CN100340670C

CN100340670C - 碳纳米管的生物学应用

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Publication number: CN100340670C
Application number: CNB2004101025746A
Authority: CN
Inventors: 阎锡蕴; 高利增; 王太宏; 聂棱
Original assignee: Institute of Biophysics of CAS
Current assignee: Institute of Biophysics of CAS
Priority date: 2004-12-24
Filing date: 2004-12-24
Publication date: 2007-10-03
Anticipated expiration: 2024-12-24
Also published as: CN1796567A

Abstract

本发明提供了一种碳纳米管提高基因扩增产率和基因转化(转染)率的新方法，包括：(1)将新型纳米材料-碳纳米管引入基因扩增系统，如DNA聚合酶链式基因扩增反应系统，能够有效促进基因扩增，提高基因扩增产率；(2)在基因导入原核细胞的过程中，加入碳纳米管，能够将原核细胞的基因转化效率提高7倍；(3)在基因导入真核细胞中，使用碳纳米管能够将携带外源基因的载体导入真核细胞，从而为真核细胞转染提供了一种新的方法。本发明不仅为基因扩增和基因导入细胞提供了一种高效、简便、经济的新方法，而且为基因诊断和基因治疗提供了一条新途径。

Description

碳纳米管的生物学应用

技术领域

本发明涉及纳米材料学与分子生物学和基因治疗的交叉学科。更具体地，本发明涉及碳纳米管在分子生物学和基因治疗等中的应用。

背景技术

在分子生物学和基因治疗的有关技术中，如在基因扩增和基因的转化或转染中，实验产率或效率的提高可以极大地推动相关研究的进展。

体外基因扩增法又称聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，是80年代中期开创的一种新技术，它能在一个反应试管中将所要研究的目的基因或DNA片段在短短数小时内扩增上百万倍，可以直接用于基因的分离和分析，是分子生物学中一项革命性技术。其原理是利用两种寡核苷酸引物分别与特异性DNA区段的正链和负链末端互补，经过模板DNA变性，模板DNA-引物配对，在DNA聚合酶作用下发生引物链的延伸发应，三个反应阶段导致新互补链的合成。引物链的延伸产物与原来模板DNA经加热变性后，作为模板DNA和另一种引物互补，在DNA聚合酶作用下又发生引物链的延伸反应，如此反复循环数十次，可使特异性DNA区段以几何级数倍增。反应体系包括(参见J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔，《分子克隆实验指南》第二版672页)：被检测的DNA片段，即模板；两条分别与被检测的DNA片段正链和负链末端互补的寡核苷酸引物链(一般为20个核苷酸左右)；四种dNTP；DNA聚合酶；MgCl₂，反应缓冲液和水。基因扩增技术在疾病诊断和法医鉴定方面起着重要作用。例如，在一些感染性疾病中，确定致病病原体(如HIV病毒和SARS病毒)；在肿瘤患者体内，检测某些癌基因的存在；在法医DNA指纹个体识别和亲子关系鉴定等等都涉及基因扩增技术。另外，基因扩增技术在考古研究领域应用极为广泛。因此，提高基因扩增效率是增加基因诊断灵敏度和提高基因治疗成功率的关键，也是研究人员一直探索的一个重要课题。

而基因的转化或转染是指把外源基因导入宿主细胞并使其在宿主细胞中发挥作用，将外源基因导入原核细胞称为转化，将外源基因导入真核细胞称为转染，这是生命科学研究领域中一种常用的重要技术和方法，也是基因治疗的首要和关键技术(附图1)。因此，开发新的细胞转染方法和提高基因的转化效率一直是生命科学研究和基因治疗临床研究的重要课题。目前用于原核细胞基因转染的常用技术是氯化钙法和电穿孔法，转化率最高可达109。用于真核细胞基因转染的方法包括磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、聚阳离子-DMSO转染法、脂质体转染法、电穿孔法、显微注射法、原生质体融合法、病毒介导的转染法。这些方法都是通过物理和化学成分影响细胞膜，改变细胞膜的通透性，使外源基因进入细胞，但转化效率不高。表1将各种转染方法的主要特点进行了比较。

