CN100351384C - 一种以贾第鞭毛虫病毒作基因表达载体的真核表达系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种以贾第鞭毛虫病毒作基因表达载体的真核表达系统，利用贾第鞭毛虫(Giardia)dsRNA病毒(virus)作为基因转染载体，采用DNA转染方式的真核表达系统和以RNA转染方式的真核表达系统两种。蓝氏贾第虫病毒基因组小(6273bp)，稳定，易纯化，能在体外有效地感染贾第虫滋养体，且具有较小的细胞毒性，贾第虫病毒基因复制的拷母数多，而且其病毒的衣壳蛋白是在贾第虫体内合成的优势蛋白。贾第虫为真核生物，外源基因在贾第虫体内表达出的蛋白具有活性。贾第虫在体外易培养，随着贾第虫的传代培养，外源基因可无限制地在体外大量制备。克服现用真核基因表达系统表达效率低，易出现基因污染等问题。
Description
技术领域：
本发明提供一种以贾第鞭毛虫dsRNA病毒作基因表达载体的真核表达系统，属于基因工程技术领域。
背景技术：
基因工程的最终目的是在一个合适的系统中使外源基因高效表达，从而生产有重要价值的蛋白质产品。基因工程的表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。而要进行外源基因在原核或真核细胞中表达首先必须构建基因表达载体。现在使用的原核表达载体很多，如非融合型表达蛋白载体PKK223-3，分泌型克隆表达载体PINIII和融合蛋白表达载体PGEX等。真核细胞表达载体有SV40载体、腺病毒载体以及痘苗病毒载体等，然而目前存在问题是原核表达载体形成的表达产物可能没有蛋白活性，使用的真核表达系统表达效率低，易出现基因污染等问题。
发明内容：
本发明提供一种以贾第鞭毛虫dsRNA病毒作基因表达载体的真核表达系统，克服现用真核基因表达系统表达效率低，易出现基因污染等问题。
贾第鞭毛虫简称贾第虫为真核生物，外源基因在贾第鞭毛虫体内表达出的蛋白具有活性。贾第鞭毛虫在体外易培养，随着贾第鞭毛虫的传代培养，外源基因可无限制地在体外大量制备。克服现用真核基因表达系统表达效率低，易出现基因污染等问题。
本发明利用贾第鞭毛虫(Giardia)dsRNA病毒(virus)作为基因表达载体，在贾第鞭毛虫体内进行外源基因的真核表达。如：采用DNA转染方式的真核表达系统和以RNA转染方式的真核表达系统两种：
1、以DNA转染方式的真核表达系统
将装在质粒载体上的贾第虫病毒全长cDNA的5’端非翻译区前连接贾第虫基因的启动子和信号肽基因(亦可不连接信号肽基因)，后在5’端367至800bp间和3’端637至2017bp间分别用NcoI和XhoI酶切，并在此处插入外源基因，构建含外源基因的重组质粒，然后将该质粒通过电穿孔等方法转染贾第虫，利用贾第虫的启动子和信号肽，通过病毒的同源重组表达外源基因。
2、以RNA转染方式的真核表达系统
在贾第虫病毒全长cDNA的5’非翻译区前端加入T7启动子，并在5’端非翻译区后的367至800bp间和3’端637至2017bp间插入外源基因，后用RNA聚合酶进行体外转录，并将其转录体电穿孔至含病毒的贾第虫体内。通过病毒的同源重组表达外源基因。
以贾第虫病毒全长cDNA基因序列或大于50bp的该基因序列作基因表达载体。
其中所述的贾第虫病毒全长cDNA基因序列选自序列表中序列1所示的序列，全长6273bp。
本发明的积极效果在于：贾第虫病毒基因组小，稳定，易纯化，能在体外有效地感染贾第虫滋养体，且具有较小的细胞毒性，贾第虫病毒基因复制的拷母数多，而且其病毒的衣壳蛋白是在贾第虫体内合成的优势蛋白。贾第虫为真核生物，外源基因在贾第虫体内表达出的蛋白具有活性。贾第虫在体外易培养，随着贾第虫的传代培养，外源基因可无限制地在体外大量制备。
附图说明：
图1.转染用编码GLVcDNA-gp40基因的嵌合RNAs的构建。
A：蓝氏贾第虫病毒全长cDNA；
B：编码GLVcDNA-gp40基因的嵌合RNA；
T7启动子，
GLVcDNA非翻译区，
gp40基因，”
终止密码子。
图2为ppoly2/sfinot GLV-GP40重组质粒构建图。
蓝氏贾第虫的启动子和信号肽基因；“GL”蓝氏贾第虫；
隐孢子虫GP40基因；
蓝氏贾第虫病毒全长cDNA。
具体实施方式：
实施例1
以RNA转染方式的真核表达系统。
如图1所示，将蓝氏贾第虫病毒(Giardia lamblia)全长cDNA的5’端连接T7启动子，然后在5’端670bp处和3’端2017bp处，用体外诱变试剂盒诱变产生NcoI和XhoI酶切位点，分别用NcoI和XhoI酶切，同时将隐孢子虫gp40基因两端产生NcoI和XhoI酶切位点，用NcoI和XhoI酶切，在T4DNA连接酶的作用下，将隐孢子虫gp40基因与蓝氏贾第虫病毒基因进行连接，然后在T7RNA聚合酶的作用下进行体外转录，将转录体100μg在电压1000V/cm，电容50μF条件下电击，转染含病毒的蓝氏贾第虫滋养体内，电击后将电转杯放在冰浴中10min，后进行37℃培养，用PCR等方法鉴定外源基因在蓝氏贾第虫体内的表达。
实施例2
以DNA转染方式的真核表达系统
