CN100443495C

CN100443495C - 一种环菠萝蜜烷三萜皂苷化合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

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Publication number: CN100443495C
Application number: CNB2006100873272A
Authority: CN
Inventors: 肖培根; 杨梦苏; 高璟春; 张金超; 黄峰
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-06-07
Filing date: 2006-06-07
Publication date: 2008-12-17
Anticipated expiration: 2026-06-07
Also published as: CN1958597A

Abstract

本发明涉及一种环菠萝蜜烷三萜皂苷化合物及其抗肿瘤作用，它具有式I化学结构通式和体外抑制肿瘤细胞生长活性，本发明还涉及该化合物及其衍生物在制备药物方面的用途，特别是在制备抗肿瘤药物领域。

Description

一种环菠萝蜜烷三萜皂苷化合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域：

本发明涉及从类叶升麻全草或根茎中提取分离一种新化合物及其衍生物，其骨架属于环菠萝蜜烷型三萜皂苷；本发明还涉及该化合物在制备药物方面的用途，特别是在制备抗肿瘤药物领域。

背景技术：

升麻族(Tribe Cimicifuga)属于毛茛科，包括铁破锣属，黄三七属，升麻属，类叶升麻属，和垂果升麻属5个属群。其中类叶升麻[Actaea asiatica Hara]系类叶升麻属(Actaea)植物；是一种民间常用草药。其根茎或全草药用，具有发表透疹，清热解毒，升举阳气的功效；民间用来治疗风热头痛，麻疹不透，阳毒发班；脱肛，子宫脱落。升麻族植物的主要化学成分是9，19-环菠萝蜜烷型三萜和肉桂酸类化合物。近年来对升麻族植物及其化学成分的研究发现，除了具有改善更年期潮热，多汗等症状，治疗更年期综合症，其中的三萜类成分更加具有抑制体外肿瘤细胞生长，抗氧化和抗HIV病毒的作用。目前尚未见有类似本发明所述化合物及其衍生物化学结构的报道。

发明内容：

本实验室利用现代分离技术和结构测定手段对类叶升麻进行化学成分研究过程中，从中分离得到一种结构新颖的单体化合物，通过活性筛选，发现这些单体化合物具有很强的药理活性。

本发明的目的之一是提供一种结构如下的9，19-环菠萝蜜烷型三萜皂苷化合物及其药学上可接受的盐

本发明还提供制备该化合物及其药学上可接受的盐的方法。

本发明还提供该化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明的化合物在体外细胞毒实验中可明显抑制肝癌肿瘤细胞系HepG2和乳腺癌肿瘤细胞系MCF-7的增殖，具有细胞毒作用，是一种肿瘤治疗药物(IC₅₀＝9.9，9.8μM)。