表1.几种常用转染方法的主要特点的比较

转染方法	主要应用	特点
转染方法	主要应用	特点	DEAE-葡聚糖法	瞬时转染	操作简便、重复性较好。但对细胞有一定的毒副作用，而且对转染细胞系有限制
磷酸钙法	稳定转染、瞬时转染	操作简便但重复性差，不适用于原代细胞，而且对转染细胞系有限制	DEAE-葡聚糖法	瞬时转染	操作简便、重复性较好。但对细胞有一定的毒副作用，而且对转染细胞系有限制
磷酸钙法	稳定转染、瞬时转染	操作简便但重复性差，不适用于原代细胞，而且对转染细胞系有限制	阳离子脂质体法	稳定转染、瞬时转染	方法简单，可携带大片段DNA，能转染各种类型的细胞，但毒性较大
阳离子聚合物	稳定转染、瞬时转染	转染效率高，操作简单，适用各种类型的细胞，易重复，细胞毒性低	阳离子脂质体法	稳定转染、瞬时转染	方法简单，可携带大片段DNA，能转染各种类型的细胞，但毒性较大
阳离子聚合物	稳定转染、瞬时转染	转染效率高，操作简单，适用各种类型的细胞，易重复，细胞毒性低	病毒介导法	稳定转染、瞬时转染	用于难转染的细胞，携带基因不能太大，安全性低

显微注射法	稳定转染、瞬时转染	操作技术性强，转染细胞数有限，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞
显微注射法	稳定转染、瞬时转染	操作技术性强，转染细胞数有限，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞	电穿孔法	稳定转染、瞬时转染	操作简便，但需要特定的仪器设备；适用性广，除了质粒外，还可转染大的基因组；适用各种类型的细胞，但细胞致死率高

真核细胞转染方法在基因表达、基因治疗和DNA疫苗的应用中都具有重要意义，在开发新的转染方法时，不仅要考虑转染的效率的高低，还要考虑转染材料对细胞乃至活体的毒性大小，所以尽管目前开发的真核细胞转染方法已经有很多，但都具有缺陷，不能满足现在实验和临床的需要。比如目前常用的脂质体Lipofectamine 2000转染试剂，虽然具有较高的转染效率，但对细胞毒性比较大，因此仅比较适合体外细胞转染。新的转染方法的开发和建立有助于这些问题的解决。

发明内容

针对上述研究背景，本发明人通过深入研究，突破了化学和分子生物学的局限性，从一个新的视角把新型碳纳米管(carbon nanotube，CNT)材料引入分子生物学技术，有效地提高了基因扩增的产率和基因转化或转染的效率。

因此，本发明的一个目的是提供碳纳米管在提高PCR基因扩增产率中的应用，其中在PCR反应体系中加入碳纳米管。优选所述碳纳米管是羧基或羟基修饰的碳纳米管。

本发明另一个目的是提供碳纳米管在提高原核细胞的基因转化效率中的应用，其中在基因转化体系中加入碳纳米管。优选所述碳纳米管是羧基或羟基修饰的碳纳米管。

本发明还有一个目的是提供碳纳米管在提高真核细胞的基因转染效率中的应用，其中在碳纳米管的存在下将携带外源基因的载体导入真核细胞。优选所述碳纳米管是氨基修饰的碳纳米管。

本发明的上述应用可以是用于法医鉴定、疾病诊断、基因治疗和细胞治疗领域。

本发明与传统的PCR反应相比，其特点在于PCR反应中引入了碳纳米管材料。这种策略是基于两点理论基础：(1)碳纳米管与DNA相互作用。碳纳米管表层是碳原子组成的六元环或五元环，能够与DNA形成π-π键，同时碳纳米管表面的羧基能够与DNA形成氢键(Nature Materials，2003，2，338-342)(2)碳纳米管与PCR反应中的酶相互作用(Nanotechnology15：154，2004)。碳纳米管可与蛋白酶的疏水界面通过疏水作用与之结合，亦可借助羧基或羟基与蛋白酶形成氢键。这一新技术的发明不仅推动纳米生物学的发展，而且为控制疾病的传播途径、明确癌症的诊断和治疗、指导临床用药提供了新方法和新途径。