如图2所示，将装在ppoly2/sfinot质粒载体上的蓝氏贾第虫病毒(GLV)的全长cDNA(ppoly2/sfinot GLV)5’端连接蓝氏贾第虫a微管启动子基因和信号肽基因，后在其5’端670bp和3’端2017bp处，用体外诱变试剂盒诱变产生NcoI和XhoI酶切位点，分别用NcoI和XhoI酶切，同时将隐孢子虫gp40基因两端产生NcoI和XhoI酶切位点，用NcoI和XhoI酶切，在T4DNA连接酶的作用下构建重组质粒ppoly2/sfinot GLV-gp40，将该质粒50μg在电压400V/cm，电容800μF条件下电击，转染含病毒的蓝氏贾第虫滋养体内，电击后将电转杯放在冰浴中10min，后进行37℃培养，通过PCR及Western blotting检测gp40基因在蓝氏贾第虫体内的表达。
蓝氏贾第虫病毒全长cDNA基因序列：
<110>中国人民解放军军需大学
<120>一种以贾第鞭毛虫病毒作基因表达载体的真核表达系统
<140>03111079.7
<141>2003-02-25
<160>1
<210>1
<211>6273
<212>DNA
<213>贾第鞭毛虫病毒(Giardia sp.virus)
<400>1
ggaaggagtg ccaggccatt accctccgcc cctgcctaac aaaactggct taccagaggc 60
gggggggcgt ggtagacggt atgtctaggt ccagagaaag cggtcgctgt taagccgctg 120
gacttcgcca cgcttacacc atcgagaaca cataagtggt gtaatattat gtgtttggct 180
gcgtgtgtca cgagcacgac ccatggagga atctaaccca ggtggtgttg tgtatgataa 240
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aacagcagtg gtccgcccct catgccctat gaaacgttag ggggccgaca ctagtgggca 360
agcccgatgg tgtgggggac tggatatggg aacaccagtc cgttaaaccc gtacggcttc 420
gccagcctac accggggggg gcttaatccc cttattttgg cacctgaaaa tattactttt 480
gacactttga acacacagaa tgaccacgag gagacctacg gagagtctcc agaggttcct 540
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ttttcagcta taaaaactct ctacaattat tactcagaag gtccttcgat cccaattatg 720
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tatgggtata aacaacgttt cagtaacagg agattgacca ctagtgcgct ttgctacgca 900
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cctcacatga ggacattgtc acctatcggt cttgaagtat tcaatctggc tacttctcag 1080
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gacatactat cgatctttgg tgaggtgttc ctgccacacg tgatgcaacc ggtctcaaac 1200
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aatctaccgt tacagaacct cgattatcta tctctcgaca tgatggaatt ctacgctcct 2280
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gcaccatcta gacttgcagt caaattagac tggtctaagc ttagcgcctg gtactcagat 2820
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tgggatccta cgcaggaaag acgcgcacag gtttcgtgta cacatacttt agccccaact 2940
tcctttcgag ctttaacgtg tctgagccta tattccacaa ggccatcaac cttacaccac 3000
cttacgatga cacgagccaa actgtaattc aaaatttgtc catgccacag atgctcagct 3060
tcgatcccta ctacgagtct acgttctatg tggtctccgc ggataacgag tggataccga 3120
