CN100373156C

CN100373156C - 纳米生物酶电极

Info

Publication number: CN100373156C
Application number: CNB2005100300825A
Authority: CN
Inventors: 朱以华; 杨晓玲; 朱辉钰; 郭飞
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2005-09-28
Filing date: 2005-09-28
Publication date: 2008-03-05
Anticipated expiration: 2025-09-28
Also published as: CN1766599A

Abstract

本发明涉及一种树状大分子封装金属纳米粒子与酶自组装形成多层膜传感界面的纳米生物酶电极。纳米颗粒由于空间效应被封装在树状大分子内部，能保持其良好的活性；电极表面形成含有分散性好的含有纳米金属颗粒的多层膜，可缩短响应时间，提高酶传感器的感应度；本发明还延长了生物酶电极使用寿命，并可根据不同的应用需求选用不同种类的氧化酶，制得多样化的超灵敏的纳米生物酶电极。

Description

纳米生物酶电极

技术领域

本发明涉及通过测试电化学变量的方法分析材料所用的生物化学电极，特别是一种含纳米金属颗粒增强的超灵敏的纳米生物酶电极，以及它的制备方法。

背景技术

生物传感器由于其具有体积小、精度高、灵敏度好和便于现场测定等优点，在临床诊断、工业控制、食品和药物分析、生物药物开发、环境分析、军事领域、生物技术和生物芯片等方面都有重要的用途。如利用葡萄糖氧化酶组装的葡萄糖生物传感器，可用于测量人的血糖、工业废水、发酵或饮料中的糖份。但目前市售的葡萄糖、胆固醇等生物传感器用的生物酶电极存在着背景电流大、响应特性差、易受环境中氧浓度的影响以及易受电活性物质干扰等诸多缺点，限制了其实际应用。近年来，人们试图将纳米金属粒子或纳米金属复合粒子等引入到生物传感器的酶电极中，利用金属纳米颗粒的比表面积大、表面活性中心多、表面反应活性高、催化效率高、吸附能力强，以及导电性好等优异性质，提高酶的稳定性、催化活性和酶与电极之间电子传递，从而大幅度提高电极的电流响应灵敏度。

中国专利CN 1427074A(2003)授权公告了一种含亲水纳米铂颗粒和憎水二氧化硅颗粒的复合酶功能敏感膜及其制法和用途。它是将纳米颗粒与氧化酶水溶液混合，然后再分散在高分子凝胶中，涂抹在电极表面制得纳米颗粒和葡萄糖氧化酶的复合敏感膜，将电流响应的敏感度提高了几十倍。不足之处在于未能解决纳米颗粒间易团聚的问题，而团聚则会造成固定化后的酶相互间重叠，有效活性表面积下降，从而限制了酶膜敏感度的充分提高。

为了得到单分散的粒径均匀的纳米颗粒，在制备过程中选用合适的模板和稳定剂是一种有效的方法。树状大分子的尺寸均一，其大小可通过生长的代数来控制，尺度在几纳米的范围内，因此是制备纳米颗粒的一种良好模板。近年来，美国的Crooks等人采用了一种新型的用树状大分子为模板制备单分散的过渡金属纳米簇的方法。具体做法是：利用树状大分子聚酰胺-胺(PAMAM)内部的氨基先与过渡金属离子络合，将过渡金属捕获在树状大分子中，再加入过量的还原剂将金属离子还原成零价金属，即可生成树形高分子封装的纳米金属簇，粒径一般在5nm以内。但封装后生成的纳米金属颗粒/树状大分子复合物被用作有机合成的催化剂，未涉及生物酶电极。

同时，树状大分子本身也是一种纳米颗粒，将它组装在传感器上，在一定程度上也可提高传感器的灵敏度。欧洲专利EP 1278061 A1(2001)公开了一种由纳米颗粒/树状大分子复合物构成的化学传感器。纳米颗粒间通过功能化的树形大分子连接而呈网状排布，树形大分子分枝可作为选择性门户，能够有效摄取被分析物质的分子，提高传感器的灵敏度。并且树形高分子表面富集的官能团还为传感器的化学选择性提供了可能。但在此发明中，纳米颗粒是存在于树状大分子间，团簇粒径大，同时此发明也未涉及酶生物传感器。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提出一种树形大分子封装金属纳米粒子与酶自组装形成多层膜传感界面的纳米生物酶电极；并公开其制备方法。

本发明的技术方案为：

本发明的纳米生物酶电极是一种含有由树状大分子封装金属纳米粒子/酶通过自组装形成的多层膜传感界面的生物传感器，其特征在于，所述的纳米生物酶电极包括电极，吸附在电极表面的、内部封装有金属纳米粒子的树状大分子和酶形成的多层传感膜。

