CN100529065C - 一种包含bpi基因的重组病毒及含有其的药物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组病毒，其包含病毒载体以及选自如下的基因构建体：1)人BPI基因或其功能片段基因，或其简并性序列；和2)含有人BPI基因或其功能片段基因，或其简并性序列的嵌合基因，其中在人BPI基因或其功能片段基因的3’端进一步连接人免疫球蛋白重链恒定区Fc基因或其等位体基因。本发明还涉及含有人BPI基因或其功能片段基因的基因构建体用于制备哺乳动物GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗的药物组合物的用途。本发明还涉及一种利用所述重组病毒或药物组合物进行GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗的方法。

Description

一种包含BPI基因的重组病毒及含有其的药物组合物及其用途
发明领域
本发明涉及哺乳动物革兰氏阴性菌(GNB)和/或GNB样病原体感染疾病的基因治疗领域。具体的，本发明涉及一种重组病毒，其包含病毒载体以及选自如下的基因构建体：1)人BPI基因或其功能片段基因，或其简并性序列；和2)含有人BPI基因或其功能片段基因，或其简并性序列的嵌合基因，其中在人BPI基因或其功能片段基因的3’端进一步连接人免疫球蛋白重链恒定区Fc基因或其等位体基因。本发明还涉及含有人BPI基因或其功能片段基因的基因构建体用于制备哺乳动物GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗的药物组合物的用途。本发明还涉及一种利用所述重组病毒或药物组合物进行GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗的方法。
发明背景
细菌感染是临床常见疾病，严重感染发展成败血症的病例很多，死亡率在30-50％，其中一半以上与革兰氏阴性菌(gramnegative bacteria，以下简称为GNB)感染发展为败血症和引起内毒素(Endotoxin)中毒性休克死亡有关[Dahlberg，et al.J SurgRes.63：44(1996)][Lazaron，et al.Urol Clin North Am.26：687(1999)][Balk，et al.Crit Care Clin.16：179(2000)]。抗生素具有杀抑菌作用，但不能中和内毒素，有时对抗生素高度敏感的GNB在大量死亡裂解后反而会促进内毒素休克的发生，目前采用抗脂多糖和抗促炎症细胞因子单抗治疗的结果也不理想[Mccloskey，et al.Ann Intern Med.121：1(1994)][Vincent，et al.Clin InfectDis.34：1084(2002)]。此外，细菌耐药问题也给临床抗感染治疗带来极大的困难，抗生素治疗有时并不能奏效。因此，研制一种既能广谱杀伤GNB，又能中和内毒素，同时还能克服耐药的抗感染药物成为国内外研究的热点。
杀菌/渗透增强蛋白(bactericidal/permeablity increasingprotein，以下简称为BPI)是1978年Weiss等首次在多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)中发现的一种分子量约为55KD阳离子抗菌蛋白。该种抗菌蛋白由456个氨基酸残基组成，其N端片段能高亲和力结合GNB的脂多糖(lipopolysaccharide，以下简称为LPS)和类脂A，具有中和内毒素和直接杀伤GNB的作用[Weiss，et al.253：2664(1978)][Weiss，et al.Blood，69：652(1987)][Ooi，et al.，J.Exp.Med.174：649(1991)][Weiss，et al.J Clin Invest.90：1122(1992)]。1989年Gray等从人中性粒细胞中成功克隆出BPI cDNA，随后重组BPI及其N端功能片段相继表达成功[Gray，et al.J Biol Chem.264：9505(1989)][Gazzano-Santoro，et al.Infect.Immunol.60：4754(1992)][Horwitz，et al.Protein Expr Purif.8：28(1996)]。
深入研究证实，重组BPI及其功能片段具有如下主要生物学功能：对GNB、GNB样病原体(如衣原体、立克次体和螺旋体)和真菌具有广谱杀伤或抑制作用，而对高等真核细胞无毒副作用；对内毒素(LPS)具有中和作用，可抑制LPS介导的促炎细胞因子(如TNF-α、IL-1β)和其他炎性介质的释放；与抗生素联合施用具有显著协同杀菌效应[Elsbach，et al.Curr Opin Immun.10：45(1998)][Beamer，ASM News.68：543(2002)]。此外，根据BPI的作用机制，它能克服临床GNB耐药问题[Mannion，et al.J.Clin.Investig.85：853(1990)]。因此，重组BPI及其功能片段有望为临床抗感染治疗提供一条新的途径。
近年来，重组人BPI N端功能片段(rBPI21)在治疗GNB肺炎、GNB败血症、慢性渗出性耳炎和下肢缺血再灌注损伤后并发症等动物模型的研究中取得了令人鼓舞的结果[Cazzola，et al.Curr Opin Pulm Med，10：204(2004)][Lin，et al.AntimicrobAgents Chemother.40：65(1996)][Nell，et al.Infect.Immun.68：2992(2000)][Harkin，et al.J.Vasc.Surg.33：840(2001)]，在临床对脑膜炎菌血症、创伤性失血及其并发症和肝部分切除后并发症等感染疾病的治疗也取得了一定疗效[Levin，et al.Lancet.356：961(2000)][Demetriades，et al.J.Trauma.46：667(1999)][Wiezer，et al.Shock.10：161(1998)][Beamer，ASM News.68：543(2002)]。但是重组BPI及其功能片段在临床应用中，由于存在如下主要问题而使其疗效和应用受到了极大影响：(1)体内半衰期短(＜60分钟)难以持续维持有效治疗浓度；(2)发挥杀菌效应所需时间长(＞4小时)；(3)治疗剂量大、费用高。为解决上述问题，我们从1996年开始了BPI-Fcγ1重组抗菌蛋白的研究。
Ig样重组蛋白是采用重组DNA技术产生的由某种功能蛋白与免疫球蛋白(Ig)重链恒定区(Fc)片段嵌合而成的重组蛋白。该重组蛋白不仅具有某种功能蛋白所特有生物功能，还具有免疫球蛋白稳定性好、体内半衰期长等特性[Hodges，et al.AntimicrobAgents Chemother.35：2580(1991)]。由BPI或其N端功能片段与免疫球蛋白Fc片段或其等位体嵌合组成的Ig样重组蛋白(以下简称为BPI-Fc重组蛋白)，兼备BPI和Fc双重功能，它们不仅具有中和内毒素和广谱杀伤GNB作用，还具有血清半衰期较长、能激活补体和介导调理吞噬等生物学特性。此外，根据免疫学原理，Fc激活补体和介导调理吞噬能快速产生非特异杀菌作用(＜1小时，不受细菌是否耐药影响)[安云庆，医学免疫学基础，北京科学技术出版社，1998年9月第一版，ISDN 7-5304-2124-7]；因此，BPI-Fc重组蛋白能通过BPI和Fc的双重作用快速杀伤GNB(包括GNB样病原体)，并且能克服临床耐药问题。因此，BPI-Fc重组蛋白有望成为比BPI更好的新型高效抗感染物质。
基因治疗(gene therapy)是将功能基因导入体内器官、组织或细胞中表达进行疾病治疗的方法。基因治疗是维持或调控功能蛋白在体内表达有效治疗浓度的有效手段。用于基因治疗的基因递送系统(gene delivery system)分为病毒型载体和非病毒型载体。
