CN100396698C

CN100396698C - 一种新的乳腺癌相关蛋白及其特异性多克隆抗体

Info

Publication number: CN100396698C
Application number: CNB2003101153896A
Authority: CN
Inventors: 柯杨; 杜晓娟; 宁涛; 杨琳; 赵军
Original assignee: Beijing Inst Of Tumor Prevention & Cure
Current assignee: Beijing Inst Of Tumor Prevention & Cure; Beijing Institute for Cancer Research
Priority date: 2003-11-21
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2008-06-25
Anticipated expiration: 2023-11-21
Also published as: CN1618810A

Abstract

本发明涉及一种新的乳腺癌相关蛋白KIAA0649及与KIAA0649蛋白3’端如SEQ ID NO：2所示第496至1209位的氨基酸残基组成的多肽特异性结合的多克隆抗体。本发明还涉及所述多克隆抗体的制备方法和用途。

Description

一种新的乳腺癌相关蛋白及其特异性多克隆抗体

技术领域

本发明涉及一种未知功能的蛋白及其特异性多克隆抗体，更特别地，本发明涉及一种新的乳腺癌相关蛋白及其特异性多克隆抗体。本发明还涉及所述多克隆抗体的制备方法和用途。

背景技术

目前我国的乳腺癌总体发病率在30/10万以下，约为美国和北欧国家的1/4-1/3。但我国沿海地区如上海等城市发病率呈明显上升趋势(标化发病率由1974年的18.3/10万上升到1997年的46/10万)。乳腺癌已经成为威胁我国女性健康与生命的最常见的恶性肿瘤之一。

研究表明，肿瘤相关的分子标志对肿瘤的诊断和治疗起着重要的作用。雌激素受体(ER)和BRCA1等分子的表达，是临床上应用比较广泛的乳腺癌分子标志，对乳腺癌早期诊断，治疗和预后有着重要的参考价值。但是，由于肿瘤细胞的异质性和发生机制的复杂性，目前已知的分子标志只能解决部分患者的早期诊断和治疗指标的问题，因此寻找新的肿瘤标志分子，将为临床早发现早诊断和早治疗提供更多更可靠的靶分子，是肿瘤研究的重要内容。

KIAA0649基因于1998年首次被ISHIKAWA等人克隆出(Prediction of thecoding sequences of unidentified human genes.X.The complete sequencesof 100 new cDNA clones from brain which can code for large proteins invitro，DNA Res.5(3)，169-176(1998))，而关于该基因及其表达蛋白的功能至今没有文献报道。生物信息学分析，该基因位于人9号染色体(9q34.3)，cDNA序列全长4932bp，编码1209个氨基酸组成的KIAA0649蛋白，分子量为127352Da，该蛋白功能未知。

抗体技术是研究蛋白质功能和临床检测中重要的一环。抗体是机体在抗原刺激下所产生的特异性球蛋白，所以又称为免疫球蛋白(Ig)。但免疫球蛋白并不都具有抗体活性。人类Ig，根据其重链稳定区的分子结构和抗原性的不同，可分为五类，即IgG、IgA、IgM、IgD及IgE。抗体存在于血清、粘膜分泌液及其它体液中，由遗传基因决定所产生的抗体称为天然抗体，而由抗原激发免疫细胞产生的抗体称为免疫抗体或称特异性抗体。特异性抗体是免疫应答中的重要产物，因此亦是免疫学实验中常用的试剂，对于抗原的分析鉴定和定量检测极为重要，在各种免疫学诊断中应用极为广泛。

由人工制备的特异性抗体分为三种类型，即多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体。传统的方法是将抗原注入人体(如预防接种注射疫苗)或动物，由人或动物体内B淋巴细胞产生抗体。由于抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B淋巴细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此将抗原注入机体所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称之为多克隆抗体。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的乳腺癌相关蛋白。

本发明的一个目的是提供本发明的新的乳腺癌相关蛋白在作为乳腺癌标志分子中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种与本发明的新的乳腺癌相关蛋白第496位至1209位氨基酸残基组成的多肽特异性结合的多克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供一种本发明的多克隆抗体的制备方法。

本发明的另一个目的是提供本发明的多克隆抗体在体外检测待测样品中是否存在本发明新的乳腺癌相关蛋白的用途。

本发明的另一个目的是提供含有本发明的多克隆抗体的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供本发明的多克隆抗体在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

一方面，本发明提供一种新的乳腺癌相关蛋白。GI(基因库索引号)：7662223；NCBI Genbank登记号：NM-014811；VERSION(版本)NM-014811.1。生物信息学分析，该基因位于人9号染色体(9q34.3)，cDNA序列全长4932bp，编码1209个氨基酸组成的KIAA0649蛋白(从550至4176)，分子量为127352Da，该蛋白功能未知。

本发明人在大量实验的基础上，利用与KIAA0649蛋白3’端(如SEQ ID NO：2所述第496至1209位的氨基酸残基组成的多肽特异性结合的多克隆抗体，运用免疫组织化学技术以该抗体检测人乳腺癌病理组织中该蛋白的表达情况，结果表明该KIAA0649蛋白在癌组织表达阳性率非常高；癌旁组织中阳性表达率较高，远端正常乳腺组织表达率则极低。从而，以实验证明了KIAA0649蛋白为一个新的乳腺癌相关蛋白。另外，利用免疫组织化学方法研究了KIAA0649蛋白在30例乳腺癌组织中的表达情况，结果与正常组织的阳性率(11％)相比，在30例乳腺癌组织中的阳性率为96.67％，说明其为乳腺癌相关蛋白，进一步说明其为乳腺癌的新的标志分子。

本发明提供了KIAA0649蛋白在作为乳腺癌相关蛋白，尤其是作为乳腺癌标志分子中的应用。该分子将有可能作为乳腺癌病理诊断及恶性程度判定标准，并有可能成为乳腺癌的一个预后指标，从而为乳腺癌的诊断和临床治疗提供一个可能的分子基础。在本发明的一个实施方式中，采用与如SEQ ID NO：2所示的乳腺癌相关蛋白特异性结合的多克隆抗体，体外检测待测样品中是否存在SEQ ID NO：2所示的乳腺癌相关蛋白，其中存在SEQ ID NO：2所示的乳腺癌相关蛋白的待测样品为与乳腺癌相关，需进一步鉴定。

在本发明的一个实施方式中，其中所述体外检测方法包括：

1)将待测样品与本发明所述的多克隆抗体孵育，所述的多克隆抗体与待测样品中的KIAA0649蛋白特异性结合，由此形成免疫复合物；并且

2)检测是否存在免疫复合物。

另一方面，本发明提供一种多克隆抗体，该多克隆抗体与SEQ ID NO：2所示第496至1209位氨基酸残基组成的多肽特异性结合。本文所述的“抗体的特异性”是指多克隆抗体对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。特异性高，抗原的识别能力就强。“多克隆抗体与抗原特异性结合”是指多克隆抗体特异性识别靶抗原并与靶抗原的不同抗原表位或抗原决定簇结合的特性。多克隆抗体与单克隆抗体不同，单克隆抗体是均质的，所有的单克隆抗体识别相应靶抗原的同一抗原表位，并且所有的单克隆抗体在结合特性方面的结构和功能是相同的；而多克隆抗体为异质的，所有的多克隆抗体不是来源于单一克隆，因此在结合机制及结构方面都有变化。在本发明中多克隆抗体是有好处的，一方面，由于所有的多克隆抗体对靶抗原是高度特异性的，另一方面，由于靶抗原上具有大量的抗原表位，而多克隆抗体与靶抗原的不同抗原表位结合，所以使多克隆抗体与靶抗原的结合产生协同效果，从而更好地识别靶抗原。

在本发明的一个优选实施方式中，本发明的多克隆抗体对谷胱苷肽-S-转移酶与SEQ ID NO：2第496至1209位氨基酸残基组成的多肽形成的重组蛋白特异性结合，而对谷胱苷肽-S-转移酶没有特异生。所述多克隆抗体主要为IgG。

本领域普通技术人员已知，可以直接采用如SEQ ID NO：2第496至1209氨基酸残基组成的多肽作为抗原，获得本发明的多克隆抗体。也可以将本发明如SEQ ID NO：2第496至1209氨基酸残基组成的多肽与已知的标签形成重组蛋白作为抗原，获得本发明的多克隆抗体。所述的标签选自，但不限于，组氨酸标签(His标签)、谷胱苷肽-S-转移酶标签(GST标签)、HA标签、HSV标签、Myc标签和VSV-G-标签。在本发明的一个实施方式中，采用GST与如SIQ IDNO：2所示第496至1209位氨基酸残基组成的多肽形成的重组蛋白。

