CN100349613C - 肉毒毒素口服制剂及其治疗消化性溃疡和胃食管反流病的用途 - Google Patents

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Abstract

通过口服给药肉毒毒素治疗消化性溃疡的方法和治疗胃食管反流病的方法。口服制剂含有A、B、C、D、E、F或G型肉毒毒素以及载体，如面粉、糖或明胶。

Description

肉毒毒素口服制剂及其治疗消化性溃疡和胃食管反流病的用途
                      背景技术
本发明涉及治疗溃疡和/或治疗胃食管反流病的方法。具体而言，本发明涉及用肉毒毒素治疗消化性溃疡和治疗胃食管反流病的方法。
溃疡
在正常消化过程中，食物从口中顺着食管向下流到胃中。胃产生盐酸和胃蛋白酶以消化食物。食物从胃中流到小肠的上部即十二指肠，并在其中继续消化和营养吸收。
溃疡是在有酸和胃蛋白酶存在的胃或十二指肠的衬里(lining)中形成的疼痛或损伤。胃中的溃疡被称为胃溃疡。十二指肠中的溃疡被称为十二指肠溃疡。胃中和十二指肠中的溃疡被共同称为消化性溃疡。溃疡较少发生在食管中或十二指肠的第一部分，即十二指肠球中。
约两千万的美国人在其一生中发生至少一次溃疡。此外，溃疡影响约四百万人并且每年有超过四万人动手术是因为溃疡引起的持久症状或问题，悲惨的是每年约六千人死于溃疡或溃疡相关的并发症。
溃疡可发生在任何年龄，但在青少年中较少见，并且在儿童中更罕见。十二指肠溃疡通常在30～50岁之间第一次出现。胃溃疡更有可能发生在年龄超过60岁的人中。十二指肠溃疡在男性中发生的频率比女性中高，而胃溃疡在女性中比在男性中更常见。
一般认为有三个因素，即生活方式、酸和胃蛋白酶以及细菌幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)对溃疡的发生有作用。例如，生活方式因素，如压力和饮食可促使溃疡形成。并且，消化液(盐酸和胃蛋白酶)与胃保护自身免受上述强烈物质的能力之间失衡可导致溃疡。最后，感染幽门螺杆菌也可导致溃疡发生。
胃不能保护自身免受强烈的消化液，即酸和胃蛋白酶，将促使溃疡形成。例如，胃中过多的消化液，即酸和/或胃蛋白酶的存在，或受损胃中正常量的上述物质可成为溃疡形成的病因。胃以数种方式保护自身免受上述液体。一种方式是产生粘液，一种润滑剂样的涂层用以屏蔽胃组织。另一种方式是产生碳酸氢盐，用以中和消化液，并将其分解为对胃组织损害较小的物质。最后，血液循环到胃衬里、细胞更新以及细胞修复也帮助保护胃。
幽门螺杆菌是一种存在于胃中的螺旋形细菌。所述细菌(与酸分泌物一起)已显示可损害胃及十二指肠组织，导致炎症和溃疡。
幽门螺杆菌可在胃中生存是因为它产生脲酶。脲酶产生中和胃酸的物质，从而使细菌生存。由于其形状和移动的方式，幽门螺杆菌可渗透到胃的保护粘液衬里并在其中产生削弱胃保护粘液的物质，从而使胃细胞对酸和胃蛋白酶的损害作用更敏感。
细菌还可附着到胃细胞上并进一步削弱胃的保护机能，引起局部炎症。由于某些尚未完全理解的原因，幽门螺杆菌还可刺激胃产生更多的酸。
过多的胃酸和其它刺激因素可导致十二指肠的上端，即十二指肠球发炎。在某些人中，长时期的上述炎症导致生成被称为十二指肠胃化生的胃样细胞。然后幽门螺杆菌攻击上述细胞，导致组织进一步损伤并发炎，从而可能引起溃疡。
在感染幽门螺杆菌的数周内，多数人发生胃炎，即胃衬里发炎。然而，大部分人将不会出现与感染相关的症状或问题。对发生幽门螺杆菌相关症状或溃疡的人有什么不同尚不知晓。遗传或环境因素可能导致某些个体出现问题。或者，感染毒力更强的细菌菌株可能导致症状和溃疡。
最常见的溃疡症状是胸骨和肚脐之间腹部的绞痛或灼痛。疼痛经常出现在两顿饭之间以及早晨较早的时候。它可能持续数分数到数小时，并且可能通过进食或服用抗酸剂得到缓解。
不常见的溃疡症状包括恶心、呕吐和没有食欲以及体重下降。由溃疡引起的出血可能出现在胃和十二指肠中。有时患者未意识到出血性溃疡，因为血液损失缓慢并且血液在粪便中可能不明显。上述患者可感觉疲倦和虚弱。如果出血严重，血液将出现在呕吐物或粪便中。含血的粪便呈焦油状或发黑。
通过进行内窥镜和X射线检查以及对幽门螺杆菌进行检测可诊断溃疡。上部GI系统可用以诊断溃疡。上部GI系统涉及用X射线检查食管、胃和十二指肠以确定溃疡的位置。为了在X射线图像中看到溃疡，患者须吞咽被称为钡的白垩样流体。
另一种诊断检查是内窥镜检查法，在该方法中，患者轻微镇静而医生将一端有照相机的灵巧小型仪器通过嘴插入食管、胃和十二指肠中。通过该方法可检查整个上部GI道。从而诊断并为溃疡或其它症状拍照，如果需要，还可对组织进行活组织检查。
胃和十二指肠溃疡可用H2-阻断剂(blocker)、酸(质子)泵抑制剂以及粘膜保护剂治疗。当治疗幽门螺杆菌时，所述药物可与抗生素结合使用。
H2阻断剂通过阻断组胺，一种酸分泌的强烈刺激物，减少胃产生的酸的量。不幸的是，H2阻断剂需要几周以显著降低溃疡疼痛。并且，用H2阻断剂治疗持续6～8周。尼扎替丁(Nizatidine，Axid)已批准用于治疗十二指肠溃疡，但尚未批准用于治疗胃溃疡。已批准用于治疗胃溃疡和十二指肠溃疡的H2阻断剂包括西咪替丁(Cimetidine，Tagamet)、雷尼替丁(Ranitidine，Zantac)和法莫替丁(Famotidine，Pepcid)。
与H2阻断剂相同，酸(质子)泵抑制剂改变胃酸的产生。然而，酸泵抑制剂通过阻止胃的酸泵，即酸分泌的最后一步更完全地阻断胃酸的产生。FDA已批准使用奥美拉唑(omeprazole)短期治疗溃疡疾病。
粘膜保护性药物保护胃的粘液衬里免受酸侵蚀。与H2阻断剂和酸泵抑制剂不同，保护剂不抑制酸的释放。所述药物通过屏蔽胃的粘液衬里，使其不受酸的损害。有两种常见的保护剂：
硫糖铝(sucralfate，Carafate)。该药物附着到溃疡上并提供保护屏障，以治愈溃疡并阻止胃酸的进一步侵害。硫糖铝已批准用于十二指肠溃疡的短期治疗和维持治疗。
米索前列醇(Misoprostol，Cytotec)。该合成的前列腺素，是一种由人体天然产生的物质，它通过提高粘液和碳酸氢盐的产生以及促进血液向胃的流动以保护胃衬里。它仅批准用于预防NSAID引起的溃疡。
两种常见的非处方保护药物有：抗酸剂。抗酸剂可通过中和胃酸暂时缓解溃疡疼痛。所述抗酸剂还可有粘膜保护作用。多种品牌的非处方抗酸剂有市售。Bismuth Subsalicylate.碱式水杨酸铋既具有保护作用，又具有抗幽门螺杆菌的抗菌作用。
发现溃疡和幽门螺杆菌之间的联系产生了一种新的治疗选择。目前，除了以降低胃酸产生为目的的治疗外，医生还可为受到幽门螺杆菌感染的患者开抗生素。这种治疗方法是引人注目的医疗进步，因为消除幽门螺杆菌表示溃疡可能痊愈并且很可能不再复发。
可采用多种持续2～8周的治疗方案。例如已知的持续两周的三重治疗(triple therapy)。该方案可根除大量幽门螺杆菌并降低十二指肠溃疡的复发率。患有与NSAID无关的胃溃疡的患者也可受益于细菌根除。虽然三重治疗是有效的，但有时难以遵循，因为患者必须在两周内每天服用三种不同的药物四次。
此外，治疗通常有副作用，例如使女性感染酵母菌、胃不适、恶心、呕吐、味觉失灵(bad taste)、肠运动松弛或暗淡以及头晕。两周的三重治疗结合两种抗生素，即四环素(如Achromycin或Sumycin)和甲硝唑(metronidazole，如Flagyl)以及碱式水杨酸铋(Pepto-Bismol)。一些医生可能加入酸抑制药物以缓解溃疡疼痛并促进溃疡治愈。在某些病例中，医生可能用阿莫西林(例如，Amoxil或Trimox)代替四环素或者如果他们认为细菌对甲硝唑有抗药性，则可使用其它抗生物如克拉霉素(clarithromycin，Biaxin)。
除了三重治疗外，已知的还有两周的双重治疗。双重治疗对患者而言较易遵循，并且副作用较小。双重治疗可包括抗生素，如阿莫西林或克拉霉素以及奥美拉唑，一种阻止酸产生的药物。不幸的是，按照现有治疗，可能需要4～8周(即使用铋、甲硝唑、四环素)或更长的时间(即使用H2或质子泵抑制剂)以有效治疗消化性溃疡。
在多数情况下，抗溃疡的药物快速有效地治愈溃疡。根除幽门螺杆菌防止大部分溃疡复发。然而，对药物无应答或发生并发症的患者可能需要动手术。虽然手术通常成功地治愈溃疡以及防止其复发并预防以后的并发症，但有时仍会产生一些问题。
