CN100377709C - 受体酪氨酸激酶抑制剂的制药用途及相关检测方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮治疗癌症的方法。具体地，本方法可有效治疗实体瘤或白血病，包括前列腺癌、结直肠癌、乳房癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、小细胞癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病或骨髓增生性疾病。还提供了测定4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮的数量的方法和测定代谢情况的方法。
Description
相关申请的相互引用关系
[0001]本申请要求以下的优先权：2003年6月16日提交的美国临时申请号60/478,916；2003年4月3日提交的美国临时申请号60/460,369；2003年4月3日提交的美国临时申请号60/460,327；2003年4月3日提交的美国临时申请号60/460,493；2003年4月3日提交的美国临时申请号60/460,328；2002年11月13日提交的美国临时申请号60/426,204；2002年11月13日提交的美国临时申请号60/460,226；2002年11月13日提交的美国临时申请号60/460,282；2002年11月13日提交的美国临时申请号60/460,107，和2003年11月7日提交的题为“治疗癌症的方法及相关方法”的美国临时申请。出于所有目的，上述每项申请都全文引入本文作为参考，就象它们在本文完全列出一样。
发明领域
[0002]本发明涉及用受体酪氨酸激酶抑制剂治疗癌症的方法。本发明还涉及在给对象施用该抑制剂后，测定该抑制剂及其代谢产物的数量和浓度的方法。
发明背景
[0003]毛细血管可到达几乎所有的人体组织，向组织提供氧气和营养物质并清除废物。在通常情况下，衬于毛细血管内壁的内皮细胞不会分裂，因此，毛细血管的数目和大小在成年人体内一般不会有所增长。然而，在某些正常情况下，例如当组织受损或处于月经周期的某些阶段时，毛细血管开始迅速增生。这一由既有血管形成新生毛细血管的过程称为血管生成或血管再生。参见Folkman，J.Scientific American 275，150-154(1996)。伤口愈合时的血管生成是成年时期病理生理性的血管再生的一个实例。在伤口愈合的过程中，新增的毛细血管供给氧气和营养物质，促使肉芽组织生成，并协助清除废物。在愈合过程结束以后，毛细血管通常会退化。Lymboussaki，A.“胚胎、成体和肿瘤中的血管内皮生长因子及其受体”的学术论文，赫尔辛基大学，分子/癌症生物学实验室和病理系，Haartman学院，(1999)。
[0004]血管生成还在癌细胞的生长中起重要的作用。已知一旦癌细胞巢达到一定大小，即其直径约为1至2mm时，癌细胞必须获得血液供给才能使肿瘤生长得更大，这是因为此时扩散将不足以为癌细胞提供足够的氧气和营养。
[0005]受体酪氨酸激酶(RTKs)是调节发育细胞的生长和分化、成体组织的重塑和再生的跨膜多肽。Mustonen，T.等，J.Cell Biology 129，895-898(1995)；vander Geer，P.等.Ann Rev.Cell Biol.10，251-337(1994)。已知，被称为生长因子或细胞因子的多肽配体可激活RTKs。RTKs的信号传导包括配体结合、受体外部区域构型变化，以及由此引发的受体二聚体化。Lymboussaki，A.“胚胎、成体和肿瘤中的血管内皮生长因子及其受体”的学术论文，赫尔辛基大学，分子/癌症生物学实验室和病理系，Haartman学院，(1999)；Ullrich，A.等，Cell 61，203-212(1990)。配体与RTK的结合，导致受体在特定酪氨酸残基处的转磷酸化，并随后发生催化域的活化，该催化域的作用在于使胞质中的底物磷酸化。同上。
[0006]RTKs的两个亚族对于血管内皮是特异性的。这两个亚族包括血管内皮生长因子(VEGF)亚族和Tie受体亚族。第III类RTKs包括VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3。Shibuya，M.等，Oncogene 5，519-525(1990)；Terman，B.等，Oncogene 6，1677-1683(1991)；Aprelikova，O.等，Cancer Res.52，746-748(1992)。
[0007]据述，VEGF亚族的成员可诱导血管渗透性的增加以及血管内皮细胞的增殖，并且被进一步确定为血管生成和血管再生的主要诱导物。Ferrara，N.等，Endocrinol.Rev.18，4-25(1997)。已知，VEGF可特异性地结合于RTKs(包括VEGFR-1和VEGFR-2)。DeVries，C.等，Science 255，989-991(1992)；Quinn，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.90，7533-7537(1993)。在体内和体外，VEGF均能刺激内皮细胞的迁移和增殖，并诱导血管生成。Connolly，D.等，J.Biol.Chem.264，20017-20024(1989)；Connolly，D.等，J.Clin.Invest.84，1470-1478(1989)；Ferrara，N.等，Endocrino.Rew.18，4-25(1997)；Leung，D.等，Science 246，1306-1309(1989)；Plouet，J.等，EMBO J 8，3801-3806(1989)。
[0008]因为已知血管生成对于癌的生长十分关键，并且该过程由VEGF和VEGF-RTK所调控，因此，人们付诸了大量的努力试图开发出VEGF-RTK的拮抗剂用于抑制或延缓血管生成，并且希望此类疗法能够干扰或阻止肿瘤的增生。
[0009]血小板衍生生长因子受体激酶(PDGFRK)是RTK的另一种类型。从神经胶质母细胞瘤到前列腺癌等多种不同的实体瘤中，均显示有PDGF的表达。在这些不同的肿瘤类型中，PDGF信号的生物学作用是多种多样的，有的是通过自分泌作用刺激癌细胞的生长，也有更复杂的涉及邻近基质和血管生成作用的旁分泌交互作用。
[0010]4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮为VEGF-RTK、PDGF-RTK和其它受体酪氨酸激酶(如成纤维细胞生长因子受体(FGF-RTK))的小分子抑制剂。该化合物已记载于一项专利和几项专利的申请中，出于所有目的，这些文献均全文引入本文作为参考：美国专利号6,605,617，U.S.S.N.10/644,055、美国临时申请号60/405,729、60/428,210和60/484,048。该化合物的特定施用方法与用于确定本有效抗癌剂的代谢情况的方法一样是需要的。
发明概述
[0011]本发明提供治疗癌症(包括白血病和实体瘤)的方法。具体地，提供了一种方法，使得对象血液中4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮的浓度达到足以抑制癌症的生长。该化合物为受体酪氨酸激酶的抑制剂。还提供了作为生物指标的化合物，以及用这些化合物来监测对象体内抑制剂的分布和代谢情况的方法。此外，本发明还提供了含有此抑制剂的药物组合物和药物，以及其用法。
[0012]这样，依据本发明，我们提供了癌症的治疗方法，该方法包括给癌症患者施用足量的式I化合物：
施用该化合物药学上可接受的盐、该化合物的互变体，或该互变体的药学上可接受的盐，从而使得对象血浆中该化合物的Cmax达到大约20至4000ng/mL或对象血液中该化合物的Cmax达到大约40至8000ng/mL。在一些实施例中，施用的该化合物的量足以使得对象血浆中该化合物的Cmax达到大约35至2000ng/mL或使得对象血液中该化合物的Cmax达到大约70至4000ng/mL，对象血浆中该化合物的Cmax达到大约50至500ng/mL或对象血液中该化合物的Cmax达到大约100至1000ng/mL，对象血浆中该化合物的Cmax达到大约50至250ng/mL或对象血液中该化合物的Cmax达到大约100至500ng/mL，对象血浆中该化合物的Cmax达到大约75至150ng/mL或对象血液中该化合物的Cmax达到大约150至300ng/mL，对象血浆中该化合物的Cmax达到大约100至2000ng/mL或对象血液中该化合物的Cmax达到大约200至4000ng/mL，或者对象血浆中该化合物的Cmax达到大约100至1000ng/mL或对象血液中该化合物的Cmax达到大约200至2000ng/mL。在一些实施例中，施用于对象的是式I化合物的乳酸盐，且在某些这些实施例中对象是人。所述化合物、其互变体或其盐类可以被制备为丸剂、胶囊、片剂、软胶囊(gelcaps)、小胶囊、悬浮液、水溶液，或本文描述的其它形式。在某些这样的实施例中，乳酸盐是以水溶液的形式给人体对象口服的。在其它一些实施例中，该化合物可通过注射给药。
[0013]在另一方面，本发明提供了治疗癌症的方法，包括给癌症患者施用足量的式I的化合物，或其药学上可接受的盐，或其互变体，或互变体的药学上可接受的盐，使得对象在给药后24小时，其血浆中该化合物的浓度达到约10至2000ng/mL或其血液中化合物的浓度达到约20至4000ng/mL。在一些实施例中，所施用的化合物的数量足以在给药后24小时使给药对象血浆中化合物的浓度达到约20至1000ng/mL或其血液中化合物的浓度达到约40至2000ng/mL，在给药后24小时对象血浆中化合物的浓度达到约40至500ng/mL或其血液中化合物的浓度达到约80至1000ng/mL的化合物，或在给药后24小时对象血浆中化合物的浓度达到约40至250ng/mL或其血液中化合物的浓度达到约80至500ng/mL。在一些实施例中，施药对象是人。通常，在应用本方法治疗癌症时，施用于对象的是式I化合物的乳酸盐。在某些这样的实施例中，乳酸盐是以丸剂、胶囊、片剂、软胶囊、小胶囊、悬浮液或水溶液的形式给对象口服。
[0014]这样，在施用本方法治疗癌症某些实施例中，式I化合物是以含有果糖的药物组合物或药物的形式给药的。在一些此类实施例中，药物组合物还含有矫味剂，如橘子味(tetrarome mandarine flavor)。在其它一些实施例中，药物组合物还含有水。因此，本癌症治疗方法还可包括在给对象施用化合物之前，将式I的固态化合物与水混合，形成含水的混合物。本发明还提供了将式I化合物用于制备癌症治疗药物的方法。
[0015]在此描述的其它一些癌症治疗方法的实施例中，该化合物以下列的药物组合物的形式给药：颗粒剂、粉剂、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、软胶囊(gelcaps)、小胶囊、乳剂、糖浆、酏剂、浆剂(slurry)、喷雾剂、气雾剂、栓剂或溶液。优先的药物组合物形式为片剂、丸剂、胶囊、软胶囊或小胶囊。
[0016]在此描述的其它一些癌症治疗方法的实施例中，该化合物通过注射的形式给药，如短期丸剂注射(short bolus)、缓慢输注或长期输注。每日的注射次数可以为一次、两次、三次或四次。
[0017]在本癌症治疗方法的一些实施例中，施用于对象的式I化合物的剂量在0.25至30mg/kg对象体重之间。在其它的一些实施例中，施用于对象的化合物的量约在25至1500mg/日之间，较佳地在约200至500mg/日。
[0018]本癌症治疗方法可有效治疗多种癌症，其中包括一些实体瘤或白血病形式的癌症。特别地，本方法可用于治疗例如以下癌症：前列腺癌、结直肠癌、乳房癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、小细胞癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性疾病、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、慢性淋巴性白血病、肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、甲状腺癌、神经内分泌癌、肾细胞癌、胃癌、胃肠道基质瘤、神经胶质瘤、脑癌或膀胱癌。
[0019]在一些实施例中，在此描述的癌症治疗方法还包括施用式I化合物，作为治疗周期的一部分。这样，治疗周期可包括每日施用一定量的式I化合物并持续7、14、21或28日，随后的7或14日停止施用。在一些实施例中，治疗周期包括每日施用一定量的该化合物，持续7日，随后的7日停止施用。一个治疗周期可以重复一次或多次，提供一个疗程。此外，该化合物可在治疗周期的给药期内，每日施用一次、两次、三次或四次。在其它的一些实施例中，本方法还包括在一个疗程内，每日或隔天施用一定量的化合物一次、两次、三次或四次。