本发明的抗原可以按本领域技术人员已知的常规固相合成方法合成。例如本发明如SEQ ID NO：2第496至1209位氨基酸序列可以按Steward and Young(Steward，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2^nd Ed.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.，(1984))描述的方法用AppliedBiosystem合成仪或Pioneer^TM肽合成仪按固相化学技术合成。也可以先合成多个片段，然后连在一起形成更大的片段。优选本发明的抗原通过基因工程的方法获得。利用在原核生物或真核生物中表达含有编码本发明的抗原的多核苷酸序列。

虽然本发明KIAA0649蛋白的序列已经公开，但是发明人在大量实验的基础上，发现如SEQ ID NO：2所示496至1209氨基酸残基组成的多肽足以作为抗原，免疫动物获得本发明的多克隆抗体，并且在原核生物中表达如SEQ ID NO：2所示496至1209氨基酸残基组成的多肽。

在本发明的一个优选实施方式中，首先将KIAA0649蛋白cDNA的3’末端如SEQ ID NO：1所示2035至4191位核苷酸序列克隆到原核表达载体pGEX4T-2(购自Pharmacia)中(pGEX4T-2/K2.1)，使其读码框架一致，利用BL-21菌株(购自Invitrogen)表达GST重组蛋白。

本领域普通技术人员熟知适用于表达本发明的抗原的载体。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)等。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择适当的载体。当然，可以在真核细胞中表达本发明的抗原，这时应使用适用于真核细胞的载体，例如pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)，以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)等。

可使用任何适当的宿主细胞表达本发明的抗原。可提到的适当宿主的例子有：原核细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等；低等真核细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇和中国家蚕细胞；植物细胞；高等真核细胞如哺乳动物细胞如CHO、COS细胞。哺乳动物表达系统的例子包括人细胞系，如Hela、293和U937细胞系，以及COS、CHO和BHK细胞系。转导、转化或转染的方法是本领域已知的，包括，但不限于，病毒感染、氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法等。为了活化启动子、选择转化体或扩增所需的基因，可以在适当修饰的常规营养培养基中培养被转导、转染或转化的宿主细胞。培养中所使用的温度、pH值等培养条件一般都是由所选用的表达特定蛋白质的宿主细胞决定的，并且这些条件都是本领域技术人员熟知的。为了大量获得重组蛋白，可以采用诱导型启动子，并利用诱导物诱导基因的表达。实质上，“诱导物”可以是任何能诱导宿主中基因表达的物质，可以化学物质或环境刺激，如，暴露于特定波长的光下。在本发明的一个优选实施方式中，采用的诱导物为IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)。

抗血清的效价可根据抗体的不同性质，分别采用环状沉淀试验、琼脂双向扩散、单向免疫扩散、溶血实验、凝集反应、酶联免疫吸附实验及放射免疫分析等进行测定。在本发明的一个优选实施方式中，本发明的多克隆抗体分子量约为150kD，用酶联免疫吸附实验检测其抗体效价为10^-5至10^-6。

本发明提供一种本发明的多克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括：

将谷胱苷肽-S-转移酶与SEQ ID NO：2第496至1209位氨基酸残基组成的多肽形成的重组蛋白作为抗原，免疫动物，取血，分出抗血清并纯化制得，制得的多克隆抗体与SEQ ID NO：2所示的多肽特异性结合，而对谷胱苷肽-S-转移酶没有特异性。

在本发明的多克隆抗体的制备方法中，供免疫用的动物可为哺乳类和禽类，包括，但不限于，家兔、山羊或绵羊、马、骡和豚鼠等。动物种类的选择主要是根据抗原的特性和所要获得抗体的量和用途。对本发明的蛋白质抗原，大部分动物均适合，优选家兔和山羊，更优选家兔。对于难以获得的抗原，且抗体需要量少，可用纯系小鼠制备。免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性。由于动物个体的免疫应答能力差异较大，每批免疫宜同时使用数只动物。

抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类、免疫次数、注射途径以及受体动物的种类、免疫周期及所要求的抗体特性等而不同。剂量过低不能形成足够强的免疫刺激，但剂量过高，又有可能造成免疫耐受。在一定范围内，抗体效价随注射抗原的剂量而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般而言，小鼠首次抗原剂量为5-400μg/次；大鼠为10μg-1mg/次；兔为10μg-5mg/次，优选50-100μg。如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法；反之，欲获得高效价的抗血清，宜采用大剂量抗原长程免疫法。对本发明的包涵体来源的抗原常可加用佐剂，以增强抗原的免疫原性或改变免疫反应的类型，以刺激机体产生较强的免疫应答。如不加佐剂，则抗原剂量应加大约10-20倍。佐剂有弗氏(Freund’s)佐剂、脂质体佐剂及氢氧化铝佐剂等。其中最常用的是弗氏佐剂，根据其组成分为完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)和不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)两种。IFA通常由羊毛脂1份、石蜡油5份组成，每毫升IFA中加入1-20mg卡介苗即为CFA。

本发明的包涵体来源的抗原可采用背部、足掌、淋巴结周围、耳后等处皮内或皮下多点注射。初次免疫与第二次免疫的间隔时间多为2-6周。常规免疫方案为抗原加CFA皮下多点注射进行基础免疫；再以抗原加IFA作2-5次加强免疫，每次间隔2-6周，皮下或腹腔注射加强免疫。完成免疫程序后，先取少量血清测试抗体效价达到要求时，即可从动物心脏穿刺(豚鼠及家兔)，颈静脉或颈动脉放血(家兔、羊及马匹)，待血液凝固后，离心沉淀分离出血清，加入0.1％叠氮钠作为防腐剂。

在本发明的一个优选实施方式中，提供了一种本发明的多克隆抗体的制备方法，其中，所述抗原由原核细胞表达，制备性SDS-PAGE胶纯化，纯度达电泳级；免疫动物时，将抗原与等体积完全弗氏佐剂混匀进行初次免疫，再次免疫时以不完全弗氏佐剂取代弗氏佐剂，两次免疫时间间隔2至4周，之后每隔一个月加强免疫一次并于加强后10天内取耳静脉血，用酶联免疫吸附实验检测其抗体效价，当抗体效价为10^-5至10^-6时，免疫后8至10天，取血，其中每次免疫量为1μg抗原量/g动物体重至1μg抗原量/10g动物体重；离心收集上清，制得多克隆抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，例如盐析、凝胶过滤、亲合色谱层析等方法。

本发明还提供了本发明的多克隆抗体的用途，在本发明的一个实施方式中，本发明提供了本发明的多克隆抗体在体外检测待测样品中是否存在KIAA0649蛋白中的用途，其中所述体外检测包括：

2)检测是否存在免疫复合物。

所述的待测样品可以直接来自病人的病灶组织或周围组织，也可以来自石蜡切片。可以将待测样品预处理，以符合检测的需要。

检测是否存在免疫复合物的方法可以采用本领域普通技术人员已知的方式检测，例如荧光、发光、放射性或化学发光化合物或酶标记。这些标记的精确特性并不是特别关键，但是它应该能够通过其本身或与一种或多种额外物质结合(如酶的底物)，产生外源方法可检测的信号。

在本发明的一个实施方式中，采用Westen Blot方式检测样品中是否存在KIAA0649蛋白(参见实施例3)。本发明的一个实施方式中，利用本发明的多克隆抗体，采用免疫组化方法体外检测待测样品中是否存在KIAA0649蛋白(参见实施例4)。免疫组化方法常用的酶与ELISA检测使用的酶基本上相同，包括，但不限于，辣根过氧化物酶(horserad-ish Peroxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatease，AP)，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等，优选辣根过氧化物酶。本领域普通技术人员已知，针对不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于，邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS和二氨基联苯胺(DAB)等。碱性磷酸酶的底物一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)，AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮)。对于酶标IgG二抗及三抗等，现已有商品出售，可以直接商购获得。

本发明另一方面提供一种药物组合物，其含有本发明的多克隆抗体和必要时的药物可接受的载体或赋形剂。本发明的多克隆抗体可以与药物可接受的赋形剂或载体结合形成药物组合物。药物可接受的载体或赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料，例如，包括但不限于盐水、缓冲盐液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其混合物。所述药物组合物适于胃肠外、舌下、脑池内、阴道内、腹膜内、直肠内、颊内、肿瘤内或表皮给药。