目前，采用标准开放式手术(standard open surgery)治疗溃疡。将来，外科医生可能采用腹腔镜法。腹腔镜是带有照相机的长管状仪器，它使得外科医生能看着视频监视器通过小切口做手术。溃疡手术的常见类型有迷走神经切断术、幽门成形术和窦切除术。
迷走神经切断术涉及切断迷走神经，即一种将信息从脑传递到胃的神经。中断由迷走神经传递的信息可降低酸分泌。然而，该手术可能还干扰胃排空。该手术最新的变体涉及仅切断控制胃酸分泌细胞的神经部分，从而回避影响胃排空的部分。
在窦切除术中，产生激素的胃下部(窦)被切除，所述激素刺激胃分泌消化液。有时外科医生还可能切除分泌胃蛋白酶和酸的胃的相邻部分。迷走神经切断术通常与窦切除术结合进行。
幽门成形术是另一种可与迷走神经切断术一起进行的外科方法。幽门成形术扩大十二指肠和小肠的入口(幽门)，使内容物能更自由地从胃中进入。
溃疡的并发症可包括出血、器官壁穿孔以及消化道通道变窄和阻塞。随着溃疡腐蚀胃肌或十二指肠壁，血管还可能损伤，从而导致出血。如果受感染的血管较小，血液可能缓慢渗入到消化道中。在很长一段时间内，人可能出现贫血并感觉虚弱、头晕或疲劳。如果受损的血管较大，出血严重，从而需要及时的医疗保养。症状包括站立时感觉虚弱或和头晕、吐血或昏厥。由于含血，粪便可能变成焦油黑色。大多数出血性溃疡可用内窥镜法治疗。确定溃疡的位置并用加热装置烧灼血管或注射止血物质。如果内窥镜治疗不成功，可能需要动手术。
有时溃疡在胃或十二指肠的壁中腐蚀出一个洞。细菌和部分消化的食物可穿过开口溢出到无菌的腹腔(腹膜)。从而导致腹膜炎，一种腹腔和腹壁的炎症。穿孔溃疡可导致突然急剧的严重疼痛，需要及时住院并接受手术。
位于与十二指肠相连的胃末端的溃疡可导致肿胀和瘢痕，从而可导致肠入口变窄或封闭。所述阻塞可阻止食物离开胃并进入小肠中。结果，人可能将胃中的内容物呕吐出来。可采用内窥镜气囊扩张技术，一种使用气囊强迫狭窄通道打开的方法。如果扩张不能缓解问题，那么可能需要手术。
胃食管反流病
胃食管反流病(GERD)(又称为消化性食管炎和反流食管炎)是一种食管炎症，由胃内容物反流到食管中引起。某些胃食管反流是进餐后常出现的无症状的正常情形。然而，当反流是由下部食管括约肌无能(虚弱)引起时，可变得非常严重，所述括约肌是一组使食管与胃隔离的肌肉纤维。当上述情形发生时，酸性或碱性的胃内容物可从胃中通过下部食管括约肌回到食管里并引起GERD症状。可导致食管括约肌无能，从而引起GERD的情形包括怀孕、食道裂孔疝、肥胖、复发或持续呕吐以及鼻管。GERD也是食管手术和食管狭窄的危险因素。
GERD的症状包括心痛、打嗝、食物回流、恶心、呕吐、声音嘶哑、喉咙痛、吞咽困难和咳嗽。对GERD的诊断有粪便对愈疮木脂呈阳性、连续的食管pH监测显示反流、内窥镜检查显示食管炎或溃疡、食管测压术显示括约肌压力反常、钡吞咽显示回流以及Bernstein检测对胃酸反流呈阳性。
治疗GERD的措施包括降低体重，进餐后避免躺下，睡觉时升高床头，服药时饮用大量水，避免食用脂肪、巧克力、咖啡因、薄荷(这些食品可导致食管压力下降)，避免烟酒。可缓解GERD症状的药物疗法包括在进餐后服用抗酸剂以及临睡前服用组胺H2受体阻断剂、促进剂(promotility agent)、质子泵抑制剂。并且，对于难以用药物治疗的GERD患者可能需要抗反流手术(尼森胃底折术，Nissenfundoplication)治疗。不治疗GERD可导致食管炎、食管溃疡、支气管痉挛、慢性肺病和巴雷特(Barrett)食管，后者的食管衬里发生变化，从而增大癌的可能性。
因此，现有的消化性溃疡和胃食管反流病的治疗法有许多缺陷和不足。
肉毒毒素
根据形态学和功能的分类，梭菌属有超过127个种类。厌氧的革兰氏阳性菌肉毒梭菌产生有效的多肽神经毒素即肉毒毒素，它在人类和动物中导致被称为肉毒中毒的神经麻痹疾病。肉毒梭菌的孢子发现存在于土壤中并且可在家庭式罐头厂未正确消毒的密封食品容器中生长，这是导致多起肉毒中毒的原因。肉毒中毒作用通常出现于食用被肉毒梭菌培养物或孢子感染的食品后的18～36小时。显然，肉毒毒素可不衰减地穿过肠的衬里层(lining)并攻击外周运动神经元。肉毒毒素中毒的症状可从行走、吞咽和说话困难进行到呼吸肌麻痹和死亡。
A型肉毒毒素是人类已知的最致命的天然生物剂。大约50皮克的市售A型肉毒毒素(纯化的神经毒素络合物)1即达到小鼠的LD50(即1个单位)。每单位BOTOX含有约50皮克(约5.6×10-17摩尔)的A型肉毒毒素络合物。有趣的是，在摩尔级上，A型肉毒毒素的致死性比白喉高约18亿倍，比氰化钠高约6亿倍，比眼镜蛇毒素高约3千万倍，比霍乱高约1.2千万倍。Singh，Critical Aspects of BacterialProtein Toxins，Natural Toxin II的63～84页(第四章)，B.R.Singh等编辑，Plenum Press，纽约(1996)(根据约0.05ng BOTOX等于1单位的事实对其中定义的A型肉毒毒素0.3ng等于1U这一LD50进行了校正)。1单位(U)的肉毒毒素定义为将其腹膜内注射到重18～20克的雌性Swiss Webster小鼠中的LD50。
七种免疫学上不同的肉毒神经毒素已有表征，分别为血清A、B、C1、D、E、F和G型肉毒神经毒素，各种血清型通过用类型特异性抗体中和区分。不同血清型的肉毒毒素在其感染的动物物种以及所引起的麻痹的严重程度和持续时间上均不相同。例如，据测定根据在大鼠中所测得的麻痹产生的速度，A型肉毒毒素比B型肉毒毒素强500倍。此外，据测定在灵长类动物中B型肉毒毒素在480U/kg的剂量下是无毒性的，而该剂量是A型肉毒毒素灵长类LD50的约12倍。Moyer E等，Botulinum Toxin Type B：Experimental and Clinical Experience，“Therapy With Botulinum Toxin”的第6章，71～85页，Jankovic，J.等编辑(1994)，Marcel Dekker，Inc.。肉毒毒素显然以高亲和力与胆碱能运动神经元结合，并转运到神经元中，从而阻断乙酰胆碱的释放。
不论何种血清型，其毒素中毒的分子机理似乎都是相似的并包括至少三个步骤或阶段。在过程的第一个步骤中，毒素通过重链即H链和细胞表面受体之间特异性的相互作用与靶神经元的突触前膜结合；一般认为对于各种类型的肉毒毒素和破伤风毒素，上述受体是不同的。H链的羧基端片断HC似乎对于毒素靶向细胞表面很重要。
在第二个步骤中，毒素穿过中毒细胞的质膜。毒素首先通过受体介导的胞吞作用(endocytosis)被细胞吞没并形成含有毒素的内体。然后毒素从内体中逃离到细胞的细胞质中。这一步骤被认为是由H链
1从加利福尼亚欧文市的阿勒限公司购得，商标为BOTOX，每瓶100单位的氨基端片断HN介导的，当pH为约5.5或以下时，HN即产生应答引发毒素的构象变化。已知内体具有降低内体内pH的质子泵。构象变化使疏水残基暴露在毒素中，从而允许毒素将自身嵌入内体膜中。然后毒素(或至少轻链)通过内体膜转运到细胞质中。
肉毒毒素活性机制的最后一步似乎涉及连接重链H链和轻链L链的二硫键的还原。肉毒毒素和破伤风毒素的全部毒性活性均包含在全毒素的L链中；L链是一种锌(Zn++)内肽酶，它选择性切割含有神经递质的小泡识别和停靠质膜胞质表面以及小泡与质膜融合所必需的蛋白质。破伤风神经毒素以及B、D、F和G型肉毒毒素导致一种突触小体膜蛋白即小突触泡膜蛋白(又称为小泡相关膜蛋白(VAMP))降解。上述切割活动中的任何一者都将导致大部分存在于突触小泡细胞质表面的VAMP被移除。血清型A和E肉毒毒素切割SNAP-25。血清型C1肉毒毒素最初被认为切割突触融合蛋白，但后来发现其切割突触融合蛋白以及SNAP-25。各种肉毒毒素特异性切割不同的键，除了B型肉毒毒素(以及破伤风毒素)切割相同的键。