病毒型载体基因导入效率高，在基因治疗临床研究中广泛应用，但存在安全性问题[Anderson，Nature，392：25(1998)]。无病毒基因病毒载体(gutless viral vector)具有良好的安全性，是病毒型载体的重要发展方向[Sakhuja，et al.Hum Gene Ther.14：243(2003)]。腺伴随病毒(AAV)载体、腺病毒微载体(mini-Ad)、HSV扩增子(amplicon)载体均为无病毒基因病毒载体。
非病毒型载体安全性好，但基因导入效率低；随着新型高效非病毒载体技术和材料(如靶向性载体、纳米载体等)的研究进展，这类载体在基因治疗中的应用将越来越多[Manfred，et al.DDT，7(8)：479(2002)][Molas，et al.Curr Gene Ther.3：468(2003)]。
自从1990年美国科学家Anderson博士等人进行了首例人类基因治疗的临床试验以来，据美国重组DNA顾问委员会(Recombinant DNA Advisory Committee)统计，截至2004年3月已有619个基因治疗临床试验方案，涉及恶性肿瘤、遗传性疾病、心血管疾病、自身免疫疾病、神经内分泌系统疾病和艾滋病的防治，但未见细菌感染疾病基因治疗的报道[http://www4.od.nih.gov/oba/rac/protocol.pdf]。
本发明人首次明确提出了细菌感染疾病可以采用基因治疗的概念，并首先应用包含BPI功能片段基因的AAV2-BPI-Fcγ1重组腺伴随病毒在小鼠GNB感染治疗中取得了成功。
发明概述
本发明的一个方面，提供了一种重组病毒，其包含病毒载体以及选自如下的基因构建体：
1)人BPI基因或其功能片段基因，或其简并性序列；和
2)含有人BPI基因或其功能片段基因，或其简并性序列的嵌合基因，其中在人BPI基因或其功能片段基因的3’端进一步连接人免疫球蛋白重链恒定区Fc基因或其等位体基因。
本发明的另一方面，涉及本发明所述的重组病毒用于制备哺乳动物GNB和/或GNB样病原体(如衣原体、立克次体和螺旋体)感染疾病的基因治疗的药物组合物的用途，其中所述哺乳动物包括人。
本发明的又一方面，涉及一种用于GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗的药物组合物，其中含有本发明所述的重组病毒，以及药学可接受的载体。
本发明的再一方面，涉及一种用于GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗的药物组合物，其包含药学可接受的非病毒型载体，以及选自如下的基因构建体：1)人BPI基因或其功能片段基因，或其简并性序列；和2)含有人BPI基因或其功能片段基因，或其简并性序列的嵌合基因，其中在人BPI基因或其功能片段基因的3’端进一步连接人免疫球蛋白重链恒定区Fc基因或其等位体基因。
本发明还涉及一种用于GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗的方法，包括：将治疗有效量的本发明所述重组病毒或所述药物组合物施用于患者。在本发明的一个具体实施方案中，所述基因治疗的方法进一步包括在施用治疗有效量的本发明所述重组病毒或所述药物组合物的之前、同时或之后将已知抗生素类化合物联合施用于患者的步骤。
发明详述
下面就本发明的目的和实施做进一步阐述，本领域的技术人员对本发明的所涉及的范围、内容和优点是显而易见的；因此，附加权利要求和将来的任何修正均在本发明的保护范围中。
本发明的一个方面，提供了一种重组病毒，其包含病毒载体以及选自如下的基因构建体：
1)人BPI基因或其功能片段基因，或其简并性序列；和
2)含有人BPI基因或其功能片段基因，或其简并性序列的嵌合基因，其中在人BPI基因或其功能片段基因的3’端进一步连接人免疫球蛋白重链恒定区Fc基因或其等位体基因。
病毒型载体作为基因治疗的载体具有基因导入效率高的优点，在基因治疗临床研究中较早广泛应用的有逆转录病毒载体和腺病毒载体。但它们存在着局限性，如可诱导机体产生免疫反应和存在安全性等问题；具体的，逆转录病毒载体与宿主基因组整合可能导致细胞癌变；腺病毒载体虽不与宿主基因组整合，但因其病毒蛋白会引起免疫反应和炎症反应，会加重GNB和/或GNB样病原体感染疾病，而且其重复使用也存在限制。
无病毒基因病毒载体不仅具有基因导入效率高的优点，还具有细胞毒性和免疫毒性小、安全性好的优点，是GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗的首选载体。腺伴随病毒载体、腺病毒微载体、HSV扩增子载体均为无病毒基因病毒载体。具体的，腺伴随病毒载体具有可与宿主基因组整合和持续时间长等特点；而第三代腺病毒载体-腺病毒微载体(mini-Ad)缺失了全部或大部分腺病毒基因，仅保留ITR和包装信号序列，具有不与宿主基因组整合、介导目的基因表达水平较高和持续时间较短等特点；它们在GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗临床应用中将具有各自的优点和各自的应用，都在本发明所要求保护的范围中。
腺伴随病毒载体(adeno-associated viral vector，AAV载体)具有安全性好、免疫原性低、稳定性好及宿主范围广的优点，被公认为最安全的病毒载体，在基因治疗和疫苗的研究中受到广泛重视。目前发现的腺伴随病毒有AAV1-AAV8 8种血清型，它们主要区别在衣壳蛋白的不同，并因此对不同的组织和细胞有不同的感染效率。常见的AAV1-AAV6 6种血清型是在人类及灵长类动物上分离到的，其中以AAV2型的研究最为清楚。各种血清型AAV型载体在小鼠肝脏和肌肉组织中感染效率由高到低的顺序是AAV1＞AAV5＞AAV3＞AAV2＞AAV4，在大鼠视网膜中顺序是AAV5＞AAV4＞AAV1＞AAV2＞AAV3，其中AAV1和AAV5型载体有很好的应用前景[Davidson，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.97：3428(2000)]。目前广泛应用的AAV载体都是以AAV2型为基础的AAV2型载体，对多种组织细胞都具有较好的转导效率，如肌肉、视网膜、肝脏、神经元细胞等。但AAV2型载体对一些组织细胞的转染效率较低，并且在正常人群中有85％存在主要针对AAV2的抗体，会引起的转导效率和治疗基因表达水平急剧降低的问题[Halbert，et al.J Virol.74：1524(2000)]。为了获得更高的基因导入效率，许多研究者致力于研究基于不同血清型AAV的新型AAV载体，主要方向之一是采用其它血清型的AAV病毒外壳；目前已有很好应用前景的AAV2、AAV1、AAV3、AAV5型载体及其杂合载体出现。与AAV2载体相比，AAV1载体在除神经组织外的其他组织，比如肌肉组织和肝脏中的转导效率都普遍较高[Bernd，et al.J Virol.77：2768(2003)]。与AAV2型载体相比，AAV5型载体能更高效地转导呼吸道上皮细胞、肌肉、神经元、胶质细胞、视网膜组织，在视网膜、大脑和胰岛中表现出更好的感染效率，导致这种差异的原因之一是AAV5与AAV2病毒的细胞受体不同；并且在人群中针对AAV5的抗体极少；因此，AAV5型载体更适合于作为针对这些靶组织的基因治疗载体[Jason，etal.Molecular Therapy.6：510(2002)]。目前各种血清型AAV载体的都是“杂合”载体(AAV5除外)，即：使用AAV2的ITR以及全部或部分AAV2的rep蛋白，分别换上其它血清型AAV的cap蛋白，就可以得到具有各血清型的感染特征的杂合AAV载体。
“杂合”载体具有如下优点：第一，可以继续使用为包装AAV2载体构建的各种载体细胞株，从而大大简化了AAV载体“换壳”的过程；第二，使用研究较清楚且经过临床检验了安全性的AAV2的ITR，可以避免使用其它血清型的ITR可能带来的风险。例如，AAV1/2型杂合载体是AAV1病毒的外壳中包装了AAV2的ITR和外源基因表达盒，具有野生型AAV1感染效率高和AAV2安全性好等特性[Hildinger，et al.J Virol.75：6199(2001)]。