[0020]还提供了治疗癌症的方法，它包括步骤：给癌症患者施用足量的下式化合物：
其药学上可接受的盐，或其互变体，或互变体的药学上可接受的盐，使得对象血浆中化合物的浓度达到约500至60,000ng*h/mL的AUC或对象血液中化合物的浓度达到约750至120,000ng*h/mL的AUC。在其它这样的实施例中，施用的药量能使得对象血浆中化合物的浓度达到约1,000至30,000ng*h/mL的AUC或对象血液中化合物的浓度达到约1,500至60,000ng*h/mL的AUC。在其它这样的实施例中，对象血浆中化合物的浓度约为2,000至15,000ng*h/mL的AUC或对象血液中化合物的浓度约为3,000至30,000ng*h/mL的AUC。
[0021]本发明还进一步提供了一种治疗癌症的方法，包括给癌症患者施用具有式I的化合物、其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐，其中在首个治疗周期中该化合物的施用量为每日25mg，在随后的治疗周期中，化合物的施用量逐渐提高，直到每日施用于对象的化合物达到1500mg，或者直到在施用对象身上已经观察到了限制剂量的毒性。通常，在这样的实施例中，化合物的施用量在首次给药后随着每个后续治疗周期而加倍。在一些实施例中，治疗周期包括每日施用相同量的化合物，持续7日，随后的7日停止施用。
[0022]在另一方面，本发明提供了另一种治疗癌症的方法，包括给癌症患者施用足量的式I化合物
其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐，并且使对象暴露于一种或两种选自式II和式III的化合物：
II或
其中，式II和式III化合物中的一种或两种是通过对象对式I化合物的代谢而产生的，从而使得一种或多种式I、式II和式III化合物的合并Cmax在对象的血浆中达到约20至约4000ng/ml，或其中的一种或多种式I、式II和式III化合物的合并Cmax在对象的血液中达到约40至约8000ng/ml。
[0023]在另一方面，本发明提供了一种癌症治疗方法，包括步骤：给癌症患者施用足量的一种或多种下式化合物：
其活性代谢产物、其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐，使得对象血浆中一种或多种化合物的合并Cmax达到约20至4000ng/mL，或对象血液中一种或多种化合物的合并Cmax达到约40至8000ng/mL。在一些实施例中，一种或多种化合物的量使对象血浆中某一化合物的Cmax达到约35至2600ng/mL，或对象血液中某一化合物的Cmax达到约35至6000ng/mL。在其它一些实施例中，一种或多种化合物的量使对象血浆中某一化合物的Cmax达到约35至1200ng/mL，或对象血液中某一化合物的Cmax达到约50至2400ng/mL。
[0024]在本发明的其它方面，提供了测定式I化合物、其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐在施用对象体内代谢情况的方法，该方法包括：测定取自对象的一种或多种样品(尿液、血液或组织)中该化合物的至少一种代谢产物的数量。在这样一些的实施例中，至少一种代谢产物为具有式II的N-氧化物：
[0025]在这样的一些实施例中，至少有一种代谢产物为具有式III的N-去甲基化合物：
[0026]在这样的一些实施例中，至少有一种代谢产物还进一步包括作为第二代谢产物，该代谢产物是式II的N-氧化物。这些代谢产物的数量可以用包括紫外线(UV)光谱和/或液相色谱-质谱(LC-MS)在内的技术来测定。
[0027]在本发明的其它方面，提供了测定对象体内式I化合物、其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐的数量的方法，该方法包括在将化合物施用于对象以后，测定取自对象的样品(尿液、血液或组织)中该化合物的数量。本方法还包括测定样品中该化合物代谢产物的数量。这些可被测定的代谢产物包括(但并不限于)：式II的N-氧化物和/或式III的N-去甲基化合物。在一些实施例中，本方法还可包括在式I的化合物施用于对象后，在不同时间从对象提取两个或多个样品进行测定。
[0028]在随后的详细描述中，本发明的其它对象、特征和优点将更为显而易见。然而可以理解的是，本文中的详细描述和具体实例，尽管表述了本发明的某些具体实施例，但是仅作为诠释而给出，这是因为凭借此详细描述，在本发明的精神实质和范围内所作的各种变动和修改对于本领域的技术人员是显而易见的。
附图简述
[0029]图1显示由式I化合物引发的KM12L4a肿瘤抑制。
[0030]图2显示KM12L4a荷瘤小鼠中，Cmax和AUC值与KM12L4a肿瘤生长的抑制百分比之间的关系。
详细描述
[0031]本发明涉及用式I化合物治疗癌症的方法，测定取自对象的生物样品中的式I化合物和/或其代谢产物的数量的方法，和包含式I化合物的药物组合物和药物，及其使用方法。
[0032]下列定义的术语和惯用语通篇使用于本说明书中。
[0033]如本文所用，“AUC”是指在血浆中化合物浓度随时间变化的曲线图中曲线下所围的面积。
[0034]如本文所用，“Cmax”是指化合物施用于对象后，在对象的血浆、组织或血液中该化合物的最大浓度。Cmax通常在将化合物施用于对象后的几个小时内出现。
[0035]限制剂量的毒性是根据不良反应通用术语标准(CommonTerminology Criteria of Adverse Events)3.0版(CTCAE)而定义的。这样，在该化合物施用于对象后，如果在药物治疗周期内观察到以下任一情况，那么应当认为限制剂量的毒性出现：4级嗜中性白细胞减少症(即，绝对嗜中性白细胞计数(ANC)：500个细胞/mm3)连续5日或更多日，或发烧性嗜中性白细胞减少症(即，发烧38.5℃并且ANC 1000个细胞/mm3)；4级血小板减少症(即，25,000个细胞/mm3或需要血小板输液的出血事件)；4级疲乏，或ECOG功能状态下降2分；尽管使用了足够的/最大的医疗干预，仍出现3级或更严重的恶心、腹泻、呕吐和/或肌痛；3级或更严重的非血液毒性(除了疲乏)；由于使用化合物1治疗而引起的毒性恢复延迟症状超过2周；2级或更严重的具备临床意义的心脏毒性(如，静态射出分率下降至40％-50％或收缩分数下降至15％-24％；心脏肌钙蛋白T 0.05ng/mL)。
[0036]药学上可接受的盐包括无机碱、有机碱、无机酸、有机酸、或碱性或酸性氨基酸的盐。本发明所包括的无机碱的盐有，碱金属(如钠或钾)，碱土金属(如钙和镁，铝，和氨)。作为有机碱的盐，本发明包括例如三甲胺、三乙胺、嘧啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺盐。作为无机酸的盐，本发明包括例如盐酸、硼氢酸(hydroboric acid)、硝酸、硫酸和磷酸的盐。作为有机酸的盐，本发明包括例如乳酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸的盐。作为碱性氨基酸的盐类，本发明包括例如精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸的盐。酸性氨基酸的盐包括例如天冬氨酸和谷氨酸的盐。
[0037]应理解，本发明的有机化合物可以呈现互变异构现象。由于本说明书内的化学结构仅能描绘某一时刻下的一种可能的互变(异构)形式，所以应理解，本发明包括了所绘结构的任何互变(异构)形式。例如，式I化合物及其一个互变(异构)体，即互变体Ia，如下所示：
互变体Ia
[0038]式I化合物的其它互变体，互变体Ib和互变体Ic，如下所示：
互变体Ib
互变体Ic
[0039]正如本领域的技术人员容易理解的那样，许多功能基团和其它结构均可产生互变异构现象，所以，任何式I化合物的互变体均在本发明的范围之内。
[0040]如本文所用，术语“对象”是指任何可以受益于本发明方法的有益效果的动物。这样，依照本发明所提供的癌症治疗方法，式I化合物、其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐，可以施用于任何能够受益于该化合物有益效果的动物。所说的动物优先为哺乳动物，尤其是人类，尽管本发明并不局限于此。其它合适的动物包括(但并不限于)：大鼠、小鼠、猴、狗、猫、牛、马、猪、羊等等。
[0041]在本发明上下文中，“治疗”意指与病症或疾病有关的症状的减轻，或这些症状的进一步发展或恶化过程的停止，或疾病或病症的防止与预防。例如，在癌症情况下，成功的治疗可包括症状的减轻或疾病进程的停止，这可以通过肿瘤生长率的降低、肿瘤生长的停止、肿瘤大小的减小、癌症部分或完全的消退、或生存率或临床受益的提高来衡量。
[0042]一方面，本发明提供了癌症的治疗方法，它包括给癌症患者施用足量的式I化合物：
该化合物药学上可接受的盐、该化合物的互变体、或互变体的药学上可接受的盐，使得对象血浆中该化合物的Cmax达到大约20至4000ng/mL或对象血液中该化合物的Cmax达到大约40至8000ng/mL。在一些实施例中，施用的该化合物的量足以使得对象血浆中该化合物的Cmax达到大约35至2000ng/mL或使得对象血液中该化合物的Cmax达到大约70至4000ng/mL，对象血浆中该化合物的Cmax达到大约50至500ng/mL或对象血液中该化合物的Cmax达到大约100至1000ng/mL，对象血浆中该化合物的Cmax达到大约50至250ng/mL或对象血液中该化合物的Cmax达到大约100至500ng/mL，对象血浆中该化合物的Cmax达到大约75至150ng/mL或对象血液中该化合物的Cmax达到大约150至300ng/mL，对象血浆中该化合物的Cmax达到大约100至2000ng/mL或对象血液中该化合物的Cmax达到大约200至4000ng/mL的，对象血浆中该化合物的Cmax达到大约100至1000ng/mL或对象血液中该化合物的Cmax达到大约200至2000ng/mL。较佳地，化合物的施用量足以使对象血浆中化合物的的Cmax达到约75至150ng/mL或对象血液中化合物的Cmax达到约150至300ng/mL。这样，应理解，式I化合物、互变体及其盐类的用量足以使Cmax落入给定的范围内。
[0043]另一方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，它包括给癌症患者施用足量的式I化合物、其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐，使得在对象血浆中化合物的浓度在给药后24小时达到约10至2000ng/mL或在其血液中化合物的浓度达到约20至4000ng/mL。在一些实施例中，所施用的化合物的数量足以在给药后24小时使得对象血浆中化合物的浓度达到约20至1000ng/mL或其血液中化合物的浓度达到约40至2000ng/mL，在给药后24小时对象血浆中化合物的浓度达到约40至500ng/mL或其血液中化合物的浓度达到约80至1000ng/mL的化合物，或在给药后24小时对象血浆中化合物的浓度达到约40至250ng/mL或其血液中化合物的浓度达到约80至500ng/mL。
[0044]通常，在此描述的癌症治疗方法中，式I化合物或其互变体一般以药学上可接受的盐施用。诸如以各种摩尔比和互变体或消旋形式存在的乳酸盐、苹果酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、盐酸盐、柠檬酸盐或马来酸盐都是合适的。较佳地，将式I化合物的乳酸盐施用于诸如人之类的对象。乳酸盐可以很方便地以丸剂、胶囊、片剂、软胶囊、小胶囊、悬浮液或水溶液的形式给药，并其可给病人口服。在其它的实施例中，该化合物或其盐类可如下所述通过注射方式给药。
[0045]这样，在使用本本发明的癌症治疗方法的某些实施例中，式I化合物是以含有果糖的药物组合物或药物的形式给药的。在一些此类实施例中，药物组合物还含有矫味剂，如橘子味(tetrarome mandarine flavor)之类的矫味剂和/或稀释液，比如水。因此，本癌症治疗方法还可包括在给对象施用化合物之前，将式I的固态化合物与水混合，形成含水的混合物。本发明还提供了将化合物1用于制备癌症治疗药物的方法。
[0046]在本治疗癌症的方法的一些实施例中，施用于对象的式I化合物的药量在0.25至30mg/kg对象体重之间。在其它的一些实施例中，每日施用于对象的化合物的药量约为25至1500mg/对象，或每日约为100至1000mg/对象，或每日约为200至500mg/对象。