虽然所有肉毒毒素血清型在神经肌肉接头均显然抑制神经递质乙酰胆碱的释放，但它们是通过影响不同的神经分泌蛋白和/或在不同的位点切割上述蛋白进行的。例如，A型和E型肉毒均切割25千道尔顿(kD)的突触小体相关蛋白(SNAP-25)，但它们在所述蛋白中靶向的氨基酸序列是不同的。B、D、F和G型肉毒毒素均作用于小泡相关蛋白(VAMP，又称为小突触泡蛋白)，但各血清型在不同的位点切割所述蛋白。最后，C1型肉毒毒素表现为切割突触融合蛋白和SNAP-25。上述作用机理的不同可能影响各种肉毒毒素血清型的相对效能(potency)和/或作用的持续时间。显然，可在多种不同的细胞类型中发现肉毒毒素底物。参考例如Gonelle-Gispert，C.等SNAP-25a and-25b isoforms are both expressed in insulin-secreting cells andcan function in insulin secretion，Biochem J.1；339(第一部分)：159-65：1999和Boyd R.S.等，The effect of botulinumneurotoxin-B on insulin release from a Ξ-cell line，以及BoydR.S.等，The insulin secreting Ξ-cell line，HIT-l5，containsSNAP-25 which is a target for botulinum neurotoxin-A，上述两者均发表于Mov Disord，10(3)：376：1995(胰岛B细胞含有至少SNAP-25和小突触泡蛋白)。
对于七种已知的肉毒毒素血清型，其肉毒毒素蛋白分子的分子量为约150kD。有趣的是，肉毒毒素是作为含有150kD的肉毒毒素蛋白分子和相关的无毒素蛋白的络合物从梭菌中释放出来的。因此，A型肉毒毒素络合物可由梭菌以900kD、500kD和300kD的形式产生。B型和C1型肉毒毒素显然以仅为700kD或500kD的络合物产生。D型肉毒毒素以约300kD和500kD的络合物产生。最后，E型和F型肉毒毒素以仅为约300kD的络合物产生。所述络合物(即分子量大于约150kD)被认为含有非毒素的血凝素蛋白以及非毒素和无毒性的非血凝素蛋白。上述两种非毒素的蛋白(它们与肉毒毒素分子组成相关的神经毒素络合物)可能发生作用以向肉毒毒素分子提供稳定性以抗变性，并在毒素被摄取时保护其以防消化酸。此外，有可能较大的(分子量大于约150kD)肉毒毒素络合物可使肉毒毒素从肉毒毒素络合物肌肉注射部位的扩散速度减慢。
所有的肉毒毒素血清型均由肉毒梭菌作为无活性的单链蛋白产生，所述蛋白必需经由蛋白酶切割或切口以具有神经活性。产生血清型A和G肉毒毒素的细菌菌株具有内源性蛋白酶，因此血清型A和G可主要以其活性形式从细菌培养物中回收。相反地，血清型C1、D和E肉毒毒素由非蛋白酶解的菌株合成并因此在从培养物中回收时，通常是无活性的。血清型B和F由蛋白酶解和非蛋白酶解的菌株产生，因此可以活性或无活性形式回收。然而，即使是产生，例如，血清B型肉毒毒素的蛋白酶解菌株也仅切割所产生毒素的一部分。切口分子与无切口分子的精确比例取决于培养时间长短以及培养温度。因此，一定百分比的任何制品，如B型肉毒毒素很可能是无活性的，从而可能解释为什么B型肉毒毒素比A型肉毒毒素的效能低。临床制品中无活性肉毒毒素分子的存在对制品的全蛋白载荷(overall protein load)有贡献，这与抗原性增大有关联，却未促进临床功效。
肉毒毒素和毒素络合物可从，例如List BiologicalLaboratories，Inc.，Campbell，加利福尼亚；the Centre for AppliedMicrobiology and Research，Porton Down，英国；Wako(日本大阪)以及密苏里州圣路易斯的Sigma Chemicals购得。市售的含有肉毒毒素的药用组合物包括BOTOX(A型肉毒毒素的神经毒素络合物与人类血清白蛋白以及氯化钠，可从加利福尼亚欧文市的Allergan，Inc.购得，100单位瓶装的冻干粉末，使用前用0.9％的氯化钠复原)、Dysport(制剂中有A型肉毒毒素的血凝素络合物与人类血清白蛋白以及乳糖，可从英国贝克郡的Ipsen Limited购得，粉末状，使用前用0.9％的氯化钠复原)以及MyoBlocTM(一种可注射的溶液含有B型肉毒毒素、人类血清白蛋白、琥珀酸钠和氯化钠，pH为约5.6，可从爱尔兰都柏林的Elan Corporation购得)。
A型肉毒毒素在治疗多种临床症状中的成功引起了对其它肉毒毒素血清型的兴趣。此外，纯肉毒毒素已用于治疗人类。参考例如，KohlA.等，Comparison of the effect of botulinum toxin A(Botox(R))with the highly-purified neurotoxin(NT 201)in the extensordigitorum brevis muscle text，Mov Disord 2000；15(增补本3)：165。例如，可使用纯肉毒毒素制备药用组合物。
A型肉毒毒素已知可溶于pH为4～6.8的稀水溶液中。当pH大于约7时，特别是当pH和温度升高时，起稳定作用的无毒性蛋白从神经毒素中游离出来，导致毒性逐渐丧失。Schantz E.J.等，Preparationand characterization of botulinum toxin type A for humantreatment(特别是44～45页)，Jankovic，J.等， Therapy with Botulinum Toxin的第3章，Marcel Dekker，Inc(1994)。
肉毒毒素分子(约150kDa)以及肉毒毒素络合物(约300～900kDa)，如A型毒素络合物对由表面变性、热和碱条件引起的变性也非常敏感。失活的毒素形成可能为致免疫性的类毒素蛋白。得到的抗体可使患者抵抗毒素注射。
体外研究已表明肉毒毒素抑制钾阳离子引起的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织的原代细胞培养物中的释放。此外，据报道在脊髓神经元的原代培养物中，肉毒毒素抑制甘氨酸和谷氨酸的诱发释放，并且在脑突触小体制品中，肉毒毒素抑制各种神经递质的释放，所述神经递质包括乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素(Hebermann E.等，Tetanus Toxin and Botulinum A and C Neurotoxins InhibitNoradrenaline Release From Cultured Mouse Brain，J Neurochem51(2)；522～527：1988)CGRP、物质P和谷氨酸(Sanchez-Prieto，J.等，Botulinum Toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From GuineaPig Cerebral Cortical Synaptosomes，Eur J.Biochem 165；675～681：1987)。因此，当使用的浓度足够时，肉毒毒素将阻断刺激诱发的大部分神经递质的释放。参考，例如Pearce，L.B.，PharmacologicCharacterization of Botulinum Toxin For Basic Science andMedicine，Toxicon 35(9)；1373～1412中的1393页；Bigalke H.等，Botulinum A Neurotoxin Inhibits Non-Cholinergic SynapticTransmission in Mouse Spinal Cord Neurons in Culture，BrainResearch 360；318～324：1985；Habermann E.，Inhibition by Tetanusand Botulinum A Toxin of the release of [3H]Noradrenaline and[3H]GABA From Rat Brain Homogenate，Experientia 44；224～226：1988，Bigalke H.等，Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin InhibitRelease and Uptake of Various Transmitters，as Studied withParticulate Preparations  From Rat Brain and Spinal Cord，Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol 316；244～251：1981；以及Jankovic J.等，Therapy With Botulinum Toxin，Marcel Dekker，Inc.，(1994)，第五页。