本发明所涉及的式(1)化合物，迄今为止，尚未发现有相关专利或文献报道。

本发明的化合物可以经过分离提取得到，其制备方法可以采用如下方法：

1)类叶升麻根茎为原料，乙醇回流提取，回收溶剂，得浸膏；

2)将浸膏用水溶解，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取物；

3)乙酸乙酯萃取物用硅胶低压柱层析，以石油醚-丙酮-甲醇系统梯度洗脱，共收集合并成5份；

4)其中第1份再次用硅胶低压柱层析，以氯仿-甲醇系统梯度洗脱，共收集9份；

5)其中第7份用反相C-18中压柱层析，以甲醇-水系统梯度洗脱，共收集合并为3份；

6)其中第3份经高效制备液相在12分钟处得到一白色晶体，即式(1)化合物。

具体可以是：

以类叶升麻[Actaea asiatica Hara]根茎(4.0Kg)为原料，经用70％乙醇回流提取三次，每次三小时；合并三次提取液后，回收溶剂，得浸膏。将浸膏用水溶解，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取物300g。乙酸乙酯萃取物用硅胶(200-300目)低压柱层析，以石油醚-丙酮-甲醇系统梯度洗脱(1∶0∶0-9∶1∶0-8∶2∶0.2-7∶2.5∶0.5-6∶3∶1-4∶4∶2)，每份5000ml，共收集合并成5份，其中第1份(102g)，再次用硅胶(200-300目)低压柱层析，以氯仿-甲醇系统梯度洗脱(10∶0-9∶1-8∶2-7∶3-6∶4-5∶5)，每份5000ml，共收集9份。其中第7份(7.5g)用反相C-18中压柱层析，以甲醇-水系统梯度洗脱(40∶60，50∶50，60∶40，)，每份1000ml，共收集合并为3份，其中第3份经高效制备液相(MeOH-H₂O，80∶20，flow rate 2.5ml/min，column temp.35℃)在12分钟处得到一白色晶体，高效分析液相检查为单一峰，得到R1为β-D-xylopyranosyl，R2为COCH3，R3为H的式(1)化合物(即化合物I，5mg)。

化合物I，白色晶体，mp.142-145℃，[a]²⁰ _D-67°(c 1.52，MeOH).高分辨质谱HRESIMS(见图1)给出m/z 667.3815[M+Na]⁺(calcd 667.3822)，确定其分子式为：C₃₇H₅₆O₉，不饱和度为9。

IR谱(见图2)在3600-3100及979，1041cm^-1出现强吸收峰，示苷类化合物；在1732，1242cm^-1显示强吸收带，表明分子结构中含乙酰基。紫外吸收光谱中除了三萜类化合物的常见边缘吸收外，在265nm处有强吸收峰。

¹H NMR谱(见图3)高场区显示一对AB系统质子的信号[δ0.0.19 (1H，d，J＝4.0Hz，19-H)，0.61(1H，d，J＝4.0Hz，19-H)]，四个叔甲基质子的单峰信号[δ0.90，1.01，1.22，1.32]，三个重叠的双峰甲基的质子信号[δ1.14，1.15，1.16]，一个乙酰基质子信号[δ2.15]，一个烯氢信号[δ6.21，d，J＝4.0Hz]和一个糖的端基质子信号[δ4.82，d，J＝7.6Hz]。在¹³C NMR谱(见图4)中有五个连氧碳信号出现在δ109.1，80.1，77.2，72.8和68.7，另外还有两个连氧碳出现在δ78.4和77.1，两个不饱和碳出现在δ117.7和151.2。以上信息表明该化合物为一9，19-环菠萝蜜烷型三萜木糖苷，且含有一个乙酰基(表1)。

根据HMQC(见图5)和HMBC(见图6)谱图信息，将化合物波谱信息与已知化合物比较，发现在化合物的氢谱中，除了在δ1.16的常见的21-CH₃双峰甲基外，在δ1.14，1.15还有两个双峰甲基。我们推测化合物结构中有异丙基(-CH(CH3)2)片断存在于侧链末端。而氢谱中化学位移值为δ3.32的多重峰则为异丙基中两个甲基旁边的质子。在碳谱中在δ172.3和202.0有两个羰基碳，前者归属为乙酰基上的羰基，后者则推断为24-C，因为在HMBC中，δ202.0和两个双峰甲基[δ1.14，1.15，分别3H，d，J＝6.7Hz，H-26，27]有显著相关。在化合物I中，22-H信号消失，取而代之的是一个在低场区的烯氢信号[δ6.21，d，J＝4.0Hz]，并且在HMBC中，这个烯氢和20-C[δ27.1]，21-C[δ26.0]以及24-C[δ202.0]有显著相关，因此推断此质子位于22-C，且在22-C和23-C之间有双键存在。

在HMBC图谱中，还可以看到如下显著相关：H a-11(δ2.64)/δ78.4(C-12)；H a-15(δ2.06)/δ50.5(C-13)，δ49.7(C-14)，δ77.1(C-16)；H-16(δ4.27)/δ49.7(C-14)；H-17(δ2.12)/δ117.7(C-22)，δ151.2(C-23)，δ78.4(C-12)；H-20(δ2.49)/δ117.7(C-22)，δ151.2(C-23)。综合一维，二维波谱信息，所有的碳氢信号都得以归属(表1)。