因此，本领域普通技术人员知晓，可以根据不同的目标组织选用上述各种不同血清型AAV载体及其杂合载体，作为本发明具体实施方案的修正和改进，用于本发明所述的哺乳动物革兰氏阴性菌(GNB)/或GNB样病原体感染疾病的基因治疗领域。具体的，基于不同血清型的腺伴随病毒发展而来的各种载体，包括现有的AAV2、AAV1、AAV3、AAV5型腺伴随病毒载体及其杂合载体，都在本发明所要求保护的范围中。在本发明所述的方法中，优选使用AAV2型腺伴随病毒载体。
尽管病毒型载体的安全性尚待进一步验证，但在临床2/3以上的方案中已得到广泛应用，因此，腺伴随病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体和逆转录病毒载体都在本发明所述的范围。鉴于病毒基因产物会加重GNB和/或GNB样病原体感染疾病的免疫反应和炎症反应；因此，无病毒基因病毒载体是本发明的首选。
在本发明中，所述的病毒载体可以选自腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体和逆转录病毒载体，或者选自无病毒基因病毒载体，包括腺伴随病毒载体、腺病毒微载体和HSV扩增子载体。优选为目前广泛应用的AAV2型腺伴随病毒载体。
另外，随着各种新型病毒型载体的进展，所得到的新型病毒型载体，只要能够成功实现本发明所述重组BPI基因或BPI嵌合基因的递送，均可以作为BPI基因或其嵌合基因的载体应用于GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗，都在本发明所要求保护的范围中。
在本发明中，所述人BPI基因的功能片段基因为1)编码如SEQ ID NO：1所示的人BPI蛋白第1-199个氨基酸的BPI1-199功能片段之多核苷酸序列，其中所述SEQ ID NO：1的氨基酸序列第132位氨基酸任选的可以被替换为Ala或Ser，或者2)编码1)中所述氨基酸片段之C端截短6个氨基酸的BPI1-193功能片段之多核苷酸序列。
在本发明中，所述的BPI嵌合基因是指人BPI基因的3’端进一步嵌合各类免疫球蛋白重链恒定区Fc基因，也称为BPI-Fc嵌合基因。其对应表达的BPI-Fc重组蛋白兼备BPI和Fc双重功能，即具有中和内毒素和广谱杀伤GNB的作用，又具有体内半衰期长、稳定性好和激活补体、介导调理吞噬等有助于抗感染免疫作用的生物学特性，能够通过Fc激活补体和介导调理吞噬增强杀菌作用。Theofan等[美国专利5,643,570(1997)]证实了BPI-Fc重组蛋白具有中和内毒素和杀伤GNB的作用，能保护小鼠抗GNB感染和内毒素的攻击；但是，在所述专利中并未提及BPI-Fc通过Fc激活补体和介导调理吞噬增强杀菌的作用。
已知所述Fc基因包括各类免疫球蛋白重链恒定区Fc基因或其等位体基因，其中Cγ1、Cγ2和Cγ3具有激活补体和介导调理吞噬双重功能，Cα1、Cα2具有介导调理吞噬功能。在本发明中，所述人免疫球蛋白重链恒定区Fc基因为选自如下之一：Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cα1和Cα2基因。
本发明人采用人BPI1-199功能片段基因和人Fcγ1基因嵌合而成的BPI-Fcγ1嵌合基因作为治疗基因，并证实了BPI-Fcγ1重组蛋白兼备BPI和Fc双重功能，即不仅具有中和内毒素和杀伤GNB的作用，而且能够通过Fc激活补体和介导调理吞噬迅速发挥杀菌效应，大大增强杀菌作用(参见后面的实施例)。
表达控制元件是指驱动基因表达的启动子(promoter)、增强子(enhancer)、一些可调控的序列或元件以及poly A序列等。它们可在宿主细胞内驱动或调节目的基因，例如本发明所述重组BPI基因或BPI-Fc嵌合基因的表达，从而达到治疗GNB和/或GNB样病原体感染疾病的目的。能够用于本发明的表达控制元件包括但不限于，病毒启动子(如CMV、SV40启动子)、看家基因启动子(如二氢叶酸还原启动子)、组织/细胞特异性启动子(如肌肉中肌酸激酶的启动子)、可诱导启动子(如金属硫蛋白基因的启动子、类固醇诱导的启动子)等。本领域技术人员知晓，只要能够用于调控本发明所述重组BPI基因或BPI-Fc嵌合基因的表达控制元件均能用于本发明。在本发明的一个实施方案中，采用AAV2型腺伴随病毒载体pSNAV上的CMV启动子和SV40 poly A作为表达控制元件。
在本发明的一个优选实施方案中，所述重组病毒为含有BPI-Fcγ1嵌合基因的AAV2型重组腺伴随病毒，其中所述BPI-Fcγ1嵌合基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其由人BPI1-199功能片段基因和人Fcγ1基因嵌合而成，且其5’端和3’端分别连接于CMV启动子和SV40polyA表达控制元件。
在本发明的一个实施方案中，通过如下方法制备用于GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗的含有BPI基因的重组病毒：将BPI-Fcγ1嵌合基因构建于AAV2型腺伴随病毒载体pSNAV上，得到pSNAV-ssBPI-Fcγ1腺伴随病毒表达载体，其中BPI-Fcγ1嵌合基因的5’端含编码BPI信号肽DNA序列，其5’端和3’端分别连接于CMV启动子和SV40poly A表达控制元件；然后将所得pSNAV-ssBPI-Fcγ1转染BHK-21细胞得到载体细胞株，用重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/ΔUL2感染载体细胞株产生AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒；经提纯、鉴定制备得到用于基因治疗的AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒。采用其它方法如经典的双质粒共转染加辅毒法和Ad-free法等同样可以产生AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒。
本发明人证实，采用AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒进行基因治疗能有效保护受GNB感染攻击的小鼠。由于人Fcγ1不能激活小鼠补体系统参与作用，而人Fcγ1仅可能因种属交叉介导小鼠吞噬细胞产生部分交叉介导调理吞噬效应；由此可见，在实施例中采用AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒进行基因治疗对小鼠产生抗感染保护作用的物质基础主要是BPI，如用单独BPI基因作为治疗基因将得到类似的结果。
根据BPI-Fc兼备BPI和Fc双重功能，即不仅具有中和内毒素和杀伤GNB的作用，而且在同种属间能够通过Fc激活补体和介导调理吞噬迅速发挥杀菌效应，并大大增强杀菌作用；可以期待，在GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗应用中，BPI-Fc嵌合基因可望是比单独BPI基因更为有效的治疗基因。综上，在GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗应用中，含有BPI基因或BPI-Fc嵌合基因的重组病毒都在本发明所述的范围中。