可通过如下方法获得A型肉毒毒素：按照已知方法在发酵罐中建立并生长肉毒梭菌的培养物，然后收获并纯化发酵混合物。所有肉毒毒素血清型最初都是作为无活性的单链蛋白合成的，所述蛋白必需经由蛋白酶切割或切口以具有神经活性。产生血清型A和G肉毒毒素的细菌菌株具有内源性蛋白酶，因此血清型A和G可主要以其活性形式从细菌培养物中回收。相反地，血清型C1、D和E肉毒毒素由非蛋白酶解的菌株合成，因此在从培养物中回收时，通常是无活性的。血清型B和F由蛋白酶解和非蛋白酶解的菌株产生，因此可以活性或无活性的形式回收。然而，即使是产生，例如，血清型B肉毒毒素的蛋白酶解菌株也仅切割所产生毒素的一部分。切口分子与无切口分子的精确比例取决于培养时间长短以及培养温度。因此，一定百分比的任何制品，如B型肉毒毒素很可能是无活性的，从而可能解释已知的B型肉毒毒素比A型肉毒毒素的效能低很多。临床制品中无活性肉毒毒素分子的存在对制品的全蛋白载荷有贡献，这与抗原性增大有关联，却未促进临床功效。此外，已知B型肉毒毒素经肌肉注射后，活性的持续时间较短并且在相同的剂量水平不如A型肉毒毒素有效。
高质量的结晶A型肉毒毒素可由肉毒梭菌的HallA菌株生产，所述毒素特征为≥3×107U/mg，A260/A278小于0.60，并且在凝胶电泳上有独特的带型。已知的Schantz方法可用于获得结晶的A型肉毒毒素，如Schantz，E.J.等在Properties and use of Botulinum toxin andOther Microbial Neurotoxins in Medicine，Microbiol Rev.56；80～99：1992所述的。通常，通过在适宜的培养基中培养A型肉毒梭菌可从厌氧发酵中分离并纯化A型肉毒毒素络合物。分离出非毒素的蛋白后，也可使用已知方法获得纯肉毒毒素，例如，分子量为约150kD的纯化A型肉毒毒素，其特异性效能为1～2×108LD50U/mg或以上；分子量为约156kD的纯化B型肉毒毒素，其特异性效能为1～2×108LD50U/mg或以上；分子量为约155kD的纯化F型肉毒毒素，其特异性效能为1～2×107LD50U/mg或以上。
纯肉毒毒素(即150千道尔顿的肉毒毒素分子)或毒素络合物均可用于制备药用组合物。两种分子和络合物均对由表面变性、热和碱条件引起的变性敏感。失活的毒素形成可能为致免疫性的类毒素蛋白。得到的抗体可使患者抵抗毒素注射。
同酶一样，通常，肉毒毒素(细胞内肽酶)的生物活性至少部分取决于其三维构象。因此，通过热、多种化学药品的表面拉伸(surfacestretching)和表面干燥可使A型肉毒毒素丧失毒性。此外，已知将通过已知的培养、发酵和纯化所获得的毒素络合物稀释到非常非常低的、可用于药用组合物制剂的毒素浓度将导致毒素的快速解毒，除非有适宜的稳定剂存在。将毒素从毫克量稀释到每毫升含有毫微克的溶液有很大难度，因为经上述高度稀释后，毒素将迅速丧失特异性的毒性。由于可能在制成含有毒素的药用组合物数月或数年后才使用所述毒素，因此可用稳定剂，如白蛋白和明胶使毒素稳定。
市售的含有肉毒毒素的药用组合物，其出售的商标为BOTOX(从加利福尼亚欧文市的Allergan，Inc.购得)。BOTOX由纯化的A型肉毒毒素络合物、白蛋白和氯化钠在无菌、真空形式下密封形成。A型肉毒毒素由在含有N-Z胺和酵母提取物的培养基中生长的肉毒梭菌Hall菌株的培养物制成。A型肉毒毒素络合物通过一系列酸沉淀从培养溶液中纯化为结晶的络合物，所述络合物由高分子量的活性毒素蛋白和相关的血凝素蛋白组成。将结晶络合物重新溶于含有盐水和白蛋白的溶液中，并在无菌过滤(0.2微米)后真空干燥。真空干燥的产品在-5℃或以下储存于冷冻装置中。BOTOX在肌肉注射前，可用无菌的非保存盐水复原。每小瓶BOTOX含有无菌、真空干燥形式的约100单位(U)的A型肉毒梭菌毒素纯化的神经毒素络合物，0.5毫克人类血清白蛋白和0.9毫克氯化钠，并且无防腐剂。
通过将适量的稀释液抽取到尺寸适中的注射器中以采用无防腐剂的无菌标准盐水(0.9％的氯化钠注射)使真空干燥的BOTOX复原。由于BOTOX可能因冒泡或类似的剧烈搅拌而变性，因此稀释液应轻轻地注射到小瓶中。出于保持无菌状态考虑，BOTOX优选在小瓶从冷冻装置中取出并复原后四小时内给药。在这四小时中，复原的BOTOX可储存在约2℃～约8℃的冰箱中。据报道，复原冷藏的BOTOX可保持其效能至少约两周。Neurology，48：249～53：1997。
肉毒毒素已用于治疗以骨骼肌机能亢进为特征的神经肌肉病症的临床处置中。A型肉毒毒素(Botox)在1989年获得美国食品与药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)的许可，主要用于治疗12岁以上患者的睑痉挛、斜视和偏侧面肌痉挛。在2000年，FDA批准血清A型(Botox)和血清B型(MyBlocTM)肉毒毒素的商用制品用于治疗宫颈张力障碍，并且在2002年FDA批准A型肉毒毒素(Botox)用于美容治疗某些运动机能亢进的(眉间)面部皱纹。A型肉毒毒素外周肌肉注射的临床效果通常显现于注射后一周内，某些时候几小时内。A型肉毒毒素单次肌肉注射所产生的症状缓解(即松弛的肌肉麻痹)的持续时间通常可为约3个月，虽然据报道在某些情况下，肉毒毒素作用引起的腺体，如唾液腺失去神经支配持续数年。例如，已知A型肉毒毒素的效能可高达12个月(Naumann M.等，Botulinum toxin type A in the treatment of focal，axillary andpalmar hyperhidrosis and other hyperhidrotic conditions，European J.Neurology 6(增补本4)：S111～S115：1999)，并且在某些情况下可长达27个月。Ragona，R.M.等，Management of parotidsialocele with botulinum toxin，The Laryngoscope 109：1344～1346：1999。然而，Botox肌肉注射的普通维持时间通常为约3～4个月。
据报道A型肉毒毒素已用于多种临床处置中，包括例如：
(1)每次肌肉注射(多块肌肉)约75～125单位的BOTOX以治疗宫颈张力障碍；
(2)每次肌肉注射5～10单位的BOTOX以治疗眉间线(眉沟)(降眉间肌肌肉注射5单位，各皱眉肌肌肉注射10单位)；
(3)向耻骨直肠肌括约肌内(intrasphincter)注射约30～80单位的BOTOX以治疗便秘；
(4)向上眼睑外侧睑板前的眼轮匝肌和下眼睑外侧睑板前的眼轮匝肌分别肌肉注射约1～5单位的BOTOX以治疗睑痉挛。
(5)向眼外肌肌肉注射约1～5单位的BOTOX以治疗斜视，注射的量根据待注射肌肉的大小以及所需的肌肉麻痹的程度(即所需的屈光度校正)变化。
(6)为治疗中风后的上肢痉挛，按照如下方式向五块不同的上肢屈肌肌肉注射BOTOX：
(a)跖深屈肌：7.5U～30U
(b)跖浅屈肌：7.5U～30U
(c)尺侧腕屈肌：10U～40U
(d)桡侧腕屈肌：15U～60U
(e)肱二头肌：50U～200U。对各指定的五块肌肉在相同的治疗期进行注射，因此患者在各治疗期接受90U～360U的BOTOX的上肢屈肌肌肉注射。
(7)颅骨膜注射(对称注射到眉间肌、额肌和颞肌)25U的BOTOX以治疗偏头痛已证实具有非常有益的偏头痛的预防治疗效果，与赋形剂相比，BOTOX在25U注射后的三个月内降低了偏头痛的发病率、最大严重程度、所伴随的呕吐以及所使用的急性药物治疗。
此外，肌肉肉毒毒素已用于治疗帕金森病患者的震颤，虽然据报道效果并不显著。Marjama-Lyons，J.等，Tremor-PredominantParkinson’s Disease，Drug&Aging 16(4)；273～278：2000。
已知用肉毒毒素可治疗某些胃肠病症和平滑肌病症。参考例如美国专利5,427,291和5,674,205(Pasricha)。此外，已知将肉毒毒素经尿道注射到膀胱括约肌可治疗排尿障碍(参考例如Dykstra D.D.等，Treatment of detrusor-sphincter dyssynergia with botulimum Atoxin：A double-blind study，Arch Phys Med Rehabil 1990年1月；71：24-6)，相同的，将肉毒毒素注射到前列腺可治疗前列腺增生。参考例如美国专利6,365,164(Schmidt)。
