CN100411689C - 抑制端粒酶逆转录酶hTERT表达的ShRNA在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
抑制端粒酶逆转录酶hTERT表达的ShRNA在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种抑制端粒酶逆转录酶hTERT表达的ShRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。该ShRNA的序列为:正义链:5’-CCGGCCAAGTATTCCTGTTCAAGTTGACTCGATTCAAGAGATCGAGTCAGCTTGAGCAGGAATGCTTGGTTTTTG-3’反义链:5’-AATTCAAAAACCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGATCTCTTGAATCGAGTCAACTTGAACAGGAATACTTGG-3’;将所述的ShRNA插入到慢病毒表达载体中,再整合到染色体中稳定表达SiRNA,从而抑制hTERT的表达;所述的ShRNA序列可识别端粒酶hTERT,被识别的序列为:CCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGA,该序列针对hTERT全长mRNA序列(NCBI AB085628.)第3036-3063碱基处。
Description
技术领域
本发明涉及一种医药分子生物技术在制备基因治疗药物中的应用,尤其是一种抑制端粒酶逆转录酶hTERT表达的ShRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术:
RNA干扰(RNAi)是如今生命科学界的研究热点,它是抑制基因表达的有力工具,有利于控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达。RNAi现象是由Fire等在线虫中首次发现并报道。他们观察到在线虫中双链RNA(dsRNA)可在转录后水平特异性抑制基因表达。随后许多学者对线虫、果蝇、植物和动物细胞进行了大量研究,证实RNAi是相当保守的生物模式。对果蝇地研究使RNAi机制基本被阐明:当长链dsRNA进入细胞时,被一种称之为Dicer的核酸酶所识别,并被剪切成21-23核苷酸的SiRNA,双链的SiRNA被RNA解链酶所解链,以单链的形式与另一核酸酶结合形成RNA酶复合体,复合体中的RNA链象向导一样引导酶复合体识别序列与之互补的mRNA,并将该mRNA水解,从而特异性的抑制基因表达。2001年,Ruchl等首先发现合成21bp的SiRNA可在哺乳动物细胞中特异并有效的抑制基因表达(Elbashir,et al.Science 296,550-553;2002)。
RNA干扰是体内消除基因突变的一种生理性保护机制,但如果人为的使用合成的针对某种特异性基因的SiRNA,能够抑制该基因的表达从而有效地用于肿瘤及病毒的基因治疗。所谓RNAi技术指基于RNAi现象而开发的抑制特定基因表达或降解特定RNA分子的分子生物学技术,根据RNAi的基本原理,可针对致病基因的DNA核苷酸序列,选择其中一段与其它基因同源性较低的序列作为靶序列,通过体外合成或体内转录形成具有21-29个碱基的互补寡核苷酸短链(SiRNA),在细胞中与靶基因的mRNA特异性结合,激活细胞自身的机制使其降解,从而特异性抑制该致病基因的表达。同样,也可以用RNAi对基因的功能进行研究。体外合成是根据靶序列直接化学合成一对互补寡核苷酸短链(SiRNA);而体内转录是将SiRNA模板克隆带入带有RNA聚合酶III类启动子(U6)的载体中,在细胞内转录形成具有发卡样结构的SiRNA而发挥作用。目前RNAi技术广泛的应用于抗病毒、抗肿瘤和基因功能的研究,并在其中取得了大量令人鼓舞的结果。
传统的肿瘤治疗方法包括放疗、化疗和手术治疗以其局限性使人们寻找新的抗肿瘤治疗方法。随着分子生物学的发展和对肿瘤分子机制认识的深入,现在人们已意识到肿瘤是一种多因子、多步骤和多基因参加的基因病。从基因水平治疗肿瘤为肿瘤疾病的根本性治愈提供了希望。在这近十年中,肿瘤的基因治疗发展非常迅猛,是目前肿瘤治疗研究的热点和新希望。肿瘤的基因治疗方法有很多种,常用的包括肿瘤的细胞因子基因治疗、增加肿瘤细胞免疫原性的基因治疗、自杀基因疗法、导入抑癌基因、封闭癌基因的表达等5种方法。但无论是那种基因治疗方法,靶基因的筛选对整个基因治疗来说至关重要。
