CN100523199C - 茶叶的不耐热咖啡因组分以及该组分在将农杆菌介导的遗传转化引入植物的有效方法中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种不耐热咖啡因组分，该组分用于在植物系统中进行有效的农杆菌介导遗传转化以在植物中开发所需特性，同时涉及从茶叶中制备所述组分的方法，以及用所述茶叶的咖啡因组分将所述农杆菌属介导的遗传转化引入植物系统中的有效且费用低廉的方法。

Description

茶叶的不耐热咖啡因组分以及该组分在将农杆菌介导的遗传转化引入植物的有效方法中的应用
技术领域
本发明涉及一种用于在植物系统中开发所需植物特性的有效的农杆菌介导遗传转化的不耐热咖啡因组分，和从茶叶中制备该组分的方法，及使用所述的茶叶的咖啡因组分把农杆菌介导的遗传转化引入植物系统中的有效且费用低廉的方法。
背景技术
农杆菌是一种革兰氏阴性土壤细菌，它把它的Ti质粒或“肿瘤诱导质粒”转运到大多数双子叶植物和许多单子叶植物的细胞中。Ti质粒经历细胞-细胞识别、信号转导、细胞和核输入和最终的T-DNA整合(Winans SC Two-way chemical signalingin Agrobacterium-plant interactions Microbiological-Reviews.1992，56：1，12-31)。
包含在每一边受到25bp不完全边界重复限制的肿瘤基因的转运DNA或T-DNA产生遗传转化和从而产生冠瘿病。信号转导的过程被一组各种“毒性基因”启动，其中7个基因是最重要的。
信号接受的第一步和随后的转导是由诱导剂如苯酚和糖启动的(Ankenbauer RG；Nester EW Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulencegenes：structural specificity and activities of monosaccharides.Journal ofBacteriology.1990，172：11，6442-6446)。
在过去二十年间，已进行了开发遗传转化植物的革命性的工作，其中农杆菌的去臂株(即肿瘤基因被感兴趣的基因替代的Ti质粒)被用于在较短时间内按照要求生产植物。用于该遗传转化试验的诱导剂通常是由Sigma Aldrich Company，USA提供的商业上获得的乙酰丁香酮(Morris JW；Morris R0 Identification of anAgrobacterium tumefaciens virulence gene inducer from the Pinaceousgymnosperm Pseudotsuga menziesii.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 1990，87：9，3614-3618)和羟基乙酰丁香酮。
已知茶叶在提取时有咖啡因组分、儿茶素和其他黄酮醇及氨基酸。某些偶然的实验指出包含咖啡因的茶的特别部分能促进农杆菌的转染、细胞-细胞识别和毒性。这使我们相信咖啡因组分在遗传转化实验中可代替乙酰丁香酮或羟基乙酰丁香酮用作毒性诱导剂。
除了含有高水平的6种儿茶素(C)和它们的衍生物，即表儿茶素(EC)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸盐(ECg)、表没食子儿茶素没食子酸盐(EGCg)，茶叶还含有咖啡因、氨基酸、含氮化合物、维生素、无机元素、碳水化合物和脂质(Chu DC and Juneja L.R.General chemical composition of greentea and its infusion.In：Chemistry and Application of Green Tea.1997.CRCPress，N.York.编，Yamamoto T.，Juneja L.R.，Chu DC，Kim M.，pp.)。
Sunilkumar等，1999的报道(Sunilkumar G；Vijayachandra K；Veluthambi K1999，Pre-incubation of cut tobacco leaf explants promotes Agrobacterium-mediated transformation by increasing vir gene induction.Plant ScienceLimerick.141：1，51-58)指出，为了增加转化效率的预培育可以通过在与农杆菌共培养时加入100μM乙酰丁香酮到新切叶边来消除。在预培育期间通过叶边产生的vir基因诱导剂是用来在预培育时增加农杆菌的转化效率的重要因素，但是缺点在于诱导剂“乙酰丁香酮”和预培育的效果是类似的，则诱导剂没能起多大作用。