[0047]本治疗癌症的方法可有效地对抗多种癌症，也包括一些实体瘤或白血病形式的癌症。本方法尤其可以用于治疗诸如前列腺癌、结直肠癌、乳房癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、小细胞癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性疾病、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、慢性淋巴性白血病、肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、甲状腺癌、神经内分泌癌、肾细胞癌、胃癌、胃肠道基质瘤、神经胶质瘤、脑癌或膀胱癌的癌症。尽管不希望被理论所束缚，但是据信由于式I化合物是作为血管生成抑制剂起作用的，所以本癌症治疗方法能够有效地对抗实体瘤。更具体地，据信式I化合物及其活性代谢产物能够选择性地抑制与肿瘤的血管生成和白血病有关的某些受体酪氨酸激酶。
[0048]在一些实施例中，本癌症治疗方法还包括施用式I化合物，作为治疗周期的一部分。治疗周期包括给药期(此期间内化合物定期地施予对象)和假期(此期间内停止给药)。例如，治疗周期可包括每日施用一定量的式I化合物，持续7、14、21或28日，随后的7或14日停止施用。在一些实施例中，治疗周期包括每日施用一定量的该化合物，持续7日，随后的7日停止施用。一个治疗周期可重复一次或多次，以提供一个疗程。此外，该化合物可在治疗周期的给药期内，每日施用一次、两次、三次或四次。在其它的实施例中，本方法还包括在一个疗程内，每日或隔日施用该化合物一次、两次、三次或四次的量。疗程是指对象经历用本方法进行癌症治疗的一段时期。因此，疗程可以历时一个或多个治疗周期，或者指对象每日或间断地接受式I化合物剂量的一段时期。
[0049]本文还进一步提供了一种癌症治疗方法，它包括给癌症患者施用足量的式I化合物、其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐，使得对象血浆中化合物的AUC值达到约500至60,000ng*h/mL(纳克×小时/毫升)或对象血液中化合物的AUC值达到约750至120,000ng*h/mL(纳克×小时/毫升)。在其它这样的实施例中，化合物的用量足以使对象血浆中化合物的AUC值达到约1,000至30,000ng*h/mL或对象血液中化合物的AUC值达到约1,500至60,000ng*h/mL。在其它这样的实施例中，对象血浆中化合物的AUC值约为2,000至15,000ng*h/mL或对象血液中化合物的AUC值约为3,000至30,000ng*h/mL。
[0050]另一方面，本发明提供了式I化合物、其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备治疗癌症的药物(作为单位剂型)，其中药物的每个单位剂量足以提供下列的至少一项：
(a)在施用于对象后，对象血浆中化合物的Cmax达到约20至4000ng/mL或对象血液中化合物的Cmax达到约40至8000ng/mL；
(b)在给药后24小时，对象血浆中化合物的浓度达到约10至2,000ng/mL或在给药后24小时，对象血液中化合物的浓度达到约20至4,000ng/mL；或者
(c)在施用于对象后，对象血浆中化合物的AUC值达到约500至60,000ng*h/mL或对象血液中化合物的AUC值达到约750至120,000ng*h/mL。
[0051]在式I化合物用于制备癌症治疗药物的用途的一些实施例中，每个单位剂量足以提供下列的至少一项：
(a)对象血浆中化合物的Cmax到达约50至500ng/mL或对象血液中化合物的Cmax到达约100至1000ng/mL；
(b)在给药后24小时，对象血浆中化合物的浓度到达约20至1,000ng/mL或在给药后24小时，对象血液中化合物的浓度约达40至2,000ng/mL；或者
(c)对象血浆中化合物的AUC到达约1,000至30,000ng*h/mL或对象血液中化合物的AUC到达约1,500至60,000ng*h/mL。
[0052]在其它实施例中，每个单位剂量足以提供下列中的至少一项：
(a)对象血浆中化合物的Cmax约达50至250ng/mL或对象血液中化合物的Cmax约达100至500ng/mL；
(b)在给药后24小时，对象血浆中化合物的浓度约达40至500ng/mL或在给药后24小时，对象血液中化合物的浓度约达80至1,000ng/mL；或
(c)对象血浆中化合物的AUC约为2,000至15,000ng*h/mL或对象血液中化合物的AUC约为3,000至30,000ng*h/mL。
[0053]在其它另一些实施例中，每个单位剂量足以提供下列的至少一项：
(a)对象血浆中化合物的Cmax约达75至150ng/mL或对象血液中化合物的Cmax约达150至300ng/mL；或
(b)在给药后24小时，对象血浆中化合物的浓度约达40至250ng/mL或在给药后24小时，对象血液中化合物的浓度约达80至500ng/mL。
[0054]在另一实施例中，每个单位剂量足以使对象血浆中化合物的Cmax约达100至2000ng/mL或使对象血液中化合物的Cmax约达200至4000ng/mL；或对象血浆中化合物的Cmax约达100至1000ng/mL或对象血液中化合物的Cmax约达200至2000ng/mL。
[0055]通常，在此描述的式I化合物的用法中，一般使用该化合物的乳酸盐来制备药物。这样的药物适合于口服给药。药物的单位剂量形式包括(但并不限于)：丸剂、胶囊、片剂、软胶囊、小胶囊、悬浮液或水溶液。另外，本药物也适合于用丸剂快速注射(short bolus)、缓慢输注或长期输注的方式注射给药。
[0056]式I、式II和式III的化合物可附有描述本发明的任一种方法的使用说明。因此，在一些实施例中，本发明至少一种式I、式II和/或与式III化合物，并附有治疗癌症方法或分析式I化合物的代谢情况的说明。
[0057]本发明还进一步提供了治疗癌症的方法，它包括给癌症患者施用式I化合物、其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐，其中在首次治疗周期中化合物的施药量为每日25mg，而后化合物的施用量随着每个后续治疗周期而逐渐提高，直至每日施用于对象的化合物的用量到达1500mg，或者在对象身上观察到限制剂量的毒性。在这样的实施例中，通常化合物的施用量在首次给药后随着每个后续治疗周期而翻倍。在一些实施例中，治疗周期包括每日施用相同量的化合物，持续7日，随后7日停止施用。
[0058]同样地，在此描述的用式I化合物制备药物的一些实施例中，药物的每个单位剂量包含基于对象体重而定的每kg体重施用0.25至30mg化合物、其互变体和/或其盐类。此外，药物的每个单位剂量可以包含25至1500mg范围内的该化合物、其互变体和/或其盐类。本药物可以置于药盒(kit)中，此药盒含有7、14、21或28个上述的每日使用的单位剂量，以便适用于下述治疗周期，所述治疗周期为连续7、14、21或28日每日施用固定的药量，随后的7或14日则停止施用。
[0059]另一方面，本发明提供了癌症的治疗方法，包括给癌症患者施用足量的式I化合物
其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐，并且使对象暴露于式II和式III的化合物中的一种或两种：
II或
其中，式II和式III化合物中的一种或两种是通过对象对式I化合物的代谢而产生的，从而使得一种或多种式I、式II和式III化合物的合并Cmax在对象的血浆中达到约20至约4000ng/ml，或其中的一种或多种式I、式II和式III化合物的合并Cmax在对象的血液中达到约40至约8000ng/ml。
[0060]而另一方面，本发明提供了治疗癌症的方法，它包括给癌症患者施用足量的一种或多种选自下式的化合物：
其活性代谢产物、其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐，使得对象血浆中一种或多种化合物的合并Cmax达到约20至4000ng/mL，或对象血液中一种或多种化合物的合并Cmax达到约40至8000ng/mL。在一些实施例中，一种或多种化合物的量使对象血浆中某一化合物的Cmax达到约35至2600ng/mL，或对象血液中某一化合物的Cmax达到约35至6000ng/mL。在其它一些实施例中，一种或多种化合物的量使对象血浆中某一化合物的Cmax达到约35至1200ng/mL，或对象血液中某一化合物的Cmax达到约50至2400ng/mL。在一些实施例中，将下式化合物：
其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐施用于对象。在其它实施例中，将下式化合物：
其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐施用于对象。在另一些其它实施例中，将下式化合物：
其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐施用于对象。
[0061]在确定式I化合物对特定疾病的安全性和/或功效时，重要的一点是在该化合物施用以后，能够监测到对象体内化合物的药物代谢动力学和药效学。因此，依照本发明的一个方面，提供了测定对象体内式I化合物、其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐的代谢情况的方法。本方法包括测定取自对象的一种或多种样品(尿液、血液或组织)中该化合物的至少一种代谢产物的数量。可以通过本方法测定的代谢产物，包括具有式II的N-氧化物化合物：
(该化合物也称为4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-4-氧化哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基)]喹啉-2(1H)-酮)，以及具有式III的N-去甲基化合物：
III
(该化合物也称为4-氨基-5-氟-3-[6-(哌嗪-1-基))-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮。在一些这样的测定式I化合物的代谢情况的方法中，本方法包括测定式II的代谢产物和式III的代谢产物的数量。代谢产物的数量可以应用本领域技术人员已知的技术来测定，包括紫外(UV)光谱或液相色谱-质谱(LC-MS)。
[0062]在本发明的其它方面，提供了测定对象体内式I化合物、其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐的数量的方法。本方法包括在化合物施用于对象后，测定其在取自对象的样品(尿液、血液或组织)中的数量。本方法还以可包含测定样品中该化合物的代谢产物的数量。可被测定的代谢产物包括(但并不限于)：式II的N-氧化物化合物和/或式III的N-去甲基化合物。在一些实施例中，本方法还包括在式I化合物施用于对象以后，在不同时间从对象身上提取两种或多种样品。
[0063]另一方面，提供了将式I化合物、其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐用于癌症治疗的方法，该方法包括给癌症患者施用一定量的所述化合物，该用量足以提供以下的至少一项
(a)施用于对象后，对象血浆中化合物的Cmax达到约20至4000ng/mL或对象血液中化合物的Cmax达到约40至8000ng/mL；
(b)在给药后24小时，对象血浆中化合物的浓度达到约10至2,000ng/mL或施药后24小时。对象血液中化合物的浓度达到约20至4,000ng/mL；或
(c)施用于对象后，对象血浆中化合物的AUC值达到约500至60,000ng*h/mL或对象血液中化合物的AUC值达到约750至120,000ng*h/mL。
[0064]在将该化合物用于癌症治疗的方法的一些实施例中，每个单位剂量至少足以提供下列中的至少一项：
(a)对象血浆中化合物的Cmax到达约50至500ng/mL或对象血液中化合物的Cmax到达约100至1000ng/mL；
(b)在给药后24小时，对象血浆中化合物的浓度到达约20至1,000ng/mL或在给药后24小时，对象血液中化合物的浓度约达40至2,000ng/mL；或
(c)对象血浆中化合物的AUC到达约1,000至30,000ng*h/mL或对象血液中化合物的AUC到达约1,500至60,000ng*h/mL。
