CN100473659C - 酒花花叶病毒基因和用于检测酒花花叶病毒的方法 - Google Patents

Abstract

已分离和纯化了酒花花叶病毒(HMV)基因，并且已阐明了其碱基序列。可以利用分离的HMV基因的核酸序列经简单并精确的方法检测HMV。这些方法对于在植物中检测HMV感染尤其有用。与常规的免疫学方法(如ELISA)相比，利用本发明提供的方法更简单并精确地检测HMV是可能的。

Description

酒花花叶病毒基因和用于检测酒花花叶病毒的方法

本申请是1998年7月22日提交的题为“酒花花叶病毒基因和用于检测酒花花叶病毒的方法”的中国专利申请98807424.9的分案申请。

技术领域

本发明涉及酒花花叶病毒的基因(此后简称为HMV)和用于检测HMV的诊断方法。

背景技术

HMV，一种酒花的病原性病毒，是一种包含单链RNA基因组的丝状病毒，并且作为酒花潜在病毒属于相同的香石竹潜病毒组。HMV是对敏感的酒花品种的花叶病症状的一种重要的病原体[Probasco和Skotland，Can.J.Microbiol.22：116011162(1976)；Adams和Barbara，应用生物学年评96：201208(1980)；Adams和Barbara，应用生物学年评101：495500(1982)；Yu和Liu，植物病理学36：3844(1987)；Kanno等，Ann.Phytopath.Soc.Japan 680(1994)]；因此，对于酒花的产生，进行了不受这一病毒污染的田块的调查和无病毒幼苗的监测。

通常，为了证实无病毒幼苗和进行田块调查以阻止病毒再感染，已经使用了免疫诊断方法，如ELISA。然而，经ELISA的HMV诊断法存在各种问题，如制备上的困难以及抗体的可用性。此外，即使抗体可供使用，ELISA仍然存在一些问题，例如由于抗体的非特异性反应产生的诊断结果的低准确度。

另一方面，由于分子生物学的最新进展使得已经阐明了各种病毒基因序列，因此可以利用基因工程技术精确地检测和诊断某些病毒物种。然而，HMV的检测依赖于以上提到的免疫学方法，因为它的基因序列还没有被阐明。

因此，本发明的发明人曾积极努力分离和纯化HMV基因，并且阐明它的碱基序列。此外，他们已经开发了利用这样的核酸序列检测HMV的方法。

发明内容

正如以上所描述的，本发明提供了酒花花叶病毒的基因或包含其部分序列(即HMV基因的片段)的核酸。

这些分离的与纯化的(例如，合成的)核酸使得可以利用遗传学方法在酒花种苗内和田块中检测病毒的存在。例如，采用这些核酸，遗传学方法(如PCR，杂交方法等)使得可以以一种高度精确的方式检测微小量的病毒。

以上描述的核酸可以从酒花花叶病毒的基因组RNA或其对应的cDNA制备。

上述酒花花叶病毒cDNA的碱基序列与SEQ ID NO：1中所显示的碱基1-1844完全相同，或者与该序列是基本上相同的序列。本文中术语＂基本上相同的序列＂指利用遗传学检测方法(例如杂交方法等)可以用来检测酒花花叶病毒的序列，包括与SEQ ID NO：1的序列可杂交的那些序列。即这样的与SEQ ID NO：1之序列基本上相同的序列可以利用上述SEQ ID NO：1中所示的核酸经遗传学方法(例如杂交方法等)制备。优选地，这些序列是在下文所描述的条件下可杂交的。

此外，可以优选地利用上述的部分序列，例如，编码病毒颗粒和外被蛋白质等的构成物的基因区。更具体地说，可以利用编码由525-1445位碱基编码的306个氨基酸残基的、编码由1445-1753位碱基编码的102个氨基酸残基的、或者编码由302-508位碱基编码的68个氨基酸残基的SEQ ID NO：1序列。在其中它们用作PCR法的引物和杂交法的探针的情况下，尽管为了利用这些部分序列可以使用以上所述的全长序列，但是在病毒检测中可以选择包含至少15个碱基及合适长度的区域。例如，为了用作PCR法的引物和杂交法的探针，优选地采用SEQ ID NO：2和3中所示的碱基序列。本发明也包括以下任何DNA序列：其编码由SEQ IDNO：1的525-1445位碱基编码的306个氨基酸残基、编码由SEQ ID NO：1的1445-1753位碱基编码的102个氨基酸残基、或者编码由SEQ ID NO：1的302-508位碱基编码的68个氨基酸残基。

