白酶抑制活性的测定

我们使用纯品化合物小分子(川藏香茶菜丙素)，测定了其对SARS主蛋白酶的抑制活性。川藏香茶菜丙素对SARS主蛋白酶抑制活性的测定与步骤4基本相同(结果示于图12)。然后改变川藏香茶菜丙素的浓度，在2μM测定其对SARS主蛋白酶的抑制活性(结果示于图13)。从图12-图13中可以发现，20μM的川藏香茶菜丙素对SARS主蛋白酶具有较强的抑制活性，当其浓度为2μM时对SARS主蛋白酶仍然有抑制活性。这就说明中药川藏香茶菜里面含有的川藏香茶菜丙素能够有效的抑制SARS主蛋白酶的活性，也说明川藏香茶菜丙素有望成为治疗SARS的有效药物。

实施例5

按照与实施例1中制备川藏香茶菜乙酸乙酯样品的制备方法制备紫草、板蓝根、香附、荔枝核、山药、地骨皮、石韦、天花粉、百部、辛夷、荔枝、虎帐12种药材的乙酸乙酯萃取样品。

实施例6

以HCV NS5B晶体结构为基础，使用按照本发明的天然产物混合物药物筛选备选库中的样品的制备方法制备的天然产物混合物备选样品进行抗HCV感染的药物筛选

1.靶标蛋白质的选取：HCV NS5B蛋白

HCV(Hepatitis C Virus)属于黄病毒科(flaviviridae)，是丙型肝炎的病原体。由于缺乏疫苗和有效的治疗药物，HCV感染已经成为一种世界性的流行病。随着HCV复制过程重要蛋白以及这些蛋白与相关配体或抑制剂的精确三维结构的解析，基于这些蛋白的三维结构设计、筛选治疗HCV感染的药物，成为目前开发治疗HCV药物的重要手段。NS5B是HCV的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，在HCV复制过程中起着关键的作用，是抗HCV感染的药物筛选的主要靶标蛋白(Behrens，S.E等人EMBO J 1996：15(1)12-22)。但全长的HCV NS5B蛋白溶解性较差，Ferrari(Ferrari，等人1999)等为提高NS5B的溶解性，在构建NS5B表达载体时切除了C端的21个氨基酸(称为HCV NS5BΔ21)，在E.Coil中获得了保持酶活性的高度可溶的蛋白。虽然在HCV不同的基因型和亚型中，NS5B的蛋白质序列不尽相同，但是相关活性位点却非常保守，这就为我们从已解析结果的NS5B出发，筛选针对不同基因型的药物提供了重要的依据。

构建在pET-21b载体上的HCV NS5BΔ21：genotype1b，isolate BK(丙型肝炎病毒基因型1b分离株BK缺失C端21个残基的NS5B：氨基酸序列见序列表部分2)质粒获赠于中科院生物物理所高光侠教授实验室，该质粒在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达后进行进一步分离纯化参见(Ago，等人1999)。

2.HCV NS5B蛋白的晶体生长

HCV NS5B的晶体生长参见(Ago，等人1999)，我们在结晶池液：20-25％(w/v)PEG4000，10％(v/v)甘油，5mM DTT，50mM MES pH5.0～6.0和25～30mg/ml的蛋白浓度下，能够得到尺寸较大、衍射能力很强的晶体，为进一步的药物筛选工作提供了良好的晶体学基础。

3.天然产物混合物备选样品的制备

选用实施例5制备的天然产物混合物备选样品

4.天然产物混合物备选样品对HCV NS5B抑制活性的测定

HCV NS5B的体外活性测定方法参见(Robert A.等人.Journal of Virology，July 2003：7575-7581)天然产物混合物备选样品对HCV NS5B的抑制活性如下测定：在缓冲溶液20mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM MgCl2，0.5mM MnCl2，1mMDTT，1mg/ml polyA，1mg/ml OligodT(18T)，1mg/ml UTP，1mg/ml P32-UTP中加入HCV NS5B蛋白(终浓度0.8μg/ml)，天然产物混合物备选样品的DMSO溶解物(终浓度20ug/ml、10ug/ml)，每5分钟取样一次，将到达取样时间的2-4μl反应后的溶液滴于处理好的DEAE滤纸上以终止反应。当反应完成后，用2×SSC溶液和95％乙醇先后洗涤DEAE滤纸4次，以除去残余P32-UTP，晾干后，使用PhosphorImage或者底片曝光，以测定中药混合物备选样品对HCV NS5B的抑制活性，结果示于图14。由图14可以看出紫草、山药、虎帐的乙酸乙酯萃取样品对HCV NS5B蛋白有较好的抑制活性。选定这些样品进行下一步的晶体浸泡工作。