[0065]在将该化合物用于癌症治疗方法的其它实施例中，每个单位剂量足以提供下列中的至少一项：
(a)对象血浆中化合物的Cmax约达50至250ng/mL或对象血液中化合物的Cmax约达100至500ng/mL；
(b)在给药后24小时，对象血浆中化合物的浓度约达40至500ng/mL或在给药后24小时，对象血液中化合物的浓度约达80至1,000ng/mL；或
(c)对象血浆中化合物的AUC约为2,000至15,000ng*h/mL或对象血液中化合物的AUC约为3,000至30,000ng*h/mL。
[0066]在其它另一些使用该化合物作为癌症治疗方法的实施例中，每个单位剂量足以提供下列中的至少一项：
(a)对象血浆中化合物的Cmax约达75至150ng/mL或对象血液中化合物的Cmax约达150至300ng/mL的；或
(b)在给药后24小时，对象血浆中化合物的浓度约达40至250ng/mL或在给药后24小时，对象血液中化合物的浓度约达80至500ng/mL。
在另一些实施例中，每个单位剂量足以使对象血浆中化合物的Cmax约达100至2000ng/mL或使对象血液中化合物的Cmax约达200至4000ng/mL；或者每一单位剂量足以使对象血浆中化合物的Cmax约达100至1000ng/mL或对象血液中化合物的Cmax约达200至2000ng/mL。
[0067]还提供了将某一代谢产物用于测定式I的化合物、其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐在对象体内的代谢情况的用途，所述的代谢产物至少包含以下一种：下式的N-氧化物：
或下式的N-去甲基化合物：
[0068]本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物可通过将一种或多种本发明的化合物、其药学上可接受的盐或其互变体，与药学上可接受的载体、赋形剂、粘合剂、稀释剂等混合制备而成，从而用于治疗或改善多种疾病。这样的疾病包括(但并不限于)癌症，其中包括前列腺癌、结直肠癌、乳房癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、小细胞癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性疾病、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、慢性淋巴性白血病、肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、甲状腺癌、神经内分泌癌、肾细胞癌、胃癌、胃肠道基质瘤、神经胶质瘤、脑癌或膀胱癌。进一步指出，治疗有效剂量是指本发明的一种或多种化合物的用量足以导致疾病症状改善。本发明的药物组合物可通过本领域熟知的方法制造，例如传统方法中的粒化、混合、溶解、胶囊化、冻干、乳化或研磨等技术。组合物可以是颗粒、粉末、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、注射剂、乳剂、酏剂、悬浮液或溶液的形式。本组合物可为不同的给药途径而配制，例如，口服给药、鼻内给药、经粘膜给药、直肠给药、或皮下给药，以及鞘内、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内、眼内或心室内注射。本发明的一种或多种化合物也可以是局部给药而非全身给药，比如以缓释剂型注射给药。给出以下剂型主要是用作举例，而不解释为对于本发明的限定。
[0069]对于口服、口腔和舌下的给药，粉末、悬浮液、颗粒、片剂、丸剂、胶囊、软胶囊和小胶囊是可接受的固体剂型。这些可以通过诸如将本发明的一种或多种化合物、其药学上可接受的盐或其互变体，与至少一种添加剂或赋形剂(如淀粉或其它添加剂)混合的方式制备。适合的添加剂或赋形剂有果糖、蔗糖、乳糖、纤维素糖、甘露醇、麦芽糖醇、右旋糖苷、山梨糖醇、淀粉、琼脂、藻酸盐、甲壳质、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成的聚合物或甘油酯、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和/或聚乙烯吡咯烷酮。口服剂型还可以含有其它成份以协助给药，例如惰性的稀释剂，或润滑剂(如硬脂酸镁)，或防腐剂(如对羟基苯甲酸酯或山梨酸)，或抗氧化剂(如抗坏血酸、生育酚或半胱氨酸)，崩解剂，粘合剂，增稠剂，缓冲剂，甜味剂，增香剂或加香剂。此外，染料或色素也可被添加作为标示。片剂和丸剂还可用本领域已知的合适包被材料加以处理。
[0070]适于口服的液体剂型可以为药学上可接受的乳剂、糖浆、酏剂、悬浮液、浆液和溶液的形式，还可以含有非活性稀释剂(如水)。药物制剂可用无菌液体制成液体悬浮液或溶液，可用的液体例如(但并不限于)，油、水、醇及其组合。还可以添加药学上合适的表面活性剂、悬浮剂、乳化剂，以便用于口腔或胃肠道给药。
[0071]如上所述，悬浮液可包括油。这样的油包括(但并不限于)：花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油。悬浮液制剂还可包括由脂肪酸形成的酯类，比如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、脂肪酸甘油酯和乙酰脂肪酸甘油酯。悬浮液制剂可包括各种醇，例如(但并不限于)，乙醇、异丙醇、十六醇、甘油和丙二醇。诸如但不限于聚乙二醇、石油烃(如矿物油和凡士林)的醚类以及水也可用于悬浮液剂型。
[0072]对于鼻内给药(例如将化合物递送至大脑)，或通过吸入给药(如通过肺递送药物)，药物制剂可以是溶液、喷雾、干粉，或气溶胶，这些药物可以含有任何合适的溶剂也可任选地加入其它化合物，比如(但不限于)，稳定剂、抗菌剂、抗氧化剂、pH调节剂、表面活性剂、生物可利用性改良剂(bioavailabilitymodifiers)及其混合物。鼻内给药制剂的和给药方法的例子，可在WO 01/41782，WO 00/33813，WO 91/97947，美国专利号6,180,603，和美国专利号5,624,898中找到。适合于气溶胶配方的气雾推进剂可以含有压缩空气、氮气、二氧化碳或低沸点的烃类溶剂。本发明的一种或多种化合物能够十分方便地由喷雾器等装置以气溶胶喷雾的形式递送。
[0073]可注射剂型通常包括水悬浮液或油悬浮液，悬浮液可用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂制备。可注射剂型可以是溶液状态也可以是悬浮液形式，它们由溶剂或稀释剂制备。可接受的溶剂或载体包括：无菌水、Ringer氏溶液或等渗的盐水溶液。无菌油可作为溶剂或悬浮剂使用。油类或脂肪酸优先为非挥发性的，包括天然的或合成的油类、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯。
[0074]对于注射剂，药物制剂可以是适合用合适溶液重建的粉末。这样的粉末包括(但并不限于)：冷冻干燥粉末、旋转干燥粉末或喷雾干燥粉末，无定形粉末，颗粒，沉淀物，或微粒。对于注射剂，该药物配方可以任选地含有稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、生物可利用性改良剂及其混合物。该化合物也可以制备成适合胃肠外给药的形式，例如通过丸剂注射(bolus injection)或持续输注给药。注射的单位剂型可以在安瓿中，也可以在多剂量的容器中。
[0075]因此，在描述于此的本癌症治疗方法中，该化合物可以通过注射(如短期丸剂注射(a short bolus)、缓慢输注或长期输注)给药。每日的注射次数可以是一次、两次、三次或四次。通常，短期丸剂注射(a short bolus)所需的注射时间约为1至30分钟；缓慢输注通常约需30分钟至6小时时间；长期输注通常要持续6小时以上至约7天的时间。
[0076]对于直肠给药，药物制剂可以是能在肠、乙状结肠和/或直肠内释放出化合物的栓剂、药膏、灌肠剂、片剂或霜剂的形式。直肠栓剂是将一种或多种本发明的化合物、或药学上可接受的盐或该化合物的互变体，与可接受的赋形剂(例如，可可油或聚乙二醇)混合而制备的，其在正常的贮藏温度下呈固态，而在体内适合药物释放的温度下(如在直肠中)呈现液态。在制备软胶型制剂和栓剂时也可使用油类。水、盐水、含水葡萄糖和相关糖溶液，以及甘油都可用于悬浮型制剂的制备，所述的悬浮型制剂还可含有悬浮剂(如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基纤维素或羧甲基纤维素)，以及缓冲液和防腐剂。
[0077]除了上述那些有代表性的剂型，药学上可接受的赋形剂和载体通常是本领域的技术人员所知的，因此也包括于本发明中。这样的赋形剂和载体在诸如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”Mack出版公司，新泽西州(1991)的书籍中都有描述，该文献在此引入作为参考。
[0078]本发明的制剂可以设计为如下所述的适合短效、速释、长效和持续释放的剂型。因此，这些药物也可以制备成控释或缓释的剂型。
[0079]本组和物还可以含有诸如胶束或脂质体的物质，或其它的胶囊形式，或者可以用长期释放的方式给药，以达到长期的药物贮藏和/或输送效果。因此，药物可以压缩入小球或圆柱体中并植入肌内或者皮下，作为长效注射剂(depotinjections)或作为植入物(如移植片)。这样的植入物可以使用已知的惰性材料，如硅树脂和可生物降解的聚合物来制备。
[0080]治疗有效剂量是指导致症状改善的化合物的量。具体剂量可依照疾病情况、年龄、体重、总体健康状况、性别、对象的饮食、剂量间隔、给药途径、排泄率和药物联合而进行调整。任何含有有效药量的上述剂型都正好属于常规实验范围内，也因此正好落于本发明的范围内。治疗有效剂量可依照给药途径和剂型而有所变化。本发明优选的一种或多种化合物是具有高治疗指数的药物。治疗指数是毒性和疗效之间的剂量比，可以用LD50和ED50之间的比率来表示。LD50是指50％群体的致死剂量，而ED50是指50％群体的治疗有效剂量。LD50和ED50可通过动物细胞培养或实验动物中标准的药学程序进行测定。
[0081]本发明还提供了增强人类或非人类动物抗癌能力的方法。本方法包括：给所述的哺乳动物或非人类动物施用有效量的本发明的化合物或组合物。本发明的化合物的有效用量包括那些能够抑制RTK的用量，这些用量可以用诸如在此处描述的测定方法进行检测，或者采用任何其它的本领域技术人员已知的方法加以检测，这些方法通过G-蛋白偶联受体的激活来检测生化途径中的信号转导，例如通过测定cAMP水平的上升并与对照模型的比较。有效用量还可以包括能够通过抑制RTK来使得RTK紊乱症状减轻的用量。
[0082]RTK紊乱症、或RTK介导的疾病可以通过所提供的那些方法加以治疗，包括任何涉及RTK的生物紊乱或疾病，或者抑制RTK后导致紊乱或疾病状态下有缺陷的生化途径加以改善的生物紊乱或疾病。此类疾病的例子有癌症，例如前列腺癌、结直肠癌、乳房癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、小细胞癌、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓增生性疾病。
[0083]化合物1的合成已在美国专利号6,605,617中公开。为了确定化合物2和3的种类，化合物1的代谢产物(化合物2和3)是独立合成的，如实施例6中所示。
[0084]因此，通过参考以下的实施例，所概述的本发明将更容易被理解。以下的实施例仅以诠释的方式给出，而并不用于限制本发明。
具体实施方式
[0085]以下的缩写和术语通篇使用于各实施例中：
ATP：三磷酸腺苷
AUC：曲线下面积
BSA：牛血清白蛋白
DMSO：二甲亚砜
EDTA：乙二胺四乙酸
ERK：胞外调节激酶
Hepes：N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)
HPLC：高效液相色谱
HMVEC：人微血管内皮细胞
kg：千克
LC：液相色谱
MAPK：丝裂原活化蛋白激酶
MS：质谱
MeOH：甲醇
mg：毫克
mL：毫升
MTS：[3-(4，5-二甲基-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-
四唑，内盐
nM：纳摩尔
PBS：磷酸盐缓冲液
NMR：核磁共振谱
RT-PCR：逆转录酶-聚合酶链式反应
SCF：干细胞因子
TFA：三氟乙酸
T1/2：半衰期，即50％的化合物从生物系统中被清除所需的时间
μg：微克
μL：微升
μM：微摩尔
UV：紫外光谱
实施例1