此外，本发明提供了通过采用上述纯化的核酸的筛选遗传学方法检测酒花样品内酒花花叶病毒，以证实其是否由这一病毒污染的方法。

根据本发明，与常规的免疫学技术比较，存在于微小量样品中的病毒可以以高的灵敏度得到检测。以上所述的遗传学方法，例如，可以优选地使用聚合酶链反应(PCR)。也就是说，酒花花叶病毒引起的感染可以按以下步骤快速地得到检测：利用以包含酒花花叶病毒基因部分序列的核酸为引物，经PCR扩增酒花样品内的核酸，接着，测定扩增产物的长度，即检测从酒花花叶病毒基因扩增的核酸在扩增中是否确实产生。当然，从酒花花叶病毒基因扩增的核酸的存在与待试酒花样品中的病毒存在相关联，即所试验的酒花受到了病毒的感染。相反地，从酒花花叶病毒基因扩增的核酸的不存在与待试酒花样品中的病毒不存在相关联，即所试验的酒花未受到病毒的感染。

作为以上描述的PCR引物，可以优选地使用例如，SEQ ID NO：2或3的核酸。当它们用作为引物时，可以通过将被作为最终扩增产物的395个碱基对的特定DNA片段检测有酒花花叶病毒引起的感染。引物不仅可以通过组合SEQ ID NO：2和3中的序列设计，也可以从SEQ ID NO：1的序列中选择合适的区域来设计。此外，部分不同于SEQ ID NO：1，2和3中序列的序列也可以用作引物，只要它们能够退火到酒花花叶病毒基因序列上并被扩增。

作为一个不同于PCR的遗传学方法，可以优选地使用杂交方法。用于这一杂交方法的探针可以基于酒花花叶病毒基因或其部分序列来制备。例如作为这种探针可以利用在SEQ ID NO：1中所描述的核酸，它的互补序列或部分序列，即其片段。作为这种部分序列，可以优选地利用SEQ ID NO：3中的核酸。此外，即使是部分地不同于SEQ ID NO：1中的核酸，但基本上等同于SEQ ID NO：1中的核酸，可以杂交到酒花花叶病毒核酸上，这种核酸也可优选地作为探针使用。

此外，本发明为方便地检测酒花花叶病毒提供了试剂盒，其基于上述核酸和方法。例如，在经PCR检测HMV的情况下，除上述的核酸之外，对PCR必需的试剂如聚合酶等可以包括在其中。如果必要，阳性或阴性对照样品可以包括在其中。通过提供这样一种试剂盒，可以更方便地检测酒花花叶病毒。

当参照与附图相联系的下文时，本发明和其许多存在的优点可以更容易地得到理解。

附图说明

图1是描述HMV基因cDNA片段大小的电泳照片，该基因是由利用AP2，3NTRAP2以及CARORF3引物经逆转录PCR测定的：

道M：DNA大小标记(λDNA的StyI消化物)

第1道：土豆病毒S

第2道：酒花潜在病毒

第3道：酒花花叶病毒

第4道：蒸馏水。

图2是描述实施例5的HMV基因诊断方法中PCR产物之电泳结果的照片：

道M：DNA大小标记(Φx174的HinfI消化物)

第1道：ELISA的HLV和HMV-阳性酒花(品种：Bullion/HLV基因诊断结果)

第2道：ELISA的HLV和HMV-阴性酒花(品种：Bullion/HLV基因诊断结果)

第3道：ELISA的HLV和HMV-阳性酒花(品种：Bullion/HMV基因诊断结果)