本发明的另一方面，涉及本发明所述的重组病毒用于制备哺乳动物GNB和/或GNB样病原体(如衣原体、立克次体和螺旋体)感染疾病基因治疗的药物组合物的用途；其中所述哺乳动物优选为人。由于BPI及其功能片段对GNB和含有脂多糖结构的GNB样病原体(如衣原体、立克次体和螺旋体)具有广谱杀伤或抑制作用[Elsbach，et al.Curr Opin Immun.10：45(1998)][Beamer，ASM News.68：543(2002)]；再者，BPI-Fc还可以通过Fc激活补体和介导调理吞噬对含有脂多糖结构的GNB样病原体产生非特异杀伤作用[安云庆，医学免疫学基础，北京科学技术出版社，1998年9月第一版，ISDN 7-5304-2124-7]；因此，GNB和/或GNB样病原体(如衣原体、立克次体和螺旋体)感染疾病都可以采用本发明所述的基因治疗方法加以治疗。此外，BPI对真菌具有杀伤或抑制作用，对内毒素具有中和作用；因此，所述的重组病毒用于制备哺乳动物真菌感染疾病及内毒素相关疾病基因治疗的药物组合物的用途，也应在本发明所述的范围中。
本发明的又一方面，涉及一种用于GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗的药物组合物，其中含有本发明所述的重组病毒，以及药学可接受的载体。
另外，用于基因导入的非病毒型载体具有安全性好、易于制备、可大剂量使用的特点，但基因导入效率低、体内应用困难。令人鼓舞的是这类载体的发展较快，虽然用于基因治疗的非病毒载体目前主要是脂质体，但一些靶向性载体和纳米材料载体等也呈现出诱人的前景。因此，非病毒型载体也可以在制备本发明所述的基因治疗药物中的使用。
因此，本发明的再一方面，涉及一种用于GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗的药物组合物，其包含药学可接受的非病毒型载体，以及选自如下的基因构建体：1)人BPI基因或其功能片段基因，或其简并性序列；和2)含有人BPI基因或其功能片段基因，或其简并性序列的嵌合基因，其中在人BPI基因或其功能片段基因的3’端进一步连接人免疫球蛋白重链恒定区Fc基因或其等位体基因。在本发明的一个具体方案中，所述药学可接受的非病毒载体为脂质体。
本发明还涉及一种用于GNB和/或GNB样病原体感染疾病基因治疗的方法，包括：将治疗有效量的本发明所述重组病毒或所述药物组合物施用于患者。
在本发明的一个具体实施方案中，所述基因治疗的方法还包括在施用治疗有效量的本发明所述重组病毒或所述药物组合物的之前、同时或之后将已知抗生素类化合物联合施用于患者的步骤。BPI或其功能片段与抗生素联合施用具有显著协同杀菌效应[Elsbach，et al.Curr Opin Immun.10：45(1998)][Beamer，ASMNews.68：543(2002)]，而本发明所述重组病毒或所述药物组合物在体内通过表达包含人BPI或其功能片段的目的蛋白发挥作用。本发明所述重组病毒或所述药物组合物与抗生素联合施用也具有协同杀菌效应。在本发明的一个具体方案中，AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒与头孢呋辛钠联合应用在体内显示出显著协同抗菌效应。
综上，本发明所述用于基因治疗的重组病毒、药物组合物以及基因治疗的方法对严重感染患者，尤其对肿瘤放化疗、器官移植、AIDS病和手术患者等免疫功能低下、易发严重感染人群，具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1.AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因结构示意图。
图2.RT-PCR检测AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染CHO-K1细胞中BPI-Fcγ1 mRNA转录的凝胶电泳图谱。其中，AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染的CHO-K1细胞出现预期约300bpDNA扩增带(泳道2)，无病毒感染CHO-K1细胞未出现相应扩增带(泳道3)，泳道1为pBR322DNA/Msp I分子量标记。
图3.斑点法检测AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染CHO-K1细胞培养上清中BPI-Fcγ1重组蛋白表达。其中，分别用MOI值为5×104、1×105、5×105(v.g./cell)的AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染的CHO-K1细胞培养上清依次为(斑点1)、(斑点2)和(斑点3)，阳性对照为0.1μg人IgG(斑点4)。由图可知，AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染的CHO-K1细胞培养上清中表达BPI-Fcγ1重组蛋白，且表达量与AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染剂量呈正相关；无病毒感染的CHO-K1细胞培养上清未表达(斑点5)。
图4.Western Blot检测AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染CHO-K1细胞培养上清中BPI-Fcγ1重组蛋白表达。AAV2-BPI-Fcγ1重组感染的CHO-K1细胞培养上清中表达BPI-Fcγ1重组蛋白，在约48KD处显示一条谱带(泳道2)；无病毒感染CHO-K1细胞培养上清中未表达(泳道1)。
图5.BPI-Fcγ1重组蛋白对LPS中和作用的时间关系。其中，PBS+LPS组作为未中和LPS对照组，BPI-Fcγ1重组蛋白作为本底对照组。结果显示，BPI-Fcγ1重组蛋白能有效中和LPS，60min后中和作用显著。
图6.BPI-Fcγ1重组蛋白对LPS中和作用的剂量关系。其中，PBS+LPS组作为未中和LPS对照组，BPI-Fcγ1重组蛋白作为本底对照组。结果显示，BPI-Fcγ1重组蛋白中和LPS具有明显剂量依赖关系。
图7.细菌生长比浊法测定BPI-Fcγ1重组蛋白的体外杀菌作用。其中PBS为对照组。结果显示，BPI-Fcγ1重组蛋白对大肠杆菌O111：B4有明显杀伤作用，在4小时后开始明显抑制生长，并显示剂量依赖关系。
图8.补体对BPI-Fcγ1重组蛋白杀伤GNB的增强作用。结果显示，在补体参与下，BPI-Fcγ1重组蛋白对细菌的杀伤作用显著增强，证实BPI-Fcγ1重组蛋白可通过激活补体增强杀菌效应。
图9.白细胞对BPI-Fcγ1重组蛋白杀伤GNB的增强作用。结果显示，在白细胞(吞噬细胞)参与下，BPI-Fcγ1重组蛋白对细菌的杀伤作用显著增强，证实BPI-Fcγ1重组蛋白可通过调理作用，增强吞噬细胞对细菌的吞噬杀伤作用。
图10.RT-PCR检测AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染小鼠肌肉组织中BPI-Fcγ1 mRNA转录的凝胶电泳图谱。其中，AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染的小鼠1(泳道2)、小鼠2(泳道3)和小鼠3(泳道4)均出现预期约300bp DNA扩增带；正常小鼠对照组小鼠1(泳道5)、小鼠2(泳道6)和小鼠3(泳道7)未出现相应扩增带；泳道1为pBR322 DNA/MspI分子量标记。
图11.免疫组化法检测AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染小鼠肌肉组织中BPI-Fcγ1重组蛋白表达。AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒实验组小鼠注射部位肌肉组织切片均可见肌纤维呈棕黄色表达(图11b)，正常小鼠对照组肌肉组织切片均未见肌纤维着色(图11a)，AAV2-EGFP重组病毒对照组小鼠注射部位肌肉组织切片均可见绿色荧光蛋白表达(图11c)。
图12.AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗对致死量细菌感染小鼠血液和脏器细菌含量的影响。结果显示，AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗组小鼠血清和脏器中细菌含量均显著低于PBS对照组小鼠。