胃肠外给药包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、关节内注射和输注。适于胃肠外给药的药物组合物包括无菌水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在临使用前在无菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。适宜的水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、羧甲基纤维素、植物油和可注射的有机酯如油酸乙酯。这些组合物还可以含有防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂等佐剂。加入等渗剂如糖类、氯化钠等可能是有利的。

表皮给药包括在皮肤、黏膜上、以及在肺和眼的表面给药。这样的药物组合物包括粉剂、软膏、滴剂、透皮贴剂、离子电渗疗法装置以及吸入剂等。在适于吸入的组合物中，本发明多克隆抗体被压缩或含于压缩气体如氮气或液化气体推进剂中。优选地，本发明多克隆抗体不溶于液化推进介质中。

直肠或阴道给药的组合物优选为栓剂，它可以通过将本发明的多克隆抗体与适宜的非刺激性赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合制备，所述赋形剂或载体在室温为固态，在体温下为液态，因此在直肠或阴道腔内融化并释放出活性化合物。

当以上述或其他方式进行治疗时，治疗有效量的本发明多克隆抗体可以是本发明多克隆抗体的单独形式，使用或不使用药物可接受的赋形剂。治疗有效量指以适宜的治疗方式对治疗肿瘤有效的本发明多克隆抗体的量。对任何特定患者的具体治疗有效剂量取决于许多因素，包括所治疗的疾病和气其严重程度；所用具体多克隆抗体的活性；所用的特定组合物；患者的年龄、体重、性别、饮食和一般健康状况；给药时间；给药途径；多克隆抗体的排泄速度；治疗的持续时间联合或同时服用的其他药物等。

在本发明的大量实验的基础上，本发明进一步提供了本发明的多克隆抗体在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。本发明制备的多克隆抗体可以与本发明的新的乳腺癌相关蛋白KIAA0649特异性结合，而乳腺癌相关蛋白KIAA0649在乳腺癌组织中强表达，并且在30例乳腺癌组织中的阳性率为96.67％，更进一步说明其为乳腺癌相关蛋白，尤其是乳腺癌的新的标志分子。

附图说明

图1为SDS-PAGE分析用质粒pGEX4T-2/K2.1转化的JM109&BL21菌株，其中，M为高分子量蛋白质标准；1-3和5为含有pGEX4T-2/K2的菌株JM109的总蛋白，未用IPTG诱导；4和6为含有pGEX4T-2/K2的菌株JM109的总蛋白，用IPTG诱导；7为含有pGEX4T-2/K2的菌株BL21的总蛋白，未用IPTG诱导；8为含有pGEX4T-2/K2的菌株BL21的总蛋白，未用IPTG诱导。

图2为蛋白纯化的SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色图，其中，M为高分子量蛋白质标准；1为含有pGEX4T-2/K2.1的菌株JM109的总蛋白，未用IPTG诱导；2为含有pGEX4T-2/K2.1的菌株JM109的总蛋白，用IPTG诱导；3为上清液中的蛋白质；4为包涵体中的蛋白质；5为来自包涵体的GST/K2.1纯化蛋白。

图3为用Western blot方法检测内源性KIAA0649蛋白在人类乳腺癌细胞系和宫颈癌细胞系的表达情况，其中，1为宫颈癌细胞系(Hela)的核蛋白，2为宫颈癌细胞系(Hela)的浆蛋白，3为乳腺癌细胞系(MCF-7)的总蛋白，4为乳腺癌细胞系(MCF-7)的核蛋白，5为乳腺癌细胞系(MCF-7)的浆蛋白，从图中可见，该蛋白主要分布在细胞核中。

图4A显示运用免疫组织化学方法研究KIAA0649在乳腺癌组中的癌细胞表达情况，从图中可看出，乳腺癌组中的癌细胞团胞浆胞核均被染成棕色，即KIAA0649表达为阳性；图4B显示运用免疫组织化学方法研究KIAA0649在乳腺癌旁组织中的癌变细胞团块中的表达情况，从图中可看出，乳腺癌旁组织中的癌变细胞团块中的癌细胞较癌组织中癌细胞体积小，但胞浆仍被染成棕色，即KIAA0649表达为阳性；图4C显示运用免疫组织化学方法研究KIAA0649在乳腺癌远端正常组织中的癌细胞表达情况，从图中可看出，乳腺癌组织远端的正常乳腺腺泡由单层立方上皮围成，结构基本正常，KIAA0649表达阴性，图中棕色着色的部分为小血管内皮。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1重组蛋白的诱导、表达及纯化

1、表达质粒的构建

采用酵母双杂交系统2(购自Clontech公司)并参照其说明书，从Hela细胞cDNA文库中得到与1A6/DRIM(柯杨等，化学致癌作用靶基因的分离与测序，中国科学，1996，26：85-91，Schwirzke，M.et al Differential gene expressionin mammary carcinoma cell lines：indentification of DRIM，a new genedown-regulated in metastasis.Anticancer Research.1998，18：1409-1422.)结合的蛋白KIAA0649的cDNA序列，即如SEQ ID NO：1所示2035至4191位核苷酸序列。然后将KI从0649片段克隆到pGEX4T-2原核表达载体，用于原核表达GST融合蛋白。

2、观察目的基因是否在大肠杆菌中表达以及IPTG的诱导浓度

2.1在将表达质粒pGEX4T-2/K2.1转化入BL21(DE3)和(购自Invitrogen)菌株的平板上挑取单个克隆，接种于含氨苄青霉素(50ug/ml)的10mlLB中，37℃，225rpm，摇床上摇至OD值1.0左右。

2.2取四个摇菌管，分别加入上述菌液2ml，并编好号码，剩余的2ml存于4℃备用。在1、2、3号管中分别加入IPTG(购自sigma公司)至终浓度为0.1mM、0.5mM、1mM，4号管不加IPTG作为对照。37℃，225rpm，摇床上摇6小时左右。

2.3从1、2、3、4号管中分别取1ml菌液放入标记好的4个1.5mlEP管中，10000rpm，离心3分钟，沉淀细菌，彻底弃去培养液。沉淀加100ul1×上样缓冲液(分子克隆第2版884页)。加蛋白质分子量标准，各样品上样15ul，另外加无转化质粒的大肠杆菌BL21(DE3)样品作对照，行SDS-PAGE胶电泳，并用考马斯亮蓝染色，观察目的蛋白是否表达，0.1Mm、0.5mM、1mM IPTG诱导时目的基因目的蛋白的表达量，诱导表达的蛋白分子量是否与预期相同。

结果：如图1所示，诱导表达的GST/K2.1重组蛋白分子量与预期相同，蛋白分子量为115KD。

3、观察目的蛋白的表达是否可溶

用上述已经确定表达目的蛋白的菌液1ml加入到含氨苄青霉素(50ug/ml)的50mlLB中，20-30℃，225rpm摇床上摇至OD值约为2.0；加100mmIPTG至终浓度为0.1mM，继续按原条件培养2小时；7700g，4℃离心10min，收集细菌，弃上清；用1ml细胞裂解液溶解细菌沉淀，用碱变性法分离细菌中可溶性成分及包涵体成分，(方法见下面碱变性法提取包涵体中的重组蛋白)；用蛋白质分子量标准、IPTG未诱导样品、IPTG诱导样品、细菌超声后上清和初纯化的包涵体提取物成分，行SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色，观察诱导表达的目的蛋白是否可溶(表达的蛋白在上清中即为可溶)。

结果：本发明的表达的蛋白为不可溶性蛋白。

4、重组蛋白的大量诱导

挑取单克隆阳性表达菌，接种于100mlLB(Amp+)培养液中，37℃震荡培养过夜；次日以LB(Amp+)稀释至1000ml，继续培养至OD＝1左右，加IPTG至终浓度为1mM，继续培养6小时；4℃，5000rpm离心10分钟；沉淀以1×PBS洗涤后，分装(50ml菌液沉淀/管)，-70℃保存备用。