cttcagggcc tgcttggaag gtaccatacc tggaaaacgt agttaagcgg tctggcaggc 3180
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cgacgtgtaa gacaagaaaa ggaaggcatt atgcctattt ctctgctgct ttggggggca 3300
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tctacgctcc gattcagctc caagacgcca taccagtacg tagagaagat ccagtgccag 3420
ggagcatata cgcagtcttt aagtttttct cagaaccaaa ggcttgggag atacgtgcac 3480
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ctttggacat ttatatagat attctttccc aaatggagct gccaaagtac atacacgagt 3660
tcttagtttt actcagaggc aaggtgtgtg aagtttcgag gttgtacaag aaggaacagg 3720
tattcataat actactaacc gtattctctg agctcacagc catagttcgc catagaggta 3780
acaagtccac ggggtcgatg gggaggatgt ggactttgtt atcagacttc gagaccctgc 3840
ttgggaaggt gagctataag aacccgagta tcattgagga gcaggttgtt ccctggctaa 3900
cctcagatcc tataccacgt acccctgatt tctactctac gtatttcaag atggcggttc 3960
agtttatgca caggacattc gttcctgtca ctctcagaag tgcccctccg ttaacatttt 4020
acgagtactg tgcgaggtcg gagctctggg gaaccacggg atccggctac atcggctatg 4080
gcaagcgcag tttcaacaaa tggtcgatct acggagctta tcctaccgag gagatttatc 4140
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aggtacgtgc tgtaatctcc gcctctttcc aatcgtacat attgatgtcc tacctcgagt 4260
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accagtccaa ttttgatcgt cagcctgact tggtccaaat aggcatctgg caacagttac 4440
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tatcacgttt agcctcaact acgaccttcc cgaacctaaa ggtacggatg tcggacggtg 4560
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tcatcaatgt gacacaactt ctaaccatgg cggaattgtc caacactctg gcctcgttga 4680
ggtcaacggt ggtacagggc gacgatatcg ctctaagtat gactgaccgg gagcaggcca 4740
cacagttagt tgacacttat gcacgtcaag ggttcgaggt caacccgaag aagttctgga 4800
tatcacccga ccgggacgaa ttcctccgga gggtagcaac ccctggtata gtcgcggggt 4860
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actacatctc catgttgcca aagctagcga aggtgcctaa catggtccgg gagtatgtaa 4980
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tgattggtag gtttacagct gctcatcctg ataagcgagc cttaactctt ctttaccatt 5160
ggttcgtgag agacttgacg catgctacaa aaataaaaaa aagaaatctt ctggtcctgt 5220
tacagcagcc gggcttctgg ggaggttatt cccagagcct ggttggcttg ttaaggacca 5280