端粒酶是一种细胞核糖体蛋白酶,其活性与复制衰老有直接关系,端粒酶的作用是在染色体3’末端加上TTAGGG这一重复序列,主要有两种形式,一种是HumanTelomerase Reverse Transcriptase Catalytic Subunit端粒酶逆转录酶(hTERT),另一种为Human telomerase RNA Component(hTR or hTERC)。美国科学家Kim等发现临床进展期恶性肿瘤必须有一种特定的机制来维持端粒的长度,使肿瘤细胞具有无限增殖的潜力,而这种作用是通过重新激活或上调端粒酶活性来实现。随着端粒的缩短,肿瘤的恶性程度逐渐降低,最终通过细胞衰老机制使肿瘤消退。但如果对将这些衰老的肿瘤细胞转导hTERT,使之获得端粒酶活性,肿瘤细胞能在老鼠体内继续生长,且恶性度越来越高,这充分证明端粒酶在肿瘤生长中的作用至关重要。而此时使用针对hTERT的ShRNA处理这些肿瘤,其生长迅速受到抑制,最终肿瘤细胞出现衰老而消退。
虽然载体介导的RNAi技术诞生时间并不长,然而由于其便捷、高效和低成本的特点,已经成为研究使致病基因失活和研究基因功能有力的工具。本发明的载体为第三代慢病毒病毒载体,是去除了3’-LTR末端U3区域133-bp的基因序列的自身非活化载体(SIN载体),有利于建立具有组织特异性启动子的载体,用于SiRNA基因治疗时,U6或H1-RNA启动子不会受到5’-LTR的影响。同时因丢失了5’-LTR强启动子功能,明显减少了因插入失活而导致癌变的危险。该载体表达基因的下游插入了WPRE(post-transcriptional regulatory element from the genome of Woodchuck hepatitisvirus)元件,明显提高了目的基因的表达水平,同时加强了目的基因在靶细胞表达的稳定性。该慢病毒载体的包装质粒中去除了Tat元件,使得该载体更安全。本发明的中间载体pKS-U6带有原核复制元件和基本的U6或H1-RNA启动子单位,U6或H1-RNA启动子是RNA聚合酶III家族启动子,在体内能很好的介导发卡样SiRNA的合成,是RNAi载体不可缺少的元件。
发明内容:
本发明的目的在于:针对传统的肿瘤的基因治疗方法中,RNA干扰技术的中目标基因的选择、转染效率等存在的问题给研究工作带来许多不便的实际问题,提供一种新的慢病毒介导的抑制端粒酶hTERT表达的ShRNA及其在制备抗肿瘤药物方面的应用。
本发明的目的是这样实现的:一种抑制端粒酶hTERT表达的ShRNA在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于:该ShRNA的序列为:
正义链:
5’-CCGGCCAAGTATTCCTGTTCAAGTTGACTCGATTCAAGAGATCGAGTCAGCTTGAGCAGGAATGCTTGGTTTTTG-3’
反义链:
5’-AATTCAAAAACCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGATCTCTTGAATCGAGTCAACTTGAACAGGAATACTTGG-3’;
将所述的ShRNA插入到慢病毒表达载体中,再整合到染色体中稳定表达SiRNA,从而抑制hTERT的表达;所述的ShRNA序列可识别端粒酶hTERT,被识别的序列为:CCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGA,该序列针对hTERT全长mRNA序列(NCBI AB085628.)第3036-3063碱基处。
在本发明中:所述的ShRNA序列中除了包括TTCAAGAGA Loop序列,还包括其它类型的Loop序列;被识别的序列还包括该序列范围内的其它19-27碱基序列。
在本发明中:所述的ShRNA序列两端为Age I和EcoR I酶切位点,可以直接克隆入pKS-U6载体中,或同时包括使用其它酶切位点克隆入含H1-RNA启动子的载体序列。
在本发明中:所述的ShRNA序列中包括2个Wobble碱基取代,从而形成以下SiRNAhairpin结构:
在本发明中:是将该ShRNA插入到慢病毒载体中后,用于抗肿瘤基因治疗药物中。
在本发明中:ShRNA插入到慢病毒载体中是通过中间载体pKS-U6实现的。
本发明的优点在于:端粒酶hTERT在80%以上的肿瘤中高表达,本发明涉及的ShRNA序列能有效地抑制hTERT的表达,从而使肿瘤细胞进入衰老状态而停止生长。将该基因序列插入中间载体pKS-U6中,有利于形成Leading sequence一致的重组子,提高RNAi效率。将U6-hTERT-ShRNA盒式结构用工具酶切除后亚克隆入慢病毒载体中,形成慢病毒注射液,可直接进行瘤体内注射,用于治疗肿瘤。慢病毒载体不同于腺病毒载体、逆转录病毒载体,它既可以转染活化状态的细胞,还可以转染静息细胞,而且不会插入失活,不致突变。
附图说明:
图1是构建U6-hTERT-ShRNA结构示意图;
图2是构建pLenti-hTERT-ShRNA结构示意图;
图3是肝癌细胞系SMMC-7721转导pLenti-hTERT-ShRNA后端粒酶活性明显减弱;
图4是HepG-2转导pLenti-hTERT-ShRNA后端粒酶活性明显减弱;
图5~图11是pLenti-hTERT-ShRNA抗肝癌作用的体内实验的照片。
具体实施方式:
实施例1:ShRNA的设计与合成
根据hTERT mRNA序列(NCBI AB085628.),用Ambion在线软件选择5条19-28nt的核苷酸序列作为RNAi靶点。这个靶序列分别为:
hTERT1:678-697CAGTGCCAGCCGAATCTG
hTERT2:1324-1349ACACAGACCCCCGTCGCCTGGTGCA
hTERT3:3036-3063CCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGA
hTERT4:2705-2728AGGCTGGGAGGAACATGCGTCGC
hTERT5:2372-2396TCATCGAGCAGAGCTCCTCCCTGAA
根据以上靶序列寡核苷酸链,分别设计其ShRNA,并其末端引入Age I和EcoR I酶切位点,中间有Loop序列。
以hTERT3序列为例,合成Oligoes(由南京生物工程公司合成)。
正义链:
5’-CCGGCCAAGTATTCCTGTTCAAGTTGACTCGATTCAAGAGATCGAGTCAGCTTGAGCAGGAATGCTTGGTTTTTG-3’
反义链:
5’-AATTCAAAAACCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGA TCTCTTGAATCGAGTCAACTTGAACAGGAATACTTGG-3’
合成的ShRNA序列中包括2个Wobble碱基取代,在转入细胞后形成以下SiRNAhairpin结构为:
实施例2:重组质粒的构建
构建重组质粒的过程如图1所示。取实施例1合成并纯化的ShRNA片断各10ug,退火成互补双链。将中间载体pKS-U6用(本试验室构建)Age I和EcoR I双酶切后,凝胶电泳回收大片断。质粒载体与ShRNA以1∶4用T4连接酶连接,转化感受态菌DH5-α,用氨苄青筛选位点,形成pKS-U6-hTERT-ShRNA。BamH I和Sal I酶切初步证实有外源性基因片段插入,进一步使用ABI-7700测序,与要合成的目的片段对比后确认合成的5对hTERT-ShRNA序列正确,无基因突变(如图1)。将测序正确的pKS-U6-hTERT-ShRNA质粒用BamH I和SalI酶切,得到U6-hTERT-ShRNA盒式结构,将其定向克隆入pLenti-GFP载体的BamH I和Sal I位点中,形成pLenti-hTERT-ShRNA,酶切鉴定插入子存在,进一步测序后证明5对hTERT-ShRNA序列正确(如图2所示)。
实施例3:重组慢病毒pLenti-hTERT-ShRNA的生产
①、在100mm培养皿(Corning)中接种106个293T细胞,待细胞长至70-80%融合时作1∶3传代,用含10%小牛血清(购于杭州四季青公司)的DMEM(购于GIBCO-BRL公司)作为培养基,在5%CO2培养箱中培养24h。
②、待细胞达70%融合时,将pLenti-hTERT-ShRNA质粒和慢病毒载体的包装质粒一起,用磷酸钙共沉淀法进行转染。
③、待细胞生长24h后换细胞培养基,置37℃5%CO2培养箱中培养,24h后收获病毒上清,换细胞培养基。
④、收获转化后72h病毒上清,用漂白剂处理细胞培养皿以破坏病毒生产细胞。
⑤、将病毒上清作50000rpm超速离心,吸取病毒上清层。
⑥、测病毒滴度,用PBS调整病毒滴度为1012VP/ml。
⑦、使用0.22μm的滤膜进行超滤,然后包装入2ml的西林瓶中(每西林瓶含1ml)。-80℃的深低温冰箱保存。
⑧、对病毒进行热源检测、微生物检测,同时用PCR法检测是否有野生病毒复制(RCL),确保无热源,无细菌、真菌、病毒等微生物污染,无野生病毒复制。
实施例4:细胞感染
分别取2盘10cm培养皿肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721,中待其长至80%融合时,作1∶3传代,分别获6盘HepG2和SMMC-7721肝癌细胞,24h后分别加入5种pLenti-hTERT-ShRNA慢病毒上清3ml,设1盘空载体对照,共6组。37℃培养箱中共育3h,加入7ml含血清的RPMI1640。48h后加入puromycin筛选,分别获得抗性克隆,用于端粒酶活性的检测。
实施例5:体外实验端粒酶活性检测和hTERT的表达情况。
1、TRAP assay
离心收集SMMC-7721和HepG2,并用K+、Ca+的PBS洗两次,加入100ulTRAP-lysisbuffer(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L MgCl2,1mmol/L EGTA,0.1mmol/L PMSF,5mmol/L b-硫基乙醇,0..5%CHAPs,10%甘油),充分混匀后冰上放置30min,12000r/min 4度离心20min,收集上清并用考马思亮兰染色,用紫外分光光度法于595nm波长处测定,蛋白浓度并稀释为2ug/ul。采用Kim报导的TRAP法(详见Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomeraseactivity with immortal cells and cancer.Science,1994,266:2011-2015)用端粒酶检测试剂盒(购自CHEMICON公司)进行端粒酶活性测试,其结果如图3所示。在图中:TRAP assay.0:heat control;1:SMMC-7721-pLenti-hTERT-ShRNA;2:HepG-2-pLenti-hTERT-ShRNA;3:SMMC-7721;4:Hela-pLenti-hTERT-ShRNA;5:BJ-hTERT-pLenti-hTERT-ShRNA;6:Hela cells;7:BJ-hTERT;8:MJ-90-hTERT;9:3T3cells as positive control。
2、RT-PCR
①RNA的抽提
各收集5×106SMMC-7721和HepG2,加入1ml TriPure,混匀,静置5min。在管中再加入0.2ml氯仿,振荡15s,室温静置8分钟。12000g于4℃离心15分钟。取上清500μl移至另一个用RNase free离心管中,加0.5ml异丙醇,上下颠倒混匀15s,于室温静置8分钟,12000g于4oC离心10分钟,弃干上清。在管中加入1ml75%的乙醇,振荡混旋,7500g于4oC离心5分钟,弃上清后于室温干燥5min。溶于50μl DEPC处理过的ddH2O,吹吸混匀,60℃水浴15分钟,取3μl加入197μl的ddH2O稀释后测浓度和OD260/OD280,保存于-70℃,待用。
②RT-PCR测定
在用RNase free的PCR管中加入9.5μl的nuclease-free water,2μl Oligo dT(0.5g/l)和4g tRNA(0.5g/l),PCR仪内70℃反应5分钟,立即放到-20℃冰箱,冰浴5min,再加入5μl M-MLV 5×buffer,2.5μl dNTP(10mM),1μlRNasin-Ribonuclease inhibitor,1μl M-MLV,轻弹管壁混匀,短暂离心,42℃反应60分钟,获得了cDNA。取上述cDNA 1μl加入35.5μl ddH2O,再加入5μl10×Buffer(含25mM Mg2+)、1μl dNTP、2μl引物(sense,antisense各1μl)和0.5μl(5unit/μl)Taq DNA聚合酶,在MJ Minicycler PCR仪进行扩增。扩增参数根据具体基因primer(sense:5’gcctctagatttcatccagccaca3’;antisense:5’cctctctcccctgcaacacaca3’)进行设定,并进行优化。
GAPDH 450bp
Sense:CTC AGA CAC CAT GGG GAA GGT GA,
Antisense:ATG ATC TTG AGG CTG TTG TCA TA,
hTERT 145bp
Sense 5’-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3’;
Antisense:5’-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3’;
PCR产物在含1μg/ml EB的1%agarose胶进行电泳,用UVP成像系统拍照,如图4所示。在图中:RT-PCR:1:SMMC-7721;2:SMMC-7721-pLenti-TERT-ShRNA;3:HepG-2;4:HepG-2-pLenti-TERT-ShRNA;5:Hela cells;6:Hela-pLenti-hTERT-SiRNA。
实施例6:pLenti-hTERT-ShRNA治疗人肝癌Scid鼠移植肿瘤
1、材料与方法:人肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721(均可购自ATCC)为本实验室传代培养。Scid鼠重度联合免疫缺陷小鼠,购自南京大学动物模式中心。
2、将Scid小鼠分为7组,每组6只。
第一组为将转导pLenti-hTERT-ShRNA的SMMC-7721细胞(5×104/只)直接皮下注射。
第二组为将转导pLenti-hTERT-ShRNA的HepG2细胞(5×104/只)直接皮下注射。