根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)毒性(vir)基因的表达和通过该生物体的对双子叶植物的转化依赖于宿主植物的酚化合物和各种烷基丁香酰胺、丁香酸、合成的酰胺如乙烷丁香酰胺、阿魏酸或芥子酸，它们是vir基因的有力的诱导剂(Virgene inducing activities of hydroxycinnamic acid amides in Agrobacteriumtumefaciens Berthelot，K；Buret，D；Guerin，B；Delay，D；Negrel，J；Delmotte，FM.Phytochemistry.1998，49：6，1537-1548)。
但是，测试的诱导剂没有显示出比作为vir基因诱导的参考化合物的乙酰丁香酮更高的活性，除了在高于1mM浓度的乙烷丁香酰胺。在测试根瘤农杆菌(A.tumefaciens)菌株A348(pSM243cd)时，乙烷阿魏酰胺和乙烷芥子酰胺比相应的酚更有效，只是在100μM以上。
上述诱导剂的主要缺点在于这些需要在超过100μM的高浓度使用的化合物是十分昂贵的。而且，化合物如乙酰丁香酮只能由少数公司生产，如Sigma Aldrich，发展中国家的实验室需要从美国进口。
Lee等，1995(Lee，YongWoog；Jin ShouGuang；Sim，WoongSeop；Nester，EW；Lee，YW；Jin，SG；Sim，WS Proceedings of the National Acadamy Of Sciencesof the United States of America.1995 Genetic evidence for direct sensingof phenolic compounds by the VirA protein of Agrobacterium tumefaciens.92：26，12245-12249。)提到，根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的毒性(vir)基因可以通过由VirA和VirG蛋白组成的两个成分的调节系统被低分子量酚化合物和单糖诱导。使用根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的四种野生型KU12，C58，A6和Bo542来测试15种不同的酚化合物如乙酰香兰酮。通过转移不同的Ti质粒到同基因染色体背景，酚表意决定子(phenoic-sensing determinant))显示出与Ti质粒有关。Ti质粒的亚克隆说明vira位置决定了酚化合物对vir基因活化的功能。这些结果提示VirA蛋白直接使酚化合物表意活化vir基因。该报道的缺点在于需要Ti质粒的亚克隆以确定对vir位置准确的酚诱导剂。
Hess等，1991(Hess，KM；Dudley，MW；Lynn，DG；Joerger.RD；Binns，AN.1991，Mechanism of phenolic activation of Agrobacterium virulence genes：development of a specific inhibitor of bacterial sensor/response systems.Proceedings of the National Acadamy Of Sciences of the United States ofAmerica.1991，88：17，7854-7858)提到，二氢二松柏醇糖苷的配基是根瘤农杆菌(A.tumefaciens)中毒性基因表达的有利的诱导剂。使用该模型，开发了vir诱导的特别抑制剂。该报道的缺点在于该抑制剂不影响Ti质粒其他基因的表达但不可逆地阻滞vir表达。
