CN105334254B - 一种基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极制备方法 - Google Patents

一种基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极制备方法。以Pt电极为基底电极，通过吸附法将葡萄糖氧化酶固定在电极表面，然后再在电极表面生长金来加固葡萄糖氧化酶在电极表面的固定。本发明有效的解决了生物分子与固体表面结合力弱，易泄露或解脱，稳定性差等问题，而且纳米金具有良好的生物相容性且导电性好，对氧化还原反应具有较强的催化活性，加速酶的再生速度,提高葡萄糖氧化酶电极的响应灵敏度。该制备方法简单，重现性好，抗干扰能力强，具有很高的实用价值，特别是在电化学方面有很好的应用前景。

Description

一种基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极制备方法
技术领域
本发明属于葡萄糖氧化酶电极制备技术领域，特别涉及一种基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极制备方法。
背景技术
纳米材料当今科学研究的热点。纳米材料是指三维空间中至少有一维处于纳米尺度(1-100nm)范围内的材料或由它们作为基本单元组装而成的结构材料，包括金属、氧化物、无机化合物和有机化合物等。该尺寸处在原子、分子为代表的微观世界和宏观物体交界的过渡区域(介观体系)，处于该尺寸的材料表现出许多既不同于微观粒子又不同于宏观物体的特性纳米材料具有高比表面积，高催化活性特殊的理化性质及超微小性等特征使其在电化学催化中的应用有广泛的前景。
另外，葡萄糖氧化酶电极是问世最早的生物传感器，以其为代表的酶电极也是生物传感器领域的研究热点。酶电极的制备的关键技术就是酶的固定化，即在电极表面覆着一层敏感膜，膜的厚度、致密性、均匀度与分子排列的有序性等因素对酶电极的性能也有一定的影响。但由于生物分子与固体表面结合力弱，易泄露或解脱，稳定性差等原因，使得葡萄糖氧化酶电极的实用性减弱，其灵敏度、检测范围、响应时间、抗干扰能力较差、使用寿命等方面都有待进一步改进，为此需要进一步加固电极表面的葡萄糖氧化酶膜，提高酶电极的性能。
催化生成Au纳米微粒在生物传感器中的应用，是利用Au纳米微粒的催化作用。在GOx酶反应中，金纳米微粒能够迅速从被还原的GOx(FADH2)获得电子而使GOx重新具有氧化性，加速酶的再生速度，提高酶电极的响应灵敏度。另外纳米金具有良好的生物相容性且导电性好，故可加速GOx与电极间的电子传递，改善酶电极的性能。即测定葡萄糖时的催化反应：
GOx(FADH2)+O2→GOx(FAD2 +)+H2O2 (2)
Glucose+GOx(FAD)→GOx(FADH2)+Gluconic acid (3)
HAuCl4+H2O2→Au+HCl+O2 (4)
发明内容
本发明的目的是提供一种基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极制备方法。
具体步骤为：
(1)用α-氧化铝抛光粉打磨Pt电极至镜面，然后用二次水冲洗，接着用蒸馏水超声清洗3分钟，然后用1mmol/L的铁氰化钾溶液作底液，循环伏安法扫描电极，扫描电位范围为-0.2～0.6V，当△Ep＝Ep1-Ep2≤0.08V，即制得备用Pt电极。
(2)取5μL浓度为10～30mg/mL葡萄糖氧化酶滴到步骤(1)制备的备用Pt电极表面，自然凉干，然后放进冰箱4～8小时，以使葡萄糖氧化酶黏合紧密，制得葡萄糖氧化酶修饰的电极。
(3)取250μL pH值为6～7的PBS溶液和50μL质量百分比浓度为1％的HAuCl4水溶液，两者混匀，接着加50μL十六烷基三甲基氯化铵和500μL浓度为0.01mol/L的葡萄糖，最后加H2O定溶至5ml，即配制得金生长溶液。
(4)取5μL步骤(3)配制的金生长溶液滴到步骤(2)制得的葡萄糖氧化酶修饰的Pt电极上，凉干后再补滴5μL，重复上述操作5次，然后用二次水冲洗电极，凉干，即制得基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极。
所述α-氧化铝抛光粉的中位粒径为d50＝30～50nm。
所述PBS溶液为0.2mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液。
本发明方法的优点如下：
(1)本发明方法能够制得具有较好的稳定性和重复性，抗干扰能力强，灵敏度高，且工艺简单、成本低，具有很高的实用价值的葡萄糖氧化酶电极，适用于食品或医学卫生等领域中低浓度葡萄糖的检测，具有很高的实用价值，特别是在电化学方面有很好的应用前景。
(2)本发明方法能有效地对电极上的葡萄糖氧化酶进行固定化，解决了由于生物分子与固体表面结合力弱，易泄露或解脱等问题，使电极具有更好的稳定性和重现性。金纳米微粒具有良好的生物相容性，不会破坏酶的结构及活性，且其导电性好，可加速葡萄糖氧化酶与溶液间的电子传递,改善酶电极的性能。
(3)金纳米微粒对氧化还原反应具有较强的催化活性，在电极反应中，纳米金粒子能迅速从被还原葡萄糖氧化酶获得电子而使得葡萄糖氧化酶重新具有氧化性，加速酶的再生速度,提高酶电极的响应灵敏度。
(4)本发明方法只有简单的吸附法和滴除法两个步骤，其制备工艺简单快捷，且成本低廉。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极对不同葡萄糖浓度响应的循环伏安法扫描结果图。
图2是本发明实施例1制备的基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极对不同葡萄糖浓度响应的电流-时间曲线扫描结果图。
图3是本发明实施例1制备的基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极对不同葡萄糖浓度响应的线性关系图，其中葡萄糖浓度为横坐标，电流-时间曲线的电流值(取30～240s之间每30s内电流的平均值)为纵坐标。
图4是对比例1处理好的裸Pt电极对不同葡萄糖浓度响应的循环伏安法扫描结果图。
图5是对比例1处理好的裸Pt电极对不同葡萄糖浓度响应的电流-时间曲线扫描结果图。
图6是对比例2制备的镀铂Pt电极对不同葡萄糖浓度响应的循环伏安法扫描结果图。
图7是对比例2制备的镀铂Pt电极对不同葡萄糖浓度响应的电流-时间曲线扫描结果图。
图8是对比例3制备的Au电极对不同葡萄糖浓度响应的循环伏安法扫描结果图。
图9是对比例3制备的Au电极对不同葡萄糖浓度响应的电流-时间曲线扫描结果图。
具体实施方式
实施例
本实施例用于说明本发明基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极的制备方法及其对葡萄糖的测定性能。
(1)用α-氧化铝抛光粉打磨Pt电极至镜面，然后用二次水冲洗，接着用蒸馏水超声清洗3分钟，然后用1mmol/L的铁氰化钾溶液作底液，循环伏安法扫描电极，扫描电位范围为-0.2～0.6V，当△Ep＝Ep1-Ep2＝0.08V，即制得备用Pt电极。
(2)取5μL浓度为20mg/mL葡萄糖氧化酶滴到步骤(1)制备的备用Pt电极表面，自然凉干，然后放进冰箱6小时，以使葡萄糖氧化酶黏合紧密，制得葡萄糖氧化酶修饰的电极。
(3)取250μL pH值为6.5的PBS溶液和50μL质量百分比浓度为1％的HAuCl4水溶液，两者混匀，接着加50μL十六烷基三甲基氯化铵和500μL浓度为0.01mol/L的葡萄糖，最后加H2O定溶至5ml，即配制得金生长溶液。
(4)取5μL步骤(3)配制的金生长溶液滴到步骤(2)制得的葡萄糖氧化酶修饰的Pt电极上，凉干后再补滴5μL，重复上述操作5次，然后用二次水冲洗电极，凉干，即制得基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极。
所述α-氧化铝抛光粉的中位粒径为d50＝40nm。
所述PBS溶液为0.2mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液。
以本实施例制得的酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极为工作电极，取5ml pH值为6.5的PBS溶液作底液，用循环伏安法扫描作空白(参数设定：电位：0～0.8V扫描速度：0.1灵敏度：1.e-005)，然后逐次往底液滴加100μL葡萄糖(0.01mol/L)，并且各用循环伏安法扫描一次，至加到500μL葡萄糖为止，结果见图1、2和3。
以本实施例制得的酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极为工作电极，取20mlpH值为6.5的PBS溶液置于放有搅拌子的烧杯中作底液，放到DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器上，打开开关并设置适当的搅拌速度，用电流-时间曲线扫描(参数设定初始电位0.5V采样间隔：0.1s实验时间：240s灵敏度：1.e-006)，
每30秒滴加50μL葡萄糖，共滴加7次，结果见图1、2和3，可见本发明制备的基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极对葡萄糖有良好的响应，在一定的葡萄糖浓度范围内，随着浓度的增大，电流响应越大。说明基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶修饰电极是可用的。
对比例1：
该对比例用于检测裸Pt电极对葡萄糖的测定性能。
用α-氧化铝抛光粉磨电极至镜面，然后用二次水冲洗，接着用蒸馏水超声清洗约3分钟。再接着用铁氰化钾溶液作底液，循环伏安法(电位-0.2～0.6V)扫描电极，若△Ep＝Ep1-Ep2＝0.08V即可用。
以处理好的裸Pt电极做工作电极，然后按实施例1的方法对葡萄糖进行测定，结果如图4和图5。
对比例2：
该对比例用于检测镀铂的Pt电极对葡萄糖的测定性能。
(1)用α-氧化铝抛光粉磨电极至镜面，然后用二次水冲洗，接着用蒸馏水超声清洗约3分钟。再接着用铁氰化钾溶液作底液，循环伏安法(电位-0.2～0.6V)扫描电极，若△Ep＝Ep1-Ep2＝0.08V即可用。
(2)给预处理好的Pt电极镀铂：1ml H2PtCl6(1mM)+4ml PBS(pH＝6.5)＝5ml作底液，用循环伏安法扫描(参数设置：电位：-0.9～0.1V扫速：0.05段数：20灵敏度：1.e-004)
以本对比例的镀铂Pt电极做工作电极，然后按实施例1的方法对葡萄糖进行测定，结果如图6和图7。
由图4、5、6和7可见，机械抛光的裸Pt电极和新镀铂膜的Pt电极对葡萄糖检测都无响应，即说明了没有酶的电极对葡萄糖检测无响应。进一步证明了通过本发明酶电极制备方法制得的基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极，已经将酶很好的固定到电极表面上，而使电极具有良好响应灵敏度。
对比例3：
该对比例以Au电极做基底电极，制备酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极及检测其对葡萄糖的测定性能。
(1)用α-氧化铝抛光粉磨Au电极至镜面，然后用二次水冲洗，接着用蒸馏水超声清洗约3分钟。再接着用铁氰化钾溶液作底液，循环伏安法(电位-0.2～0.6V)扫描电极，若△Ep＝Ep1-Ep2＝0.08V即可待用。
(2)按实施例1酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶修饰Pt制备步骤对Au电极进行制备，然后再按实施例1的方法对葡萄糖进行测定，结果如图8和图9。
由图8和图9可见，Au电极对葡萄糖虽有响应，但其响应很差，其响应结果不如Pt电极好，所以本发明采用了Pt电极作为基底电极。

Claims (1)

1.一种基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极制备方法，其特征在于具体步骤为：
(1)用α-氧化铝抛光粉打磨Pt电极至镜面，然后用二次水冲洗，接着用蒸馏水超声清洗3分钟，然后用1mmol/L的铁氰化钾溶液作底液，循环伏安法扫描电极，扫描电位范围为-0.2~0.6 V，当△Ep=Ep1-Ep2≤0.08 V，即制得备用Pt电极；
(2)取5μL浓度为10~30 mg/mL葡萄糖氧化酶滴到步骤(1)制备的备用Pt电极表面，自然凉干，然后放进冰箱4~8小时，以使葡萄糖氧化酶黏合紧密，制得葡萄糖氧化酶修饰的电极；
(3)取250μL pH值为6~7的 PBS溶液和50 μL 质量百分比浓度为1%的HAuCl4 水溶液，两者混匀，接着加50μL 十六烷基三甲基氯化铵和500 μL浓度为0.01 mol/L的葡萄糖，最后加H2O定溶至5 ml，即配制得金生长溶液；
(4)取5μL步骤(3)配制的金生长溶液滴到步骤(2)制得的葡萄糖氧化酶修饰的Pt电极上，凉干后再补滴5μL，重复上述操作5次，然后用二次水冲洗电极，凉干，即制得基于酶催化还原氯金酸的葡萄糖氧化酶电极；
所述α-氧化铝抛光粉的中位粒径为d50=30~50nm；
所述PBS溶液为0.2 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液。
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Assignee: Guangxi Branch of Chinalco Great Wall Testing Technology Co.,Ltd.

Assignor: GUILIN University OF TECHNOLOGY

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Denomination of invention: Preparation of glucose oxidase electrode based on enzyme catalyzed reduction of chloroauric acid

Granted publication date: 20180410

License type: Common License

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