5、包涵体洗涤及碱变性法提取重组蛋白

将上述PBS洗涤后沉淀加1ml细菌裂解液(1mM，PMSF；1mg/ml，lysozyme；用PBS配)，冰浴20分钟；加10ul TritonX100至终浓度为1％，冰浴10分钟；冰上间歇超声裂菌，20HZ，超声30秒，至菌液不粘；4℃，15000rpm离心25分钟，上清留做SDS-PAGE分析；沉淀为不溶性包涵体，加5倍体积包涵体洗液(10mm，EDTA)，冰上间歇超声30秒，悬浮沉淀；4℃，15000rpm离心15分钟；重复e)-f)4-5次，沉淀为不溶性包涵体；加5倍体积包含提洗液，冰上间歇超声30秒，悬浮沉淀。4℃，3,000rpm离心10分钟，吸出浑浊液体，弃沉淀；4℃，15000rpm离心15分钟；每1000ml表达菌加2ml变性缓冲液I悬浮(2mM，DTT；2mN，EDTA(pH8))，冰上间歇超声30秒；加等体积变性缓冲液II悬浮(40mM，NaOH)，冰上间歇超声1分钟；加1/4体积变性缓冲液III(40％，甘油；50mM，Tris-HCl(pH8.0)；1mM PMSF)，冰浴5分钟；4℃，15000rpm离心1小时，收集上清，为碱变性法初纯化的外源表达蛋白。

6、SDS-PAGE制备胶及电洗脱纯化重组蛋白

SDS-PAGE制备胶的灌制：洗净制备胶玻璃板两块，准备好边条3根，边条两面涂少许凡士林，将玻璃板垫好并夹住。用1％琼脂糖封闭已夹好的两块玻璃的底边和周边；配10％分离胶60ml，5％浓缩胶15ml；灌胶：分离胶灌至玻璃板的2/3处，浓缩胶占分离胶的1/5，上面留有上样区域≥3cm；初纯化外源蛋白加等量2×SDS-PAGE上样缓冲液(100mM Tris-HCl(pH6.8)，20％甘油，200mMDTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝。(2×SDS上样缓冲液950ul+50ulβ-巯基乙醇))，沸水煮5min后上样，100V电泳6-7小时；电泳毕，用冷0.1MKCl浸泡胶2-3分钟，切下目的条带放入确保不漏的透析袋内；将透析袋置于水平电泳洗脱装置内，60V洗脱过夜，次日100V继续洗脱1小时，然后反转电极向相反方向洗脱3-5分钟；吸出透析带内液体，蔗糖包埋浓缩，PBS透析。

结果：如图2所示，得到的纯化蛋白达到电泳级。

实施例2抗血清、多克隆抗体的制备和鉴定

1、抗体检测用试剂：

ELISA用液：

①ELISA包被液：0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.5)；0.1M NaHCO₃，500ml；0.1M Na₂CO₃，30ml；调pH至9.5。

②ELISA洗液：0.05％Tween-20，用PBS(pH7.4)配制。

③ELISA封闭液及抗体稀释液：1％BSA，用PBS(pH7.4)配制。

④ELISA底物反应液：OPD 3.4mg；PBS(pH7.4)10ml；30％H2O2 5ul。

⑤ELISA反应终止液：12.5％H₂SO₄。

2、抗血清的制备

2.1动物：雄性，6-8W日本长耳白兔4只，2500g/只。

2.2抗原：GST/K2.1重组蛋白由原核表达，制备性SDS-PAGE胶纯化，纯度达电泳级，50ug/只/次。

2.3免疫程序及途径：

初次免疫：KIAA0649抗原与等体积完全佛氏佐剂充混匀，形成油包水，于兔背部皮内多点注射；四周后第一次加强免疫，KIAA0649抗原与不完全佛氏佐剂等体积混匀，背部皮内多点注射；之后每隔一个月加强免疫一次并于加强后第10天取耳静脉血，用ELISA法测抗体效价；当抗体效价达10^-5或10^-6时，于末次加强免疫后第8-10天放血，收集血清；抗血清的收集：将收集的血于4℃静置3-4小时，5,000rpm离心10分钟，收集上清。-70℃冻存备用。

3、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体滴度

ELISA包被液稀释纯化GST/K2.1抗原，浓度为5ug/ml，包被96孔板，50ul/孔，4℃过夜；0.05％Tween20-PBS洗2遍，1％BSA封闭，200ul/孔，室温1-2小时或4℃过夜；0.05％Tween20-PBS洗2遍，加入不同稀释度的抗血清(10^-3，10^-4，10^-5，10^-6)和正常兔血清(10^-3)，50ul/孔，室温1小时；0.05％Tween20-PBS洗5遍，加羊抗兔HRP(1∶1000)50ul/孔，室温1小时；PBS洗5遍，加OPD显色液100ul/孔，避光显色，显色后加终止液50ul/孔。

结果：抗体滴度可达10^-5-10^-6。

4、Western Blot检测多克隆抗体特异性

取30ug核蛋白或浆蛋白行12％SDS-PAGE电泳，电泳结束后，小心取胶，按胶的大小裁剪硝酸纤维素膜或PVDF膜和滤纸，并浸泡于电转缓冲液中15min，(PVDF膜需用甲醇溶液泡1-2min)；安装转移装置：先将两层滤纸放在海绵上，依次放置纤维素膜、凝胶及两层滤纸，使每层之间不留气泡，夹紧塑料支架放入电泳槽内，使硝酸纤维素膜一侧对正极、胶对阴极；接通电源，4℃、70V转膜2小时；转移结束后，取出NC膜，用丽春红染色(丽春红S(ponceauS)2g/l、三氯乙酸30g/l、磺基水杨酸30g/l)1-2min，蒸馏水冲洗至条带清晰可见，做好分子量标记；5％脱脂奶粉封闭4℃过夜或室温1小时；用0.5％Tween20-PBS洗涤后加KIAA0649特异抗体(1∶500或1∶1000)4℃过夜或37℃1小时；用0.5％Tween20-PBS洗3次，时间分别为15min、5min和5min，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体(购自北京中山生物公司)，室温作用1小时；用0.5％Tween20-PBS洗3次后按ECL^TM(Western blotting detection reagents，购自amersham pharmacia biotech)说明书方法进行化学发光、X光片曝光、洗片。

结果：参见图3，该内源性KIAA0649蛋白主要分布在细胞核中。

实施例3运用免疫组织化学方法研究KIAA0649在乳腺癌的表达情况

1、标本来源：本实验所用的乳腺癌病例均为临床和病理诊断明确的病例。有癌组织30例，与之相应的癌旁组织标本17例、正常组织标本18例。正常组织均为相应手术癌标本的远端组织。免疫组织化学用石蜡组织切片来自北京大学临床肿瘤学院病理科。

2、免疫组织化学实验步骤

石蜡切片常规脱蜡至水(二甲苯，60min，3次；；100％乙醇，3min，2次；95％乙醇，3min；75％乙醇，3min；蒸馏水冲洗，1×PBS再洗一次)；1％H₂O₂阻断内源性过氧化物酶室温，10min；抗原微波修复：切片放入修复液(9ml 0.1M枸橼酸溶液和41ml0.1M枸橼酸钠溶液加入450ml水中，溶液pH应为6.0)中92℃-98℃至少维持10min后室温冷却20-30min；1×PBS洗3次每次5min，10％正常羊血清37℃封闭1小时或4℃过夜；吸去羊血清(勿洗)，加入本发明的多克隆抗体(一抗)(1∶200)4℃过夜；1×PBS洗3次每次5min，加入生物素标记的羊抗鼠二抗(购自北京中山生物公司)，37℃作用30min至1小时；1×PBS洗3次每次5min，加入辣根过氧化物酶标记的三抗链霉卵白素(HRP-Strepavidin)(购自北京中山生物公司)，37℃作用30min至1小时；1×PBS洗3次每次5min，DAB 避光显色5-10min(DAB 5mg；PBS 10ml；30％H₂O₂ 5ul)，镜下观察有信号时可用自来水冲洗终止反应，10％苏木精复染(自来水冲洗)，1％盐酸-酒精分色(可滴片并直接泡在1×PBS里然后用水冲)；逐级酒精脱水、二甲苯透明(75％乙醇，3min；95％乙醇，3min；100％乙醇，3min，2次；二甲苯，3min，2次)；中性树胶加盖玻片封片。

结果：如图4A所示，乳腺癌组中的癌细胞团，胞浆胞核均被染成棕色，即KIAA0649表达为阳性；如图4B所示，乳腺癌旁组织中癌变团块中的癌细胞较癌组织中的癌细胞体积小，但胞浆仍被染成棕色，即KIAA0649表达阳性；如图4C所示，乳腺癌组织远端的正常乳腺腺泡由单层立方上皮围成，结构基本正常，KIAA0649表达阴性，图中棕色着色的部分为小血管内皮。