本发明的特色在于利用碳纳米管与DNA相互作用以及碳纳米管与细胞膜相互作用的特点，建立了以碳纳米管为介质的新的转染方法，并把这种方法应用于原核和真核两个基因转化系统，通过碳纳米管的作用促进基因的转化或转染，从而有效提高基因转化率。本发明应用于原核细胞的基因转化，能够使基因转化效率提高10倍。本发明应用碳纳米管成功地实现了真核细胞的基因转染，建立了一种新型的真核细胞基因转染方法。本发明适用于任何一种基因在不同细胞中的转化。本发明与传统基因转化或转染方法相比，使原核基因转化率明显提高，而且碳纳米管应用于真核细胞转染是一种新型的转染方法，这不仅丰富了分子生物学技术，而且在基因治疗中具有重要的应用价值。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应理解为是对本发明进行限定。

图1.基因转化或转染在生物和医学中的应用；

图2.羧基修饰的多壁碳纳米管对PCR扩增产率的影响，A.琼脂糖凝胶电泳分析各组PCR扩增产物；B.分析各组PCR产物中的DNA含量。图中的0、1、2、3、4、5、6、7分别代表不同的组，与表2中的组相对应；

图3.羟基修饰的多壁碳纳米管对PCR扩增产率的影响，A.琼脂糖凝胶电泳分析各组PCR扩增产物；B.分析各组PCR产物中的DNA含量。图中的0、1、2、3、4、5、6分别代表不同的组，与表3中的组相对应；

图4.羧基修饰碳纳米管促进原核细胞BL21基因转化，A.碳纳米管促进转化的实验对比图；B.转化菌落数计数的对比分析；

图5.羟基修饰的碳纳米管促进原核细胞TOP10基因转化，菌落计数对比分析；

图6.氨基修饰的多壁碳纳米管介导的细胞转染荧光观察(细胞放大倍数200)，左：对照组；右：实验组。

具体实施方式

下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。

实施例1碳纳米管提高基因扩增产率

本发明所采取的研究策略是在PCR基因扩增反应体系中加入适量的碳纳米管，提高基因的扩增效率，电泳分析鉴定基因扩增产率。

一、羧基修饰的多壁碳纳米管提高基因扩增产率

在本实验中使用的扩增模板是T载体(PROMEGA公司，商品号A1360)上鼠抗体重链可变区(吴小平等，抗肿瘤血管三结构域单链抗体VH/L的构建与表达，生物工程学报17(1)：50-54，2001)，引物长为26个碱基(5‘GGAACATATGGAGGTGAAACTGCAGG-3’，5’-ACTAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACC-3’)，扩增产物为386bp，(Taq酶购自PROMEGA公司)。本实验中使用的碳纳米管是羧基修饰的多壁碳纳米管(多壁碳纳米管购自深圳纳米港有限公司，根据文献常规操作将多壁碳纳米管经强酸处理后离心烘干即可得到羧基修饰的多壁碳纳米管，Acc.Chem.Res.2002，35，1096)。PCR仪是MJ RESEARCH PTC-200(MJRESEARCH公司)。

在本实验中，设计8组实验(0组为不含碳纳米管的对照组，1-7组为含有不同量羧基修饰多壁碳纳米管的实验组)，研究羧基修饰的多壁碳纳米管对PCR产率的影响。在这8组PCR反映管中分别加入不同的组分(表2)。

表2.羧基修饰的多壁碳纳米管对PCR产物影响的实验设计

反应程序：94℃变性10分钟，55℃复性1分钟使模板与引物配对，72℃延伸1分钟，94℃变性1分钟，然后再复性延伸循环24次，最后在72℃充分延伸10分钟，产物保存于4℃。

PCR反应结束后，从每个反应管中取10μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。具体操作如下：取样10μl PCR样品与2μl 6X上样缓冲液混合，加样于1％琼脂糖凝胶，在100V电压下电泳，DNA从负极向正极方向迁移。电泳结束后通过凝胶成像系统(Gel Doc2000^TM Chemi Doc^TM，BIORAD)对PCR产物进行分析，鉴定每个PCR反应的DNA含量，分析碳纳米管在基因扩增中的作用以及促进PCR反应的最佳浓度。

从图2可以看出，当羧基修饰的多壁碳纳米管含量在1ng时(实验组3)对PCR产率的促进最为明显，说明在上述反应体系中加入1ng的多壁碳纳米管是促进PCR扩增和增加基因扩增产率的最佳浓度。当多壁碳纳米管量较少或较多时都不利于PCR反应，尤其是当多壁碳纳米管含量超过100ng后，PCR反应将不能进行(实验组7)。通过凝胶成像分析软件Quantityone 1.0进行DNA定量分析，发现与常规的PCR方法(实验组0)相比，实验组3的PCR产物量提高至少3倍。由此得出结论：在该扩增体系中碳纳米管在一定浓度范围内可以增强PCR扩增效率，最佳浓度为0.04ng/μl。

二、羟基修饰的碳纳米管提高基因扩增产率

在本实验中使用的扩增模板是T载体(PROMEGA公司，商品号A1360)上鼠抗体重链可变区(吴小平等，抗肿瘤血管三结构域单链抗体VH/L的构建与表达，生物工程学报17(1)：50-54，2001)，引物长为26个碱基(5‘-GGAACATATGGAGGTGAAACTGCAGG-3’，5’-ACTAGCTAGCTGAGGAGACGGTGACC-3’)，扩增产物为386bp，(Taq酶购自PROMEGA公司)。本实验中使用的碳纳米管是羟基修饰的多壁碳纳米管(多壁碳纳米管购自深圳纳米港有限公司，多壁碳纳米管经强碱处理即可得到富含羟基的多壁碳纳米管)。PCR仪是MJ RESEARCH PTC-200(MJ RESEARCH公司)。

在本实验中，设计7组实验(0组为不含碳纳米管的对照组，1-6组为含有不同量羟基修饰多壁碳纳米管的实验组)，研究羟基修饰的多壁碳纳米管对PCR产率的影响。在这7组PCR反映管中分别加入不同的组分(表3)。

表3.羟基修饰的多壁碳纳米管对PCR产物影响的实验设计

Taq酶(5U/μl)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Taq酶(5U/μl)	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	羟基修饰多壁碳纳米管(ng)	0	10	20	100	200	500	1000

从图3可以看出，当羟基修饰的多壁碳纳米管含量在10-50ng时(实验组3)对PCR产率的促进最为明显，说明在上述反应体系中加入10ng的多壁碳纳米管是促进PCR扩增和增加基因扩增产率的最佳浓度。当多壁碳纳米管量较多时都不利于PCR反应，尤其是当多壁碳纳米管含量超过100ng后，PCR反应将不能进行(实验组5、6)。通过凝胶成像分析软件Quantityone 1.0进行DNA定量分析，发现与常规的PCR方法(实验组0)相比，实验组2、3的PCR产物量是对照组的1.3倍。由此得出结论：在该扩增体系中羟基多壁碳纳米管在一定浓度范围内可以增强PCR扩增效率，最佳浓度为0.8ng/μl。

应当指出，对于类似的PCR基因扩增体系，根据本发明的教导，本领域普通技术人员可以容易地确定用于提高PCR扩增效率的最佳碳纳米管浓度。

实施例2碳纳米管提高基因在原核细胞中的转化效率

基因转化在分子生物学操作中极为重要，是基因的克隆与表达中一个重要步骤，尤其是在基因治疗中，提高转化效率仍是有待解决的问题。在原核转化体系中，常用的是CaCl₂法和电转化法，本发明是在利用CaCl₂法制备感受态细胞的基础上，加入羧基或羟基修饰的多壁碳纳米管，观察其转化效率。