糖的端基氢信号出现在δ4.82(1H，d，J＝7.6Hz)说明苷键为β构型。糖在母核上的连接位点由HMBC谱图中端基氢与δ89.6的显著相关确定在C-3位。化合物的绝对立体构型在NOESY的基础上，并结合已知化合物的信息得以确定。

综合以上光谱分析，确定化合物I的结构为16β：23-expoxy-12β-acetoxy-22，23-didehydro-24-one-25-hydro-9，19-cycloanostane-3-O-β-D-xylopyranoside。

化合物I结构测定的实验数据：IR(KBr)vmax(cm-1)3395(OH)，2943(CH)，2869，1732，1678，1632，1458，1385，1242，1041，980。HRESIMS m/z 667.3815(calcd 667.3822 for[M+Na]+).¹H NMR和¹³C NMR数据见表1。

表1化合物I的¹H，¹³C-NMR数据(溶剂为氘代吡啶)

本发明还包括本发明化合物的药物可接受的盐，特别是形成药学上可接受的无毒盐。可按常规转化方法制备这些盐。

本发明还包括以本发明化合物作为活性成分的药物组合物。本发明的药物组合物，含有生理有效量的式I的9，19-环菠萝蜜烷型三萜类化合物及其药物可接受的盐，根据需要还可包括药物可接受的载体，所说的9，19-环菠萝蜜烷型三萜类化合物及其药物可接受的盐在组合物的重量比为0.1-99.9％，药物可接受的载体在组合物中的重量比为0.1-99.9％。本发明的药物组合物以适合药用的制剂形式存在，这些制剂形式可以是：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂、滴丸剂。

本发明进一步涉及式I所述的9，19-环菠萝蜜烷型三萜在制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用。本发明经过实验证明本发明化合物及其药物可接受的盐具有治疗和/或预防肿瘤的作用，本发明为此进行了细胞毒性试验，试验采用人肝癌细胞株(HepG2)和人乳腺癌细胞(MCF-7)，试验如下：

1.材料：人肝癌细胞株(HepG2)、人乳腺癌细胞株(MCF-7)购自美国ATCC。培养基DMEM、胎牛血清购自Gibico公司。MTT(3-(4，5-Dimethyiazol-2，5-diphenyl tetrazoliumbromide)，购自Sigma公司。

2.肿瘤细胞培养：HepG2和MCF-7细胞分别培养在含10％FBS的RPMI1640(含100u/mlPemcillin以及100ug/ml的Streptomycin)培养基中，收集生长良好并取处于对数生长期的细胞用培养基配成密度为1×10⁵个细胞/ml的细胞悬液，均匀地接种于96孔培养板中，每孔100ul(即每孔细胞个数为10⁴个)，在5％CO₂，37℃培养箱内培养24小时待细胞完全贴壁后，给药组用不同浓度的式I化合物处理，化合物终浓度分别为50ug/ml，40ug/ml，30ug/ml，20ug/ml，10ug/ml，5ug/ml，1ug/ml。同时设对照组和空白组，每组6个复孔，在5％CO₂，37℃培养箱内培养48hr后，加入10μl的10mg/ml^-1MTT使终浓度为0.05％，孵育4hr后，离心弃去上清液培养基，加入100μlDMSO，在酶标仪上振荡60s后，于595nm测定吸光度值。

3.式I化合物对肿瘤细胞的抑制率计算：根据测得的吸光度值进行细胞的存活率计算，各测试孔的OD值减去空白组OD值(完全培养基加MTT，无细胞)，各重复孔的OD值取均数。细胞的存活率以T/C％表示，T为加药组细胞的OD值，C为对照组细胞的OD值。化合物对肿瘤细胞的抑制率以(1-T/C)％表示。

4.实验结果

式I化合物体外对三种肿瘤细胞株的IC₅₀值

	HepG2	MCF-7
	HepG2	MCF-7	式I化合物(μM)	9.9	9.8

实验结果表明：式I化合物对血液瘤和实体瘤具有显著的抑制作用。

附图说明：

图1：式I化合物的红外光谱

图2：式I化合物的高分辨质谱

图3：式I化合物的氢谱

图4：式I化合物的碳谱

图5：式I化合物的HMQC谱

图6：式I化合物的HMBC谱

具体实施方式：

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：化合物1的制备

取类叶升麻[Actaea asiatica Hara]根茎4.0Kg，用20L70％乙醇回流提取三次，每次三小时；合并三次提取液后，回收溶剂，得浸膏。将浸膏用1L水溶解，依次用1L石油醚，4L乙酸乙酯，4L正丁醇萃取，得乙酸乙酯萃取物300g。乙酸乙酯萃取物用硅胶(200-300目)低压柱层析，以石油醚-丙酮-甲醇系统梯度洗脱(1∶0∶0-9∶1∶0-8∶2∶0.2-7∶2.5∶0.5-6∶3∶1-4∶4∶2)，每份5000ml，共收集合并成5份，其中第1份(102g)，再次用硅胶(200-300目)低压柱层析，以氯仿-甲醇系统梯度洗脱(10∶0-9∶1-8∶2-7∶3-6∶4-5∶5)，每份5000ml，共收集9份。其中第7份(7.5g)用反相C-18中压柱层析，以甲醇-水系统梯度洗脱(40∶60，50∶50，60∶40，)，每份1000ml，共收集合并为3份，其中第3份经高效制备液相(MeOH-H₂O，80∶20，flow rate 2.5ml/min，column temp.35℃)在12分钟处得到一白色晶体，高效分析液相检查为单一峰，得到R1为β-D-xylopyranosyl，R2为COCH3，R3为H的式(1)化合物(即化合物I，5mg)。

实施例2

片剂的制备

式I化合物 20g

乳糖 80g

硬脂酸镁 1.0％

3％聚维酮乙醇溶液适量

共制成 1000粒

取处方量化合物1与处方量乳糖混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，50℃干燥30-45分钟，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，压片。每片含化合物20mg。

实施例3

胶囊剂的制备

式I化合物 20g

乳糖 80g

硬脂酸镁 1.0％

3％聚维酮乙醇溶液适量

共制成 1000粒

取处方量式I化合物与处方量乳糖混合均匀，加3％聚维酮乙醇溶液制软材，过18目筛制颗粒，50℃干燥30-45分钟，整粒，加入硬脂酸镁，混匀，充于1号胶囊。每粒含化合物20mg。

Claims

1、一种结构如下的9，19-环菠萝蜜烷型三萜皂苷化合物或其药学上可接受的盐

2、权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

3、含有权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。

4、权利要求3的药物组合物，选自片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、滴丸剂、贴剂。

5、权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其中化合物的制备包括以下步骤：

1)类叶升麻根茎为原料，70％乙醇回流提取三次，每次三小时，回收溶剂，得浸膏；

3)乙酸乙酯萃取物用硅胶低压柱层析，以石油醚-丙酮-甲醇系统梯度洗脱，洗脱液的比例为1∶0∶0→9∶1∶0→8∶2∶0.2→7∶2.5∶0.5→6∶3∶1→4∶4∶2，共收集合并成5份；

4)其中第1份再次用硅胶低压柱层析，以氯仿-甲醇系统梯度洗脱，洗脱液的比例为10∶0→9∶1-8∶2→7∶3→6∶4→5∶5，共收集9份；

5)其中第7份用反相C-18中压柱层析，以甲醇-水系统梯度洗脱，洗脱液的比例为40∶60→50∶50→60∶40，共收集合并为3份；

6)其中第3份经高效制备液相，条件为：MeOH-H₂O，80∶20，流速2.5ml/min，柱温35℃，在12分钟处得到一白色晶体。