3、利用免疫组织化学方法研究KIAA0649在乳腺癌的表达情况

将癌组织30例，与之相应的癌旁组织标本17例、正常组织标本18例，分别按照上述免疫组织化学实验步骤的方法研究KIAA0649在乳腺癌的表达情况。

结果见表1。

表1、KIAA0649在乳腺癌的表达情况

	例数(n)	阳性例	阴性例	阳性率(％)
	例数(n)	阳性例	阴性例	阳性率(％)	癌	30	29	1	96.67
癌旁	17	12	5	70.59	癌	30	29	1	96.67
癌旁	17	12	5	70.59	正常	18	2	16	11.11

结论：如表1所示，KIAA0649蛋白在癌组织表达阳性率非常高；癌旁组织中阳性表达率较高，远端正常乳腺组织表达率则极低。表明KIAA0649在乳腺癌组织中的表达与乳腺癌的发展进程密切相关，强烈提示该蛋白极有可能成为一个新的乳腺癌标志分子，并预示着该蛋白分子有非常好的理论研究价值和临床应用前景。

序列表

<110>北京市肿瘤防治研究所

<120>一种新的乳腺癌相关蛋白及其特异性多克隆抗体

<130>D0311026F

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>4932

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(550)..(4179)

<223>

<400>1

gcgcggcccg ggcgcggggc ggcggcagcg gcggcgcgcg gggaggcggg gaggcggggg 60

gcccggccgg acgcccctgc gccccctccc cgcgccccgg ccgagggcgg agcgcgctgg 120

ccctgcagcc tccggcccgc ccccggcccg ccgcctcccc cgggacgtgg gacgcgggcg 180

caggcggggt ccgcgcggcg ggcggcgggg gacgggcgga gtcaaaagtc tattgaaaaa 240

gcagagagag aatgcctcgg tgtgtaagtg gagtgatgag gacctgatct ctgggccgtg 300

tgggaacact ggctgccatt tcatcacagt caacctggac tcacagaatt tcaagagctt 360

gtcggttggg tcaagaatga acctacgcat gacggcgtgc tgatcctggg tttctagtca 420

tcctttttaa gctgcaaaga agcatttgca gacgttgtct catgggtacc gcttgccaac 480

tttggaggat gtgaagccgg tagagaaata aagcatcgcc cctctgcgcg cccctccccg 540

tctgctaga atg ttt ctc atg aac gct tct cca gtg gtt gct ctc cag tcc 591

Met Phe Leu Met Asn Ala Ser Pro Val Val Ala Leu Gln Ser

1 5 10

aaa tgg gag gcc ttt ggc ccg cca ggg agc tgt agg ttc ccc agg tgc 639

Lys Trp Glu Ala Phe Gly Pro Pro Gly Ser Cys Arg Phe Pro Arg Cys

15 20 25 30

ttc tcg gag gct gac gag ggc gtg gag agc gcg tcg gtg agc gcc cgg 687

Phe Ser Glu Ala Asp Glu Gly Val Glu Ser Ala Ser Val Ser Ala Arg

35 40 45

gtg cag atg ctt atc agc act ctg cag cgc gac ggg gct gct cgg ggc 735

Val Gln Met Leu Ile Ser Thr Leu Gln Arg Asp Gly Ala Ala Arg Gly

50 55 60

acc agc gat gag cgc gcc gca cag agg ggc cac agg gca gag gga tgc 783

Thr Ser Asp Glu Arg Ala Ala Gln Arg Gly His Arg Ala Glu Gly Cys

65 70 75

cac gac gcc agg ccg gct gcc aag ccc acc gtg cac aag gag cca ccc 831

His Asp Ala Arg Pro Ala Ala Lys Pro Thr Val His Lys Glu Pro Pro

80 85 90

gcg ttg gct gtc tgt ggt ctc gtt gct gac ttt gac ccc atg ggg gag 879

Ala Leu Ala Val Cys Gly Leu Val Ala Asp Phe Asp Pro Met Gly Glu

95 100 105 110

gag gaa act aca gac ttt ggc ccg ttg gtg cta gat tca gac agt gat 927

Glu Glu Thr Thr Asp Phe Gly Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Ser Asp

115 120 125

gat tcc gtg gac agg gac att gag gag gcc atc cag gag tac ctg aag 975

Asp Ser Val Asp Arg Asp Ile Glu Glu Ala Ile Gln Glu Tyr Leu Lys

130 135 140

gca aag agt gga gcc gca cag ccc ggg gcc ggc ggg gcc cag cca ggt 1023

Ala Lys Ser Gly Ala Ala Gln Pro Gly Ala Gly Gly Ala Gln Pro Gly

145 150 155

gca gcc cag cct tcc agg gcc gca ggc gga ggc agt aga tgt aag ccg 1071

Ala Ala Gln Pro Ser Arg Ala Ala Gly Gly Gly Ser Arg Cys Lys Pro

160 165 170

gaa ccg gct cac ggc agt gcc ccg act gcc ctg tgt ccc cca aaa ctt 1119

Glu Pro Ala His Gly Ser Ala Pro Thr Ala Leu Cys Pro Pro Lys Leu

175 180 185 190

gta cct gga tca ggt ggt ggc ccc ggc agc cag gtg gga tcc agc aag 1167

Val Pro Gly Ser Gly Gly Gly Pro Gly Ser Gln Val Gly Ser Ser Lys

195 200 205

gac cag ggc tcc gcc tcc ccg gtc agt gtg agc agc gat gac tcc ttc 1215

Asp Gln Gly Ser Ala Ser Pro Val Ser Val Ser Ser Asp Asp Ser Phe

210 215 220

gag cag agc atc agg gcg gaa ata gaa cag ttt ctg aat gag aag aga 1263

Glu Gln Ser Ile Arg Ala Glu Ile Glu Gln Phe Leu Asn Glu Lys Arg

225 230 235

cag cat gag acc caa aaa tgt gat ggg tca gtg gag aag aaa cca gac 1311

Gln His Glu Thr Gln Lys Cys Asp Gly Ser Val Glu Lys Lys Pro Asp

240 245 250

aca aat gaa aat tcc gcc aag tca ctc ttg aaa tcc cac caa gag ccg 1359

Thr Asn Glu Asn Ser Ala Lys Ser Leu Leu Lys Ser His Gln Glu Pro

255 260 265 270

cct aca aag gtg gtg cat cgg cag ggc ctg ctg ggc gtc cag aag gag 1407

Pro Thr Lys Val Val His Arg Gln Gly Leu Leu Gly Val Gln Lys Glu

275 280 285

ttt gcc ttc cgc aaa cct ccc cgg tta gcg aag atg aac gtc cag ccc 1455

Phe Ala Phe Arg Lys Pro Pro Arg Leu Ala Lys Met Asn Val Gln Pro

290 295 300

aga agc ctc agg tcc aag gtc aca acc acg cag gag aac gag ggc agc 1503

Arg Ser Leu Arg Ser Lys Val Thr Thr Thr Gln Glu Asn Glu Gly Ser

305 310 315

acg aag ccg gca acc ccc tgc cgc cct tca gaa gca gca cag aat aaa 1551

Thr Lys Pro Ala Thr Pro Cys Arg Pro Ser Glu Ala Ala Gln Asn Lys

320 325 330

ggt ggg atc aaa agg agc gcc agc gct gca agg agg gga aag cga gtc 1599

Gly Gly Ile Lys Arg Ser Ala Ser Ala Ala Arg Arg Gly Lys Arg Val

335 340 345 350

atg agt gcg gca cag gcg tcc gag gcg tcc gac tcc agc agc gac gat 1647

Met Ser Ala Ala Gln Ala Ser Glu Ala Ser Asp Ser Ser Ser Asp Asp

355 360 365

ggc att gag gag gcc atc cag ctg tac cag ctg cag aaa aca cgc aag 1695

Gly Ile Glu Glu Ala Ile Gln Leu Tyr Gln Leu Gln Lys Thr Arg Lys

370 375 380

gag gcc gac ggg gac ctg ccc cag agg gtc caa ctc cga gag gag aga 1743

Glu Ala Asp Gly Asp Leu Pro Gln Arg Val Gln Leu Arg Glu Glu Arg

385 390 395

gcg cct gac cct ccc gca cac agc aca agc agt gcc aca aaa agt gcc 1791

Ala Pro Asp Pro Pro Ala His Ser Thr Ser Ser Ala Thr Lys Ser Ala

400 405 410

ttg ccc gag acc cac agg aaa aca ccc agc aag aag aag cta gtg gcc 1839

Leu Pro Glu Thr His Arg Lys Thr Pro Ser Lys Lys Lys Leu Val Ala

415 420 425 430

acc aag acc atg gac cct ggt cca ggg ggc ctg gac act gac cat gcc 1887

Thr Lys Thr Met Asp Pro Gly Pro Gly Gly Leu Asp Thr Asp His Ala

435 440 445

ccc aag ctc ctg aag gaa acc aaa gct cca cct cca gcg agc cct gct 1935

Pro Lys Leu Leu Lys Glu Thr Lys Ala Pro Pro Pro Ala Ser Pro Ala

450 455 460

tcc agg agt gag ttt gtg gaa cgg tcc tcg tgc cgg gcg gac aca tct 1983

Ser Arg Ser Glu Phe Val Glu Arg Ser Ser Cys Arg Ala Asp Thr Ser

465 470 475

gct gag ctg atg tgt gca gaa gca atc ctg gac atc tcc aag acg atc 2031

Ala Glu Leu Met Cys Ala Glu Ala Ile Leu Asp Ile Ser Lys Thr Ile

480 485 490

ctg ccg gcc cct gta gag ggc agt gac ggg tcc ctg tcc gca agc cca 2079

Leu Pro Ala Pro Val Glu Gly Ser Asp Gly Ser Leu Ser Ala Ser Pro

495 500 505 510

ctc ttc tac tcc ccg aac gtg cct tcc cgc tct gac ggc gac agt agc 2127

Leu Phe Tyr Ser Pro Asn Val Pro Ser Arg Ser Asp Gly Asp Ser Ser

515 520 525

tcc gtg gac agc gat gac agc atc gag cag gaa atc cgg aca ttt ttg 2175

Ser Val Asp Ser Asp Asp Ser Ile Glu Gln Glu Ile Arg Thr Phe Leu

530 535 540

gcc cta aag gcg cag tca ggg agt ttg ctg gcc aga ggt gag agc tgc 2223

Ala Leu Lys Ala Gln Ser Gly Ser Leu Leu Ala Arg Gly Glu Ser Cys

545 550 555

ccg cag gct gcc cag ggt cca ctt ttg ccg cct ggc ctc aac agc cag 2271

Pro Gln Ala Ala Gln Gly Pro Leu Leu Pro Pro Gly Leu Asn Ser Gln

560 565 570

acc ggc ggc cac aag acc cct ctc tct aaa aca cca gac cca ctg ctg 2319

Thr Gly Gly His Lys Thr Pro Leu Ser Lys Thr Pro Asp Pro Leu Leu

575 580 585 590

ggc tgc aaa agg aag cgt aga ggt ggt ggc cat gtg agg cca tcc acg 2367

Gly Cys Lys Arg Lys Arg Arg Gly Gly Gly His Val Arg Pro Ser Thr

595 600 605

ccc aag aaa atg cag gag gtg gtg aaa gac ggt agc cag gat gcc gac 2415

Pro Lys Lys Met Gln Glu Val Val Lys Asp Gly Ser Gln Asp Ala Asp

610 615 620

cac agc cag ggg aga gct gag ccc ggc cat gag agg cga gac ctg ccc 2463

His Ser Gln Gly Arg Ala Glu Pro Gly His Glu Arg Arg Asp Leu Pro

625 630 635

atc cag ggc aaa gcc agt gag gcc ctg gga ggg gag ggc acc gcc agg 2511

Ile Gln Gly Lys Ala Ser Glu Ala Leu Gly Gly Glu Gly Thr Ala Arg

640 645 650

ggc cct ggc gac act cgc atg tca cag ggc cag ggt aag aca gac gag 2559

Gly Pro Gly Asp Thr Arg Met Ser Gln Gly Gln Gly Lys Thr Asp Glu

655 660 665 670

gca agg cgc cta gac gag aaa gag agc tct gaa gac aaa agc agc tcc 2607

Ala Arg Arg Leu Asp Glu Lys Glu Ser Ser Glu Asp Lys Ser Ser Ser

675 680 685

ctg gac agt gac gag gac ctg gac aca gcc atc aag gac ttg tta agg 2655

Leu Asp Ser Asp Glu Asp Leu Asp Thr Ala Ile Lys Asp Leu Leu Arg

690 695 700

tcc aag cga aag ctc aag aag agg tgc agg gag ccc agg gct gcg tgc 2703

Ser Lys Arg Lys Leu Lys Lys Arg Cys Arg Glu Pro Arg Ala Ala Cys

705 710 715

agg aag aag gtc agg ttc agc aca gcc cag acg cac ttc ttg gag cag 2751

Arg Lys Lys Val Arg Phe Ser Thr Ala Gln Thr His Phe Leu Glu Gln

720 725 730

ctg ggc ggg ctc cgg aga gac tgg aaa gac agg ggc ccg cca gtg ctg 2799

Leu Gly Gly Leu Arg Arg Asp Trp Lys Asp Arg Gly Pro Pro Val Leu

735 740 745 750

aag agc tgc ctc tcc aag tcc aag aga gac agt ggc gag ggt cct ggg 2847

Lys Ser Cys Leu Ser Lys Ser Lys Arg Asp Ser Gly Glu Gly Pro Gly

755 760 765

aag aaa ccc ccc agt gtc ttt ggc agc acg gca gag agg atg agg cag 2895

Lys Lys Pro Pro Ser Val Phe Gly Ser Thr Ala Glu Arg Met Arg Gln

770 775 780

gag ggt gcc gcg agc cag gac gcg gcc ctg gcc ttc cgg gtg agg aga 2943

Glu Gly Ala Ala Ser Gln Asp Ala Ala Leu Ala Phe Arg Val Arg Arg

785 790 795

ccc gcc tcc gcc tct gcc tcc gaa ggg aat cca ttc ccc agg gag tcc 2991

Pro Ala Ser Ala Ser Ala Ser Glu Gly Asn Pro Phe Pro Arg Glu Ser

800 805 810

cag ggc cca gct ccc agc ccc ggc tcc ctg tct gat gac agc agt tca 3039

Gln Gly Pro Ala Pro Ser Pro Gly Ser Leu Ser Asp Asp Ser Ser Ser

815 820 825 830

gtg gac agc gac gac agc atc gaa ctg gag att agg aag ttt ttg gcg 3087

Val Asp Ser Asp Asp Ser Ile Glu Leu Glu Ile Arg Lys Phe Leu Ala

835 840 845

gaa aag gcc aag gag tca gtg agc agt tca gaa gtt cag gca gag ggc 3135

Glu Lys Ala Lys Glu Ser Val Ser Ser Ser Glu Val Gln Ala Glu Gly

850 855 860

ccc acc gct ctt ggg aca ggg ggc cca gcc agg cca gag gtg ctg tgc 3183

Pro Thr Ala Leu Gly Thr Gly Gly Pro Ala Arg Pro Glu Val Leu Cys

865 870 875

agg aag gag ccg gcc cca ccg cct ggc gtg tgc aca cgc agc cag agg 3231

Arg Lys Glu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Val Cys Thr Arg Ser Gln Arg

880 885 890

gcc agg ggg gtc cca cat ctg gcc gaa ggg ctt cga ggc aca gag agc 3279

Ala Arg Gly Val Pro His Leu Ala Glu Gly Leu Arg Gly Thr Glu Ser

895 900 905 910

gca gga gca cag ggc aca gct ggt ctg ttc agc cag ggc ggg aag ggg 3327

Ala Gly Ala Gln Gly Thr Ala Gly Leu Phe Ser Gln Gly Gly Lys Gly

915 920 925

ctc cct gct gct cct gcc cga ggg gat ccg gtg ccg ccc agg agc acc 3375

Leu Pro Ala Ala Pro Ala Arg Gly Asp Pro Val Pro Pro Arg Ser Thr

930 935 940

agc ggc ggt gtc tcc gcc aag ggg ctc tca gtg agc agg aga aat gtt 3423

Ser Gly Gly Val Ser Ala Lys Gly Leu Ser Val Ser Arg Arg Asn Val

945 950 955

tac gtt cac aaa gac cag agc cca cga ggg gct gag cct gct gcc aaa 3471

Tyr Val His Lys Asp Gln Ser Pro Arg Gly Ala Glu Pro Ala Ala Lys

960 965 970

agt gct ttt ggt cag ctg ccc agc tgt gcc aca gcg ggc acc gag gca 3519

Ser Ala Phe Gly Gln Leu Pro Ser Cys Ala Thr Ala Gly Thr Glu Ala

975 980 985 990

gga ggc gcc aga gga acc ttt cac atg ggc tgc ggg agc ccg agc ttc 3567

Gly Gly Ala Arg Gly Thr Phe His Met Gly Cys Gly Ser Pro Ser Phe

995 1000 1005

ctg acc ccc agc ccg gga gcg gag agg gac gct gga gcc cag gcc 3612

Leu Thr Pro Ser Pro Gly Ala Glu Arg Asp Ala Gly Ala Gln Ala

1010 1015 1020

gac cgc aca ccg ccc tgg agc gac ttc gcc cac cag agt cgg ctg 3657

Asp Arg Thr Pro Pro Trp Ser Asp Phe Ala His Gln Ser Arg Leu

1025 1030 1035

ccc agc ccg tgg gtg ctg cgc tcc gaa ggc aga gat gca gtg tgg 3702

Pro Ser Pro Trp Val Leu Arg Ser Glu Gly Arg Asp Ala Val Trp

1040 1045 1050

agg ggg ggc gtc ggg agc gag aga gac aag ggg tcc gag ggc ccc 3747

Arg Gly Gly Val Gly Ser Glu Arg Asp Lys Gly Ser Glu Gly Pro

1055 1060 1065

gcc cgg ggc ctg ccc agc ctg ccc ctt gcg ggc ttc tcg ccg ctg 3792

Ala Arg Gly Leu Pro Ser Leu Pro Leu Ala Gly Phe Ser Pro Leu

1070 1075 1080

ctg tcc acc cag ctc ttc cac ttt gga aag ggt gtc tcc tgg ggg 3837

Leu Ser Thr Gln Leu Phe His Phe Gly Lys Gly Val Ser Trp Gly

1085 1090 1095

ggc agg cag gct ggc ctc ttc agc ccc cac ctg ggg ctg cct ctg 3882

Gly Arg Gln Ala Gly Leu Phe Ser Pro His Leu Gly Leu Pro Leu

1100 1105 1110

cag ggc ccc tcc ttc tcg gcc ttc agg gag gcc cag gcc gga ccc 3927

Gln Gly Pro Ser Phe Ser Ala Phe Arg Glu Ala Gln Ala Gly Pro

1115 1120 1125

agc cct gtc ttt gga agc cca cac ttg ctg gca aag aag gac ggc 3972

Ser Pro Val Phe Gly Ser Pro His Leu Leu Ala Lys Lys Asp Gly

1130 1135 1140

ggc ccc tgg cca acc agg aag gca cag gca ggg ctg agt ttg cat 4017

Gly Pro Trp Pro Thr Arg Lys Ala Gln Ala Gly Leu Ser Leu His

1145 1150 1155

gac agg agg agc tcg ggc tcg gag gaa agc att tta gac ctg agg 4062

Asp Arg Arg Ser Ser Gly Ser Glu Glu Ser Ile Leu Asp Leu Arg

1160 1165 1170

tat cga cga agg gtc aac agg gat gac cag gag cag gac gcc ttg 4107

Tyr Arg Arg Arg Val Asn Arg Asp Asp Gln Glu Gln Asp Ala Leu

1175 1180 1185

ggc agt gac gcc agt gac ttc agc gac acc tcc acg gag gac agt 4152

Gly Ser Asp Ala Ser Asp Phe Ser Asp Thr Ser Thr Glu Asp Ser

1190 1195 1200

ggc ggc agc tca gta gtg aag gtc taa gccctcgagc tgtgggttcg 4199

Gly Gly Ser Ser Val Val Lys Val

1205

cgtcctgggt tgcgtgcatt cgtggaaagc ggcgtagccg tgcgtgtgtg tgatggttcc 4259

gtggctgcaa ggaagggaaa cagtctatta tacatagccc tgtatatatg tacaccaaca 4319

tgaaactttt atttaacaga cgtgtcctgg taaatatgat ttttgtagct ttttgtaaat 4379

tatttaaagt gatgtaaaag atatttttgg aaaatactgt tgttcaattt tgtagggtgt 4439

tcctaactgc agttttctgt gttctgcata caagtcttag cttaggaaac atttggttct 4499

taccatcaca gccaggttca cagaggctct gatgcttttt ggttgattgc tggtgagaat 4559

ggccggcggt ggctgcagtg gtagcctgag gaaggccaag ctgccctccc tgggaatcac 4619

tcagatgccc caagatgtcc gttgggaagc tcccaggaca gcacttttta tacagaggac 4679

accgcctcgg ccccacgtcc ttagaggcca gagcacatct gaaaactgca atcacagccg 4739

tccgctggaa aaacgtttcg aagcacagtg gccagcgagc gagcacgtgg ctactccctg 4799

ttgcatgtca aatccacaca gatgtcagcg gcagctgctc ggcagcccag ccctgggcct 4859

gggtgggttc atgtccaatc ttgttcgatc actagatgat tctaacatcg aaataaacct 4919

ctttttatat ggc 4932

<210>2

<211>1209

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Phe Leu Met Asn Ala Ser Pro Val Val Ala Leu Gln Ser Lys Trp

1 5 10 15

Glu Ala Phe Gly Pro Pro Gly Ser Cys Arg Phe Pro Arg Cys Phe Ser

20 25 30

Glu Ala Asp Glu Gly Val Glu Ser Ala Ser Val Ser Ala Arg Val Gln

35 40 45

Met Leu Ile Ser Thr Leu Gln Arg Asp Gly Ala Ala Arg Gly Thr Ser

50 55 60

Asp Glu Arg Ala Ala Gln Arg Gly His Arg Ala Glu Gly Cys His Asp

65 70 75 80

Ala Arg Pro Ala Ala Lys Pro Thr Val His Lys Glu Pro Pro Ala Leu

85 90 95

Ala Val Cys Gly Leu Val Ala Asp Phe Asp Pro Met Gly Glu Glu Glu

100 105 110

Thr Thr Asp Phe Gly Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Ser Asp Asp Ser