[0086]测试了4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮(化合物1)对于大量的癌细胞系和原代非恶性细胞系的抗增生活性。方法如下：细胞铺于96孔板；让贴壁细胞系的聚集3至5个小时后，添加化合物的稀释液，3天后，通过添加MTS溶液(Promega)来测定活细胞的数目。检测490nm处的吸光度，利用非线性回归法计算EC50的值。对于HMVEC的测定，在有5ng/mLVEGF存在的情况下，将化合物与细胞孵育3天。对于SCF/c-KIT测定，TF-1和H526细胞分别在有40ng/mL和100ng/mL重组SCF存在下孵育3天。通过加入MTS溶液和测定490nm处的吸光度来检测细胞的增殖情况。用非线性回归法计算EC50。结果列于表1。
[0087]在癌细胞系的和上皮细胞的子集中，细胞增殖受到抑制，其EC5050nM，这与它们依赖于化合物1所靶向的RTK是一致的(MV4；11：组成型表达有活性的FLT3；HMVEC：VEGFR2介导的增殖；TF-1：c-KIT介导的增殖)，KM12L4a细胞系除外。虽然此细胞系确实表达一些靶向的RTKs(如通过RT-PCR测定的VEGFR 1/2和PDGFR)，但是实验表明，这些RTKs的单独抑制并不能充分解释所观察到的化合物1的有效抗增殖作用。这一发现提示，此细胞系中，由化合物1介导的抗增殖作用是由于多种RTKs受到抑制而引起的，或者是由一些尚未明确的作用所引起的。
[0088]与EC50在1至10μM之间的化合物1一同孵育时，大多数的细胞系均显示了抗增殖反应，其中包括两种原代细胞系HMEC(正常的人乳腺上皮细胞)和PrEC(正常的人前列腺上皮细胞)。与体外结果一致的是，化合物1有效地抑制KM12L4a和MV4；11异种移植物在小鼠体内的生长。
表1
| EC<sub>50</sub> 50nM | EC<sub>50</sub> 0.4-1μM | EC<sub>50</sub> 1-10μM | EC<sub>50</sub> 10μM |
| MV4；11(急性粒细胞白血病)KM12L4a(结肠癌)HMVEC(VEGFNEGFR2介导的；上皮)TF-1(SCF/c-KIT介导的；急性粒细胞白血病) | RS4(急性淋巴细胞性自血病)4T1(小鼠乳癌) | MDA-MB435(乳房癌)SKOV3(卵巢癌)K562(慢性粒细胞白血病)Ku812(慢性粒细胞白血病)MOLT-4(急性淋巴细胞性白血病)ARH77(多发性骨髓瘤)HCT116(结肠癌)Du145(前列腺癌)PC3(前列腺癌)H209(肺癌)H226(肺癌)HT29(结肠癌)SW620(结肠癌)PrC(正常前列腺上皮)HMEC(正常乳腺上皮) | U87(脑癌) |
a除非另有说明，所有的测试细胞系均为人体来源。
实施例2
[0089]通过2周的毒性研究，化合物1的两个代谢产物在混合大鼠血浆中被识别和部分鉴定。所分析的对象为每日1次口服剂量30或80mg/kg的动物组，在第1天和第14天服药后用UV和LC/MS分析动物血浆。两个鉴别的代谢产物为式II的哌嗪N-氧化物化合物(化合物2)和式III的N-去甲基化合物(化合物3)(这些化合物的合成及特征见实施例6)。代谢产物水平的评估(基于紫外吸收结果以及与以前分析中相同样品中化合物1的已知定量水平的比较而得出的)，在表2中给出。已发现，在所有快速给药的混合血浆样品中，N-去甲基代谢产物的丰度均比化合物1的丰度要低得多。有关N-氧化物代谢产物的丰度，除了在80mg/kg剂量组第14天的24小时和30mg/kg剂量组第1天的1-2小时以外，其余各观察到的丰度值都比化合物1的丰度值低(表2)。代谢情况并不随着剂量或剂量持续时间的变化而变化。通常随着剂量的增加，代谢产物的水平会随化合物1的水平一同升高。
[0090]对于两个剂量组，不同的剂量持续时间(1天或是14天)似乎并未引起单独的血浆代谢产物水平的升高(表2)，也没有引起代谢产物相对于化合物1水平的升高。化合物1的水平随着剂量的持续时间的延长而降低，这也可以从代谢产物水平的降低中得以显现。这提示，时间依赖型的暴露于化合物1的减少并不反映于增加的代谢。第14天，24小时的样品中所含的化合物1和其代谢产物的水平低于第1天24小时的样品中这两者的水平，这就说明使用每天1次30或80mg/kg的剂量的疗法时，不会有代谢产物或化合物1的蓄积。在80mg/kg剂量组的所有检测时间点和30mg/kg剂量组的所有时间点(除了第1天后24小时这一时间点外)，N-氧化物代谢产物的丰度要高于N-去甲基代谢产物的丰度。N-去甲基代谢产物水平的下降较化合物1水平的下降缓慢，这就提示该代谢产物具有较长的T1/2，同时表明此代谢产物的血浆水平很可能由其清除速率而并非其生成的速率所决定(而N-氧化物则很可能与此相反)。
表2.：大鼠血浆中化合物1水平和化合物1的代谢产物的评估水平
| 剂量(mg/kg) | 日 | 取样时间(小时) | 去甲基(ng/ml)<sup>1</sup> | N-氧化物(ng/ml)<sup>1</sup> | 化合物1(ng/ml)<sup>2</sup> |
| 30 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 30 | 1 | 1-2 | 14 | 1090 | 635 |
| 30 | 1 | 4-8 | 48 | 310 | 943 |
| 30 | 1 | 24 | 22 | 25 | 54 |
| 30 | 14 | 0 | 6 | 1.3 | 20 |
| 30 | 14 | 1-2 | 6 | 135 | 467 |
| 30 | 14 | 4-8 | 12 | 220 | 442 |
| 30 | 14 | 24 | 4 | 0.4 | 8 |
| 100 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 100 | 1 | 1-2 | 35 | 424 | 1212 |
| 100 | 1 | 4-8 | 84 | 779 | 2075 |
| 100 | 1 | 24 | 83 | 137 | 500 |
| 100 | 14 | 0 | 15 | 67 | 162 |
| 100 | 14 | 1-2 | 17 | 122 | 628 |
| 100 | 14 | 4-8 | 19 | 533 | 1099 |
| 100 | 14 | 24 | 10 | 102 | 33 |
1：代谢产物的评估水平基于对代谢产物紫外吸收面积与化合物1紫外面积的比较，并且使用先前报道的化合物1的水平。2：在先前的另一项单独研究中，此处分析所用的相同血浆样品中化合物1的水平已进行了定量。
实施例3
受体酪氨酸激酶的体外激酶检测
[0091]一系列蛋白酪氨酸激酶的激酶活性采用以下方式进行测定：提供ATP以及合适的含有可以发生磷酸化作用的酪氨酸残基的多肽或蛋白质，并分析磷酸基团向酪氨酸残基的转移。对应于FLT-1(VEGFR1)、VEGFR2、VEGFR3、Tie-2、PDGFRα、PDGFRβ和FGFR1受体的细胞质内域的重组蛋白，是利用杆状病毒表达系统(InVitrogen)在Sf9昆虫细胞中表达的，并且可以通过Glu抗体相互作用(适合于带有Glu-抗原决定簇标记的构建物)或通过金属离子色谱(适合于带有His6(SEQ ID NO：1)的构建物)进行纯化。对于每项检测，测试的化合物都用DMSO连续稀释，然后与加了ATP的合适的激酶反应缓冲液相混合。添加激酶蛋白和合适的生物素化的多肽底物，使得终体积达到50-100μL，该反应物在室温下孵育1-3小时，然后加入25-50μL的45mM EDTA和50mM Hepes(pH 7.5)终止反应。终止的反应混合物(75μL)转移至链亲和素包被的微量滴定板(Boehringer Mannheim)中并孵育1小时。磷酸化的多肽产物用DELFIA时差荧光系统(Wallac或PE Biosciences)检测，其中所使用的抗磷酸酪氨酸抗体PT66是用铕标记的，并且改进之处在于：在DELFIA检测缓冲液中添加了1mM MgCl2用于稀释抗体。时差荧光在Wallac 1232 DELFIA荧光仪或PE Victor II多信号读取仪上读取。每个化合物的50％抑制(IC50)浓度都利用XL Fit数据分析软件用非线性回归加以计算。
[0092]FLT-1、VEGFR2、VEGFR3、FGFR3、Tie-2和FGFR1激酶，在50mMHepes(pH 7.0)、2mM MgCl2、10mM MnCl2、1mM NaF、1mM DTT、1mg/mL BSA、2μM ATP和0.20-0.50μM相应的生物素化多肽底物存在下，加以检测。添加的FLT-1、VEGFR2、VEGFR3、Tie-2和FGFR1激酶分别为0.1μg/mL、0.05μg/mL或0.1μg/mL。对于PDGFR激酶检测，使用120μg/mL的酶与上述相同的缓冲条件，除了将ATP和肽底物的浓度改成1.4μM ATP和0.25μM生物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQ ID NO：2)肽底物。对于FLT-1、VEGFR2、VEGFR3和FGFR1，以上各种化合物显示的IC50值均低于10μM。
[0093]重组的具有活性的酪氨酸激酶Fyn和Lck是可商业化获得的，可购自Upstate Biotechnology。对于每项检测，测试的化合物在DMSO中连续稀释，然后与合适的加了10nM33Pγ-标记ATP的激酶反应缓冲液相混合。添加激酶蛋白以及合适的生物素化多肽底物后，使得终体积达到150μL。反应物在室温下孵育3-4小时，然后转移至含有100μl终止反应缓冲液(100mM EDTA和50μM未标记的ATP)的链亲和素包被的微量滴定板(Thermo Labsystems)而终止反应。孵育1小时后，用PBS清洗链亲和素板，并在每个孔中添加200μL Microscint 20闪烁溶液。将板封闭后，使用TopCount进行计数。利用XL Fit数据分析软件使用非线性回归计算每个化合物的50％抑制(IC50)浓度。
[0094]Fyn、Lck和c-ABL的激酶反应缓冲液含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)、15mM MgCl2、30mM MnCl2、2mM DTT、2mM EDTA、25mM β-甘油磷酸、0.01％BSA/PBS、0.5μM适合的多肽底物(生物素化的Src多肽底物：对Fyn和Lck，生物素-GGGGKVEKIGEGTYGVVYK-NH2(SEQ ID NO：3))、1μM未标记ATP和1nM激酶。
[0095]c-Kit和FLT-3的激酶活性采用如下方法测定：提供ATP和合适的含有可进行磷酸化作用的酪氨酸残基的多肽或蛋白质，检测磷酸基团对酪氨酸残基的转移。c-Kit和FLT-3受体的胞质域所对应的重组蛋白是买来的(Proquinase)。一种代表性化合物，如4-氨基-5-氟-3-[5-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮在DMSO中稀释，然后与加了ATP的如下所述的激酶反应缓冲液混合用于测试。加入激酶蛋白(c-Kit和FLT-3)和生物素化多肽底物(生物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQ ID NO：2))，使得终体积达100μL。这些反应物在室温下孵育2小时，然后添加50μL的45mM EDTA和50mM HEPES(pH 7.5)终止反应。终止的反应混合物(75μL)转移至链亲和素包被的微量滴定板(Boehringer Mannheim)并孵育1小时。磷酸化的肽产物用DELFIA时差荧光系统(Wallac or PE Biosciences)检测，所使用的抗磷酸酪氨酸抗体PT66是用铕标记的，并且改进之处在于：在DELFIA检测缓冲液中添加了1mM MgCl2用于稀释抗体。时差荧光在Wallac 1232 DELFIA荧光仪或PE Victor II多信号读取仪上读取。每个化合物的50％抑制(IC50)浓度都利用XL Fit数据分析软件用非线性回归加以计算。
[0096]FLT-3和c-Kit激酶在50mM Hepes(pH 7.5)、1mM NaF、2mM MgCl2、10mM MnCl2和1mg/mL BSA、8μM ATP和1μM相应的生物素化多肽底物(生物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQ ID NO：2))存在下进行检测。FLT-3和c-Kit激酶在浓度为2nM下进行检测。
检测了化合物1的代谢产物的IC50值，并示于表3，与化合物1的IC50进行比较。
表3.