图13.AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗对致死量细菌感染小鼠血清内毒素含量的影响。结果显示，AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗组血清内毒素水平在检测的各时间点均显著低于PBS对照组(用配对t-检验，t＝9.29，p＝0.001)。
图14.AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗的致死量细菌感染小鼠的病理检验。结果显示，与正常小鼠(图14a栏)相比，细菌攻击死亡小鼠(图14b栏)各脏器淤血，血管扩张明显，与内毒素休克引发的病理改变相符；AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗组存活小鼠(图14c栏)各脏器仅可见少量淤血。
图15.AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗对致死量细菌感染小鼠血清中内毒素和促炎细胞因子动态变化的影响。结果显示，在细菌感染后，AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒实验组小鼠血清中内毒素(A)、IL-1β(B)和TNF-α(C)均显著低于PBS对照组小鼠，并且它们都是分别在感染后12小时(实验组小鼠)和18小时(对照组小鼠)达到各自的峰值，其内毒素和促炎细胞因子(IL-1β，TNF-α)动态变化之间呈现相关关系。
下面结合实施例以及附图进一步说明本发明所要求保护的技术方案。
实施例一AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒的制备
1.pSNAV-ssBPI-Fcγ1腺伴随病毒表达载体的构建
提取HL-60细胞(ATCC CCL-240)mRNA(参照QIAGEN公司Oligotex Direct mRNA Kit试剂盒使用说明)；用P1(5’-CCTGAA TTC GGT ACC ATG AGA GAG AAC ATG GCC A-3’，SEQID NO：3)和P2(5’-AGC TGG AAT TCA CGG AT-3’，SEQ IDNO：4)为引物，进行常规RT-PCR扩增(参照Promega公司AccessRT-PCR system试剂盒使用说明)，实验主要参数说明如下：在48℃反转录45分钟后，PCR反应40个循环，其中复性温度为51.5℃。RT-PCR扩增得到含编码BPI信号肽DNA序列(SEQ IDNO：5)的约300bp扩增片段signBPI300。
用EcoR I/Hinc II双酶切signBPI300，回收107bp的EcoRI/Hinc II双酶切片段signBPI107备用；用Hinc II酶切自行构建的质粒pBV-sBPI-Fcγ1，回收1284bp酶切片段sBPI1284；用T4DNA连接酶常规连接signBPI107和sBPI1284，以此连接反应液为模板，用P1和P2为引物，进行常规PCR扩增，实验主要参数说明如下：PCR反应30个循环，其中复性温度为51.5℃。PCR扩增得到约300bp扩增片段ssBPI300。
用Kpn I/EcoR I双酶切ssBPI300，回收272bp的Kpn I/EcoRI双酶切片段ssBPI272；用EcoR I/Sal I双酶切pBV-sBPI-Fcγ1，回收1107bp的EcoR I/Sal I双酶切片段BPI-Fcγ11107；把ssBPI272和BPI-Fcγ11107共连接到pSNAV[伍志坚等，病毒学报，16：1(2000)]的Kpn I/Sal I双酶切位点上，经转化、筛选、酶谱鉴定和DNA测序，准确构建得到含BPI信号肽DNA序列的BPI-Fcγ1嵌合基因及其腺伴随病毒表达载体pSNAV-ssBPI-Fcγ1，其中BPI-Fcγ1嵌合基因编码的BPI-Fcγ1重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述pSNAV-ssBPI-Fcγ1质粒业已于2004年8月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为1205。
2.AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒的产生和制备
由本元正阳基因技术股份有限公司协助制备，制备方法参照文献[伍志坚等，中国科学(C辑)，31：423(2001)][Wu Xiaobing，et al.Chinese Science Bulletin.46：485(2001)]，制备步骤简述如下：将pSNAV-ssBPI-Fcγ1转染BHK-21细胞，用G418筛选得到携带BPI-Fcγ1嵌合基因的载体细胞株，用重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/ΔUL2感染载体细胞株产生AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒，经提纯、鉴定制备得到高滴度AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒(其滴度为5-10×1012v.g./ml)，用于基因治疗研究。AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因结构如图1所示。
实施例二AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒介导BPI-Fcγ1基因在CHO-K1细胞中表达
AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染CHO-K1(ATCC CCL-61)细胞：将生长良好的CHO-K1细胞以1×105细胞/孔铺入6孔板中，在含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液中37℃、5％CO2中培养12小时后；用无血清的DMEM/F12培养液轻柔地漂洗两遍，分别用MOI值为5×104、1×105、5×105(v.g./cell)的AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒在无血清DMEM/F12培养液中感染CHO-K1细胞；培养1小时后，换含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液于37℃、5％CO2中继续培养48-72小时后，检测BPI-Fcγ1基因在CHO-K1细胞中的表达情况；实验设无病毒感染CHO-K1细胞对照组。
1.RT-PCR检测CHO-K1细胞中BPI-Fcγ1mRNA转录情况
提取CHO-K1细胞的mRNA，常规RT-PCR检测BPI-Fcγ1体内的表达情况，实验主要参数说明如下：引物为P1和P2，在48℃反转录45分钟后，PCR反应40个循环，其中复性温度为51.5℃；用2％琼脂糖凝胶电泳鉴定RT-PCR扩增产物。结果如图2所示：AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染的CHO-K1细胞出现预期约300bp DNA扩增带。
2.斑点法(Dot-Blot)检测CHO-K1细胞培养上清中BPI-Fcγ1重组蛋白表达情况
分别取3μl细胞培养上清点样于硝酸纤维素膜上(实验设0.1μg标准人IgG点样作为阳性对照)；用含5％BSA的TBST封闭液封闭后，在含1∶500稀释的HRP标记羊抗人IgG1Fc抗体(购自深圳晶美生物工程有限公司)的溶液中充分孵育结合，用TBST充分洗膜3-4次，用化学发光试剂盒感光显影(参照Pierce公司试剂盒使用说明)。结果如图3所示。AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染的CHO-K1细胞培养上清中表达BPI-Fcγ1重组蛋白，且表达量与AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染剂量呈正相关。