5.HCV NS5B蛋白的晶体浸泡紫草乙酸乙酯萃取样品

采用晶体浸泡的方法使HCV NS5B蛋白的晶体与紫草乙酸乙酯萃取样品接触。

HCV NS5B蛋白的晶体浸泡液的制备与实施例2中5SARS主蛋白酶的晶体浸泡液的制备方法基本相同。HCV NS5B蛋白的晶体浸泡紫草乙酸乙酯萃取样品的方法与SARS主蛋白酶的晶体浸泡川藏香茶菜乙酸乙酯萃取样品的方法基本相同。

6、晶体衍射数据的收集和分析

HCV NS5B蛋白的晶体与紫草乙酸乙酯萃取样品接触后的晶体(简称复合体)的数据收集和分析与实施例4步骤6中基本相同。

通过观察相同角度的HCV NS5B蛋白母体的晶体和复合体活性位点电子密度图(图15)，可以发现，在复合体的活性位点能够观察到清晰的非蛋白质本身的电子密度(红色部分)，提示可能有小分子结合在蛋白质分子上。

7结合小分子的分析与鉴定

采用本发明提供的以蛋白质晶体结构为基础，从本发明的药物筛选备选库中获取靶分子与靶蛋白复合体精细三维结构的方法中步骤(7)提出的另外一种分析结合小分子的方法对结合的小分子进行分析和鉴定。

紫草(Sinkiang)属紫草科药用多年生草本植物，味甘、性寒，归心肺经。因其凉血活血、解毒透疹的显著功效，在各中医药典籍中均有详细记载。在《本草纲目》中以解表凉血、清热解毒、活血化淤等广谱疗效被列为上品(以根入药)。在现代医学研究中，因其具有抗感染、促进伤口愈合、抗肿瘤、抗微生物和抗血栓等众多功效，被广泛地用于医学研究和疾病治疗(Papageorgiou等人，1999.″The Chemistry and Biology of Alkannin，Shikonin，and Related NaphthazarinNatural Products.″Angew.Chem.Int.Ed.39：270-300)。

到目前为止，已经鉴定出紫草中的多种主要成分，这些主要成分对紫草在治疗疾病方面的疗效起着关键性的作用。而相关研究(Papageorgiou等人，1999.)表明这些成分主要都是紫草素(skikonin/alkannin)母核的衍生物，该母核的结构式为：

紫草中主要成分的母核的结构式。其中R基团不同代表不同的化合物。

目前已知的R基团包括如下面所示的36种。我们首先根据未知电子密度的显示，去除一些基团过大而不可能放入该处电子密度的化合物。然后准备候选的小分子的PDB数据，读入COOT后，利用COOT的Realspace Refinement的功能，将不同的小分子在电子密度中进行修正。结果显示，乙酰紫草素与未知电子密度的吻合较好，结果如图16所示。

8、结合小分子-乙酰紫草素抑制HCV NS5B的抑制机理

Qin.W等人的研究(Qin.w等人2002.Oligomeric interaction of hepatitis C virusNS5B is critical for catalytic activity of RNA-dependent RNA polymerase.J.Biol.Chem.277：2132-2137)显示NS5B存在一个重要的二体化位点(由Glu18和His502构成)。当NS5B要行使其聚合酶活性的时候，一个单体NS5B上的Glu18需要和另外一个单体NS5B上的His502位氨基酸结合，形成二体化的NS5B活性单位。在这一过程中，一旦有其他小分子预先和Glu18或者His502结合，将会阻碍NS5B形成二体化的活性单位，使其失去酶活性。由图16可以看出，乙酰紫草素与HCV NS5B His502咪唑环上的N原子形成了氢键，因而阻止了NS5B二体化活性单位的形成，从而抑制了NS5B的聚合酶活性。这就说明中药紫草里面含有的乙酰紫草素能够有效的抑制NS5B的活性，也说明乙酰紫草素有望成为治疗HCV感染的有效药物。