第三组转导空质粒的SMMC-7721细胞(5×104/只)皮下注射。
第四组为转导空质粒的HepG2细胞(5×104/只)皮下注射。
第五组为转导pLenti-hTERT-ShRNA的SMMC-7721细胞(5×104/只)肾包膜下移植。
第六组为转导pLenti-hTERT-SiRNA的HepG2细胞(5×104/只)肾包膜下移植。
第七组为转导空质粒的HepG2肾包膜下移植。
图5A为SMMC-7721-pLenti-hTERT-SiRNA皮下接种后42天的照片,B为HepG-2-pLenti-hTERT-SiRNA皮下接种后42天的照片,由图可见均无明显肿瘤生长;C为转导空质粒的SMMC-7721皮下接种后21天的照片,D为HepG-2皮下接种后21天的照片,由图可见肿瘤生长迅速,需要及时处死荷瘤scid小鼠;E为SMMC-7721-pLenti-hTERT-SiRNA肾包膜下移植后42天的照片,F为HepG-2-pLenti-hTERT-SiRNA肾包膜下移植后42天的照片,由图可见肿瘤生长极其缓慢。G为HepG-2转导空质粒后肾包膜下移植21天的照片,由图可见肿瘤迅速腹腔转移需处死小鼠。
以上实施例不是对本发明的具体限制,在具体实施时,在权利要求中涉及的28个碱基的被识别序列中,针对其中其他19-27个序列的设计ShRNA序列也同样可以实施到本发明中。
<110>南京中脉生物医药有限公司
<120>抑制端粒酶逆转录酶hTERT表达的ShRNA在抗肿瘤中的应用
<140>200610038270.7
<141>2006-02-14
<160>2
<210>1
<211>75
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>stem_loop
<222>(33)...(41)
<223>人工设计的正义链
<400>1
ccggccaagt attcctgttc aagttgactc gattcaagag atcgagtcag cttgagcagg 60
aatgcttggt tttg 75
<210>2
<211>75
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>stem_loop
<222>(39)...(47)
<223>人工设计合成的反义链
<400>1
aattcaaaaa ccaagcattc ctgctcaagc tgactcgatc tct tgaatcg agtcaact tg 60
aacaggaata cttgg 75
Claims (5)
1. 一种抑制端粒酶逆转录酶hTERT表达的ShRNA在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于:该ShRNA的序列为:
正义链:
5’-CCGGCCAAGTATTCCTGTTCAAGTTGACTCGATTCAAGAGATCGAGTCAGCTTGAGCAGGAATGCTTGGTTTTTG-3’
反义链:
5’-AATTCAAAAACCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGATCTCTTGAATCGAGTCAACTTGAACAGGAATACTTGG-3’;
将所述的ShRNA插入到慢病毒表达载体中,再整合到染色体中稳定表达SiRNA,从而抑制hTERT的表达;所述的ShRNA序列可识别端粒酶hTERT,被识别的序列为:CCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGA,该序列针对hTERT基因全长mRNA序列第3036-3063碱基处,hTERT基因全长mRNA序列记载在NCBI中,序列编号为AB085628。
2. 根据权利要求1所述的抑制端粒酶逆转录酶hTERT表达的ShRNA在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于:所述的ShRNA序列两端为Age I和EcoR I酶切位点,可以直接克隆入pKS-U6载体中,或同时包括使用其它酶切位点克隆入含Hl-RNA启动子的载体序列。
4. 根据权利要求1~3择一所述的抑制端粒酶逆转录酶hTERT表达的ShRNA在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于:将该ShRNA插入到慢病毒载体中后,用于抗肿瘤基因治疗药物中。
5. 权利要求4所述的抑制端粒酶逆转录酶hTERT表达的ShRNA在抗肿瘤药物中的应用,其特征在于:所述的该ShRNA插入到慢病毒载体中是通过中间载体pKS-U6实现的。
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