Fortin等，1992(Fortin，C；Nester，EW；Dion，P.1992，Growth inhibitionand loss of virulence in cultures of Agrobacterium tumefaciens treated withacetosyringone.Journal of Bacteriology.174：17，5676-5685)提到，乙酰丁香酮，一种根瘤农杆菌(A.tumefaciens)中毒性(vir)基因的酚诱导剂，抑制在酸性条件下培育的胭脂碱类型T37和C58。两种其他vir诱导剂，芥子酸和丁香醛也抑制生长和促进培养的C58F和T37类型中无毒性克隆的积聚。在另一方面，各种报道的不诱导vir基因的乙酰丁香酮类似物不作为生长抑制剂。C58F类型的突变体缺少在乙酰丁香酮存在的情况下诱导virB::lacZ融合的能力。该报道的缺点在于某些诱导剂是促进性的，其他是抑制性的，也是类型特异性的。
Delmotte等，1999(Delmott FM；Delay D；Cizeau J；Guerin B；Leple JC 1991.Agrobacterium vir-inducing activities of glycosylated acetosyringone，acetovanillone，syringaldehyde and syringic acid derivatives.Phytochemistry，30：11，3549-3552.)提到，使用包含virE::lacZ融合质粒的根瘤农杆菌菌株A348(pSM358)检测13种合成乙酰丁香酮、乙酰香兰酮、丁香醛和丁香酸β-糖苷诱导毒性的能力，使用4-甲基伞形酮-β-半乳吡喃糖作为底物用荧光光谱测定法检出报告子β-半乳糖苷酶的活性。乙酰丁香酮基β-L-吡喃岩藻糖苷(Acetosyringonyl beta-L-fucopyranoside)是检出的最活跃的单糖苷(monoglycoside)，甚至在高浓度该化合物没有毒性效应。但是，单糖苷与自由的乙酰丁香酮相比是较低活性vir诱导剂。相反，丁香醛的β-麦芽糖在高浓度时显示出比游离苯酚更高的活性。该糖基化诱导剂的活性可与细菌细胞表面的特定糖受体有关。该报道的缺点在于乙酰丁香酮是昂贵的化合物，需要从Sigma Aldrich，USA进口。
发明目的
本发明的主要目的是开发一种用于在植物中进行农杆菌介导的遗传转化的不耐热咖啡因组分。
本发明的另一个主要目的是从茶叶中研制不耐热咖啡因组分。
本发明的另一个目的是使从茶叶中研制不耐热咖啡因组分具有特征。
本发明的另一个目的是从茶叶中研制具有在植物中诱导菌株非特异型农杆菌介导的遗传转化的能力的组分。
本发明的另一个目的是开发用于植物的农杆菌介导遗传转化的天然和有效的诱导剂。
本发明的另一个目的是开发用于植物中的农杆菌介导遗传转化的经济和性价比高的诱导剂。
本发明的另一个目的是确定用于植物中的农杆菌介导遗传转化的茶叶氯仿部分组分的理想浓度范围。
本发明进一步的另一个目的是开发从茶叶中制备不耐热咖啡因组分的方法。
本发明的另一个主要目的是开发从茶叶提取物中制备有诱导在植物中的农杆菌介导遗传转化的特性的氯仿组分的方法。
本发明进一步的另一个目的是开发一种诱导所述的在植物中的农杆菌介导遗传转化的有效方法。
本发明的另一个目的是开发一种使用所述的茶叶中咖啡因组分诱导所述的在植物中的农杆菌介导遗传转化的有效方法。
本发明的另一个目的是开发一种诱导所述的在植物中的农杆菌介导遗传转化的性价比高的方法。
本发明的另一个目的是开发一种使用天然产生物质诱导所述的在植物中的农杆菌介导遗传转化的方法。
本发明的另一个目的是开发一种替代昂贵的转化诱导剂如乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮的替代物。
本发明进一步的另一个目的是开发一种通过农杆菌介导的遗传转化使用所述的茶叶中咖啡因组分诱导所需要的植物特性的基因进入植物的方法。
本发明进一步的另一个目的是比较高压灭菌和过滤灭菌的咖啡因组分的转化诱导活性。
发明概述
本发明涉及一种不耐热咖啡因组分，该组分用于在植物系统中进行有效的农杆菌介导遗传转化以在植物中开发所需特性，同时涉及从茶叶中制备所述组分的方法，以及用所述茶叶的咖啡因组分将所述农杆菌属介导的遗传转化引入植物系统中的有效且费用低廉的方法。
发明详述
因此，本发明涉及一种用于在植物系统中开发所需植物特性的有效的农杆菌介导遗传转化的不耐热咖啡因组分，和从茶叶中制备该组分的方法，及使用所述的茶叶的咖啡因组分把农杆菌属介导的遗传转化引入植物系统中的有效且费用低廉的方法。
在本发明的一个实施方案中，其中使用茶叶中不耐热咖啡因组分作为天然诱导剂用于细菌根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化到植物中在植物中产生所需特性的费用低廉且有效的方法。所述方法包括以下步骤：