所说的电极包括碳、铂、银、或金的电极；

所说的树状大分子是指具有树枝状结构的不同代数的高分子聚合物，可以包括1-7代的聚酰胺-胺(PAMAM)，1-7代的聚丙烯亚胺(PPI)，最合适的是5代的PAMAM。

所说的纳米金属颗粒是指过渡金属，如铜，铂，钯，金，银等单金属纳米颗粒或它们的混合物双金属纳米颗粒。纳米颗粒封装在树状大分子内部的空腔中，粒径在0.5～5nm。每克树状大分子含有1.3～2.2mmol的纳米金属颗粒(1克分子量为18000的G5.0树状大分子，与金属的物质量的比是1∶25～1∶40)。

所说的酶选用葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、辣根过氧化氢酶、胆固醇氧化酶、黄嘌呤氧化酶、乙酰胆碱酯酶、有机磷水解酶中的一种或几种。

所说的树状大分子封装的金属纳米粒子和酶形成的多层传感膜是由一层酶一层为封装有纳米金属颗粒的树状大分子交替构成序列层。例如ABABAB，其中A为酶，B为封装有纳米金属颗粒的树状大分子。序列层数并不受限制，酶的有效吸附量逐层增加以提高传感器的灵敏度，所以传感器的灵敏度可以控制组装层数进行调节。也可选用两种不同种类的酶，依照相同的方法，构建例如ABCBAB的有序列层，其中A，C为酶，B为封装有纳米金属颗粒的树状大分子。或依次类推，生成不同排列的有序列层。成膜的方法是利用静电自组装技术，层与层之间靠静电引力成膜。控制工艺条件，使得树状大分子封装的金属纳米粒子和氧化酶带有不同的电荷，如在溶液环境在pH值为6.8，葡萄糖氧化酶一般是带负电荷的，而金属纳米粒子/树状大分子复合物则是带正电荷的。

上述的超灵敏纳米生物酶电极的制备方法包括如下步骤：

1)不同代数的树状大分子的制备：

采用发散法合成树状大分子，如聚酰胺-胺树形高分子PAMAM是由乙二胺和丙烯酸甲酯通过Michael加成反应和酰胺化反应交替进行，每完成一次完整的Michael加成反应和酰胺化反应，则树状大分子增加一代。

将整代的PAMAM(初始为乙二胺)用无水甲醇溶解，并通氮气除氧后，在-40℃～0℃下，最好是-30℃，滴加丙烯酸甲酯，反应12～96小时后，减压蒸馏，得到无色或淡黄色浆状粘稠液，即得到半代的树状大分子PAMAM。

将乙二胺用无水甲醇溶解，通氮气除氧，在-40℃～0℃下，最好是-30℃，滴加半代PAMAM溶液。低温反应12～96小时后，将体系升至室温，继续反应12～96小时后，对其减压蒸馏(加入几滴正丁醇作为过量乙二胺的共沸剂)，得到无色或淡黄色浆状粘稠液，即得到整代的树状大分子PAMAM。

2)树状大分子中纳米单金属颗粒的封装：

将步骤1)得到的树状大分子(如PAMAM)的水溶液，浓度为0.5～50μM，与含有一定浓度的金属离子(如铜)的水溶液，浓度为1×10^-6～5×10^-1M，最好是0.1M，按一定的化学计量比(1∶12～64)混合，用弱酸，如柠檬酸，调节溶液的pH值在3～5间，使得金属离子与树状大分子内部的胺基络合。再加入过量的还原剂，如水合肼、硼氢化钠等，浓度为0.1～0.5M，最好是0.3M，还原树状大分子中的金属盐离子，即可制得封装以有纳米零价金属的树状大分子复合物。树状大分子的粒径一般为几个纳米，封装在树状大分子内的零价金属的粒径小于树状大分子的粒径，因此也是几个纳米。一般四代的PAMAM封装的铂纳米颗粒的粒径在0.5～4nm。

树状大分子中双金属颗粒的封装工艺基本同这一步骤，只是将与树状大分子混合的金属离子溶液换成双金属离子的混合溶液，如铂和钯的二价离子的混合溶液，再经过络合、还原步骤进行封装。双金属离子间的化学计量比为1∶0.1～10，最好是1∶3。

3)树状大分子封装的金属纳米粒子和酶形成的多层传感膜的制备：

树状大分子封装的金属纳米粒子和酶形成的多层传感膜的制备是在碳、铂、金或银的电极上进行的。先用铝粉打磨铂电极的下端部分，用体积比1∶3的硝酸与盐酸的混合液加热后，清洗电极表面，再放在乙醇，丙酮和氯仿的混合溶液超声清洗电极，随后用蒸馏水超声冲洗，洁净电极表面，再将金属电极在2％氢氧化钾的水溶液中超声20分钟，使金属电极表面带上负电荷。