3.Western Blot检测CHO-K1细胞培养上清中BPI-Fcγ1重组蛋白表达情况
取细胞培养上清进行常规Western Blot检测，方法简述如下：取细胞培养上清进行10％SDS-PAGE电泳(+DTT)后，转印到硝酸纤维素膜上；用含5％BSA的TBST封闭液封闭后，在含1∶500稀释的HRP标记羊抗人IgG1 Fc抗体的溶液中充分孵育结合，用TBST充分洗膜3-4次，用化学发光试剂盒感光显影。结果如图4所示：AAV2-BPI-Fcγ1重组感染的CHO-K1细胞培养上清中表达BPI-Fcγ1重组蛋白，在约48KD处显示一条谱带。
可见，AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒介导BPI-Fcγ1基因完整表达目的蛋白。
实施例三BPI-Fcγ1重组蛋白的生物学特性及其功能
1.BPI-Fcγ1重组蛋白对LPS的中和作用：
(1)、取200μl BPI-Fcγ1重组蛋白(25μg/ml)与200μl LPS溶液(0.5Eu/ml)混匀，37℃水浴孵育，每隔30min取样100μl；置于不含热原质的试管内，然后参照鲎试剂盒(购自上海伊华临床医学科技公司)操作说明，依次加入50μl鲎试剂混匀，37℃水浴25分钟；加入50μl显色基质鲎三肽混匀，37℃水浴3分钟；再加入偶氮试剂混匀显色，测OD545nm值。实验设PBS+LPS组作为未中和LPS对照组，设BPI-Fcγ1重组蛋白作为本底对照组。结果如图5所示：BPI-Fcγ1重组蛋白能有效中和LPS，60min后中和作用显著。
(2)、分别取50μl不同稀释度的BPI-Fcγ1重组蛋白与50μlLPS(0.5Eu/ml)混匀，37℃水浴孵育60min后，参照鲎试剂盒操作说明，依次加入50μl鲎试剂混匀，37℃水浴25分钟；加入50μl显色基质鲎三肽混匀，37℃水浴3分钟；再加入偶氮试剂混匀显色，测OD545nm值。实验设PBS+LPS组作为未中和LPS对照组，设BPI-Fcγ1重组蛋白作为本底对照组。结果如图6所示：BPI-Fcγ1重组蛋白中和LPS具有剂量依赖关系。
2.BPI-Fcγ1重组蛋白的体外杀菌作用：
采用细菌生长比浊法测定，简述如下：取100μl E.coliO111：B4(CMCC(B)No.44101-9)菌液(1×106CFU/ml)，分别与100μl不同浓度(6μg/ml和0.6μg/ml)的BPI-Fcγ1重组蛋白混匀后，加入到4ml LB培养液中37℃振荡培养，每隔2小时取样600μl测OD600nm值；实验设PBS对照组。结果如图7所示：BPI-Fcγ1重组蛋白对E.coli O111：B4有明显杀伤作用(在4小时后开始明显抑制生长)，并显示剂量依赖关系。
3.补体对BPI-Fcγ1重组蛋白杀伤GNB的增强作用：
本实验选用的细菌是E.coli O111：B4，菌液浓度约为104CFU/ml。实验设如下4组。(1)细菌对照组：取100μl菌液与100μl生理盐水混匀，37℃水浴1小时；把菌液平均均匀涂布于4块平板，37℃培养16小时，菌落计数取均值。(2)补体对照组：取100μl菌液与100μl新鲜豚鼠血清混匀，37℃水浴1小时；余同细菌对照组。(3)重组蛋白对照组：取100μl菌液分别与100μl不同稀释度BPI-Fcγ1重组蛋白混匀，37℃水浴3小时；余同细菌对照组。(4)重组蛋白加补体实验组：取100μl菌液分别与100μl不同稀释度BPI-Fcγ1重组蛋白混匀，37℃水浴3小时后，每管各加100μl新鲜豚鼠血清混匀，37℃水浴1小时；余同细菌对照组。结果如图8所示：在补体参与下，BPI-Fcγ1重组蛋白对细菌的杀伤作用显著增强，证实BPI-Fcγ1重组蛋白可通过激活补体增强杀菌效应。
4.白细胞对BPI-Fcγ1重组蛋白杀伤GNB的增强作用：
本实验选用的细菌是大肠杆菌E.coli O111：B4，菌液浓度约为104CFU/ml。实验设如下4组。(1)细菌对照组：取100μl菌液加100μl生理盐水混匀，37℃水浴1小时；把菌液平均均匀涂布于4块平板，37℃培养16小时，菌落计数取均值。(2)白细胞对照组：取100μl菌液与100μl人周血白细胞(1×105白细胞/ml)混匀，37℃水浴1小时；余同细菌对照组。(3)重组蛋白对照组：取100μl菌液分别与100μl不同稀释度BPI-Fcγ1重组蛋白混匀，37℃水浴3小时；余同细菌对照组。(4)重组蛋白加白细胞实验组：取100μl菌液分别与100μl不同稀释度的BPI-Fcγ1重组蛋白混匀，37℃水浴3小时后，每管各加100μl白细胞(1×105白细胞/ml)混匀，37℃水浴1小时；余同细菌对照组。结果如图9所示：在白细胞(吞噬细胞)参与下，BPI-Fcγ1重组蛋白对细菌的杀伤作用显著增强，证实BPI-Fcγ1重组蛋白可通过调理作用，增强吞噬细胞对细菌的吞噬杀伤作用。
实施例四
AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒介导BPI-Fcγ1基因在小鼠中表达及体内抗感染作用
(一)病毒介导BPI-Fcγ1基因在小鼠中表达目的蛋白及其生物学作用：
在5-6周龄Balb/c小鼠右后肢股四头肌注射AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒(5×1010v.g./100μl/每只)，1-2周检测BPI-Fcγ1基因的表达情况；实验设注射PBS的正常小鼠对照组和AAV2-EGFP重组病毒对照组。
1.RT-PCR检测小鼠肌肉组织中BPI-Fcγ1 mRNA转录情况：
提取注射病毒小鼠的注射部位肌肉组织mRNA；用常规RT-PCR检测BPI-Fcγ1 mRNA的体内转录情况；引物为P1和P2，在48℃反转录45分钟后，PCR反应40个循环，其中复性温度为51.5℃；用2％琼脂糖凝胶电泳鉴定RT-PCR扩增产物。结果如图10所示：AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒感染的小鼠出现预期约300bp的DNA扩增带。
2.免疫组化法检测小鼠肌肉组织中BPI-Fcγ1重组蛋白表达情况：
方法简述如下，取注射病毒小鼠注射部位肌肉组织，按常规做石蜡包埋后切片(4-5μm)平铺于玻片上，用清洗剂脱蜡，再依次用乙醇和蒸馏水洗涤，后用3％过氧化氢孵育8min去除内源性过氧化物酶，经PBS洗涤后用封闭液封闭组织切片后，用1∶100HRP标记鼠抗人IgG Fc抗体37℃孵育结合1小时，PBS洗片3次，用DAB显色试剂常规显色，封片后镜下观察组织染色情况。AAV2-EGFP对照组小鼠肌肉组织做冰冻切片(8μm)，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在小鼠肌肉组织中的表达情况。结果如图11所示：AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒实验组小鼠注射部位肌肉组织切片均可见肌纤维呈棕黄色表达，正常小鼠对照组肌肉组织切片均未见肌纤维着色，AAV2-EGFP重组病毒对照组小鼠注射部位肌肉组织切片均可见绿色荧光蛋白表达。
3.小鼠血清中目的基因产物检测及其生物学作用
注射病毒2周后对小鼠进行摘除眼球采血，其中1/3制备抗凝血、2/3制备血清。各组小鼠(3只/组)抗凝血和血清分别混合后，检测血清中目的基因产物及其主要生物学作用。