美国专利5,766,605(Sanders)提出用肉毒毒素治疗多种自主性病症(autonomic disorder)，如多涎和鼻炎。并且，已知鼻分泌物过多主要是由鼻腺过度活性引起的，所述鼻腺主要由胆碱能控制并且已证实向哺乳动物上颌窦鼻甲的鼻粘膜组织给药A型肉毒毒素可在鼻腺中引起暂时的凋亡。Rohrbach S.等，Botulinum toxin type Ainducesapoptosis in nasal glands of guinea pigs，Ann Otol RhinolLaryngol 2001年11月；110(11)：1045-50。并且，向患有内因性鼻炎(intrinsic rhinitis)的人类女性患者局部应用A型肉毒毒素可在五天内明显降低鼻过多的分泌物。Rohrbach S.等，Minimallyinvasive application of botulinum toxin type A in nasalhypersecretion，J Oto-Rhino-Laryngol 2001年11～12月；63(6)：382-4。
WO 95/17904(PCT/US94/14717)(Aoki)讨论了多种可用肉毒毒素治疗的疾病，如多汗和头痛。EP 0 605 501 B1(Graham)讨论了用肉毒毒素治疗大脑性麻痹，而美国专利6,063,768(First)讨论了用肉毒毒素治疗神经性炎症。
肉毒毒素除了在外周位置中具有药理作用外，在中枢神经系统中还可具有抑制作用。Weigand等，(125l-labelled botulinum Aneurotoxin：pharmacokinetics in cats after intramuscularin jection，Nauny-Schmiedeberg’s Arch.Pharmacol.1976；292，161～165)和Habermann(125l-labelled Neuro toxin from clos tridiumbotulinum A：preparation，binding to synaptosomes and ascentto the spinal cord，Nauny-Schmiedeberg’s Arch.Pharmacol.1974；281，47～56)的研究成果表明肉毒毒素能通过逆向运输升至脊髓区。同样地，在外周位置，如肌肉注射的肉毒毒素可能逆向运输到脊髓。
体外研究已表明肉毒毒素抑制钾阳离子引起的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织的原代细胞培养物中的释放。此外，据报道在脊髓神经元的原代培养物中，肉毒毒素抑制甘氨酸和谷氨酸的诱发释放，并且在脑突触小体制备物中，肉毒毒素抑制各种神经递质如乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、CGRP和谷氨酸的释放。
美国专利No.5,989,545公开了修饰的梭菌神经毒素或其片断，优选肉毒毒素，经化学共轭或重组融合到特殊靶部分后，可通过将试剂给药到脊髓用以治疗疼痛。
肉毒毒素还被推荐用于治疗多汗(流汗过多，美国专利5,766,605)、头痛(美国专利6,458,365)、偏头痛(美国专利5,714,468)、手术后疼痛和内脏疼痛(美国专利6,464,986)、疼痛(脊柱内给药)(美国专利6,113,915)、帕金森病(颅骨内给药)(美国专利6,306,403)、头发生长(hair growth)和头发保持(hair retention)(美国专利6,299,893)、牛皮癣和皮炎(美国专利5,670,484)、肌肉受损(美国专利6,423,319)、多种癌症(美国专利6,139,845)、胰腺病症(美国专利6,143,306)、平滑肌病症(美国专利5,437,291(包括将肉毒毒素注射到上下食管、幽门和肛门的括约肌))、前列腺病症(美国专利6,365,164)、炎症、关节炎和痛风(美国专利6,063,768)、青少年大脑性麻痹(美国专利6,395,277)、内耳病症(美国专利6,265,379)、甲状腺病症(美国专利6,358,513)、甲状旁腺病症(美国专利6,328,977)。此外，已知有控释的毒素植入物(美国专利6,306,423和6,312,708)。
据报道在大鼠中静脉注射肉毒毒素导致五肽胃泌素刺激酸和胃蛋白酶分泌下降。Kondo T.等，Modification of the action ofpentagastrin on acid secretion by botulinum toxin，Experientia1977；33：750-1。此外，据推测肉毒毒素可用于减少胃肠分泌物，如胃分泌物。参考WO95/17904的16～17页。并且，肉毒毒素已推荐用于在肠神经系统病症中治疗胃肠肌肉病症(美国专利5,437,291)以及治疗多种自主性病症(美国专利5,766,605)。肉毒毒素已注射到狗的胃底。Wang Z.等，Effects of botulinum toxin on gastricmyoelectrical and vagal activities in dogs，Gastroenterology2001年4月；120(5增补本1)：A-718。此外，将肉毒毒素肌肉注射到胃窦已推荐作为肥胖症的治疗方法。参考例如Gui D.等，Effects ofbotulinum toxin on gastric emptying and digestive secretions.A possible tool for correction of obesity？，Naunyn SchmiedebergsArch Pharmacol 2002年6月；365(增补本2)：R22；Albanese A.等，The use of botulinum toxin on smooth muscles，Eur J Neurol1995年11月；2(增补本3)：29～33；以及Gui D.等，Botulinum toxinin jected in the gastric wall reduces body weight and food intakein rats，Aliment Pharmacol Ther 2000年6月；14(6)：829～834。并且，A型肉毒毒素已推荐作为控制胃中分泌物的治疗方法。Rossi S.等，Immunohistochemical localization of SNAP-25 protein in thestomach of rat，Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2002；365(增补本2)：R37。
值得注意的是，据报道将肉毒毒素注射到下食管括约肌以治疗弛缓不能(achalasia)将在食管中形成溃疡。Eaker，E.Y.等，Untowardeffect of esophageal botulinum toxin injection in the treatmentof achalasia，Dig Dis Sci 1997年4月；42(4)：724-7。已知将肉毒毒素注射到幽门溃疡患者的痉挛幽门括约肌可使幽门肌打开。Wiesel P.H.等，Botulinum toxin for refractory postoperativepyloric spasm，Endoscopy 1997；29(2)：132。
破伤风毒素及其衍生物(即具有非天然的靶部分)、片断、杂合物和嵌合体也可具有治疗效用。破伤风毒素与肉毒毒素有很多相似之处。例如，破伤风毒素和肉毒毒素是由密切相关的梭菌物种(分别为破伤风梭菌和肉毒梭菌)制成的多肽。此外，破伤风毒素和肉毒毒素均是由轻链(分子量为约50kD)和重链(分子量为约100kD)组成的双链蛋白质，所述轻链和重链通过单个二硫键共价结合。因此，破伤风毒素和七种肉毒毒素(非络合的)的分子量均为约150kD。此外，对于破伤风毒素和肉毒毒素，轻链含有的域表现出细胞内生物(蛋白酶)活性，而重链含有受体结合(致免疫性的)域和细胞膜转运域。