第4道：ELISA的HLV和HMV-阴性酒花(品种：Bullion/HMV基因诊断结果)。

具体实施方式

1.HMV基因的分离纯化和其碱基序列的测定

1)HMV的浓缩

HMV可以通过标准方法从含HMV的酒花浓缩，例如利用聚乙二醇浓缩，用有机溶剂或热处理、分布离心等澄清。

2)从HMV浓缩物抽提RNA

从HMV浓缩物抽提RNA可以用主要用于从其他植物病毒抽提的标准方法(如SDS苯酚法)进行。

3)cDNA的克隆

利用所提取的RNA为模板，体外合成双链cDNA。对于这一双链cDNA的合成，有效的是利用引物进行逆转录PCR，所说的引物是基于相同香石竹潜病毒组之碱基序列设计的[Mackenzie等，病毒遗传学杂志：70，10531063(1989)，Rupasov等，病毒遗传学杂志：70，1861-1869(1983)，Foster等，病毒遗传学杂志：71，1877-1880(1990)，Memelink等，病毒遗传学杂志：71，917-924(1990)，Morozov等，病毒学：183，782-785(1991)，Levay & Zavriev，病毒遗传学杂志：72，2333-2337(1991)，Foster & Mills，病毒基因：6：3，213-220(1992)，Cavileer等，病毒遗传学杂志：75，711-720(1994)；所有这些参考文献并入本文作为参考]。这样合成的cDNA可以用标准技术整合进质粒载体。这样的质粒可以使用任何一种，如pUC119，pBluescript II等，它们能够在大肠杆菌中自主复制。

在克隆之后，将质粒插入到感受态大肠杆菌细胞中。细胞插入所需质粒后在培养物中选择和生长，从由此获得的转化的大肠杆菌细胞回收质粒，并经标准技术纯化。可以例如根据Maniatis等的方法(冷泉港实验室出版社，1989，引入本文作为参考)，进行从cDNA克隆至质粒回收的这些过程。

4)测定来自HMV基因组的cDNA的碱基序列

利用以上描述的来源于具有克隆的cDNA插入物的重组质粒，其碱基序列可以按照Maxam-Gilbert法或双脱氧法测定。

2.HMV感染酒花的病毒基因诊断

1)利用逆转录PCR的病毒基因诊断

a)引物的合成

基于用上述方法所确定的HMV基因组的碱基序列或所说碱基序列的互补链的碱基序列合成寡核苷酸，并用作引物。这些在PCR中用为引物的寡核苷酸长度具有至少15个碱基，优选地超过17个碱基，更优选地超过20个碱基。引物可以具有长度高达，例如，20，25，30，35，45或50个碱基，包括在它们之间的所有特定值及子范围。

更具体地说，优选地使用包含SEQ ID NO：2或3中碱基序列的引物。此外，与SEQ ID NO：2或3中碱基序列不完全相同但包含其部分序列的寡核苷酸也可以用作引物。因为PCR主要用来扩增从许多碱基选出的序列的特定基因信息的拷贝，所以即使包含与本发明的引物类似的碱基序列的寡核苷酸也被认为作为病毒基因诊断之引物等同可用。

此外，上述寡核苷酸可以以市售的自动DNA合成仪，采用例如，氰乙基亚磷酰胺法和硫代亚磷酸酯法获得。

b)从酒花样品抽提核酸

通过磨碎并在缓冲液中悬浮样品组织以浓缩病毒，接着经苯酚处理等，可以从酒花植物抽提核酸。此外，在任何生长阶段的酒花植物都可以用作以上所述的酒花样品。

c)逆转录PCR

利用如此获得的核酸和上述的引物，就可以对来源于HMV基因组的DNA采用例如Saiki等的方法(科学，230，1350-1354，并入本文作为参考)在一定的条件下尝试逆转录PCR。

更具体地说，PCR反应溶液可以按以下方法制备。向包含氯化镁(约1.0mM，优选的范围从约1.5mM-约3.0mM)，氯化钾，明胶，牛血清白蛋白，表面活性剂(吐温20，NP-40，曲通X-100等)，二甲基亚砜等的扩增缓冲液中加入两种不同的寡核苷酸，DNA聚合酶，四种碱(dATP，dTTP，dCTP和dGTP)以及从酒花样品中提取的DNA。此外，热稳定DNA聚合酶由一种从PERKIN ELMER获得的酶例证性说明。