| 化合物 | IC<sub>50</sub>(μM) | |||||
| VEGFRflt | VEGFRflk1 | bFGFR | PDGFR | Flt3 | c-kit | |
| 化合物1 | 0.010 | 0.013 | 0.008 | 0.027 | 0.0001 | 0.0015 |
| 化合物2 | 0.004 | 0.009 | 0.005 | 0.010 | 0.0004 | 0.0002 |
| 化合物3 | 0.019 | 0.012 | 0.019 | 0.037 | 0.0001 | 0.0002 |
实施例4
[0097]此项单剂研究评估了，在KM12L4a人结肠癌模型中化合物1的每日口服剂量。
[0098]在7-8周龄的雌性Nu/Nu小鼠(Charles River)的右侧腹部，皮下接种2×106个KM12L4a细胞。7天后当平均肿瘤体积达到125mm3时开始治疗。这天定为研究日1。化合物1用10mM的H3PO4制备成溶液形式，通过管饲的方式口服给药。
[0099]本项研究包括7个治疗组(n＝10/组)：载体(水)口服(p.o.)，1次/日(q.d.)；六个施用化合物1组，剂量为3，10，30，100，200，300mg/kg口服(p.o.)，1次/日(q.d.)。
[0100]在不同天内，从每个剂量组的个别动物身上抽取血浆样品，以此测定化合物1在荷瘤小鼠体内的药物代谢动力学特征(N＝2/时间点/剂量组)。在第22日给药后的8和24小时，检测从100和200mg/kg剂量组的动物身上采集的样品组织和肿瘤中化合物1的浓度(N＝2/时间点/剂量组)。
[0101]血浆化合物1的浓度用未经确证的LC/MS/MS分析来测定，其校正范围为1-8000ng/mL，定量下限(LLOQ)为1ng/mL(Charles River Laboratories，Worcester，MA)。组织和肿瘤中化合物1的浓度还使用另一未经确证的LC/MS/MS分析而测定，其校正范围为20至43740ng/g，定量下限(LLOQ)为20ng/g。
[0102]合并的药代谢动力学参数(Cmax和AUC)采用标准的非区域化分析获得，即在每个取样日分析各剂量组的平均血浆化合物的浓度-时间数据(WinNonlin Professional，版本4)。报道的AUC值是用3个浓度-时间数据点确定的。报道的给药前的浓度值是刚好在给药前所观测到的浓度。
[0103]通过4-7日的治疗，所有的剂量组中均观察到显著的剂量依赖性的肿瘤生长抑制(见表4)。计算所得的ED50值为17mg/kg。在大部分的施用量为200和300mg/kg化合物1的小鼠中，观察到的肿瘤消退程度均超过其初始大小的50％，然而这些剂量并非在整个研究期间均可被耐受。到第12-16天，施用300mg/kg药量进行治疗的小鼠其体重降低了20-30％并被无痛处死。施用200mg/kg药量进行治疗的小鼠，其中的十分之一到第14天有22％的体重降低并被无痛处死，其余小鼠降低的体重超过25％，于第21-24日被无痛处死。以100mg/kg药量持续37天给药的小鼠，其体重保持在初始体重的98％；在这个剂量下，肿瘤也保持稳定(图1)。载体组的小鼠在第9日病倒，并计算肿瘤生长抑制(TGI)(表4)。
表4.化合物1的剂量反应活性
| 每日剂量化合物1(n＝9-10/gp) | 肿瘤体积，第9日平均值±标准差(mm<sup>3</sup>) | 治疗组值/对照组值 | ％肿瘤生长抑制 | P值与载体相比 |
| 载体 | 1333±283 | - | - | - |
| 3mg/kg | 1168±202 | 0.88 | 12 | 0.1519 |
| 10mg/kg | 861±321 | 0.65 | 35 | 0.0037 |
| 30mg/kg | 553±213 | 0.42 | 58 | ≤0.00001 |
| 100mg/kg | 263±108 | 0.20 | 80 | ≤0.00001 |
| 200mg/kg | 98±40 | 0.07 | 93 | ≤0.00001 |
| 300mg/kg | 74±30 | 0.06 | 94 | ≤0.00001 |
[0104]在给药次日(第2日)，化合物1的血浆浓度在所有剂量组中均随着剂量(表5)成比例地升高。在至少2周施用不同剂量的药物后，血浆浓度与第2日的浓度仍具有可比性，这表示在每日一次给药的情况下，药物在小鼠内无蓄积(表5)。同样地，收集于第3、8和15日的化合物1的前剂量血浆浓度在每个剂量组中是相似的，这就表示第2日后达到了稳态。因此，这些数据提示化合物1在荷瘤小鼠中显示出剂量非依赖性和时间非依赖性的药物代谢动力学。
[0105]35-60％的肿瘤生长抑制分别在10和30mg/kg剂量组中观察到。用Cmax和AUC值可以评估对应的化合物1的血浆接触剂量，其范围分别为163-742ng/mL和1420-5540ng*hr/mL(图2)。给药前，相应的血浆浓度在2-135ng/mL之间。
表5.以每日1次口服剂量给SC KM1214a荷瘤小鼠施药后，化合物1的复合药物代谢动力学参数和血浆浓度-时间数据
| 剂量(mg/kg/日) | 日 | 复合药物代谢动力学参数 | 平均血浆浓度(ng/mL) | ||||
| C<sub>max</sub>(ng/mL) | AUC(ng*hr/mL)<sup>1</sup> | 时间(hr) | |||||
| 0<sup>*</sup> | 2 | 8 | 24<sup>*</sup> | ||||
| 3 | 28 | 48- | 420- | 1.55 | 48.0 | 12.7 | 11.1 |
| 10 | 281517 | 163--- | 1420--- | 2.373.95 | 163136 | 67.365.8 | 2.72 |
| 30 | 281517 | 742--- | 5540--- | 7.3723.7 | 742416 | 228123 | 8.42 |
| 100 | 281522 | 1560--1550 | 18500--21200 | 13554.7 | 15601550 | 10501330 | 97.847.7 |
| 200 | 281522 | 2500--1940 | 47200--31600 | 454434 | 23701940 | 25001400 | 12701050 |
| 300 | 281518 | 3450--2980 | 61300--58400 | 9111220 | 34502440 | 29002250 | 19502980 |
1根据3个浓度-时间数据对而计算出的AUC
-未测定
*给药前浓度
[0106]在第22日的2个取样时间(施药后的8和24小时)时，100和200mg/kg的剂量组，其组织中化合物1的浓度高于血浆中的浓度(表6)。脑和心脏的化合物1的浓度较血浆中的浓度高13至34倍；但是在这两个剂量组中，施药后的8或24小时时，肝、肺和肾的浓度较血浆中浓度高40至126倍。通常，在8小时的组织-血浆浓度比与在24小时的具有可比性。此外，24小时处的组织浓度总是低于8小时处的浓度低。结合起来，这些结果提示组织中化合物1的浓度似乎与血浆中的浓度平行下降。因此，化合物1似乎与血浆成比例地广泛分布于组织中(包括脑)，但是并不随着多次口服给药而在组织中蓄积。
表6.以100或200mg/kg/日的剂量每日1次给KM12L4a荷瘤小鼠施用化合物1后，第22日时组织、肿瘤和血浆中的平均浓度
| 剂量(mg/kg) | 时间(hr) | 组织浓度(ng/g) | 血浆浓度(ng/mL) | |||||
| 脑 | 心 | 肾 | 肝 | 肺 | 肿瘤 | |||
| 100200 | 824824 | 16900675242009160 | 2470016304040018700 | 83700390014300082800 | 1070005080176000109000 | 87500317027700041600 | 485001690010700087900 | 133047.714001050 |
N＝2/时间点/剂量组，除了在200mg/kg组中24hr时，N＝1
[0107]在100和200mg/kg剂量组中，每组在第22日的2个取样时间(施药后8和24小时)时，肿瘤化合物1的浓度比血浆中的浓度高37至354倍。然而，在这两个剂量组中，施药后24小时的肿瘤浓度仅比施药后8小时的浓度低17至65％，这就提示该化合物从肿瘤中清除的速率比它从其它正常组织中(如脑、心、肝、肺和肾)清除的速率要慢。因此，相对于血浆，化合物1似乎更广泛地分布于肿瘤，但是相对于在血浆或正常组织中，该化合物在肿瘤中则更优先滞留。
[0108]总的来说，化合物1的功效和耐受性是与剂量相关的，4至7日治疗后出现显著的抑制效果。在300和200mg/kg组中观察到肿瘤消退；这些剂量是每日耐受的，分别持续约14和21日。体重降低是与毒性相关的临床症状。100mg/kg的剂量耐受了37日，无不利的临床症状出现，与对照相比80％的肿瘤生长得到抑制。30mg/kg的剂量抑制60％的肿瘤生长。化合物1在荷瘤小鼠中呈现出不依赖于剂量和时间的药代谢动力学。与35-60％的肿瘤生长抑制有关的血浆中化合物1的Cmax、AUC和Cmin值的范围分别在163-742ng/mL、1420-5540ng*hr/mL和2-135ng/mL。化合物1广泛分布于组织，然而似乎不随着多次口服给药而在组织中蓄积。口服给药后，相对于在其它组织，化合物1有在肿瘤中优先滞留的倾向。
实施例5
[0109]此项单剂研究评估了，在PC3人前列腺肿瘤模型中，化合物1的间隔口服剂量。
[0110]雄性SCID小鼠，9-10周龄，腹部皮下接种5百万个PC3人前列腺细胞。当平均肿瘤体积达到150mm3时，开始治疗。此日即定为研究日1。化合物1制备为水溶液，经管饲口服给药。
[0111]本研究包括5个治疗组(n＝10/组)：载体(水)口服(p.o.)，1次/日(q.d.)；和100mg/kg化合物1剂量的四个组(1次/日(q.d.)，1次/2日(q.2.d.)，1次/3日(q.3.d.)，1次/4日(q.4.d.))。
[0112]如表7中所示，在所有治疗组中均观察到显著的和近似的肿瘤抑制结果。对于每日给药组，此研究在第11日暂停。对于剩余组，此研究于研究的第25日结束，然后测量平均肿瘤体积并与载体组比较。作为毒性的临床指征，每组的体重降低百分率均被测定。
表7
| 组 | n | 化合物1总剂量 | 第25日平均肿瘤体积 | 与载体相比的肿瘤生长抑制％(TGI) | 平均体重降低％(范围) |
| 载体 | 10 | 2011 | 13(1-24％) | ||
| 100mpk 1次/日，第1-11日 | 8 | 11 | 790 | 60％ | 12(3-35％) |
| 100mpk 1次/2日 | 10 | 13 | 507 | 75％ | 4(0-13％) |
| 100mpk 1次/3日 | 10 | 9 | 645 | 68％ | 4(0-11％) |