·把所述细菌接种到液态改良的酵母甘露醇肉汤(liquid modified YeastMannitol Broth)，
·把接种体在约25-30℃，在黑暗中以约150-200rpm培育约12-16小时，
·收集600nm下光密度约0.6-0.8的培育接种体以得到处于细菌生长对数期的1×109细胞/ml从而获得沉淀(pellet)，
·将该沉淀悬浮于新鲜的酵母甘露醇肉汤但不损伤细菌细胞以获得悬液，
·把不同植物的外植体浸在细菌悬液中约5-35分钟，
·在培育介质中以1-10天的不同时间培育外植体，
·在新鲜的细菌培养物中使用浓度为约0.5-300μg/ml的咖啡因组分以诱导vir基因，从而把带有转基因的Ti质粒转到植物中，以便用具有所需特性的基因遗传转化该植物。
在本发明的另一个实施方案中，其中，通过在25-30℃以4000-8000rpm离心15-30分钟来沉淀活细菌细胞。
在本发明的另一个实施方案中，其中，咖啡因组分与商业上获得的诱导剂相比是更佳的诱导剂。
在本发明的另一个实施方案中，其中从茶树植物中制备不耐热咖啡因组分的方法，该方法包括以下步骤：
·用约10-40％的丙酮水溶液在室温下提取干燥的茶叶过夜，
·用n-己烷提取滤得的茶叶提取物以获得水性层和脂质层，
·用石油醚和乙酸乙酯提取水性层以从水性层中除去儿茶素，
·用氯仿提取步骤(c)中的水性层以获得氯仿层，
·评估氯仿层中总的咖啡因组分浓度，
·用高压灭菌和过滤灭菌来灭菌咖啡因组分以获得所述的组分。
在本发明的另一个实施方案中，其中，不耐热咖啡因组分。
在本发明的另一个实施方案中，茶叶的不耐热咖啡因组分，一种用于农杆菌介导遗传转化的乙酰丁香酮的替代物，其步骤包括：
(i)把根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的两个菌株，即包含卡那霉素和潮霉素抗生素抗性基因的EHA105(无害的)和GV2260(有毒的)，和各个菌株的母系培养物的gus报道基因接种到10-30ml的有卡那霉素或潮霉素的液态改良的酵母甘露醇肉汤，
(ii)在25-30℃和在黑暗中以150-200rpm培育12-16小时，
(iii)收集600nm下光密度约0.6-0.8的培育接种体以得到处于细菌生长对数期的1×109细胞/ml，
(iv)在25-30℃以4000-8000rpm离心15-30分钟来沉淀活细菌细胞
(v)将该沉淀悬浮于5-25ml新鲜的酵母甘露醇肉汤但不损伤细菌细胞，
(vi)通过在600nm测量光密度使细菌细胞密度在1×109细胞/ml最优化，
(vii)把不同植物的各种外植体在细菌悬液中浸5-35分钟，
(viii)在滤纸上处理外植体以除去多余的根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)，
(ix)在培育介质中以1-10天的不同时间培育外植体，
(x)100-500g的Kangra jat茶叶在60℃的烤箱中干燥至恒重，
(xi)干燥的茶叶在室温用0.4-1.2升10-40％的丙酮水溶液提取过夜并过滤，
(xii)用100-500ml n-己烷提取滤液以获得两层以便除去脂质，
(xiii)取得水性层并用石油醚(100-300ml)和乙酸乙酯(100-400ml)提取以除去儿茶素，
(xiv)取得水性层并用氯仿(100-400ml)和氨溶液(3-10％)提取，
(xv)氯仿层被浓缩到10-50ml并估计总的咖啡因，
(xvi)浓缩氯仿层作为咖啡因组分，
(xvii)用高压灭菌和过滤灭菌来灭菌咖啡因组分，
(xviii)用浓度为0.5-300μg/ml的咖啡因组分代替乙酰丁香酮用于新鲜的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)培养物，
(xix)把不同植物的各种外植体转移到含有0.5-300μg/ml不同浓度咖啡因组分的重建介质中以诱导vir基因和增加转化效率，
(xx)把无外植体的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转移到含有选择抗生素的重建介质中以进一步重建和开发转基因植物，和
(xxi)使用乙腈和磷酸在梯度模式(0.05到0.2％)通过HPLC比较分析咖啡因组分(高压灭菌和过滤灭菌，参见图1和图2)和儿茶素组分以及粗制的茶提取物，以便使用二极管排列探测器在250到280nm波长检测毒性诱导化合物，如下表1和表2所示。