在PCR反应中，重复下列循环过程20-50次，优选地25-40次。变性步骤通过一般在90℃-95℃下，优选地在约94℃-95℃下加热反应混合物约30秒钟-2分钟，优选地约30秒钟-2分钟完成。引物退火步骤通过一般在30-60℃下，优选地在约30℃-55℃下与引物一起温育约1分钟-约3分钟，优选地约1分钟-2分钟进行。DNA聚合酶延伸步骤一般在约70℃-约73℃下，优选地在72℃-73℃下以热稳定DNA聚合酶处理约30秒钟-约4分钟，优选地约30秒钟-约2分钟进行。

由上述PCR获得的DNA通过在琼脂糖凝胶，丙烯酰胺凝胶等上电泳分级分离，根据DNA大小选择。在琼脂糖凝胶的情况下，通常可以在约0.5％-约3％的浓度下使用。电泳缓冲液由Tris-磷酸盐(pH 7.5-pH8.0)，Tris-乙酸盐(pH 7.5-pH 8.0)，Tris-硼酸盐(pH7.5-pH8.3)(优选地为Tris-硼酸盐)系统等例证性地说明，如果必要，可以向其中加入EDTA等。

电泳在例如50V-300V下进行10分钟到120分钟，优选地在150V下进行30分钟，并且，可以使用大小标记，例如，一种市售的100 Base-PairLadder(Pharmacia公司)。在电泳之后，这样分级分离的扩增DNA可以用染色方法显影以便检测，其中采用可以与核酸相互作用的菲啶系列的染料，如溴化乙锭。所说的染色染料不仅可以在电泳之后加入，而且也可以在其之前加入到电泳缓冲液中。在电泳终止后的染色的情况下，凝胶浸没在溴化乙锭等溶液中约60分钟，在暗处以254nm或366nm紫外光照射，检测红色的带。此外，在电泳期间染色的情况下，染料如溴化乙锭以约0.5g/ml的终浓度加入至电泳缓冲液中。在染色与电泳同时进行的情况下，通过在暗处用254nm或366nm UV照射(即使在电泳期间)来检测红色带。

病毒感染可以由存在或不存在扩增的DNA进行检测。即利用相同的引物进行PCR时，来源于病毒感染的酒花样品检测到特异性扩增的DNA，而未感染的酒花样品检测不到。

例如，当上述的SEQ ID NO：2和3的碱基序列用作引物时，包含395个碱基对的特异性DNA节段由病毒感染的酒花样品扩增。然而，在转化的HMV的情况下，所说的特异性DNA节段可以在长度上发生变化。

(2)杂交的基因诊断

不同于常规免疫测定的HMV诊断可以通过以下方法进行，通过化学合成或基因操作制备具有互补于HMV基因组DNA的序列的核酸，与所说的核酸探针杂交。

由于探针采用链长度一般具有20至几千个碱基的核酸，所以以用限制酶切割所说HMV基因组cDNA所产生的DNA片段为例说明。在杂交之前，这些探针在末端或内部经标准的方法用辐射发射物修饰，所说的辐射发射物例如放射性同位素，荧光剂等，二级可标记的物质如生物素，地高辛配基等等，酶如碱性磷酸酶等。

用于杂交的酒花植物核酸可以按标准方法抽提，例如，在Murray &Thompson，核酸研究，8，4321-4325(1980)(并入本文作为参考)中所描述的标准核酸抽提方法。将这样获得的核酸进行变性处理，并且点在滤膜上，如硝酸纤维素滤膜或尼龙滤膜上，优选地，例如，Hybond-N+(Amersham)。

通过在包含甲酰胺，MOPS，乙酸钠，EDTA等的溶液中于60-70℃下，优选地在65℃下加热5-20分钟，优选地15分钟，然后迅速冷却进行核酸的变性处理。在这一变性处理之后，核酸与20XSSC混合，然后点在滤膜上。

