CN100344650C

CN100344650C - 一种细胞质膜标记化合物及其制备方法

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Publication number: CN100344650C
Application number: CNB2005100240557A
Authority: CN
Inventors: 余龙; 杨晨怡; 唐丽莎
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2007-10-24
Anticipated expiration: 2025-02-25
Also published as: CN1824673A

Abstract

本发明属于化学领域，具体的说，本发明提供了一种细胞质膜标记化合物TDE2CD1。此外，本发明还提供了该细胞质膜标记化合物的制备方法。本发明的TDE2CD1集中表达在细胞质膜上，而且不影响细胞的正常生理活动，因此可以作为一种细胞质膜标记物。首先，在研究细胞变化用酒精固定细胞时，将目的蛋白或染料与TDE2CD1耦联，从而避免了目的蛋白或染料流失。其次，如果发现有蛋白与本发明的TDE2CD1表达部位相同，那么这种蛋白也在细胞质膜上有表达。这对于基因表达定位的研究与验证是非常简便与高效的。另一方面，本发明的TDE2CD1可以用于显现细胞轮廓，因此，本发明的TDE2CD1对诊断由细胞形状异常引起或临床症状表现为细胞形状异常的疾病，将成为一种新的途径和方法。

Description

一种细胞质膜标记化合物及其制备方法

技术领域

本发明属于化学领域，具体的说，本发明提供了一种细胞质膜标记化合物TDE2CD1。此外，本发明还提供了该细胞质膜标记化合物的制备方法。

背景技术

细胞膜蛋白在细胞多种生理功能，比如细胞分裂，细胞运动和凋亡过程中起非常重要的作用。膜蛋白可以作为细胞表面的受体或者转运蛋白参与信号传递，物质代谢，如果发生表达变异，可以促使细胞的恶性转化。随着人类功能基因组计划的进行，越来越多的新的细胞膜蛋白被克隆鉴定并提示在人类肿瘤组织和细胞株中有差异表达。TMS_TDE家族就是近几年发现的一类与肿瘤差异表达相关的跨膜蛋白家族。该类蛋白具有11个跨膜结构域，均包含一个“Myc-type helix-loop-helix”功能结构域。

MT-PVLT-10转基因小鼠能够表达多聚巨病毒的大T抗原，随着年龄的增长，其雄性小鼠品系往往会伴有睾丸肿瘤的发生和精囊充血的现象，1994年Lebel等人在其雄鼠品系的肝、脑、睾丸的cDNA库中克隆到一转录本为2.6kb的基因(over expressed in testicular tumor，Oett)，并发现其在睾丸瘤细胞株中的表达量是对照细胞株中的2-15倍，该小鼠基因编码393个氨基酸，对其功能域分析发现其编码的是含有若干疏水α-螺旋的跨膜蛋白。提示该基因很可能是一种潜在的癌基因。1999年该实验室根据同源筛选在人的胎盘cDNA文库中克隆得到人的肿瘤差异表达基因(tumordifferentially expressed gene，TDE)，该基因位于20q13.1-13.3，氨基酸序列与小鼠比较有78％同源度，也含有若干个疏水α-螺旋，提示是一个跨膜蛋白。在多种组织和细胞株中均有表达，在肺癌中呈上调表达^[9]。在结肠癌细胞株中转录水平低于正常表皮细胞。2002年Waston等人发现TDE的转录调控受到转录因子c-myc的调节，c-myc的表达可以使TDE表达下降。2003年JEN等人利用SAGE方法检测非小细胞肺癌中基因表达差异时，克隆得到人的TDE2L基因，该基因位于1p35.1，氨基酸序列与人TDE基因有60％的同源度，同样发现在非小细胞肺癌中TDE2的表达量比癌旁组织的高，呈上调趋势。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞质膜标记化合物。

本发明的另一个目的是提供一种上述细胞膜质标记化合物的制备方法。

本发明提供了一种细胞质膜标记化合物，它是一种蛋白多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

细胞质膜标记化合物人TDE2CD1是一种蛋白。在本发明中，术语“人TDE2CD1蛋白”除了SEQ ID NO 2所示序列外，还包括集中表达在细胞质膜上的SEQ ID NO 2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。