| 100mpk 1次/4日 | 9 | 7 | 686 | 66％ | 10(5-17％) |
实施例6
[0113]为了确定化合物1的已确认的代谢产物的结构，代谢产物被单独合成。
[0114]化合物2(化合物1的N-氧化物代谢产物)，如以下流程中所示进行合成。化合物1在乙醇、二甲基乙酰胺和过氧化氢的混合物中加热。反应接近完成时，用过滤的方式分离化合物2，并用乙醇清洗。如果必要，产物可通过柱色谱而进一步纯化。
化合物3(化合物1的N-去甲基代谢产物)，如以下流程中所示进行合成。用哌嗪处理5-氯-2-硝基苯胺产生化合物4，随后用叔丁氧基羰基(Boc)保护化合物4，产生化合物5。还原硝基，接着与3-乙氧基-3-亚氨基丙酸乙酯缩合得到化合物6。用六甲基二硅胺烷钾(potasssium hexamethyldisilazide)作为碱，将化合物6与6-氟氨基苯甲腈缩合，得到化合物7。粗产物7用盐酸水溶液处理，产生所需的代谢产物，纯化后得到的是黄/棕色固体。
实施例7
化合物1的乳酸盐的制备
[0115]3000mL 4-颈的带夹套的烧瓶安装了冷凝器、温度探头、N2气体进口和机械搅拌器。反应容器用N2吹洗至少15分钟，然后充入4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基))-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮(484g，1.23mol)。制备D，L-乳酸盐(243.3g，1.72mol单体-见以下段落)、水(339mL)和乙醇(1211mL)的溶液，然后将其加入反应瓶。以中等速率开始搅拌，加热反应物至其内部温度达到68-72℃。将反应的内部温度保持在68-72℃，维持15-45分钟，然后停止加热。得到的混合物用10-20微米的玻璃过滤器过滤，收集滤液至12L的烧瓶内。12L的烧瓶安装了内部温度探头、回流冷凝器、附加漏斗、气体进出口和上方搅拌器。然后，该滤液以中等的速率搅拌，并加热至回流(内部温度达到约78℃)。在维持缓和的回流时，在20分钟的时间内将乙醇(3,596mL)充入烧瓶。然后，在15-25分钟内将反应瓶冷却至其内部温度的范围约为64-70℃，并且维持该温度约30分钟。检查反应器内是否出现结晶。如果未呈现结晶，那么将4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮(484mg，0.1mol％)的乳酸盐结晶加入烧瓶，在64-70℃的温度条件下搅拌30分钟，再次检查烧瓶内是否有结晶。一旦出现结晶，就将搅拌速率降低，并且在64-70℃再搅拌90分钟。然后，在约2小时的时间内将反应物冷却至0℃，得到的混合物用25-50微米的玻璃滤器过滤。反应器用乙醇(484mL)清洗并搅拌直至内部温度约为0℃。用冷乙醇清洗滤饼，并重复此步骤2次。收集到的固体在真空烘箱内50℃条件下真空干燥至恒重，产出510.7g(85.7％)的4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基))-1H-苯并咪唑-2-基]-1H-喹啉-2-酮的黄色乳酸盐结晶。通常，在过滤的过程中会使用橡胶屏障(rubber dam)或惰性条件。虽然干燥的固体似乎不是非常吸湿，但湿滤饼容易吸收水分而变得有粘性。应小心以避免湿滤饼过久地暴露于空气中。
[0116]市售的乳酸通常含约8-12％w/w的水，且除了单体乳酸外还含有二聚体和三聚体。乳酸二聚体和单体的摩尔比通常约为1.0∶4.7。商品等级的乳酸可用于上一段中所述的程序，因为单乳酸盐优选从反应混合物中沉淀出来。乳酸单体按照以下程序纯化。
实施例8
[0117]此项研究评估了化合物1在添加FGF的Matrigel模型中的抗血管生成潜力。
[0118]11-12周龄的雌性BDF1小鼠(Charles River，Wilmington，MA)，皮下植入0.5mL添加了2μg FGF-2的Matrigel(BD生物科学，Bedford，MA)。通过测定从动物中取出的Matrigel塞中的血色素水平而定量检测添加了FGF-2后的血管形成情况(血管再生或血管生成)。
[0119]实验药物的口服给药开始于植入Matrigel的前1天，并以每日1次的剂量持续施药8次。化合物1用10mM H3PO4制备为溶液。12个治疗组包括：载体(10mM H3PO4)口服(p.o.)，1次/日(q.d.)×8日(2个对照组；植入了未添加FGF的Matrigel(基线血色素水平)或添加FGF的Matrigel(阳性对照)的小鼠)；化合物1以3、10、30、100、200、300mg/kg口服(p.o.)，1次/日(q.d.)×8日的剂量给药。每组有8只小鼠，除了给药剂量为200和300mg/kg的小鼠组为每组4只。
[0120]将施用化合物治疗的小鼠的血色素水平与用载体治疗的小鼠相比，所得的血色素的百分比抑制率可表明此化合物的抗血管生成的功效。结果以每个Matrigel塞的总血色素(mg/dL)表示。ED50定义为有效抑制约50％血管生成的剂量。从小鼠体内取出并快速冷冻的Matrigel塞经过均质化后，使用Drabkin’s试剂(Sigma Diagnostic，St.Louis，MO)通过吸收光谱来确定血色素浓度。
[0121]为了评估化合物1的血浆暴露度，在8次连续剂量(第8日)后的2和24小时收集血液。在200和300mg/kg剂量组中，仅在2小时时间点收集血液。化合物1的血浆浓度采用未经验证的LC/MS/MS分析而测定，其校正范围1-8000ng/mL，定量下限(LLOQ)为1ng/mL(Charles River Laboratories，Worcester，MA)。
[0122]第8日测定Matrigel塞中的血色素水平和化合物1的血浆浓度。整个研究中，动物的体重均被观察并测量。
[0123]与载体组处理组动物的Matrigel塞相比，由于化合物1的施用，各评估剂量组动物体内的Matrigel塞内血色素的浓度均被显著抑制(表8)。计算所得的ED50为2.6mg/kg。3和10mg/kg剂量分别引起54％和57％的抑制，而30、100、200和300mg/kg剂量组的血色素水平则降低至未添加FGF的Matrigel的水平，与添加FGF的对照组比较，抑制率为70-92％。在第8日服药后2小时，化合物1的血浆浓度与施用剂量成比例地升高，浓度范围从3mg/kg组的44ng/mL到300mg/kg组的3920ng/mL(表9)。所有剂量都很好地被耐受，未观察到体重的减轻。
表8.化合物1口服给药后，在Matrigel中的血色素浓度和剂量依赖型Matrigel塞中的血色素浓度受抑制而降低
| 治疗 | n | 平均血色素±标准差mg/dL | ％血色素抑制与Matrigel+FGF的载体治疗相比 | P值t-检验对比载体治疗Matrigel FGF |
| 单独的Matrigel | 8 | 26±15 | ||
| Matrigel FGF+载体 | 8 | 69±34 | ||
| 300mg/kg 1 | 4 | 6±0.8 | 91％ | 0.005 |
| 200mg/kg 1 | 4 | 8±0.3 | 89％ | 0.004 |
| 100mg/kg 1 | 8 | 14±7 | 80％ | ＜0.0005 |
| 30mg/kg 1 | 8 | 20±8 | 71％ | ＜0.0005 |
| 10mg/kg 1 | 8 | 29±16 | 58％ | 0.010 |
| 3mg/kg 1 | 8 | 32±14 | 54％ | 0.012 |
表9.在8次连续给药后测定的化合物1的血浆浓度
| 化合物1剂量(mg/kg/日) | 平均血浆浓度在2小时时#(ng/mL) | 平均血浆浓度在24小时时#(ng/mL) |
| 3 | 44 | 0<sup>a</sup> |
| 10 | 123 | 0<sup>a</sup> |
| 30 | 339 | 1.4 |
| 100 | 954 | 24 |
| 200 | 1910 | NS |
| 300 | 3920 | NS |
a血浆浓度低于定量检测的下限(≤1ng/mL)
NS＝未收集样品
#给药后2小时和24小时收集的样品
[0124]化合物1的血浆浓度(给药后2小时)随剂量成比例升高。在Matrigel塞内，观察到依赖于剂量和血浆浓度的血色素含量的减少。44ng/mL的血浆浓度(给药后2小时，第8日)似乎与此模型中的抗血管生成活性有关。
[0125]总的来说，化合物1对于血色素的抑制是剂量依赖性的，治疗8日后有显著的抑制。在所有剂量的化合物1的给药情况下，都观察到统计上显著的血色素的抑制。所有剂量均被良好耐受，未观察到体重降低或不利的临床症状。44ng/mL的化合物1血浆浓度(给药后2小时)与此模型中的抗血管生成活性有关。
实施例9
[0126]在第1和14个给药日的样品中，测定来自5mg/kg每日2次(BID)多次口服给药剂量组的猴血浆中化合物1的代谢情况。一种通过去甲基化(化合物3)而产生的代谢产物是通过LC/UV和LD/MS/MS而鉴定的。母(P)化合物1的m/z＝393.3(M+H+)，其色谱保留时间为18.3分钟。去甲基的代谢产物(P-CH3)经鉴定，其m/z＝379.3(M+H+)，其色谱保留时间为18.1分钟。代谢产物和化合物1间的14道尔顿的质量差别与去甲基后的化合物1相一致。代谢产物的质量和色谱保留时间与单独合成的化合物3是一致的。在此剂量水平，化合物1的哌嗪N-氧化物(N-氧化物化合物2)相应的代谢产物未被检测到。在356nm的吸收谱测定中，位于17.7和18.5分钟的UV信号处的成分，通过与化合物1的UV谱相比较并且由于它们在空白血浆中同样存在(时间0，剂量日1)，而被确定是基质成分而非代谢产物。
[0127]评估的去甲基代谢产物的水平在表1中给出。所评估的代谢产物的水平(以化合物1等价物形式)，是基于代谢产物与此分析中获得的化合物1的UV吸收峰高度比，用此吸收率之比乘以先前定量分析研究的相同样品中已确定的化合物1的水平来外推代谢产物的水平。发现在所有的混合时间点，母化合物的丰度均高于代谢产物的丰度。发现在第14日的样品中化合物1的水平相当低，与之相平行的是N-去甲基代谢产物基本检测不到。在给药的第1或14日，血浆样品中未检测到其它的代谢产物，包括共轭相的II型代谢产物(葡萄糖苷酸或硫酸盐)。
表10.化合物1的多次口服剂量给药后(5mg/kg，每日2次(BID))，大鼠血浆(N＝2)中化合物1的水平和所评估的化合物1代谢产物的水平。
| 剂量(mg/kg/day)<sup>a</sup> | 日 | 混合的样品时间(hr) | (P-CH<sub>3</sub>)(ng/ml)<sup>b</sup> | 化合物1(ng/ml)<sup>c</sup> |
| 10 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 10 | 1 | 1，2 | 8.5 | 28 |