表1  一过滤灭菌的咖啡因组分
 
浓度(μg/ml) 12小时 14小时 18小时 20小时
C0 0.377 0.377 0.377 0.393
C50 0.36 0.396 0.416 0.409
C100 0.352 0.39 0.423 0.415
表2  一高压灭菌的咖啡因组分
 
浓度(μg/ml) 0小时 6小时 12小时 18小时 24小时
C0 0.1 0.37 0.42 0.443 0.445
C50 0.104 0.367 0.429 0.423 0.402
C100 0.109 0.371 0.44 0.428 0.432
在本发明的另一个实施方案中，通过农杆菌在植物中遗传转化是通过诱导毒性或vir基因和转移包含转基因的Ti质粒进入植物组织来进行的。在编码所需的特性如抗病和抗压力、农作物质量、味道、更好的保存期的转基因在引入植物组织中，与传统繁育相比，可在更短的时间内改善作物。通常的酚诱导剂可用于vir基因的诱导，常见的商品化诱导剂是乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮。这些商品化诱导剂不仅昂贵而且限制在少数公司如Sigma Aldrich，USA。
在本发明的另一个实施方案中，茶叶的咖啡因组分有替代这些商品化诱导剂的可能，因为它们可以诱导vir基因和产生遗传转化。这些容易获得的天然组分不仅有效而且还可改善转化效率。
在本发明的另一个实施方案中，来自茶叶的毒性诱导剂咖啡因组分可被用于使用不同植物种类的不同外植体的转基因生产。
在本发明的另一个实施方案中，不同浓度的过滤灭菌的茶叶咖啡因组分按上述内容加入。
在本发明的另一个实施方案中，不同浓度的高压灭菌的茶叶咖啡因组分按上述内容加入。
在本发明的另一个实施方案中，产气荚膜杆菌，一种食品携带的病原体，在肠内在孢子形成期间产生毒素对人类产生中毒效应。为确定在全世界饮食中大量消耗的咖啡因在孢子形成和随后的毒素形成时的效应进行调查。在100μg咖啡因/ml或200μg可可碱/ml存在时，产气荚膜杆菌NCTC 8679的孢子形成从<1到80或85％。肠毒素浓度从检测不出的水平到450μg/mg的细胞提取蛋白质的水平。抗热孢子的水平从<1000增加到在1×107和2 x 107/ml之间。咖啡因引起有可收缩孢子的细胞的百分比的3-到4-倍的增加和肠毒素浓度的类似增加。
在本发明的另一个实施方案中，对咖啡因刺激产气荚膜杆菌孢子形成机理的研究指出暴露在咖啡因的培养物有明显提高的细胞间三磷酸腺苷和三磷酸鸟苷水平(Nolan LL；Labbe RG；Crake LE(ed.)；Nolan L(ed.)；Shetty K Effect of plantalkaloids on the sporulation of a food-borne pathogen.Internationalsymposium on medicinal and aromatic plants，Amherst，Massachusetts，USA，27-30Aug.1995.Acta-Horticulture.1996，No.426，287-295)。该特性使我们使用茶叶咖啡因在农杆菌介导遗传转化中诱导毒性基因，也使用茶叶咖啡因作为昂贵的化学品乙酰丁香酮的替代品。而且，由于来自茶叶的毒性诱导剂咖啡因组分也可从通常被丢弃和焚烧的维持树叶中获得，该方法看起来更经济和性价比更高。使用来自茶叶的毒性诱导剂咖啡因组分在增加转化效率时特别重要。
在本发明的另一个实施方案中，茶叶的不耐热咖啡因组分，是用于农杆菌介导遗传转化的乙酰丁香酮的替代品。(见图4)
在本发明的另一个实施方案中，茶叶的不耐热咖啡因组分，用于农杆菌介导遗传转化的乙酰丁香酮的替代品消除了上文描述的缺点。
在本发明的另一个实施方案中，该方法的新颖性是费用低廉的天然提取物被确定可替代诱导剂如乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮的成本。
在本发明的另一个实施方案中，茶叶的咖啡因组分可被用于不同系统或植物或外植体的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导遗传转化。
在本发明的另一个实施方案中，一种获得诱导剂而不涉及任何昂贵的提取方法的经济的系统，其中有杀菌活性的粗制叶子提取物也不要求昂贵的设备就可提取。
在本发明的另一个实施方案中，有毒性诱导剂活性的茶叶的咖啡因组分可以从天然生长的茶树灌木中充足地获得。