本发明还提供了一种核苷酸分子，所述的核苷酸分子序列编码一多肽，该多肽序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的一个实施例中提供了一种核苷酸分子，其核苷酸分子序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中，术语“TDE2CD1编码序列还包括SEQ ID NO 1的各种变异体。如，核苷酸序列SEQ ID NO 1中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ IDNO.1中1-108位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ IDNO.7所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-108位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，更佳地能在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-105位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-105位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

本发明还提供了一种质粒，该质粒含有TDE2CD1编码序列。

本发明还提供了一种上述的细胞质膜标记化合物的制备方法，该方法包括：

(a)将TDE2CD1编码序列的可操作地连于表达调控序列，形成表达载体；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成重组细胞；

(c)在适合表达细胞质膜标记化合物的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出细胞质膜标记化合物TDE2CD1。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

具体而言，可以用人TDE基因的cDNA序列为信息探针在人类EST数据库中筛选，获得若干与之有高度同源性的EST，利用GCG等软件构建EST-congtig图，拼接出一条TDE2的全长cDNA的序列。根据该序列设计引物，以适当的原料为模板，即可得到TDE2CD1编码序列(见SEQ ID NO 1)。

本发明中，适当的原料可以是含有TDE2CD1的各种生物材料，如人类的组织cDNA文库、基因组、细胞提取物、质粒、核苷酸序列等等。

通过与加强型绿色荧光蛋白(EGFP，enhanced green fluorescentprotein)耦联，清楚的显示本发明的TDE2CD1集中表达在细胞质膜上。在生物发光的水母中，当能量从Ca²⁺激活的水母发光蛋白转移到绿色荧光蛋白GFP时，水母就能发光。因此，当GFP在真核或原核细胞中表达时，如受到蓝光或紫外光的照射，会产生一种明亮的绿色荧光。目前，GFP作为一种新的报告系统，在基因表达和蛋白定位的研究中得到了广泛的应用。通常GFP蛋白是均匀分布在细胞质和细胞核内的，但如果将GFP蛋白接上特定的转运信号，那么GFP将会被这些信号带到特定的位置。EGFP作为一种加强型GFP，其绿色荧光更不容易淬灭。用加强型绿色荧光蛋白EGFP标记人TDE2CD1基因，构建TDE2CD1-EGFPN1重组子，将重组子和作为对照的未融合任何蛋白的EGFP分别转染各类细胞株，CO₂培养箱中培养48小时，转染细胞贴壁在培养皿内的盖玻片上。共聚焦显微镜下观察(激发波长510nm)发现，转染TDE2CD1-EGFPN1质粒的细胞中，绿色荧光集中分布在细胞质膜，而转染作为对照的未融合任何蛋白的EGFPN1质粒的细胞中绿色荧光则呈全细胞均匀分布。这提示TDE2CD1可以作为一个细胞质膜的特异标记加以使用。

本发明的TDE2CD1集中表达在细胞质膜上，而且不影响细胞的正常生理活动，因此可以作为一种细胞质膜标记物。首先，TDE2CD1重组质粒标记的蛋白不易丢失。比如在进行细胞周期检测时，转染普通EGFP，一旦酒精固定就流失，从而失去了标记的作用；而共同转染的TDE2CD1-EGFP就可以标记在膜上不被丢失。其次，如果发现有蛋白与本发明的TDE2CD1表达部位相同，那么这种蛋白也在细胞质膜上有表达。这对于基因表达定位的研究与验证是非常简便与高效的。另一方面，本发明的TDE2CD1可以作为细胞质膜的形态标记。将本发明的TDE2CD1与待检的细胞组织样品共同处理，可以显现细胞轮廓，因此，本发明的TDE2CD1对诊断由细胞形状异常引起或临床症状表现为细胞形状异常的疾病，将成为一种新的途径和方法。

附图说明

图1为TDE2CD1-EGFP融合蛋白的示意图。TDE2-EGFP融合蛋白由TDE2CD1和EGFP依次排列组成。

图2为TDE2CD1-EGFP质粒转染QGY细胞后共聚焦激光扫描显微镜视图。可见，绿色荧光集中分布在细胞质膜。这说明TDE2CD1集中表达在细胞膜上。

图3为阴性对照N1-EGFP质粒转染QGY细胞后共聚焦激光扫描显微镜视图。可见，绿色荧光则呈全细胞均匀分布，这说明未与TDE2CD1连接的EGFP在细胞所有部位都有表达。从而验证了TDE2CD1-EGFP融合蛋白之所以集中表达在细胞膜上完全是由于TDE2CD1表达的缘故。