将点在滤膜上的核酸在42-65℃，优选地在46℃的条件下在杂交溶液中与以上描述的探针杂交12-20小时，优选地是16小时。在进行反应后，冲洗滤膜，干燥，并且由检测方法，例如放射自显影等检测在点样处是否存在信号。即具有来源于病毒感染酒花的核酸(DNA+RNA)的样品检测到信号，因为它们与探针杂交，而来源于未感染酒花的样品检测不到信号，因为它们缺乏与探针互补的序列。

3.HMV基因的合成核酸的应用

HMV基因的合成核酸不仅可以用于以上所述方法检测HMV病毒，而且可以用于经反义技术产生酒花对现有病毒的抗性。更具体地说，HMV基因以使得可以形成反义RNA的方式插入到表达载体中，并且用所说载体转化酒花，导致产生显示对病毒的抗性的转化的酒花。

实施例

在下列实施例中，将参照例子详细描述本发明，它们用来说明但不限制本发明。

实施例1：HMV的浓缩

HMV-感染的酒花的种苗茎干(品种：Bullion，HMV的单一感染由ELISA确认)(100g)在4体积的0.5M磷酸钾缓冲液，pH7.2，(包含1％亚硫酸钠)中磨碎，并且通过纱布过滤获得粗提物。然后，将曲通X-100(8ml)加入至所说的抽提物中，并且，在混合搅拌1小时后，在3,000xg下离心10分钟，以获得上清液。向上清液中加入1/3体积的四氯化碳，在冰冷的情况下搅拌混合物3分钟，在3,000xg下离心10分钟再次获得上清液。向如此获得的上清液中加入聚乙二醇(20g)和氯化钠(2.4g)，搅拌混合物40分钟，静置1小时，然后在3,000xg下离心40分钟，获得沉淀。将该沉淀悬浮在0.5M磷酸钾缓冲液，pH7.2(包含1％曲通X-100)中，高速(在15,000xg下10分钟)离心，获得上清液，将其进一步超离心(在100,000xg下120分钟)，回收沉淀。重复这一分级离心方法两次，将病毒和污染物分离，使其悬浮在0.5M磷酸钾缓冲液(pH7.2)中，并以HMV浓缩物贮存。

除非有其他说明，以上所描述的所有过程均在4℃下进行。

实施例2：从HMV抽提RNA

从HMV浓缩物抽提RNA由SDS苯酚法[Proll等，土豆研究24，110(1981)，并入本文作为参考]完成。

向与实施例1类似的方法获得的HMV浓缩溶液(178μl)中加入20％SDS(10μl)，20XSSC(2μl)和蛋白酶(20mg/ml)(10μl)，将所形成的混合物在37℃温热30分钟。然后通过加入0.5％皂土悬液(100μl)和TE-饱和的苯酚(300μl)到上述混合物中进行苯酚抽提，接着用等体积的苯酚：三氯甲烷(1:1，v/v)进行第二次苯酚抽提。在含水层以三氯甲烷抽提之后，向含水层加入3M乙酸钠(10μl)和冷乙醇(250μl)，使所形成的混合物在-80℃下静置30分钟。然后将混合物在15,000xg下离心5分钟，以获得沉淀，用70％乙醇经离心洗涤之。经干燥除去乙醇后，将由此获得的沉淀溶解在蒸馏水(100μl)中。向这一溶液中加入4M氯化锂(100μl)，使混合物在冰浴中静置一夜。

然后将上述混合物在15,000xg下离心5分钟，获得沉淀，如上再次用70％乙醇经离心洗涤之，经干燥除去乙醇后，将沉淀溶解在蒸馏水(20μl)中，并作为RNA样品贮存。

实施例3：cDNA的克隆

首先，基于与HMV属于相同组的香石竹潜病毒(Calravirus)的碱基序列，合成CARORf引物(5′TGCCACTTACACCGCCTCCT3′)(SEQ IDNO：4)，AP2引物(5′-GCTACCATGGACGTCCGCGCGG(T)15-3′)(SEQID NO：5)(其中一个衔接子连接到oligo-dT上)，和3NTRAP2引物(5′-CGATGGTACCTGCAGGCGCGCC-3′)(SEQ ID NO：6)(其互补于所说的AP2引物序列)。向RNA样品(3μl)加入10μM AP2引物(1μl)和蒸馏水(7μl)，使混合物在65℃下静置10分钟。然后经迅速冷却，与5X逆转录酶缓冲液(GIBCO BRL)(4μl)，2.5mM dNTP(1μl)和逆转录酶(2,000U/μl，GIBCO BRL)(1μl)混合来变性RNA，逆转录反应在42℃下进行1小时。

为了进行PCR，制备包含10XPCR缓冲液(Boehringer)(5μl)，2.5mMdNTP(4μl)，10μM 3NTRAP2引物(1μl)，10μM CARORF3引物(1μl)，热稳定DNA聚合酶(5U/μl，Boehringer)(1μl)和蒸馏水(33μl)的反应溶液。反应条件如下：每一个循环包含变性步骤(98℃，30秒)和延伸步骤(68℃，5分钟)，将这一循环重复30次。将所扩增的产品的十分之一在1.0％琼脂糖凝胶上(在1XTRE缓冲液中)进行电泳，并且鉴别约1.8Kb的扩增的DNA节段(图1)。

然后，将以上描述的扩增PCR产物平端化，并与pUC119的SmaI限制酶位点连接。更具体地说，用SmaI消化质粒pUC119制备一些节段，将其进一步脱磷酸化(50ng/μl)(2μl)，与平端PCR产物混合(1μl)。其次，向这一混合中加入10mM ATP，10X连接缓冲液(Boehringer)，T4DNA连接酶(5U/μl，Boehringer)和蒸馏水(13μl)，将所形成的混合物在22℃下保持温热过夜以促进连接反应。

制备大肠杆菌MV1184(100μL)的感受态细胞，与以上描述的连接反应溶液混合，使混合物在冰上静置30分钟，在42℃以下温热60秒，并在冰上迅速冷却。向这一细胞溶液加入SOC介质(500μl)，将所形成的混合物在37℃下温热1小时，在琼脂介质上平缓温育，并在37℃下温育过夜。这里所使用的琼脂介质是通过向2X YT琼脂介质添加2％X-gal(50μl)，100mM IPTG(50μl)和氨苄青霉素(50g/ml)制备的。

在温育一夜后，选择多个白色菌落(Lac Z-)，分别接种到液体培养基中，并温育。从这些培养溶液用标准的方法抽提质粒DNA。选择具有带来源于插入的HMV基因组cDNA片段(约1.8Kb)的质粒的大肠杆菌细胞，并贮存。

实施例4：测定来源于HMV基因组的cDNA碱基序列

将在实施例3中选择的大肠杆菌细胞于37℃下在2×YT培养基中振荡培养一夜，用标准方法制备质粒。以以上描述的cDNA片段为模板，利用DNA测序仪(Li-Cor公司)和测序试剂盒(Amersham)，用双脱氧方法[Sanger等，美国科学院院报，74，5463(1977)，并入本文作为参考]对它们的碱基序列解码，以确定1844个碱基的序列。这些结果在SEQ ID NO：1中显示。

从如此获得的碱基序列，分析翻译区。结果在所说的碱基序列中，鉴别了编码具有约6.9kD蛋白质(68个氨基酸残基)的翻译区(序列表中SEQ ID NO：1的302-508位碱基的序列)，推定的编码外壳蛋白(306个氨基酸残基，分子量33.9kD)的翻译区(序列表中SEQ ID NO：1的525-1445位碱基的序列)，编码具有约11.3kD分子量的蛋白质(102个氨基酸残基)的翻译区(序列表中SEQ ID NO：1的1445-1753位碱基的序列)。

实施例5：经由逆转录PCR的HMV-感染酒花的基因诊断

将HMV-感染酒花(品种，Bullion)或无病毒酒花(相同品种)的叶子(各0.1g)分别在0.5M磷酸钾缓冲液(pH7.2，1ml)中磨碎，以三氯甲烷抽提磨碎物溶液。在由此获得的上清液用苯酚，然后用醚处理三次后，将乙醇加入至沉淀核酸中。通过在70％乙醇中离心洗涤由此获得的沉淀，经干燥除去剩下的乙醇。将干燥的核酸溶解在蒸馏水(501)中，将2-1小份进行逆转录PCR。

用于PCR的引物基于本发明的碱基序列设计，用DNA合成仪(ABI，380B型)经标准方法合成。这里合成的引物序列在SEQ ID NO：2和3中显示，此后分别简称为1P和1M。

利用这些引物，完成逆转录反应。首先，将1M引物(25pM)，逆转录酶(Nippon Gene，5U)，以及以上所制备的酒花核酸(2μg)混合。向这一混合物中加入50nM Tris-HCl缓冲液(pH 8.3)(包含75mM KCl，3mMMgCl₂，10mM DDT和0.5mM dNTP)，将所形成的混合物在37℃温育1小时。

然后，向逆转录产品中加入热稳定DNA聚合酶(Boehringer，0.5U)和扩增引物(25pM)以完成PCR。将反应溶液的体积设定为10μl，将矿物油(约20μl)置于顶层以阻止反应溶液蒸发。

每一个PCR中的步骤在下列条件下完成。在将PCR混合物在94℃保持3分钟后，将包含在94℃下1分钟的变性步骤在55℃下1分钟的引物退火步骤，在72℃下2分钟的DNA延伸步骤的PCR循环重复30次。然后，将反应溶液在72℃下保持5分钟，并且在4℃下贮存。

经电泳分析由以上描述的PCR获得的扩增DNA的大小，所说的电泳在包含2mM EDTA的Tris-硼酸盐缓冲液(pH8.0)中在2％琼脂糖凝胶上100V下进行30分钟，大小标记使用由限制酶HinfI(Nippon Gene)消化的x174 DNA。

在电泳完成后，将凝胶浸没在溴化乙锭水溶液中(0.5g/ml)10分钟，在暗处以UV 254nm照射以检测DNA-溴化乙锭复合物的红色带。由电泳获得的分级分离模式在图2中显示。

作为琼脂糖凝胶电泳的结果，从与所利用的引物对应的HMV-感染的酒花获得特定的DNA扩增片段(395bp)，但不能从未感染的酒花获得，使得可以区别二者。

实施例6：经斑点印迹杂交的基因诊断

由下列过程制备进行斑点印迹杂交的样品。

将HMV-感染酒花或无病毒酒花的叶子(各0.1g)在0.5M磷酸钾缓冲液(pH7.2，1ml)中磨碎，以三氯甲烷抽提磨碎物溶液。在由此获得的上清液用苯酚，然后用醚处理三次后，将乙醇加入至沉淀核酸中。通过在70％乙醇中离心洗涤由此获得的沉淀，经干燥除去剩下的乙醇。将干燥的核酸溶解在TE缓冲液(20μl)中。

向2-μl小份所说的溶液中加入三体积的核酸变性缓冲液(由65％甲酰胺，20％甲醛，1.54M MOPS，6.5mM乙酸钠和1.3mM EDTA组成)，将混合物在65℃下温热15分钟，然后迅速冷却。向这一溶液加入20 XSSC(由0.15M氯化钠和0.015M柠檬酸钠组成，pH7.0)。将10-μl小份所形成的混合物点在滤膜(Amersham，商品名：Hybond-N+)上，并且进行斑点杂交。

通过用限制酶BamHI与EcoRI消化实施例4中制备的大肠杆菌来源的质粒，并纯化消化物形成探针。这一纯化步骤通过用琼脂糖凝胶分离消化的片段并用柱(Takarashuzo，商品名：Suprec01 TM柱)洗脱HMV-来源的cDNA。

然后，采用随机标记试剂盒(Takarashuzo)用[32P]dCTP标记这样洗脱的cDNA，并且通过Sephadex G50柱，以除去未结合的[32P]dCTP。

在包含5XSSC，100μg/ml酵母tRNA(Boehringer)，0.5％SDS，0.1％菲可，0.1％PVP以及0.1％BSA的溶液中于46℃进行杂交16小时。放射自显影图结果显示，在来源于HMV-感染酒花的点样点观察到信号，从无HMV酒花观察不到信号。

从以上描述的结果可知，已经证实，按照所说信号的存在或不存在可以将HMV-感染的酒花与无HMV酒花区分开。

如上所述，在本发明中，不仅阐明了从3′-末端到1884位碱基的HMV基因组基因结构，而且也开发了HMV基因诊断方法，使得能够提供用于HMV的高精确检测方法。按本发明的遗传学检测方法中，不需要常规免疫学方法所需的许多检测步骤，包括HMV的分离，抗血清的制备，抗体的纯化，使得可以更快速地检测HMV。此外，本发明的遗传学检测方法使得可以以比常规ELISA更高准确度与精确度诊断HMV感染。另外，通过这所说病毒基因的反义链转化酒花，本发明使得可以使酒花产生对所说病毒的抗性。

明显地，在以上内容教导下，本发明的许多修改和变化是可能的。因此，应当理解，本发明可以在附加权利要求的范围内，而不是在本文具体描述范围内实施。

本申请以日本专利申请平9-212568(1997年7月23日)为基础，其全文并入本文作为参考。

序列表

SEQ ID NO：1

长度：1844

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线型

物种：cDNA

序列描述

SEQ ID NO：2

长度：20

类型：核酸

链型：单

拓扑结构：线型

物种：合成DNA

序列描述

SEQ ID NO：3

长度：20

类型：核酸

链型：单

拓扑结构：线型

物种：合成DNA

序列描述

SEQ ID NO：4

长度：20

类型：核酸

链型：单

拓扑结构：线型

物种：合成DNA

序列描述

SEQ ID NO：5

长度：23

类型：核酸

链型：单

拓扑结构：线型

物种：合成DNA

序列描述

SEQ ID NO：6

长度：22

类型：核酸

链型：单

拓扑结构：线型

物种：合成DNA

序列描述

Claims (8)

1.一种核酸分子，其由酒花花叶病毒基因或所说基因的片段组成，其中所说的酒花花叶病毒基因或其片段选自如下一组：

(a)由编码由SEQ ID NO：1的第525-1445位核苷酸编码的氨基酸序列的核苷酸序列组成的核酸分子；

(b)由编码由SEQ ID NO：1的第1445-1735位核苷酸编码的氨基酸序列的核苷酸序列组成的核酸分子；

(c)由编码由SEQ ID NO：1的第302-508位核苷酸编码的氨基酸序列的核苷酸序列组成的核酸分子；

(d)由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成的核酸分子；和

(e)由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列组成的核酸分子。

2.根据权利要求1的核酸分子，其是一种cDNA分子。

3.一种测定酒花样品中酒花花叶病毒存在的方法，该方法包括：

(i)用含有(b)从酒花获得的核酸的样品处理(a)权利要求1或2的核酸分子；

(ii)检测(a)和(b)之间的杂交存在或不存在，其中杂交在42-65℃、12-20小时的条件下进行。

4.权利要求3的方法，其中(a)由限制酶切割。

5.权利要求3或4的方法，其中在所说的样品中存在或不存在酒花花叶病毒在实施所说的方法之前是未知的。

6.一种在酒花样品中测定酒花花叶病毒存在的方法，该方法包括：

(i)在聚合酶链反应(PCR)中用含有(b)从酒花获得的核酸的样品处理(a)由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成的核酸分子和SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列组成的核酸分子；以及

(ii)检测在所说的PCR中经(a)由(b)中酒花花叶病毒基因序列扩增产生的核酸的存在或不存在。

7.权利要求6的方法，其中在所说的检测步骤中检测酒花花叶病毒基因395个碱基对片段存在或不存在。

8.用以检测酒花花叶病毒的试剂盒，其包含权利要求1或2的核酸分子。

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