ctcacctcgc agatatgata gttagcgaac tagacatagg actgccaggt cctcgggcca 5340
cgtctaatcg ctttgggaca tcccctactt cactggcccc gcactacctc actctgatag 5400
ttccgagtag cgtgcatgtg cagtcgcaaa aggaactgga tttgtggggg ctgtgcagat 5460
ccagtatata tgctaagcac tattcaaaca tatttcgata ctacaaactg actcttccta 5520
cgttggtgct ttgggcccaa cggctaggtg ataaacacgt caccgatttc attagatctg 5580
tcaccctggg ttcagaaata ccaaaatatg acccgcatac gcgtctattc acaagtaacg 5640
gggtgtcagt aggaacgtta ataaggataa gagtacgaca ttttacccac agagtgcttc 5700
gaagagagac acctaagtgt atccccgtaa tcgtcgggct atatcgggag cagacactat 5760
ccgttccgga gagtgttcgt ctatcggaac ctgacaagat actatcaagc ctacaacggg 5820
cgtcgggtta ctcactgagt ctagttaaga agatattaca gatcactagg aaaccagtgg 5880
accatccggt ggacgcgagg ttctcacagg cattccctaa caactggagc gacttggcta 5940
gaacggctgg cacctttttg ttaactgtac cggcttagga ggtttcagga gacaatgcta 6000
gccttgtcgc tgagcgtttg ggcttcaacc atagcagccg gcttcacgca atttttaggt 6060
caaggaaatt tctcctttgc gtagtagcgt agctgctcaa agaaaagaaa atactagtaa 6120
ttactgcaca cgatcggtgg gtcggccagc atagggtggt gtgcggtccg agaacgggac 6180
tggccttagt accgtcataa cacctggaca cgtgttgaaa ctgtcccccc tgtagactcc 6240
gttggctgta ggaggcagcg tacgaggggg tcg 6273
Claims (5)
1、一种以贾第鞭毛虫病毒全长cDNA作基因表达载体的真核表达系统的制备方法，所述的真核表达系统是以DNA转染方式，其中制备方法包括以下步骤：
将装在质粒载体上的贾第鞭毛虫病毒全长cDNA的5’端非翻译区前连接贾第鞭毛虫基因的启动子和信号肽基因，然后在5’端367至800bp间和3’端637至2017bp间分别用NcoI和XhoI酶切，并在此处插入外源基因，构建含外源基因的重组质粒，然后将该质粒通过电穿孔等方法转染贾第鞭毛虫，通过利用贾第鞭毛虫的启动子和信号肽，从而获得以贾第鞭毛虫病毒作基因表达载体的真核表达系统，其中贾第鞭毛虫病毒全长cDNA选自序列表中序列1所示的序列。
2、一种以贾第鞭毛虫dsRNA病毒全长cDNA作基因表达载体的真核表达系统的制备方法，所述的真核表达系统是以RNA转染方式，其中制备方法包括如下步骤：
在贾第鞭毛虫dsRNA病毒全长cDNA的5’非翻译区前端加入T7启动子，并在5’端非翻译区后的367至800bp间和3’端637至2017bp间插入外源基因，然后用RNA聚合酶进行体外转录，并将其转录体电穿孔至含病毒的贾第鞭毛虫体内，通过病毒的同源重组，从而获得以贾第鞭毛虫dsRNA病毒全长cDNA作基因表达载体的真核表达系统，其中贾第鞭毛虫dsRNA病毒全长cDNA选自序列表中序列1所示的序列。
3、根据权利要求1或2的方法所制备的真核表达系统。
4、根据权利要求3所述的真核表达系统，其特征在于：以贾第鞭毛虫病毒全长cDNA基因序列作基因表达载体。
5、贾第鞭毛虫病毒全长cDNA基因序列，选自序列表中序列1所示的序列。
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| US20020081317A1 (en) * | 1999-02-02 | 2002-06-27 | Mahan Michael J. | Bacteria with altered DNA adenine methylase (DAM) activity and heterologous epitope |
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Non-Patent Citations (2)
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