在电极表面吸附树状大分子封装的金属纳米粒子和酶形成的多层传感膜的过程：

i)将步骤2)得到的封装有纳米金属的树状大分子复合物配制成水溶液，纳米金属复合物浓度为2mg/mL，酶溶解在0.1M的缓冲液中，浓度调节在5～10mg/mL，得到封装有纳米金属的树状大分子复合物水溶液A和氧化酶水溶液B。

ii)将洁净后的铂电极竖直浸泡在封装有纳米金属的树状大分子复合物的水溶液A中，水溶液的高度必须高于电极的洁净表面处。室温下吸附5～60min，最好是10～30min，在铂电极表面形成一层封装有纳米金属的树状大分子复合物膜。然后将铂电极小心从吸附液中取出，用去离子水反复冲洗3～5遍氮气吹干。

iii)将步骤ii)中得到的表面已有一层封装有纳米金属的树状大分子复合物膜的铂电极再插入到氧化酶溶液B中，并按步骤ii)接下来的操作再进行一次。用于吸附的氧化酶的量必须大于在封装有纳米金属的树状大分子复合物膜表面吸附一个单分子层的量。

iv)将步骤iii)中得到铂电极再插入到溶液A中，并按步骤ii)接下来的操作再进行一次。如此循环多次，得到表面组装有由树状大分子封装的金属纳米粒子和酶形成的多层传感膜的纳米生物酶电极。

4)超灵敏的纳米生物酶电极用于酶生物传感器

以步骤3)得到的表面含有树状大分子封装的金属纳米粒子和酶，如葡萄糖氧化酶，形成的多层传感膜的铂电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极或甘汞电极作为参比电极，组成酶生物传感器，如葡萄糖氧化酶生物传感器。将酶生物传感器的三电极置于pH值为6～7的磷酸盐缓冲溶液中，测定其响应电流值，对应于响应的检测组分浓度，如葡萄糖浓度，做出电极电流响应曲线。

本发明的优点及效果

上述制得的纳米生物酶电极具有如下特点：(1)选用了结构完整、粒径均匀的纳米级树状大分子作为模板制备零价纳米金属颗粒，得到的纳米颗粒尺寸比较均匀，单分散性能更好；同时纳米颗粒由于空间效应被封装在树状大分子内部，仍然保持其活性；并且树状大分子的分支可作为选择性门户，小分子仍可接近被封装的纳米颗粒；(2)树状大分子表面富集的官能团使得封装了纳米金属颗粒的复合物的表面改性及与其他物质的连接更加简单易行；(3)在铂电极表面形成含有分散性好，粒径在0.5～5nm的纳米金属颗粒的多层膜，纳米金属颗粒与酶的组装有序排列，纳米粒子的宏观量子隧道效应，可缩短响应时间，提高酶传感器的感应度，使酶传感器的响应电流成数量级地提高；并可拓宽生物传感器测量的线性范围；(4)采用静电自组装的方法制备由树状大分子封装的金属纳米粒子和酶形成的多层传感膜固定化酶，通过增加组装层数可提高生物酶电极中被固定化酶的量，延长了生物酶电极使用寿命，酶膜置冰箱0～4℃可保存一年以上；

(5)在铂电极表面制备由树状大分子封装的金属纳米粒子和酶形成的多层传感膜时，可根据不同的应用需求选用不同种类的氧化酶，制得多样化的超灵敏的纳米生物酶电极。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步阐明本发明的内容，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。

实施例1

步骤(1)将20g 乙二胺溶解于100mL甲醇中，搅拌，通氮气15min，在-30℃下用恒流泵滴加1.36mol的丙烯酸甲酯，低温下反应48h后，将温度升到室温(20℃)让其熟化48h。反应完全后，在低于45℃，0.1MPa下减压蒸馏除去溶剂甲醇和过量的丙烯酸甲酯，得到0.5G PAMAM。

将上述的25mmol的0.5G PAMAM溶于100mL甲醇中，用恒流泵滴加含200mmol的乙二胺甲醇溶液中，48h低温反应后，再加48h室温反应。同样待反应完全后，在低于45℃，0.1MPa下减压蒸馏，同时加入正丁醇与乙二胺组成共沸混合物后除去，得到1G PAMAM。

重复上述合成过程，可得到从0.5G到7G的不同代数的半代或整代PAMAM树状大分子。

将步骤(1)制备的5代树状大分子PAMAM配制成50μM的水溶液，用弱酸，如柠檬酸，调节溶液的pH值为5。量取20mL 5代PAMAM树状大分子水溶液倒入50mL的小烧杯中。