| 10 | 1 | 4，8 | 31 | 62 |
| 10 | 1 | 12，13，14，16，20，24 | 10 | 21 |
| 10 | 14 | 0 | ND | 2 |
| 10 | 14 | 1，2 | ND | 4.2 |
| 10 | 14 | 4，8 | ND | 2.2 |
| 10 | 14 | 12，13，14，16，20，24 | ND | 3.2 |
a.以12小时的时间间隔(T＝0和T＝12小时)给大鼠给药(剂量：5/mg/kg化合物1每日2次)。
b.基于代谢产物与此分析中获得的化合物1的UV吸收峰高度比，用此吸收率之比乘以先前定量分析研究的相同样品中已确定的化合物1的水平，来得出代谢产物的水平。
c.此表中所列出的化合物1的水平是在先前的单独研究中已定量的水平的平均值。
ND：无法检测到
实施例10
[0128]收集用化合物1治疗后的小鼠的血浆和肿瘤进行研究，用以评估潜在的药效终点。施用化合物1治疗以后，分析KM12L4a肿瘤中的靶向调节，结果显示VEGFR1、VEGFR2、PDGFRβ和FGFR1的磷酸化以时间依赖性和剂量依赖性方式受到抑制。例如，HMVEC细胞显示出VEGF介导的VEGFR2磷酸化的抑制，其IC50约为0.1μM。此外，施用化合物1处理的内皮细胞通过VEGF的介导而抑制MAPK和Akt的磷酸化。
[0129]此外，还观察到了时间依赖性和剂量依赖性的对于ERK(MAPK)活化的抑制。ERK是受体酪氨酸激酶的下游目标。观察到的KM12L4A细胞中的IC50范围在0.1至0.5μM。(KM12L4A细胞在其表面表达PDGFRβ和VEGFR1/2)。KM12L4A细胞同化合物1在无血清的DMEM中孵育3h。采集后，裂解液用SDS-PAGE分离并用磷-ERK1/2和ERK1/2抗体检测。使用ECL试剂(Amersham)来检测。化合物1对受体磷酸化和ERK活性的抑制效果在治疗后持续了24小时。化合物1以剂量-依赖的方式抑制MV4-11细胞中ERK1/2的磷酸化，其IC50为0.01至0.1μM。
[0130]在HCT116人结肠肿瘤模型中观察到了显著的体内活性。在HCT116肿瘤中，化合物1以剂量依赖性和时间依赖性方式抑制ERK(MAPK)的磷酸化，并且在肿瘤组织学分析中观察到了的显著改变。
[0131]这些在临床前模型中的PK/PD的评估表明，化合物1表现出对目标受体和下游信号分子ERK(MAPK)的时间依赖性和剂量依赖性的抑制作用。这些研究将有助于鉴别潜在的生物标记，以支持临床试验中化合物1生物活性的监测。
实施例11
[0132]将14C-标记的化合物1(在喹啉酮环的4-位)以单一口服(PO)剂量(5mg/kg)施药给雄性和雌性Sprague Dawley(SD)大鼠后，通过全身放射自显影术(WBA)检测其组织中放射性的分布。用于WBA的血液和尸体在给药后24小时后的特定时间点采集。尸体冷冻于正己烷/干冰浴中，引流，吸干，并放置于干冰上或储存于约-70℃至少2小时。冻结的尸体包埋于冷冻的羧甲基纤维素中，与包埋的放射自显影标准品一同冷冻成块，储存于-20℃直至分析。在径向平面(sagital plane)的5个感兴趣的水平面上，收集适当的40μm厚的切片，置于胶带。所有主要组织、器官和生物液体均被呈现。磷光显像屏暴露于切片并进行扫描，产生标准曲线，以便内推得出组织中14C标记的化合物1的浓度。用液体闪烁计数(LSC)来分析血浆中的放射性浓度。说明性的结果列于表11中。
[0133]14C-化合物1口服给药后，来自14C-化合物1的放射性在给药后的1小时广泛分布于所有的组织中，在给药后的4小时在大多数组织中达到Cmax。在雄性和雌性组织中放射性的总体分布是相似的。来自14C-化合物1的放射性从组织中的清除率要慢于从血浆中的清除率。在雄性和雌性中，最高的14C-化合物1的组织浓度(除了24小时通过胃肠道的情况)，在副泪腺、肾上腺、肾髓质、眼眶内泪腺和眼眶外泪腺中检测到的。来自14C-化合物1的放射性在口服剂量给药后穿过血/脑屏障。
表11.在给雄性大鼠口服一剂化合物1(5mg/kg)后，在特定时间通过全身放射自显影术测定的组织：血浆浓度比
| 组织：血浆浓度比 | ||||||
| 动物数(处死时间) | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| 组织 | (1小时) | (4小时) | (10小时) | (24小时) | ||
| 肾上腺 | 34.3 | 33.5 | 56.0 | 68.8 | ||
| 血液 | 1.84 | 1.04 | 1.35 | 1.06 | ||
| 骨 | 0.826 | 0.679 | 1.00 | 1.23 | ||
| 骨髓 | 13.8 | 23.3 | 29.7 | 26.9 | ||
| 盲肠 | 16.9 | 11.3 | 23.7 | 15.9 | ||
| 盲肠内含物 | 0.484 | 15.7 | 356 | 130 | ||
| 小脑 | 4.86 | 2.63 | 2.47 | 1.51 | ||
| 大脑 | 6.16 | 3.39 | 3.21 | 1.71 | ||
| 脑脊髓液(CSF) | 13.7 | 18.0 | 24.0 | 11.5 | ||
| 横膈膜 | 14.1 | 9.00 | 12.2 | 6.49 | ||
| 附睾 | 3.61 | 6.57 | 9.05 | 8.53 | ||
| 食管内含物 | 2.90 | 6.82 | 1.08 | 1.15 | ||
| 食管 | 98.1 | 17.7 | 12.3 | 7.26 | ||
| 眼眶外泪腺 | 17.0 | 28.9 | 39.2 | 59.9 | ||
| 眼 | 0.535 | 1.01 | 1.20 | 1.51 | ||
| 脂肪(腹部的) | 3.08 | 1.89 | 2.04 | 1.44 | ||
| 脂肪(褐色的) | 16.2 | 20.2 | 16.2 | 8.85 | ||
| 组织：血浆浓度比 | ||||
| 动物数(处死时间) | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 组织 | (1小时) | (4小时) | (10小时) | (24小时) |
| 副泪腺 | 14.3 | 34.2 | 128 | 300 |
| 眼眶内泪腺 | 16.3 | 30.4 | 42.4 | 63.0 |
| 肾 | 45.1 | 32.4 | 49.1 | 24.3 |
| 大肠内容物 | NA | 7.00 | 454 | 238 |
| 大肠 | 11.6 | 12.8 | 21.8 | 10.9 |
| 肝 | 121 | 48.9 | 45.0 | 44.7 |
| 肺 | 47.2 | 26.9 | 28.8 | 16.8 |
| 骨髓 | 4.08 | 2.76 | 2.88 | 1.51 |
| 肌肉 | 5.93 | 4.64 | 5.77 | 2.64 |
| 心肌 | 16.8 | 11.5 | 11.8 | 4.62 |
| 鼻甲 | 4.44 | 6.29 | 11.9 | 11.0 |
| 嗅叶 | 3.77 | 2.27 | 2.15 | 1.15 |
| 胰 | 25.7 | 20.5 | 29.3 | 10.5 |
| 松果体 | 23.0 | NA | NA | NA |
| 垂体 | 20.5 | 33.9 | 48.1 | 21.5 |
| 包皮腺 | NA | NA | 23.3 | 41.3 |
| 前列腺 | 7.29 | 11.4 | 14.2 | 11.2 |
NA不适用的
[0134]应理解的是，此述的实施例用于解释，而本发明并不仅限于这些实施例而应包含所附权利要求范围内的所有形式。
Claims (5)
1.一种化合物的用途，其特征在于，用于制备治疗癌症药物，其中所述治疗是通过一种或多种的具有下式的化合物施用于癌症对象：
其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐，或与
其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐混合，
其中，该施用量足以使对象血浆中一种或多种化合物的Cmax之和达到约20至4000ng/mL，或对象血液中一种或多种的化合物的综合Cmax达到约40至8000ng/mL。
2.一种代谢产物的用途，所述的代谢产物用于测定下式化合物：
其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐在对象中的代谢情况，其特征在于，所述的代谢产物包含至少一种以下化合物：
下式的N-氧化物化合物：
或下式的N-去甲基化合物：
3.一种测定下式化合物
其药学上可接受的盐、其互变体、或互变体的药学上可接受的盐在对象中的代谢情况的方法，其特征在于，该方法包括：在取自对象的一种或多种尿液、血液或组织样品中，测定所述化合物的至少一种代谢产物的数量，其中所述至少一种代谢产物是具有下式的N-氧化物化合物：
或具有下式的N-去甲基化合物：
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该方法包括测定N-氧化物化合物和N-去甲基化合物两者的数量。
5.如权利要求3或4中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的代谢产物通过紫外光谱或液相色谱-质谱测定。
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| GR01 | Patent grant | ||
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Owner name: NOVARTIS VACCINES & DIAGNOSTIC Free format text: FORMER NAME OR ADDRESS: CHIRON CORP. |
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| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: Delaware Patentee after: Novartis Vaccines & Diagnostic Inc. Address before: American California Patentee before: Chiron Corporation |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20080402 Termination date: 20151112 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |