CN102608189A

CN102608189A - 一种纳米磁性四氧化三铁修饰的免疫传感器的制备方法

Info

Publication number: CN102608189A
Application number: CN2012100888502A
Authority: CN
Inventors: 孙霞; 李青青; 王相友; 刘君峰; 杜淑媛
Original assignee: Shandong University of Technology
Current assignee: Shandong University of Technology
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2032-03-30
Also published as: CN102608189B

Abstract

本发明涉及一种纳米磁性四氧化三铁修饰的免疫传感器的制备方法，其特征在于：敏感界面的组成为纳米金(GNPs)1%、纳米复合膜（功能化多壁碳-壳聚糖溶液-纳米四氧化三铁FCNTs-CS-Fe₃O₄）、农药抗体5μg/mL、BSA2.5%。依次将上述材料固定在免疫传感器表面后，因为纳米金晶体、功能化多壁碳、纳米四氧化三铁溶液能增大电子的转移，进而增大免疫传感器的相应，提高传感器的灵敏度；功能化多壁碳和壳聚糖有良好的成膜性并具有丰富的基团，可以增大与传感器表面和生物的结合度进而提高传感器的灵敏度和稳定性；BSA的封闭作用可以增大传感器的特异性和稳定性，从而可以制备高稳定性、高灵敏度、选择性好、长寿命的免疫传感器。

Description

一种纳米磁性四氧化三铁修饰的免疫传感器的制备方法

本发明提供一种纳米磁性四氧化三铁修饰的免疫传感器的制备方法，属于构建免疫传感器技术领域。

背景技术

免疫传感器的关键是敏感界面的构建，因为其直接影响生物分子的固定化、传感器的稳定性、灵敏度和选择性等主要性能。生物分子的固定化可以分为生物分子的固定化材料和生物分子的固定化技术，固定化材料和固定化技术既要保持生物活性单元的固有特性和生物活性，又要避免生物自由活性单元应用上的缺陷，因此它们是生物传感器制备过程中的关键性因素。生物分子的固定化材料主要包括溶胶—凝胶、有机导电聚合物、生物材料及纳米材料、表面活性剂等，但是单独使用一种材料往往不能满足所构建的免疫传感器的高稳定性、选择性和灵敏度等主要性能。因此，制备稳定的、与生物分子高结合度的和可保持生物分子活性的纳米复合膜和其他材料组合构建的免疫传感器敏感界面，以制备高稳定性、高灵敏度和选择性好的免疫传感器成为免疫传感器技术发展的主要方向。

目前关于免疫传感器敏感界面的制备方法有多种，进而固定化方法多种多样，常用的免疫蛋白分子的固载方法主要有：吸附法、包埋法、共价键合法、定向固定法和层层自组装法。但是这些方法中都存在一定的缺陷，如基于高分子膜、无机多孔材料、聚电解质等作为固载的吸附法，存在容易脱落，对溶液pH值、温度、离子强度和换能器表面状况较为敏感等缺点；直接将免疫分子与高分子溶剂，如聚氯乙烯(PVC)、聚碳酸酷、醋酸纤维、Nafion等合成的高聚物及海藻酸、明胶、壳聚糖等天然的溶胶状高聚物，混合得到包覆了免疫分子复合膜的包埋法实验条件温和，操作较简单，但是对被测免疫蛋白与包埋蛋白的免疫结合增加了空间位阻，同时也不利于底物与产物的扩散；通过自发的化学吸附作用或键合作用的层层自组装方法在传感器界面形成二维有序单层膜操作简便，具有良好的稳定性、有序性，但对自组装分子结构有限制，且容易受到杂质吸附、分子聚合、溶剂选择、基片表面物理性质的影响。上述方法的缺陷都会对制备的免疫传感器的灵敏度、稳定性、选择性和使用寿命造成影响。

发明的目的在于提供一种能克服上述各种固定方法的缺陷，可构建出高灵敏度、高选择性、低成本、长寿命和可重复利用的免疫传感器的敏感界面的制备方法。

其技术方案为：一种纳米磁性四氧化三铁修饰的免疫传感器的制备方法，其特征在于：免疫传感器的敏感界面组成为纳米金(GNPs)、由功能化多壁碳、纳米四氧化三铁、壳聚糖制作的纳米复合膜和BSA。

所述的一种纳米磁性四氧化三铁修饰的免疫传感器的制备方法，其特征在于： HAuCl₄其浓度为2 mg/mL，BSA的浓度为2.5％。

所述的一种纳米磁性四氧化三铁修饰的免疫传感器的制备方法，其特征在于：纳米复合膜的组成功能化多壁碳（FCNTs）1mg/mL、酰基化壳聚糖（CS）3mg/mL、纳米四氧化三铁1.5mg/mL。

其制备原理为：本发明制备的免疫传感器敏感界面可以兼顾保持免疫传感器表面固定的单克隆抗体蛋白的生物活性与固载后的稳定性。本发明采用的纳米金（GNPs）晶体具有扩大电极比表面积和增大纳米复合膜固定量的功能，同时能使得修饰电极表面吸附大量抗体，提供和自然相似的微环境并保持固定分子的生物活性。功能化多壁碳纳米管（FCNTs）具有极高的化学稳定性、良好的传递电子性能以及催化活性表面的功能，被用于免疫传感器敏感界面的制作。壳聚糖（CS）属多糖类, 它具有优异的成膜性、吸附性、透气性和渗透性，成膜后具有很好的吸附性、稳定性和良好的生物相容性，其丰富的氨基、多孔性结构使它被广泛用于生物分子的固定和修饰电极的制备。纳米磁性四氧化三铁具有良好的生物相容性，非常好的超顺磁性，低毒性，简便的制备过程等优点，并能为生物分子的固定提供良好的生物微环境在分析应用领域它能够用来新建，重建并且分离敏感膜，此外纳米磁性四氧化三铁能够保持酶的活性达三个月之久，而抗体和酶同属于蛋白质，因此可以将其应用到免疫传感器的制备中。作者将功能化多壁碳、壳聚糖与纳米四氧化三铁同时复合制成纳米复合膜，不但增大了传感器的电流响应以增大检测精度，更获得了具有大量氨基的共沉积膜，可以更好地结合抗体，使抗体与农药特异性结合端暴露在表面上，最后BSA对非特异性位点的封闭进一步增大检测精度，以研发性能优异的电化学生物传感器。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种纳米磁性四氧化三铁修饰的免疫传感器的制备方法，其特征在于：⑴快速称取0.1g氯金酸固体，溶于9.9g去离子水中，制得1%的氯金酸溶液备用；⑵称取2.5g BSA，加入97.5mL去离子水，搅拌至完全溶解制成2.5%的BSA溶液。将全部溶液放入冰箱里4℃保存备用。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种纳米磁性四氧化三铁修饰的免疫传感器的制备方法，其特征在于：⑴壳聚糖-纳米四氧化三铁-功能化多壁碳纳米复合膜的制备：称取30mg壳聚糖（CS），溶于10mL含有1.0%的醋酸溶液，混合液连续搅拌30min，使壳聚糖完全溶解。然后取2mL壳聚糖溶胶，加入2mg纳米四氧化三铁和3mg功能化的多壁碳超声80分钟，得到黑色胶质液。

　本发明采用纳米金较高的比表面积、稳定性和导电性可以增大电极表面电子的转移和生物相容性，进而增大免疫传感器的响应电流；由功能化多壁碳、壳聚糖与纳米四氧化三铁复合制成纳米复合膜，与传统方法相比不但增大了传感器的电流响应以增大检测精度，可以更好地结合克百威单克隆抗体，使抗体与农药特异性结合端暴露在表面上，最后BSA对非特异性位点的封闭进一步增大检测精度。

具体实施方式

实施例：快速称取0.1g氯金酸固体，溶于9.9g去离子水中，制得1%的氯金酸溶液，电沉积在电极上，然后用PH=7.4的PBS缓冲液冲洗表面，氮气吹干；取10μL上述由功能化多壁碳、壳聚糖溶液、纳米四氧化三铁制备好的纳米复合膜滴涂在固定过纳米金的电极表面，常温下静置1.5h，然后用PH=7.4的PBS缓冲液冲洗表面，氮气吹干；将制备好的电极浸入农药抗体中在4℃下浸泡8h，取出用PH=7.4的PBS缓冲液冲洗掉多余的液体，氮气吹干；将上述制备好的电极最后浸入2.5%的BSA溶液中37℃下静置1h，以封闭电极上非特异性结合位点，取出置于室温下晾干，免疫传感器的敏感界面制作完成，保存在4℃条件下备用。使用此敏感界面制作的免疫传感器灵敏度、选择性较高，其稳定性性和再生性良好。

此制备方法操作工艺简单，成本较低，能提高免疫传感器的灵敏度、选择性等，符合我国免疫传感器制备方法发展和国际化的要求。

Claims

1.一种纳米磁性四氧化三铁修饰的免疫传感器的制备方法，其特征在于：免疫传感器的敏感界面组成为纳米金(GNPs)、由功能化多壁碳、普鲁士蓝、壳聚糖制作的三维纳米复合膜（功能化多壁碳-壳聚糖溶液-纳米四氧化三铁FCNTs-CS-Fe₃O₄）、和BSA。

2.如权利要求1所述的一种纳米磁性四氧化三铁修饰的免疫传感器的制备方法，其特征在于：纳米金(GNPs)其浓度为1%，BSA的浓度为2.5％。

3.如权利要求1所述的一种纳米磁性四氧化三铁修饰的免疫传感器的制备方法，其特征在于：三维纳米复合膜的组成：功能化多壁碳（MWNTs）1.5mg/mL、酰基化壳聚糖（CS）3mg/mL、纳米四氧化三铁（Fe₃O₄）1 mg/mL。