115 120 125

Val Asp Arg Asp Ile Glu Glu Ala Ile Gln Glu Tyr Leu Lys Ala Lys

130 135 140

Ser Gly Ala Ala Gln Pro Gly Ala Gly Gly Ala Gln Pro Gly Ala Ala

145 150 155 160

Gln Pro Ser Arg Ala Ala Gly Gly Gly Ser Arg Cys Lys Pro Glu Pro

165 170 175

Ala His Gly Ser Ala Pro Thr Ala Leu Cys Pro Pro Lys Leu Val Pro

180 185 190

Gly Ser Gly Gly Gly Pro Gly Ser Gln Val Gly Ser Ser Lys Asp Gln

195 200 205

Gly Ser Ala Ser Pro Val Ser Val Ser Ser Asp Asp Ser Phe Glu Gln

210 215 220

Ser Ile Arg Ala Glu Ile Glu Gln Phe Leu Asn Glu Lys Arg Gln His

225 230 235 240

Glu Thr Gln Lys Cys Asp Gly Ser Val Glu Lys Lys Pro Asp Thr Asn

245 250 255

Glu Asn Ser Ala Lys Ser Leu Leu Lys Ser His Gln Glu Pro Pro Thr

260 265 270

Lys Val Val His Arg Gln Gly Leu Leu Gly Val Gln Lys Glu Phe Ala

275 280 285

Phe Arg Lys Pro Pro Arg Leu Ala Lys Met Asn Val Gln Pro Arg Ser

290 295 300

Leu Arg Ser Lys Val Thr Thr Thr Gln Glu Asn Glu Gly Ser Thr Lys

305 310 315 320

Pro Ala Thr Pro Cys Arg Pro Ser Glu Ala Ala Gln Asn Lys Gly Gly

325 330 335

Ile Lys Arg Ser Ala Ser Ala Ala Arg Arg Gly Lys Arg Val Met Ser

340 345 350

Ala Ala Gln Ala Ser Glu Ala Ser Asp Ser Ser Ser Asp Asp Gly Ile

355 360 365

Glu Glu Ala Ile Gln Leu Tyr Gln Leu Gln Lys Thr Arg Lys Glu Ala

370 375 380

Asp Gly Asp Leu Pro Gln Arg Val Gln Leu Arg Glu Glu Arg Ala Pro

385 390 395 400

Asp Pro Pro Ala His Ser Thr Ser Ser Ala Thr Lys Ser Ala Leu Pro

405 410 415

Glu Thr His Arg Lys Thr Pro Ser Lys Lys Lys Leu Val Ala Thr Lys

420 425 430

Thr Met Asp Pro Gly Pro Gly Gly Leu Asp Thr Asp His Ala Pro Lys

435 440 445

Leu Leu Lys Glu Thr Lys Ala Pro Pro Pro Ala Ser Pro Ala Ser Arg

450 455 460

Ser Glu Phe Val Glu Arg Ser Ser Cys Arg Ala Asp Thr Ser Ala Glu

465 470 475 480

Leu Met Cys Ala Glu Ala Ile Leu Asp Ile Ser Lys Thr Ile Leu Pro

485 490 495

Ala Pro Val Glu Gly Ser Asp Gly Ser Leu Ser Ala Ser Pro Leu Phe

500 505 510

Tyr Ser Pro Asn Val Pro Ser Arg Ser Asp Gly Asp Ser Ser Ser Val

515 520 525

Asp Ser Asp Asp Ser Ile Glu Gln Glu Ile Arg Thr Phe Leu Ala Leu

530 535 540

Lys Ala Gln Ser Gly Ser Leu Leu Ala Arg Gly Glu Ser Cys Pro Gln

545 550 555 560

Ala Ala Gln Gly Pro Leu Leu Pro Pro Gly Leu Asn Ser Gln Thr Gly

565 570 575

Gly His Lys Thr Pro Leu Ser Lys Thr Pro Asp Pro Leu Leu Gly Cys

580 585 590

Lys Arg Lys Arg Arg Gly Gly Gly His Val Arg Pro Ser Thr Pro Lys

595 600 605

Lys Met Gln Glu Val Val Lys Asp Gly Ser Gln Asp Ala Asp His Ser

610 615 620

Gln Gly Arg Ala Glu Pro Gly His Glu Arg Arg Asp Leu Pro Ile Gln

625 630 635 640

Gly Lys Ala Ser Glu Ala Leu Gly Gly Glu Gly Thr Ala Arg Gly Pro

645 650 655

Gly Asp Thr Arg Met Ser Gln Gly Gln Gly Lys Thr Asp Glu Ala Arg

660 665 670

Arg Leu Asp Glu Lys Glu Ser Ser Glu Asp Lys Ser Ser Ser Leu Asp

675 680 685

Ser Asp Glu Asp Leu Asp Thr Ala Ile Lys Asp Leu Leu Arg Ser Lys

690 695 700

Arg Lys Leu Lys Lys Arg Cys Arg Glu Pro Arg Ala Ala Cys Arg Lys

705 710 715 720

Lys Val Arg Phe Ser Thr Ala Gln Thr His Phe Leu Glu Gln Leu Gly

725 730 735

Gly Leu Arg Arg Asp Trp Lys Asp Arg Gly Pro Pro Val Leu Lys Ser

740 745 750

Cys Leu Ser Lys Ser Lys Arg Asp Ser Gly Glu Gly Pro Gly Lys Lys

755 760 765

Pro Pro Ser Val Phe Gly Ser Thr Ala Glu Arg Met Arg Gln Glu Gly

770 775 780

Ala Ala Ser Gln Asp Ala Ala Leu Ala Phe Arg Val Arg Arg Pro Ala

785 790 795 800

Ser Ala Ser Ala Ser Glu Gly Asn Pro Phe Pro Arg Glu Ser Gln Gly

805 810 815

Pro Ala Pro Ser Pro Gly Ser Leu Ser Asp Asp Ser Ser Ser Val Asp

820 825 830

Ser Asp Asp Ser Ile Glu Leu Glu Ile Arg Lys Phe Leu Ala Glu Lys

835 840 845

Ala Lys Glu Ser Val Ser Ser Ser Glu Val Gln Ala Glu Gly Pro Thr

850 855 860

Ala Leu Gly Thr Gly Gly Pro Ala Arg Pro Glu Val Leu Cys Arg Lys

865 870 875 880

Glu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Val Cys Thr Arg Ser Gln Arg Ala Arg

885 890 895

Gly Val Pro His Leu Ala Glu Gly Leu Arg Gly Thr Glu Ser Ala Gly

900 905 910

Ala Gln Gly Thr Ala Gly Leu Phe Ser Gln Gly Gly Lys Gly Leu Pro

915 920 925

Ala Ala Pro Ala Arg Gly Asp Pro Val Pro Pro Arg Ser Thr Ser Gly

930 935 940

Gly Val Ser Ala Lys Gly Leu Ser Val Ser Arg Arg Asn Val Tyr Val

945 950 955 960

His Lys Asp Gln Ser Pro Arg Gly Ala Glu Pro Ala Ala Lys Ser Ala

965 970 975

Phe Gly Gln Leu Pro Ser Cys Ala Thr Ala Gly Thr Glu Ala Gly Gly

980 985 990

Ala Arg Gly Thr Phe His Met Gly Cys Gly Ser Pro Ser Phe Leu Thr

995 1000 1005

Pro Ser Pro Gly Ala Glu Arg Asp Ala Gly Ala Gln Ala Asp Arg

1010 1015 1020

Thr Pro Pro Trp Ser Asp Phe Ala His Gln Ser Arg Leu Pro Ser

1025 1030 1035

Pro Trp Val Leu Arg Ser Glu Gly Arg Asp Ala Val Trp Arg Gly

1040 1045 1050

Gly Val Gly Ser Glu Arg Asp Lys Gly Ser Glu Gly Pro Ala Arg

1055 1060 1065

Gly Leu Pro Ser Leu Pro Leu Ala Gly Phe Ser Pro Leu Leu Ser

1070 1075 1080

Thr Gln Leu Phe His Phe Gly Lys Gly Val Ser Trp Gly Gly Arg

1085 1090 1095

Gln Ala Gly Leu Phe Ser Pro His Leu Gly Leu Pro Leu Gln Gly

1100 1105 1110

Pro Ser Phe Ser Ala Phe Arg Glu Ala Gln Ala Gly Pro Ser Pro

1115 1120 1125

Val Phe Gly Ser Pro His Leu Leu Ala Lys Lys Asp Gly Gly Pro

1130 1135 1140

Trp Pro Thr Arg Lys Ala Gln Ala Gly Leu Ser Leu His Asp Arg

1145 1150 1155

Arg Ser Ser Gly Ser Glu Glu Ser Ile Leu Asp Leu Arg Tyr Arg

1160 1165 1170

Arg Arg Val Asn Arg Asp Asp Gln Glu Gln Asp Ala Leu Gly Ser

1175 1180 1185

Asp Ala Ser Asp Phe Ser Asp Thr Ser Thr Glu Asp Ser Gly Gly

1190 1195 1200

Ser Ser Val Val Lys Val

1205

Claims

1.一种多克隆抗体，该多克隆抗体与SEQ ID NO：2所示第496至1209位氨基酸残基组成的多肽特异性结合。

2.如权利要求1所述的多克隆抗体，该多克隆抗体与谷胱苷肽-S-转移酶与SEQ ID NO：2所示第496至1209位氨基酸残基组成的多肽形成的重组蛋白特异性结合，而对谷胱苷肽-S-转移酶没有特异性。

3.如权利要求2所述的多克隆抗体，该多克隆抗体分子量约为150kD，用酶联免疫吸附实验检测其抗体效价为10^-5至10^-6。

4.一种如权利要求1至3任一项所述的多克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括：

将谷胱苷肽-S-转移酶与SEQ ID NO：2所示第496至1209位氨基酸残基组成的多肽形成的重组蛋白作为抗原，免疫动物，取血，分出抗血清并纯化制得，制得的多克隆抗体与SEQ ID NO：2所示的多肽特异性结合，而对谷胱苷肽-S-转移酶没有特异性。

5.一种体外检测待测样品中是否存在KIAA0649蛋白的方法，该方法包括：

1)将待测样品与如权利要求1至3任一项所述的多克隆抗体孵育，所述的多克隆抗体与待测样品中的KIAA0649蛋白特异性结合，由此形成免疫复合物；并且

2)检测是否存在免疫复合物。

6.一种检测KIAA0649蛋白的组合物，其包含如权利要求1至3任一项的多克隆抗体。

7.如权利要求1至3任一项的多克隆抗体在制备检测KIAA0649蛋白的组合物中的应用。