(1)、采用改进的ELISA法(Modified enzyme-linkedimmunosorbent assay)检测小鼠血清中的目的基因产物BPI-Fcγ1嵌合蛋白，方法简述如下：将直径为5毫米的硝酸纤维素滤膜圆碟分别置于100μL小鼠血清、10％白蛋白溶液(空白试验对照)中充分吸附15分钟；取出自然干燥(20分钟)后，将滤膜圆碟分别置于未包被的ELISA板孔中；之后参照BPI ELISA试剂盒(购自Hycult biotechnology.b.V)说明，加100μL生物素化抗BPI抗体，室温作用1小时；洗涤4次后，加100μL亲和素化的辣根过氧化物酶，室温作用1小时；洗涤4次后，加100μL显色剂，室温避光反应20分钟，加100μL终止液，混匀后立即测量OD450值(同一实验重复三次)。结果显示，对照组小鼠血清OD450值[0.283+0.026(n＝3)]与白蛋白空白试验对照组OD450值[0.290±0.020(n＝3)]无差异(t＝0.23，P＝0.832)；AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒实验组小鼠血清OD450值[0.849±0.164(n＝3)]和对照组小鼠血清OD450值存在显著性差异(t＝5.92，P＝0.024)。上述结果证实在AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒实验组小鼠血清中存在表达分泌的目的基因产物。
(2)、取小鼠血清50μL与50μL内毒素含量为1.0EU/mL的无热源水溶液混匀，37℃水浴30min后，参照鲎试剂盒操作说明，检测小鼠血清中目的基因产物对内毒素的中和作用(同一实验重复三次)。结果显示：AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒实验组小鼠血清OD545值为0.173±0.021(n＝3)；对照组小鼠血清OD545值为0.287±0.021(n＝3)；无热源水对照组OD545值为0.087±0.005(n＝3)。AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒实验组小鼠血清和小鼠对照组小鼠血清OD545值存在显著性差异(t＝6.61，P＝0.003)。上述结果表明，AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒实验组小鼠血清中存在的目的基因产物对内毒素具有中和作用。
(3)、取小鼠血清100μl与100μl E.coli O111：B4菌液(1X103CFU/mL)混匀，4℃作用15分钟后，采用平板倾注法进行细菌涂板，每份待检样本平分倾注两块平板，37℃培养16小时，菌落计数取均值(同一试验重复三次)。结果显示：AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒实验组小鼠血清和对照组小鼠血清菌落计数分别为22.5±5.20(n＝3)和33.00±4.93(n＝3)(t＝3.88，P＝0.018)。上述结果表明，AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒实验组小鼠血清中存在的目的基因产物对E.coli具有杀伤作用。
(二)、AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗对致死量GNB感染小鼠的保护作用
大肠杆菌(E.coli)O111：B4腹腔感染Balb/c小鼠的最小致死量(minimal lethal dose，以下简称MLD)测定：用含5％高活性干酵母的PBS将大肠杆菌O111：B4稀释成不同浓度菌液，对随机分组的6-7周龄Balb/c小鼠腹腔注射菌液(0.5ml/每只)，观察小鼠的死亡情况；将72小时内引起80-100％小鼠死亡的最低菌量作为MLD。结果如表1所示，把2.5×104cfu确定为Balb/c小鼠腹腔注射(0.5ml/每只)大肠杆菌O111：B4的MLD。
表1、大肠杆菌O111：B4腹腔感染Balb/c小鼠的最小致死量(MLD)测定
Figure C20058000053800281
对随机分组的5-6周龄Balb/c小鼠每只在右后肢股四头肌注射5×010v.g./100μlAAV2-BPI-Fcγ1重组病毒，1-2周对每只小鼠腹腔注射1MLD的大肠杆菌O111：B4菌液(0.5ml/每只)进行感染攻击，进行如下观察和检测；实验设PBS对照组和AAV2-EGFP重组病毒对照组。
1.对致死量细菌感染小鼠的保护作用：
观察上述小鼠的死亡情况，结果如表2所示：AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗对最小致死量大肠杆菌O111：B4感染小鼠有明显保护作用。
表2、AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗对最小致死量大肠杆菌O111：B4感染小鼠的保护作用
Figure C20058000053800291
2.对致死量细菌感染小鼠血液和脏器细菌计数
分别在细菌感染攻击后不同时间，按下述方法采血、取脏器进行细菌计数：(1)、小鼠眼球采血，静置40min，1000rpm/min离心10min，取血清做1∶10稀释，制成血清样本；(2)、分别取小鼠肝脏和脾脏，用无菌生理盐水冲洗，加3ml无菌生理盐水，用无菌细胞筛碾磨，制成脏器匀浆液标本。各取上述血清标本和脏器匀浆液标本各50μl做细菌涂板(每个标本均做重复涂板)，37℃培养16小时，菌落计数取均值。结果如图12所示：AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗组小鼠血清和脏器中细菌含量显著低于PBS对照组小鼠。
3.对致死量细菌感染小鼠血清内毒素水平的检测：
在细菌感染攻击后不同时间眼球采血，所获血清用无热源水1∶10稀释后，按鲎试剂盒操作说明检测血清中内毒素水平变化趋势。结果如图13所示：AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗组血清内毒素水平在检测的各时间点均显著低于PBS对照组(用配对t-检验，t＝9.29，p＝0.001)。
4.对致死量细菌感染小鼠的病理检验：
取正常Balb/c小鼠、细菌攻击死亡小鼠和AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗组72小时后存活小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和小肠组织切片进行HE染色后观察各脏器的病理改变。结果如图14所示：与正常小鼠相比，细菌攻击死亡小鼠各脏器淤血，血管扩张明显，与内毒素休克引发的病理改变相符；AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗组存活小鼠各脏器仅可见少量淤血。
5.致死量细菌感染小鼠血清中内毒素和促炎细胞因子动态变化及其相关关系
在致死量细菌感染攻击后不同时间对小鼠进行摘除眼球采血获得血清，将各组小鼠(3只/组)血清分别混合后，参照鲎试剂盒操作说明检测混合血清中内毒素和参照ELISA试剂盒(购自R&D Systems Inc.)操作说明检测促炎细胞因子的含量(同一实验重复三次)。
小鼠血清中内毒素和促炎细胞因子(IL-1β，TNF-α)含量动态变化如图15所示：在细菌感染后，AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒实验组小鼠血清中内毒素、IL-1β和TNF-α均显著低于对照组小鼠，并且它们都是分别在感染后12小时(实验组小鼠)和18小时(对照组小鼠)达到各自的峰值，其内毒素和促炎细胞因子(IL-1β，TNF-α)动态变化之间呈现相关关系。对照组小鼠血清中促炎细胞因子含量大幅度升高(感染后18小时达到峰值)，与该组小鼠感染后高达92.5％的死亡率(感染后18小时开始死亡)(见表1)相对应。
上述实验结果表明，AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒基因治疗能显著降低血清中内毒素和促炎细胞因子水平，抵抗由致死量细菌感染引发的内毒素中毒性休克。
(三)、AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒与抗生素联合应用对致死量GNB感染小鼠的协同保护作用