在本发明的另一个实施方案中，茶叶的毒性诱导剂咖啡因组分是来自天然物质而不是合成的或半合成的天然物质。
在本发明的另一个实施方案中，茶叶的毒性诱导剂咖啡因组分可以从活跃生长的顶部嫩芽，即经济的两叶和一芽，充足地获得。
在本发明的另一个实施方案中，茶叶的毒性诱导剂咖啡因组分可以从较低的维持树叶中充足地获得，从而使之更经济，因为这些树叶通常是被丢弃和焚烧的。
在本发明的另一个实施方案中，粗制提取物也可在使用毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenesis)的“发根生产”中使用。
在本发明的另一个实施方案中，农杆菌的转化效率可明显提高。
在本发明的另一个实施方案中，茶叶提取物应用在使用合成诱导剂常常无效的不同系统或植物或外植体的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)遗传转化中。
在本发明的另一个实施方案中，来自用于不使用商品化和昂贵的诱导剂的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)遗传转化的低成本系统。
在专利NF 14/02中的粗制茶叶提取物是使用丙酮和n-己烷获得的，在专利NF221/02中的咖啡因组分是使用乙酸乙酯和石油苯溶解提取除去儿茶素。粗制茶叶提取物通常包含儿茶素和咖啡因，而咖啡因组分只包含咖啡因，所以它们不应该被认为是同样的物质。图3的支持数据显示：茶树提取物不同组分对根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)培养的效应。这清楚地证实了两个部分的差别。
使用浓度为0.5-300μg/ml的咖啡因组分在新鲜的根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)培养细菌介质中代替乙酰丁香酮。这涉及咖啡因在培养介质中的浓度并实际上涉及范围在0.5-300μg在介质中的咖啡因浓度。该诱导剂的浓度被间接地估计为组分中咖啡因的浓度。
附图的简要描述
图1显示过滤灭菌和高压灭菌的咖啡因茶组分对根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)培养细菌生长的效应。
图2显示过滤灭菌和高压灭菌的咖啡因组分的对比。
图3显示茶叶提取物的不同组分对根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)培养细菌生长的效应。
图4显示乙酰丁香酮和咖啡因组分对根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)生长的效应对比。
以下实施例用于阐明并不应当解释为对本发明范围的限制。
实施例1
(xxii)把根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的两个菌株，即包含卡那霉素和潮霉素抗生素抗性基因的EHA105(无害的)和GV2260(有毒的)，和各个菌株的母系培养物的gus报道基因接种到10-30ml的有卡那霉素或潮霉素的液态改良的酵母甘露醇肉汤，并在25-30℃和在黑暗中以150-200rpm培育12-16小时。收集600nm下光密度约0.6-0.8的培育接种体以得到处于细菌生长对数期的1×109细胞/ml。在25-30℃以4000-8000rpm离心15-30分钟来沉淀活细菌细胞。将该沉淀悬浮于5-25ml新鲜的酵母甘露醇肉汤但不损伤细菌细胞，并通过在600nm测量光密度使细菌细胞密度在1×109细胞/ml最优化。把不同植物的各种外植体在细菌悬液中浸5-35分钟。在滤纸上处理外植体以除去多余的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。在培育介质中以1-10天的不同时间培育外植体。100-500g的Kangra jat茶叶在60℃的烤箱中干燥至恒重，并在室温用0.4-1.2升10-40％的丙酮水溶液提取过夜并过滤。用100-500mln-己烷提取滤液以获得两层以便除去脂质。取得水性层并用石油醚(100-300ml)和乙酸乙酯(100-400ml)提取以除去儿茶素。取得水性层并用氯仿(100-400ml)和氨溶液(3-10％)提取。氯仿层被浓缩到10-50ml并估计总的咖啡因。浓缩氯仿层作为咖啡因组分，并用高压灭菌和过滤灭菌来灭菌咖啡因组分。用浓度为0.5-300μg/ml的咖啡因组分代替乙酰丁香酮用于新鲜的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)培养物。把不同植物的各种外植体转移到含有0.5-300μg/ml不同浓度咖啡因组分的重建介质中以诱导vir基因和增加转化效率。把无外植体的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转移到含有选择抗生素的重建介质中以进一步重建和开发转基因植物。通过HPLC比较分析三种组分，即咖啡因组分(高压灭菌和过滤灭菌的，)和儿茶素组分和粗制茶叶提取物。使用乙腈和磷酸(0.05到0.2％)在梯度模式使用二极管排列探测器在250到280nm波长检测“毒性诱导化合物”。
实施例2
咖啡因组分被过滤灭菌并在如实施例1所述的根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导转化的各种外植体中作为诱导剂代替乙酰丁香酮。
实施例3
咖啡因组分被高压灭菌在如实施例1和2所述的根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导转化的各种外植体中作为诱导剂代替乙酰丁香酮。
本发明的主要优点：
(1)茶叶咖啡因组分可以代替乙酰丁香酮作为根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导遗传转化的有力的毒性诱导剂。
(2)茶叶咖啡因组分可以用于商品化毒性诱导剂乙酰丁香酮无效的不同系统或植物或外植体的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)遗传转化中。
(3)由于不需要使用商品化毒性诱导剂，茶叶咖啡因组分是对根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导遗传转化的低成本的系统。
(4)由于有毒性活性的茶叶咖啡因组分的获得不需要涉及任何昂贵的设备或花费高的提取方法，其应用是一种经济的方法。
(5)有毒性诱导能力的茶叶咖啡因组分可以容易地从天然的全年生长的茶树灌木中充足地获得。
(6)有毒性诱导能力的茶叶咖啡因组分是天然的不是合成或半合成的种类。
(7)有毒性诱导能力的茶叶咖啡因组分可以从甚至是较低的支持树叶中充足地获得，从而使之更经济，因为那些树叶常常被丢弃或焚烧。
(8)茶叶咖啡因组分也可作为有毒性诱导能力的制剂用于涉及不同植物或外植体的不同的体外系统。
(9)有毒性诱导能力的茶叶咖啡因组分也可被用于使用毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenesis)的“发根生产”。
(10)有毒性诱导能力的茶叶咖啡因组分可被用于提高农杆菌介导的转化效率。

Claims (2)

1.一种使用茶叶中不耐热咖啡因组分作为天然诱导剂用于在植物中进行根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化，在植物中产生所需特性的方法，所述方法包括以下步骤：
i.用10-40％的丙酮水溶液在室温下提取干燥的茶叶过夜，
ii.用n-己烷提取滤得的茶叶提取物以获得水性层和脂质层，
iii.用石油醚和乙酸乙酯提取水性层以从水性层中除去儿茶素，
iv.用氯仿提取步骤(iii)中的水性层以获得氯仿层，
v.评估氯仿层中总的咖啡因组分浓度，
vi.用过滤灭菌来灭菌咖啡因组分以获得所述的组分，
vii.把所述细菌接种到液态改良的酵母甘露醇肉汤，
viii.把接种体在25-30℃，在黑暗中150-200rpm培育约12-16小时，
ix.收集600nm下光密度0.6-0.8的培育接种体以得到处于细菌生长对数期的1×109细胞/ml从而获得沉淀，
x.将该沉淀悬浮于新鲜的酵母甘露醇肉汤但不损伤细菌细胞以获得悬液，
xi.把不同植物的外植体浸在细菌悬液中5-35分钟，
xii.在培育介质中以1-10天的不同时间培育外植体，
xiii.在新鲜的细菌培养物中使用浓度为0.5-300μg/ml的咖啡因组分以诱导vir基因，从而把带有转基因的Ti质粒转到植物中，以便用具有所需特性的基因遗传转化该植物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过在25-30℃以4000-8000rpm离心15-30分钟来沉淀活细菌细胞。
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