并且，破伤风毒素和肉毒毒素在突触前胆碱能神经元的表面对神经节(gangliocide)受体表现出高特异性亲和力。由受体介导的外周胆碱能神经元对破伤风毒素的胞吞作用导致逆向轴突运输，从而阻断抑制性神经递质从中枢突触中的释放和痉挛麻痹。相反地，受体介导的外周胆碱能神经元对肉毒毒素的胞吞作用几乎未引起逆向运输，从而抑制了中毒外周运动神经元对乙酰胆碱的胞吐作用并产生松弛麻痹。
最后，破伤风毒素和肉毒毒素彼此在生物合成和分子结构上也非常相似。例如，破伤风毒素和A型肉毒毒素之间共有34％的蛋白质序列相同，而对于某些功能域，序列的同一性高达62％。Binz T.等，The Complete Sequence of Botulinum Neurotoxin Type A andComparison with Other Clostridial Neurotoxins，J BiologicalChemistry 265(16)；9153～9158：1990。
乙酰胆碱
通常在哺乳动物的神经系统中，每一种神经元仅释放一种类型的小分子神经递质。神经递质乙酰胆碱由很多脑区中的神经元分泌，但特异性地由下述神经元分泌，包括运动皮层的大锥体细胞、基底神经节中几种不同的神经元、支配骨骼肌的运动神经元、自主神经系统(交感神经和副交感神经)的神经节前神经元、副交感神经系统的神经节后神经元以及交感神经系统的某些神经节后神经元。基本上，只有通向汗腺、竖毛肌(piloerector muscle)和少数血管的神经节后交感神经纤维是胆碱能性的，而交感神经系统的大部分神经节后神经元分泌的神经递质是去甲肾上腺素。在多数情况下，乙酰胆碱具有兴奋作用。然而，已知乙酰胆碱在某些外周副交感神经末梢具有抑制作用，例如通过迷走神经抑制心率。
自主神经系统的传出信号通过交感神经系统或副交感神经系统传递到身体中。交感神经系统的神经节前神经元延伸自位于脊髓中间外侧角(intermediolateral horn)中的神经节前交感神经元细胞体。从细胞体延伸出来的神经节前交感神经纤维与位于脊椎旁的交感神经节中或椎骨前神经节中的神经节后神经元形成突触。由于交感神经系统和副交感神经系统的神经节前神经元都是胆碱能性的，因此对神经节应用乙酰胆碱将刺激交感和副交感神经节后神经元。
乙酰胆碱活化两种类型的受体，毒蕈碱和烟碱受体。毒蕈碱受体发现存在于所有由副交感神经系统的神经节后神经元以及交感神经系统的神经节后胆碱能神经元所刺激的效应细胞中。烟碱受体发现存在于肾上腺髓质以及自主神经节中，即在神经节后神经元的细胞表面上，所述神经元在交感和副交感神经系统的神经节前与神经节后神经元之间的突触中。烟碱受体还发现存在于很多非自主性神经末梢中，例如神经肌接点处的骨骼肌纤维的膜中。
当小而透明的细胞内小泡与突触前神经元细胞膜融合时，乙酰胆碱即从胆碱能神经元中释放出来。多种非神经元分泌细胞，如肾上腺髓质(以及PC12细胞系)和胰岛细胞分别从大致密核心小泡中释放儿茶酚胺和副甲状腺激素。PC12细胞系是大鼠嗜铬细胞瘤细胞的克隆，被广泛用作研究交感肾上腺发育的组织培养模型。肉毒毒素经渗透(如电穿孔一样)或直接注射到去神经细胞中后，将在体外抑制两种类型的化合物从两种类型的细胞中的释放。还已知肉毒毒素阻断神经递质谷氨酸从皮质突触小体细胞培养物中的释放。
神经肌肉接点是通过轴突接近肌肉细胞而在骨骼肌中形成的。通过神经系统传递的信号引起末端轴突处的作用电位，并活化离子通道，导致神经递质乙酰胆碱在例如神经肌肉接点的运动终板处从神经元内的突触小泡中释放出来。乙酰胆碱穿过细胞外间隙与乙酰胆碱受体蛋白在肌肉终板的表面上结合。一旦发生了足够的结合，肌肉细胞的作用电位即引起特异性的膜离子通道变化，从而导致肌肉细胞收缩。然后乙酰胆碱从肌肉细胞中释放出来并通过胆碱脂酶在细胞外间隙中代谢。代谢产物回收到末端轴突中以再加工为乙酰胆碱。
因此需要的是用肉毒毒素治疗消化性溃疡和治疗胃食管反流病的方法。
发明内容
本发明满足上述需要，提供用肉毒毒素治疗消化性溃疡和治疗胃食管反流病的方法。本发明将肌肉注射或皮下注射肉毒毒素以治疗溃疡或治疗胃食管反流病的方法排除在外，因为所述方法对患者有侵害(即内窥镜检查)并且不方便。
根据本发明，将肉毒毒素合成为口服剂型以在患有消化性溃疡的患者的胃中或十二指肠中释放毒素活性成份。肉毒毒素口服制剂的制备可易于通过如下步骤完成，将冻干的或冷冻干燥的肉毒毒素粉末与载体，如面粉、糖或明胶混合，然后将混合物压制以制得可摄取的片剂。对载体以及压制程度进行选择以使得到的片剂(或者可制得含有治疗量的肉毒毒素的胶囊，所述毒素与载体混合或不掺入载体)可用于吞咽，并且载体以及载体的特性应使载体在胃中快速溶解，以释放肉毒毒素活性成份。
肉毒毒素是A、B、C1、D、E、F和G型肉毒毒素中的一种，并且优选A型肉毒毒素。肉毒毒素可以约1单位～约10,000单位的量与载体结合。优选的与载体结合的肉毒毒素的量为约5单位～约500单位的A型肉毒毒素。当肉毒毒素是B型肉毒毒素时，优选的与载体结合的肉毒毒素的量可在约250单位～约25,000单位的B型肉毒毒素之间。
本发明的一个具体实施方案可包括口服制剂，所述口服制剂含有快速生物降解的聚合物或天然物质(即淀粉、糖或明胶)以及约5单位～约25,000单位的由载体密封的肉毒毒素，从而形成控释系统(controlled release system)，其中治疗量的肉毒毒素可在患有消化性溃疡的人类患者的胃肠系统中从载体中释放出来。
一种制造本发明范围内肉毒毒素可摄取片剂或胶囊的方法，包括如下步骤：将肉毒毒素混合到或分散于适宜的载体中以形成载体-肉毒毒素混合物；以及将载体-肉毒毒素混合物压缩到片剂中或将混合物填充到胶囊中。
本发明的另一例实施方案可为含有聚合物的载体以及与所述载体相结合的稳定的肉毒毒素，所述聚合物选自快速降解的聚交酯(polylactides)和聚乙醇酸交酯(polyglycolides)，从而形成肉毒毒素递送系统(delivery system)，其中治疗量的肉毒毒素可在口服摄取后在患者的GI系统中从载体内释放出来。载体可包括大量掺入到微球中的肉毒毒素。
根据本发明用于制备口服制剂的肉毒毒素可包括第一元件、第二元件和第三元件，其中第一元件含有能在生理条件下与神经元细胞表面受体特异性结合的结合元件，第二元件含有能促进多肽穿过神经元细胞膜转移的转运元件，第三元件含有治疗元件，当该治疗元件存在于神经元的细胞质中时，可抑制神经元对乙酰胆碱的胞吐作用。治疗元件可切割SNARE蛋白，从而抑制神经元对乙酰胆碱的胞吐作用，并且SNARE蛋白可选自突触融合蛋白、SNAP-25和VAMP。通常，受到肉毒毒素影响的神经元是支配例如GI道肌肉(平滑肌、横纹肌或混合的平滑肌和横纹GI肌)或GI道分泌腺组织的突触前胆碱能神经元。虽然胆碱能神经元可对肉毒毒素(即通过毒素受体)表现出高亲和力，但肌肉细胞和腺细胞可通过低亲和力机制(即胞饮作用)直接吸收毒素。因此，神经元和非神经元细胞均可成为肉毒毒素的靶。
在指定时期，由本发明范围内的口服制剂给药的肉毒毒素的量，对于A型肉毒毒素，可为约10-3U/kg～约35U/kg，而对于其它的肉毒毒素，如B型肉毒毒素，可为最多约2000U/kg。35U/kg或2000U/kg是上限，因为已分别接近某些神经毒素，如A型肉毒毒素或B型肉毒毒素的致死剂量。例如，据报道约2000单位/kg的市售B型肉毒毒素制品已接近B型肉毒毒素的灵长类致死剂量。Meyer K.E.等，Acomparative Systemic Toxicity Study of Neurobloc in AdultJuvenile Cynomolgus Monkeys，Mov.Disord 15(增补本2)；54；2000。
通过口服制剂给药的A型肉毒毒素的量优选为约10-2U/kg～约25U/kg。在指定时期，通过口服制剂给药的B型肉毒毒素的量优选为约10-2U/kg～约1000U/kg，因为据报道低于约1000U/kg的B型肉毒毒素可肌肉给药到灵长类动物中而不产生全身作用。出处同上。更优选地，A型肉毒毒素以约10-1U/kg～约15U/kg的量给药。最优选地，A型肉毒毒素以约1U/kg～约10U/kg的量给药。在很多实例中，给药约1单位～约500单位A型肉毒毒素提供有效的长期治疗缓解。更优选地，可使用约5单位～约300单位的肉毒毒素，如A型肉毒毒素，并且最优选地，可将约10单位～约200单位的神经毒素，如A型肉毒毒素局部给药到靶组织中以获得有效结果。在本发明具体的优选实施方案中约1单位～约100单位的肉毒毒素，如A型肉毒毒素可局部给药到靶组织中以获得治疗有效的结果。
肉毒毒素可由肉毒梭菌产生。此外，肉毒毒素可为修饰的肉毒毒素，即与天然的或野生型肉毒毒素相比，肉毒毒素可有至少一个氨基酸缺失、修饰或取代。此外，肉毒毒素可为重组产生的肉毒毒素或其衍生物或片断。
值得注意的是，肉毒毒素可由患有消化性溃疡的患者通过放置肉毒毒素口服制剂口服摄取(即通过吞咽片剂或胶囊)给药。当肉毒毒素是A型肉毒毒素时，口服给药肉毒毒素的量可在约1单位到约500单位之间，优选在10单位到300单位之间，最优选在50单位到200单位的A型肉毒毒素之间。
值得注意的是，据报道由肉毒毒素治疗的腺组织可在注射毒素后的长达27个月内表现出分泌活性降低。Laryngoscope 1999；109：1344～1346，Laryngoscope 1998；108：381～384。
定义
本发明采用如下定义。
“约”表示限定值的正负10％。
“生物相容的”表示对使用口服制剂无显著的炎症应答。
“生物活性化合物”表示可在接受给药的对象中产生有益变化的化合物。例如“生物活性化合物”包括神经毒素。
“有效量”当应用于生物活性化合物时表示通常足够在对象中产生所需变化的化合物的量。例如，当所需效果是治愈消化性溃疡时，化合物的有效量即为导致溃疡基本痊愈的量，并且未引起显著的全身毒性反应。
“有效量”当应用于口服制剂的非活性组分(如用于与肉毒毒素混合的载体)时表示非活性组分的量足以积极影响生物活性剂在所需时间段于GI道中以所需速度释放。所述“有效量”可根据说明书所述的以及本领域的一般知识确定。
“神经毒素”表示如下试剂，它可中断神经脉冲传递穿过神经肌肉或神经腺体接头，阻断或降低神经递质的神经元胞吐作用或在神经元的钠通道电压门(voltage gate)改变作用电位。神经毒素的实例包括肉毒毒素、破伤风毒素、蛤蚌毒素和河豚毒素。
“治疗”表示哺乳动物中疾病的任何治疗，并且包括：(i)预防疾病发生；或(ii)抑制疾病，即抑制其发展；(iii)缓解疾病，即降低疾病症状的发生率或导致疾病消退。
一种使用本发明范围内口服制剂的方法，可包括经患者摄取口服肉毒毒素制剂后在患者GI道中提供治疗有效水平的生物活性神经毒素。
通常，本发明包括治疗消化性溃疡的方法，通过给药肉毒毒素从而治疗胃溃疡。所述肉毒毒素可选自A、B、C、D、E、F和G型肉毒毒素并且消化性溃疡可为胃溃疡或十二指肠溃疡。
通过口服摄取肉毒毒素到患有消化性溃疡的患者中给药毒素并且肉毒毒素以治疗有效量给药。本发明的具体实施方案可包括治疗消化性溃疡的方法，即由患有消化性溃疡的患者口服摄取治疗有效量的A型肉毒毒素。本发明还包括治疗胃食管反流病的方法，即由患有胃酸反流病的患者口服摄取肉毒毒素。
本发明范围内的肉毒毒素口服制剂可包括肉毒毒素以及与肉毒毒素结合的载体，从而形成肉毒毒素口服制剂，其中载体制成在患有胃溃疡的患者的胃肠道中释放治疗量的肉毒毒素，而无显著的免疫系统应答。其中优选地，在肉毒毒素与载体结合前，大量肉毒毒素未转变为肉毒类毒素。因此，相当量的与载体结合的肉毒毒素，其毒性和肉毒毒素与载体结合前的肉毒毒素的毒性相比基本未变。
并且，在上述口服制剂中，载体可包括生物相容的，可生物降解的物质，所述物质选自面粉、糖和明胶。与载体结合的肉毒毒素可在约1单位到约10,000单位的肉毒毒素之间。
本发明范围内的具体口服制剂可包括肉毒毒素，所述肉毒毒素可具有第一元件、第二元件和第三元件，其中第一元件含有能在生理条件下与神经元细胞表面受体特异性结合的结合元件，第二元件含有能促进多肽穿过神经元细胞膜转移的转运元件，第三元件含有治疗元件，当该治疗元件存在于神经元的细胞质中时，可抑制神经元对乙酰胆碱的胞吐作用。
本发明范围内的另一例实施方案可包括A型肉毒毒素以及与所述A型肉毒毒素相结合的载体，从而形成肉毒毒素口服制剂，其中载体制成在患有胃溃疡的患者的胃肠道中释放治疗量的A型肉毒毒素，而无显著的免疫系统应答，并且其中载体包括生物相容的、可生物降解的物质，所述物质选自面粉、糖和明胶。
具体实施方式
本发明基于消化性溃疡可用肉毒毒素口服制剂成功治疗的发现。本发明还基于胃食管反流病可用肉毒毒素口服制剂治疗的发现。例如，申请人发现摄取肉毒毒素，如A型肉毒毒素，与在胃中或上部肠中溶解的适宜载体混合，可将治疗量的生物活性肉毒毒素递送到消化性溃疡及其附近。这使得消化性溃疡及其附近过多或受损的胃分泌有所缓解。通常，在其后数天内，溃疡表现出明显的治愈(溃疡消退)迹象并且可在口服肉毒毒素制剂给药后的数周内完全痊愈。此外，申请人还发现在口服毒素给药后的数天内，由口服给药肉毒毒素引起的胃分泌降低导致GERD症状消退。副作用可包括胃肠肌运动减少以及体重暂时下降。
申请人对口服给药的肉毒毒素可用于治疗消化性溃疡和/或GERD的发现是令人惊讶的，因为据报道将肉毒毒素注射到下部食管括约肌以治疗迟缓不能(achalasia)实际上导致在食管中形成溃疡(Eaker，E.Y.等，Untoward effects of esophageal botulinum toxin injectionin the treatment of achalasia，Dig Dis Sci 1997年4月；42(4)：724-7)。
肉毒毒素口服给药的治疗剂量应使由肠衬里吸收到循环系统的任何肉毒毒素仅引起微弱的或不显著的全身作用。因此，200单位的肉毒毒素可注射到患有糖尿病性胃轻瘫(diabetic gastroparesis)患者的幽门(胃下端)括约肌而不会在以后产生任何全身毒性。Crowell，M.D.等，Botulinum toxin reduces pyloric dysfunction in patientswith diabetic gastroparesis，Gastroenterology 2002年4月；122(4增补本1)：A451～A452。虽然没有证据表明肉毒毒素有畸胎形成作用，但这里公开的本发明范围内的方法不打算用于如下患者，包括孕妇、护理人员或计划在治疗期间受孕的人。
由于不希望受到理论的束缚，可对本发明的功效提出如下生理机制。例如，已熟知肉毒毒素作用于胆碱能神经，包括胃肠道中促使GI肌肉运动的胆碱能神经。Pasricha，P.J.，Botulinum toxin forspastic gastrointestinal disorders，Bailliere’s ClinGastroenterol 1999；13(1)：131～143。此外，胃壁细胞分泌胃泌素和产生HCl极大地取决于迷走神经以及在胃肠道中作用于神经腺体接头的肠肌层纤维的胆碱能活性。Rossi S.等，Immunohistochemicallocalization of SNAP-25 protein in the stomach of rat，NaunynSchmiedebergs Arch Pharmacol 2002；365(增补本2)：R37。并且，A型肉毒毒素BTX-A的细胞内底物(SNAP-25)存在于胃壁细胞中。GuiD.等，Effects of botulinum toxin on gastric emptying anddigestive secretions.A possible tool for correction ofobesity？，Naunyn Schiedebergs Arch Pharmacol 2002年6月；365(增补本2)：R22。最后，已熟知溃疡形成是由胃壁细胞分泌过多的胃泌素引起或促成的并且肉毒毒素。因此，肉毒毒素的口服制剂可用于治疗消化性溃疡，例如通过下调过多的胃酸分泌，从而使溃疡愈合。
显而易见地，口服给药的肉毒毒素可在GI道苛刻的环境中保留其生物活性。例如，肉毒梭菌分泌的肉毒毒素是一种络合物，该络合物包括由大量非毒素蛋白分子包围的约150kDa的单链蛋白毒素分子。值得注意的是，非毒素蛋白用以保护毒素，使其在络合物穿过GI道时免于酸水解以及酶降解，因此毒素络合物能在极端pH以及蛋白酶解酶等苛刻的条件下存活并仍然用作高度有效的神经毒素。已证实与肉毒毒素分子络合的非毒素蛋白用于在胃肠道中保护150kDa的毒素分子，使其免受消化酸。Hanson，M.A.等，Structural view of botulinumneurotoxin in numerous functional states，Brin M.F.等编辑的Scientific and therapeutic aspects of botulinum Toxin的第二章，11～27页，Lippincott，Williams&Wilkins(2002)。
本发明范围内的肉毒毒素递送系统能将治疗量的肉毒毒素释放到患有消化性溃疡的患者的GI道中，如图1所示。释放的肉毒毒素的量可包括(对于A型肉毒毒素)仅约10单位(即治疗婴儿中的小溃疡)到高达500单位(即治疗高大成年人中的多发性消化性溃疡)。疗效所需的肉毒毒素的量可根据不同肉毒毒素血清型已知的临床效能变化。例如，通常需要高几个数量级的单位的B型肉毒毒素以获得可与使用A型肉毒毒素相当的生理作用。
由本发明范围内的口服制剂以治疗有效量释放的肉毒毒素优选为基本有生物活性的肉毒毒素。换言之，由所公开的口服制剂在患者的GI道中释放出来的肉毒毒素能以高亲和力结合胆碱能神经元并至少有部分穿过神经元膜转运，而且通过其在神经元细胞质中的活性抑制神经元对乙酰胆碱的胞吐作用。本发明的目的在于允许肉毒毒素在GI道中从口服制剂中释放出来以在体内抑制胞吐作用，从而达到所需疗效，即治愈溃疡。
口服制剂制成使肉毒毒素基本均匀地分散在可生物降解的载体中。口服制剂的厚度可用以控制本发明组合物对水的吸收，从而控制神经毒素从本发明组合物中释放出来的速度，药片较厚的胶囊对多肽的释放慢于较薄的胶囊。载体优选由无毒性的、非致免疫性的、生物相容的物质组成。
生物活性神经毒素从本发明口服制剂中的释放产生可忽略血清水平但有治疗作用的生物活性神经毒素。优选地，生物活性神经毒素在体内于GI道中的释放不引起显著的免疫系统应答。
本发明的神经毒素口服制剂可制成多种形状，如薄膜、丸剂、圆柱体或圆片。
适于给药的口服制剂的具体剂量易于由所属技术领域的普通技术人员根据上述因素确定。剂量还可取决于待治疗的或去除神经支配的组织块的大小以及毒素的商用制品。此外，对人类中适宜剂量的估算可由所确定的其它组织有效去除神经支配所需的肉毒的量外推得到。例如，待注射的A型肉毒的量与治疗组织的质量以及活性水平成比例。通常，本发明的口服制剂可释放约0.01单位/kg～约35单位/kg患者体重的肉毒毒素，如A型肉毒毒素以有效实现所需的溃疡治愈。低于约0.01U/kg的肉毒毒素对肌肉无显著疗效，而约35U/kg以上的肉毒毒素接近神经毒素，如A型肉毒毒素的毒性剂量。仔细制备口服制剂可防止全身出现显著量的肉毒毒素。更优选的剂量范围为约0.01U/kg～约25U/kg的肉毒毒素，如制成的BOTOX。待给药的肉毒毒素的实际量(U/kg)取决于如下因素，如待治疗组织的范围(质量)和活性水平以及所选择的给药途径。本发明方法中优选使用的肉毒毒素血清型是A型肉毒毒素。
用于实施本发明范围内方法的神经毒素优选为肉毒毒素，如血清型A、B、C、D、E、F或G肉毒毒素中的一种。优选使用的肉毒毒素是A型肉毒毒素，因为其在人类中的效能高、易于获得，并且已知当其通过肌肉注射局部给药时对于治疗骨骼肌和平滑肌病症是安全有效的。
本发明范围包括任何神经毒素的用途，所述神经毒素在用于治疗消化性溃疡时，其疗效的持续时间长。例如，由任何种类的产生毒素的梭菌，如肉毒梭菌、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和巴氏梭菌(Clostridium beratti)所产生的神经毒素均可用于或适用于本发明方法中。并且，所有肉毒血清型A、B、C、D、E、F和G型均可方便地用于实施本发明，虽然如上所述A型是最优选的血清型。通过本发明公开的方法实施本发明可使消化性溃疡治愈并消失。
本发明范围包括：(a)神经毒素络合物以及由下列方法获得或处理的纯神经毒素，所述方法包括培养细菌、提取毒素、浓缩、保存、冷冻干燥和/或复原；以及(b)修饰的或重组的神经毒素，通过已知的化学/生物化学氨基酸修饰方法或通过使用已知的宿主细胞/重组载体的重组技术使神经毒素有一个或多个氨基酸或氨基酸序列故意缺失、修饰或取代以及由此制造的神经毒素的衍生物或片断，并且包括具有一个或多个附着靶部分的神经毒素，所述靶部分针对存在于细胞上的细胞表面受体。
根据本发明使用的肉毒毒素可以冻干或真空干燥的形式减压存储于容器中。在冻干前，肉毒毒素可与药用赋形剂、稳定剂和/或载体，如白蛋白结合。冻干或真空干燥的物质可用盐水或水复原。
确定适宜剂量的方法通常由主治医师根据各个病例的基本情况决定。上述确定过程是所属技术领域的普通技术人员的日常事务(参考，例如，Harrison’s Principles of Internal Medicine(1998)，AnthonyFauci等编辑，第14版，McGraw Hill发行)。
本发明范围还包括用于摄取的悬浮液形式的口服制剂，其制备是通过将神经毒素密封的微球悬浮在适宜的液体，如生理盐水中。
                        实施例
下列实施例提出本发明所包括的具体组合物和方法，但不用于限制本发明的范围。
                        实施例1
        制造用于口服摄取的肉毒毒素片剂的方法
肉毒毒素可合成为用于将毒素活性成份释放到胃或十二指肠中的口服制剂。通过下述方法易于达到上述目的：用乳钵和研棒混合(在室温下，不加入任何水或盐水)50单位的市售冻干的肉毒毒素粉末，如非复原的BOTOX(或200单位的DYSPORT粉末)与可生物降解的载体，如面粉或糖。或者，可通过均化法或声裂法混合肉毒毒素以在载体中形成粉末毒素的均匀分散系。然后用制片机(如压片机，可从Schen&Kniss购得，1500W.Ormsby Ave，路易斯维尔，KY40210)压缩混合物即制得可摄取的片剂。或者，可通过已熟知的方法用明胶配制毒素以生产可摄取的明胶片剂(geltab)。
                      实施例2
               治疗消化性溃疡的方法
一名52岁的老年男性在胸骨和肚脐之间的腹部有灼痛，并且他说疼痛经常发生在两顿饭之间以及早晨较早的时候。患者还诉苦说恶心并且没有食欲。内窥镜检查，并用钡X射线辅助检查证实患有胃溃疡。所述溃疡经证实难以用H2阻断剂以及幽门螺杆菌的抗生素治疗。给药实施例1的肉毒毒素口服制剂以治疗患者。例如，患者每四天吞服一片50单位的A型片剂。两周内消化性溃疡的症状消失，并且内窥镜检查显示无溃疡的痕迹。
                      实施例3
               治疗胃食管反流病的方法
一名62岁的老年肥胖女性表现出有心痛、近似连续打嗝、食物回流、喉咙痛、吞咽困难和咳嗽的症状。检查表明有食管炎并且食管测压术显示食管括约肌压力低(较低)(LES)。Bernstein检测对胃酸反流呈阳性。因此，诊断是患有GERD。患者多次减肥均不成功，并且定期摄取巧克力，还常吸烟。抗酸剂和组胺H2受体阻断剂都无效。通过给药实施例1的肉毒毒素口服制剂治疗患者。例如，患者每四天吞服一片2000单位的B型片剂。在两周内，GERD症状消失或已基本减轻。
本发明公开的组合物和方法有很多优点，如下所述：
1.肉毒毒素口服制剂可用于提供有疗效的消化性溃疡的治疗。
2.降低了患者对跟踪看护的需求。
3.由于消除了对任何注射的需求，从而提高了患者的舒适感。
4.使患者更愿意配合治疗。
本发明神经毒素口服制剂的优点包括长期消退溃疡。
本发明引用的所有参考文献、论文、公开物和专利及专利申请均以援引的方式完整纳入。
虽然本发明对某些优选方法进行了详细描述，但其它实施方案、变体及改进也可能落入本发明的范围中。例如，多种神经毒素可有效用于本发明方法中。此外，本发明包括如下口服制剂，即其中两种或多种神经毒素，如两种或多种肉毒毒素同时或依次给药。例如，A型肉毒毒素可通过口服制剂给药直至丧失临床应答或出现中和抗体，然后通过B型或E型肉毒毒素口服制剂继续给药。或者，可局部给药任何两种或两种以上的肉毒血清型A-G的组合以控制所需疗效的开始和持续时间。并且，在给药神经毒素口服制剂之前、同时或之后可给药非毒素化合物以提供附加效果，例如在神经毒素，如肉毒毒素开始发挥其疗效前，促进或加速去神经支配作用的发作。
本发明范围还包括神经毒素，如肉毒毒素在制备治疗消化性溃疡的口服制剂药物中的用途。
因此，所附权利要求的精神和范围应不限于上述优选实施方案的描述。

Claims (4)

1.肉毒毒素用于生产治疗胃食管反流病的药物的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述药物是通过口服摄取的。
3.权利要求1或2的用途，其中所述肉毒毒素选自A、B、C、D、E、F和G型肉毒毒素。
4.权利要求1或2的用途，其中所述肉毒毒素是A型肉毒毒素。
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