补充说明：

图2-图3：天然产物水相50％乙醇洗脱样品对SARS主蛋白酶活性的抑制曲线。天然产物样品的浓度为：100μg/mL。

图4-图5：天然产物乙酸乙酯萃取样品对SARS主蛋白酶活性的抑制曲线。天然产物样品的浓度为：100μg/mL。

图6：天然产物乙酸乙酯萃取样品对SARS主蛋白酶活性的抑制曲线。天然产物样品浓度：10μg/mL。

图9：SARS主蛋白酶活性位点电子密度对比。a为SARS主蛋白酶母体晶体活性位点的电子密度显示；b为SARS主蛋白酶与川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物浸泡后晶体活性位点的电子密度显示；c为SARS主蛋白酶与川藏香茶菜丙素浸泡后晶体活性位点的电子密度显示。图中显示的电子密度，蓝色为2fofc电子密度，为1.0sigma，青色和绿色为1fofc差值电子密度，为2.5sigma。

图10：未知小分子的电子密度与SARS主蛋白酶活性位点Cys145残基电子密度形成共价键，蛋白质分子用白色飘带图表示，活性位点的Cys145残基用球棍模型表示，蓝色电子密度表示Cys145的电子密度，红色电子密度表示未知小分子的电子密度。

图11：蓝色表示SARS主蛋白酶本身的质谱峰；红色表示SARS主蛋白酶与川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物作用后的质谱峰。

图15：HCVNS5B蛋白His502活性位点附近电子密度对比。a为母体活性位点的电子密度；b为浸泡过紫草乙酸乙酯萃取物之后该处的电子密度，c为b旋转90°后的显示。图中2fofc电子密度为1.0σ，1fofc差值电子密度为2.3σ。

序列表

<110>清华大学、南开大学、中国科学院生物物理研究所

<120>从中药等天然产物混合体系中高效、快速获取靶分子与靶蛋白复合体精细三维结构的新方法

<160>2

<210>1

<211>306

<212>prt

<213>SARS冠状病毒(SARS Coronavirus)

<400>1

Ser Gly Phe Arg Lys Met Ala Phe Pro Ser Gly Lys Val Glu Gly Cys

1               5                   10                  15

Met Val Gln Val Thr Cys Gly Thr Thr Thr Leu Asn Gly Leu Trp Leu

            20                  25                  30

Asp Asp Thr Val Tyr Cys Pro Arg His Val Ile Cys Thr Ala Glu Asp

        35                  40                  45

Met Leu Asn Pro Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Ile Arg Lys Ser Asn His

    50                  55                  60

Ser Phe Leu Val Gln Ala Gly Asn Val Gln Leu Arg Val Ile Gly His

65                  70                  75                  80

Ser Met Gln Asn Cys Leu Leu Arg Leu Lys Val Asp Thr Ser Asn Pro

                85                  90                  95

Lys Thr Pro Lys Tyr Lys Phe Val Arg Ile Gln Pro Gly Gln Thr Phe

            100                 105                 110

Ser Val Leu Ala Cys Tyr Asn Gly Ser Pro Ser Gly Val Tyr Gln Cys

        115                 120                 125

Ala Met Arg Pro Asn His Thr Ile Lys Gly Ser Phe Leu Asn Gly Ser

    130                 135                 140

Cys Gly Ser Val Gly Phe Asn Ile Asp Tyr Asp Cys Val Ser Phe Cys

145                 150                 155                 160

Tyr Met His His Met Glu Leu Pro Thr Gly Val His Ala Gly Thr Asp

                165                 170                 175

Leu Glu Gly Lys Phe Tyr Gly Pro Phe Val Asp Arg Gln Thr Ala Gln

            180                 185                 190

Ala Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ile Thr Leu Asn Val Leu Ala Trp Leu

        195                 200                 205

Tyr Ala Ala Val Ile Asn Gly Asp Arg Trp Phe Leu Asn Arg Phe Thr

    210                 215                 220

Thr Thr Leu Asn Asp Phe Asn Leu Val Ala Met Lys Tyr Asn Tyr Glu

225                 230                 235                 240

Pro Leu Thr Gln Asp His Val Asp Ile Leu Gly Pro Leu Ser Ala Gln

                245                 250                 255

Thr Gly Ile Ala Val Leu Asp Met Cys Ala Ala Leu Lys Glu Leu Leu

            260                 265                 270

Gln Asn Gly Met Asn Gly Arg Thr Ile Leu Gly Ser Thr Ile Leu Glu

        275                 280                 285

Asp Glu Phe Thr Pro Phe Asp Val Val Arg Gln Cys Ser Gly Val Thr

    290                 295                 300

Phe Gln

305

<210>2

<211>566

<212>PRT

<213>丙型肝炎病毒基因型1b分离株BK(Hepatitis C Virus HCV，genotype 1b，isolateBK)