步骤(2)加入浓度为0.1M的K₂PtCl₄水溶液，树状大分子PAMAM与K₂PtCl₄的摩尔比为1∶30。搅拌，室温下反应72小时。

步骤(3)再加入相比较K₂PtCl₄的量20倍过量的，浓度为0.3M的还原剂NaBH₄水溶液，用0.1M的盐酸调节溶液的pH值至8，将络合在树状大分子中金属离子还原成零价纳米颗粒。还原反应迅速发生，然后将溶液倒入透析袋中，在大量水环境中透析24小时，其间经多次换水。得到内部封装了纳米金属颗粒的树状大分子PAMAM的复合物。将此复合物配制成2mg/mL的水溶液，放置在50mL的小烧杯中。

步骤(4)将洁净后的铂电极竖直浸泡在装有5mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液的50mL小烧杯中，溶液的高度必须高于电极的洁净表面处。室温下吸附30min，在铂电极表面形成一层葡萄糖氧化酶的膜。然后将铂电极小心从吸附液中取出，用磷酸盐缓冲液反复冲洗3～5遍。

步骤(5)将步骤(4)中得到的表面有一层葡萄糖氧化酶膜的铂电极插入到含有步骤(3)中得到的封装有纳米金属的树状大分子复合物的水溶液中，并按步骤(4)接下来的操作再进行一次，吸附时间为20min。

不断重复步骤(4)、(5)，最后得到表面组装有由树状大分子封装的金属纳米粒子和酶形成的三个复层的传感膜的纳米生物酶电极。

步骤(6)将得到的表面含有树状大分子封装的金属Pt纳米粒子和葡萄糖氧化酶形成的多层传感膜的铂电极为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，组成葡萄糖氧化酶生物传感器。将酶生物传感器的三电极置于pH值为6～7的磷酸盐缓冲溶液中，扫描速率为50mV/S，电压为0.6，实验温度25℃。底液中葡萄糖浓度为1mM时，电极的灵敏度为450μA/mM·cm²，比未进行增强的空白酶电极的灵敏度提高了750倍，在葡萄糖溶液浓度为5μM～7.5mM的范围内呈线性变化，响应时间在5秒以内。

实施例2

用体积比为3∶1的0.1M的K₂PtCl₄和0.1M的K₂PdCl₄混合溶液取代实施例1步骤(2)中的0.1M的K₂PtCl₄水溶液，重复实施例1中的各个步骤，最后得到表面含有树状大分子封装的双金属Pt/Pd纳米粒子和葡萄糖氧化酶形成的多层传感膜的铂电极，并用于葡萄糖氧化酶传感器的检测。在相同的工艺条件下，测得底液中葡萄糖浓度为1mM时，电极的灵敏度为720μA/mM·cm²，比未进行增强的空白酶电极的灵敏度提高了1200倍。

实施例3

用过氧化氢酶取代实施例1步骤(4)中的葡萄糖氧化酶，用过氧化氢取代底液中的葡萄糖，重复实施例1中的各个步骤，最后得到表面含有树状大分子封装的单金属Pt纳米粒子和过氧化氢酶形成的多层传感膜的铂电极，并用于过氧化氢的检测。在相同的工艺条件下，测得底液中过氧化氢浓度为1mM时，电极的灵敏度为480μA/mM·cm²，比未进行增强的空白酶电极的灵敏度(1.1μA/mM·cm²)提高了430倍。

对比例

取相同活力单位和相同量的葡萄糖氧化酶溶液5mg/mL，利用重量百分比浓度为10％的戊二醛2mL进行交联处理，涂抹在洁净的铂电极表面，用于葡萄糖的检测。在相同的工艺条件下，灵敏度仅为0.6μA/mM·cm²。

Claims

1.一种纳米生物酶电极，其特征在于，所述的纳米生物酶电极包括电极，以及吸附在电极表面的、内部封装有金属纳米颗粒的树状大分子和酶形成的多层传感膜；

所说的电极包括碳、铂、银、金电极中的一种；

所说的树状大分子是指具有树枝状结构的不同代数的高分子聚合物，包括1-7代的聚酰胺-胺，1-7代的聚丙烯亚胺；

所说的纳米金属颗粒指过渡金属中的单金属纳米颗粒或它们的混合物双金属纳米颗粒，纳米颗粒封装在树状大分子内部的空腔中，粒径在0.5-5nm，每克树状大分子含有1.3～2.2mmol的纳米金属颗粒；

2.如权利要求1所述的纳米生物酶电极，其特征在于，所说的多层传感膜是由一层酶和一层封装有纳米金属颗粒的树状大分子交替构成序列层，其序列层数并不受限制。

3.如权利要求2所述的纳米生物酶电极，其特征在于，所说的构成多层传感膜的酶是单一酶。

4.如权利要求2所述的纳米生物酶电极，其特征在于，所说的构成多层传感膜的酶是一种以上的酶。

5.如权利要求1所述的纳米生物酶电极，其特征在于，所说的树状大分子为5代的聚酰胺-胺。