具体实施方式

实施例一 TDE2CD1的制备

通过EST同源筛选的方法，用人TDE基因的cDNA序列为信息探针在人类EST数据库中筛选，获得若干与之有高度同源性的EST，利用GCG软件构建EST-congtig图，拼接出一条3108bp的cDNA的序列，并在预测可能的开放阅读框(ORF)的5’和3’端设计特异扩增引物TDE2-A，TDE2-B(TDE2-A：5`-TCTGTATCCGCTGCTCTTGTGACG-3`，TDE2-B：5`-CATGCTAGAAGTCTCACTCAGTC-3`)分别从人的脑，胎盘，睾丸，肝等组织cDNA文库中扩增得到特异条带，将获得的PCR产物克隆到pGEM-T，经测序与拼接cDNA序列一致。该cDNA序列全长3199bp，其中含有一个1359bp的开放阅读框架(ORF)，编码453个氨基酸。序列比较分析表明，它与人类TDE1基因有较高的同源性，因此我们将其命名为TDE2。我们将该基因的cDNA序列以及其他相关信息登录NCBI的GenBank数据库，得到的登录序列号为(AF087902)。

将TDE2基因编码序列插入EGFP-N1载体，并以TDE2-EGFPN1重组质粒为模板，以TDE2-EGFPN1-A/C1-B(EGFP-TDE2-A：5`-TTCGAATTCTGATGGGGAGCGTCCTGG-3`；EGFP-TDE2-C1B：5’-CCTGGATCCCGCAGTGGAGTTGTTTCCA-3’)为引物对同样进行PCR扩增产物纯化后用EcoR I和BamH I双酶切，得到SEQ ID NO 1所示序列。

实施例二 TDE2的亚细胞定位

SEQ ID NO 1所示序列纯化后连接转化入类似双酶切的pEGFP-N1质粒，形成重组的TDE2CD1-EGFP质粒，如图1所示。按脂质体转染的方法，将作为阴性对照的EGFP-N1质粒和重组的TDE2CD1-EGFP质粒分别转染哺乳动物细胞。转染后48小时从培养皿中取出载有转染好的贴壁细胞的盖玻片，1×PBS轻洗，置于共聚焦激光扫描显微镜载物台上观察，并做断层扫描，分析融合蛋白的分布。激发光波长488nm/510nm。具体结果见图2和图3。

序列表

<210>1

<211>108

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(108)

<223>

<400>1

atg ggg agc gtc ctg ggg ctg tgc tcc atg gcg agc tgg ata cca tgt 48

Met Gly Ser Val Leu Gly Leu Cys Ser Met Ala Ser Trp Ile Pro Cys

1 5 10 15

ttg tgt gga agt gcc ccg tgt ttg cta tgc cga tgc tgt cct agt gga 96

Leu Cys Gly Ser Ala Pro Cys Leu Leu Cys Arg Cys Cys Pro Ser Gly

20 25 30

aac aac tcc act 108

Asn Asn Ser Thr

35

<210>2

<211>36

<212>PRT

<213>人类

<400>2

Met Gly Ser Val Leu Gly Leu Cys Ser Met Ala Ser Trp Ile Pro Cys

1 5 10 15

Leu Cys Gly Ser Ala Pro Cys Leu Leu Cys Arg Cys Cys Pro Ser Gly

20 25 30

Asn Asn Ser Thr

35

Claims

1.一种细胞质膜标记化合物，其特征在于，它是一种蛋白多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种核苷酸分子，其特征在于，所述的核苷酸分子序列编码一多肽，该多肽序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求2所述的核苷酸分子，其特征在于，所述的核苷酸分子序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种质粒，其特征在于，该质粒含有权利要求2所述核苷酸分子序列。

5.一种权利要求1所述的细胞质膜标记化合物的制备方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将权利要求2所述的核苷酸分子的序列可操作地连于表达调控序列，形成表达载体；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成重组细胞；

(c)在适合表达权利要求1所述的细胞质膜标记化合物的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出权利要求1所述的细胞质膜标记化合物。