取5-6周龄Balb/c小鼠随机分为四组，每组10只。用最小致死量E.coli O111：B4腹腔感染各组小鼠一小时后，分别用浓度为125μg/mL、500μg/mL、和1000μg/mL头孢呋辛钠给各组小鼠肌肉注射(100μL/只)。结果发现：注射抗生素后72小时之内，第一组小鼠全部死亡；第三、第四组小鼠全部存活；第二组小鼠死亡率为91.4％±3.5％(n＝4)，故将该组小鼠所用的头孢呋辛钠剂量(250μg/mL×100μL/只＝25μg/100μL/只)定为协同作用剂量。
小鼠分为以下四组：PBS组、头孢呋辛钠组(25μg/100μL/只)、AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒组、AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒与头孢呋辛钠(25μg/100μL/只)联合应用组，每组小鼠10只。用最小致死量E.coli O111：B4腹腔感染后，观察各组小鼠72小时内的存活率(同一实验重复两次)。结果发现：AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒与头孢呋辛钠联合应用组小鼠存活率为60～70％，显著高于头孢呋辛钠组(存活率0～10％)和AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒组(存活率30％)小鼠。上述试验结果表明，AAV2-BPI-Fcγ1重组病毒与抗生素联合应用具有协同抗菌效应，可显著增强小鼠对最小致死量E.coli感染的抵抗作用。
SEQUENCE LISTING
<110>首都医科大学
     陈金栋
<120>一种含BPI基因的重组病毒及含有其的药物组合物及其用途
<130>IEC050023PCT
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<160>5
<170>PatentIn version 3.1
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
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Ala Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile
            20                  25                  30
Lys Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe Lys Ile Lys His Leu Gly Lys
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    50                  55                  60
Ser Ser Gln Ile Ser Met Val Pro Asn Val Gly Leu Lys Phe Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ser Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg
                85                  90                  95
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        275                 280                 285
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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385                 390                 395                 400
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
                405                 410                 415
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            420                 425
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<223>primer
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<212>DNA
<213>artificial sequence
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atgagagaga acatggccag gggcccttgc aacgcgccga gatgggtgtc cctgatggtg     60
ctcgtcgcca taggcaccgc cgtgacagcg gcc                                  93

Claims (12)

1.一种重组病毒，其包含病毒载体，以及选自如下的基因构建体：
1)人BPI基因，或其简并性序列；和
2)人BPI基因功能片段BPI1-199或其简并性序列的嵌合基因，其中在人BPI基因功能片段BPI1-199的3’端进一步连接人免疫球蛋白重链恒定区Fc基因或其等位体基因。
2.权利要求1所述的重组病毒，其中所述的病毒载体选自腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体和逆转录病毒载体，或者无病毒基因病毒载体。
3.权利要求2所述的重组病毒，其中所述无病毒基因病毒载体选自腺伴随病毒载体、腺病毒微载体(Mini-Ad)和HSV扩增子载体。
4.权利要求3所述的重组病毒，其中所述腺伴随病毒载体为基于AAV1-AAV88种血清型腺伴随病毒的AAV载体。
5.权利要求4所述的重组病毒，其中所述腺伴随病毒载体为AAV2、AAV1、AAV3、AAV5型腺伴随病毒载体及其杂合载体。
6.权利要求5所述的重组病毒，其中所述腺伴随病毒载体为AAV2型腺伴随病毒载体。
7.权利要求1所述的重组病毒，其中所述人免疫球蛋白重链恒定区Fc基因为选自如下之一：Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cα1和Cα2基因。
8.权利要求1所述的重组病毒，其为含有BPI-Fcγ1嵌合基因的AAV2型重组腺伴随病毒，其中所述BPI-Fcγ1嵌合基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其由人BPI1-199功能片段基因和人Fcγ1基因嵌合而成，且其5’端和3’端分别连接于CMV启动子和SV40poly A表达控制元件。
9.权利要求1所述的重组病毒用于制备针对哺乳动物GNB和/或GNB样病原体感染的疾病的基因治疗的药物组合物的用途。
10.权利要求9所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
11.权利要求9所述的用途，其中所述GNB和/或GNB样病原体选自衣原体、立克次体和螺旋体。
12.一种用于GNB和/或GNB样病原体感染疾病的基因治疗的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的重组病毒，以及药学可接受的载体。
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