<400>2

Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala

1               5                   10                  15

Glu Glu Thr Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg

            20                  25                  30

His His Asn Leu Val Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Leu Arg

        35                  40                  45

Gln Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gln Val Leu Asp Asp His Tyr

    50                  55                  60

Arg Asp Val Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala

65                  70                  75                  80

Lys Leu Leu Ser Val Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser

                85                  90                  95

Ala Arg Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser

            100                 105                 110

Ser Lys Ala Val Asn His Ile Arg Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu

        115                 120                 125

Asp Thr Glu Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn Glu Val

    130                 135                 140

Phe Cys Val Gln Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile

145                 150                 155                 160

Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr

                165                 170                 175

Asp Val Val Ser Thr Leu Pro Gln Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly

            180                 185                 190

Phe Gln Tyr Ser Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Ala Trp

        195                 200                 205

Lys Ala Lys Lys Cys Pro Met Gly Phe Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe

    210                 215                 220

Asp Ser Thr Val Thr Glu Asn Asp Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr

225                 230                 235                 240

Gln Cys Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gln Ala Ile Arg Ser Leu

                245                 250                 255

Thr Glu Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gln

            260                 265                 270

Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser

        275                 280                 285

Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Cys Arg

    290                 295                 300

Ala Ala Lys Leu Gln Asp Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu

305                 310                 315                 320

Val Val Ile Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gln Glu Asp Glu Ala Ser Leu

                325                 330                 335

Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp

            340                 345                 350

Pro Pro Lys Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser

        355                 360                 365

Asn Val Ser Val Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu

    370                 375                 380

Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala

385                 390                 395                 400

Arg His Thr Pro Val Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met Tyr Ala

                405                 410                 415

Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile

            420                 425                 430

Leu Leu Ala Gln Glu Gln Leu Glu Lys Ala Leu Asp Cys Gln Ile Tyr

        435                 440                 445

Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Gln Ile Ile Gln

    450                 455                 460

Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly

465                 470                 475                 480

Glu Ile Asn Arg Val Ala Ser Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro

                485                 490                 495

Leu Arg Val Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Val Arg Ala Arg Leu Leu

            500                 505                 510

Ser Gln Gly Gly Arg Ala Ala Thr Cys Gly Lys Tyr Leu Phe Asn Trp

        515                 520                 525

Ala Val Arg Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Pro Ala Ala Ser Gln

    530                 535                 540

Leu Asp Leu Ser Ser Trp Phe Val Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Ile

545                 550                 555                 560

Tyr His Ser Leu Ser Arg

               565

Claims (1)

1、以蛋白质晶体结构为基础从天然产物混合物药物筛选备选库中进行药物筛选的应用，其特征在于包括如下步骤：

(1)天然产物混合物药物筛选备选库的制备包括如下步骤：

(a)取初级原料，回流提取，合并提取液，浓缩得提取物浸膏；

(b)称取所得浸膏，双蒸水悬浮，用有机溶剂萃取，分离有机溶剂相和水相；合并水相，备用；合并有机溶剂萃取物，蒸除有机溶剂，得到干膏状有机溶剂相成分，备用；

(c)蒸除步骤(b)得到的水相中的有机溶剂，用大孔树脂柱层析分离，用水为流动相洗脱，弃去水洗部分；再用乙醇溶液洗脱；将乙醇溶液洗脱部分蒸除溶剂，得干膏状样品备用；和

(d)上述步骤(b)中制得的干膏状有机溶剂相部分和步骤(c)中制得的干膏状样品分别为制得的天然产物混合物备选库的备选样品，将所有初级原料制得的每种备选样品组成天然产物混合物药物筛选备选库；以及

(2)天然产物混合物药物筛选备选库的筛选包括如下步骤：

(a)将靶标蛋白晶体与步骤(1)制得的天然产物混合物备选库的备选样品接触；

(b)分析靶标蛋白晶体与步骤(1)制得的天然产物混合物备选库的备选样品接触后的晶体的X射线衍射数据，获得上述备选样品中的与上述靶标蛋白结合的靶分子的电子密度；和

(c)鉴定上述靶分子，进而获得该靶分子与靶标蛋白复合体的精细三维结构。

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