一、碳纳米管提高pET28a在BL21(DE3)细菌中的转化效率

本实验所用的载体是pET28a(含卡那霉素抗性)，所用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，这两种生物材料均已商品化(pET28a可从Novagen购买，BL21(DE3)可从天为时代试剂公司购买)。本实验分为实验组和对照组，对照组是用常规的CaCl₂转化法，实验组是在CaCl₂转化法的基础上加入羧基修饰的多壁碳纳米管，具体实验设计(表4)。

表4.实验组和对照组转化条件的设计方案

实验步骤

1.将对照组和实验组分别加入等量的BL21感受态细胞转化液中，冰上放置30分钟；

2.42℃放置90秒；

3.冰上放置1-2分钟；

4.分别加入LB培养基800μl，37℃、225rpm培养45-90分钟；

5.对照组和实验组，分别取100μl涂LB固体培养基(卡那霉素抗性)平板，室温放置20-30分钟后，倒置于37℃恒温培养箱，培养12-16小时；

6.菌落计数，记录对照组和实验组中的细菌菌落数(见附图4)，进行比较。

上面结果表明，对照组转化率为5×10⁵cfu(clone forming unit)/μg DNA，碳纳米管实验组转化率为3.3×10⁶cfu/μg DNA。实验分析发现实验组与对照组相比，转化数提高7倍。

二、碳纳米管提高pET28a在TOP10细菌中的转化效率

本实验所用的载体是pET28a(含卡那霉素抗性)，所用的宿主细胞为大肠杆菌TOP10，这两种生物材料均已商品化(pET28a可从Novagen购买，TOP10可从天为时代试剂公司购买)。本实验分为实验组和对照组，对照组是用常规的CaCl₂转化法，实验组是在CaCl₂转化法的基础上加入羟基修饰的多壁碳纳米管，具体实验设计(表5)。

表5.实验组和对照组转化条件的设计方案

实验步骤

1.将对照组和实验组分别加入等量的TOP10感受态细胞转化液中，冰上放置30分钟；

2.42℃放置90秒；

3.冰上放置1-2分钟；

4.分别加入LB培养基800μl，37℃、225rpm培养45-90分钟；

6.菌落计数，记录对照组和实验组中的细菌菌落数(见附图5)，进行比较。

上面结果表明，对照组转化率为3×10⁶cfu(clone forming unit)/μg DNA，碳纳米管实验组转化率为9×10⁶cfu/μg DNA。实验分析发现实验组与对照组相比，转化数提高3倍。

碳纳米管的这种促进作用适合与所有核酸导入细胞的过程。细菌转化过程中加入碳纳米管可以有效提高质粒转化效率，表明在转化过程中加入碳纳米管具有明显的促进DNA转化进入原核细胞的作用。

实施例3碳纳米管介导的真核细胞基因转染

随着纳米技术的发展，目前已经出现了利用单壁碳纳米管用于真核细胞转染的报道(Pantarotto，D.；Briand，J.；Prato，M.；Bianco，A.Chem.Commun.2004，1，16-17)。本发明的特点在于；(1)使用的碳纳米管是多壁碳纳米管，其结构复杂，更有利与DNA形成复合物，从而提高其转染能力；(2)碳纳米管的修饰方法不同。本发明在碳纳米管表面引入-NH-C₆H₂-NH₂氨基基团，多壁碳纳米管经过强酸处理后，离心、烘干，再经过亚硫酰氯处理，离心、烘干，过量的己二胺处理后，去离子水洗净，得到氨基修饰的多壁碳纳米管(3)本发明采用的转染方法更为简单，直接将多壁碳纳米管与DNA在水中混合即可进行细胞转染。

本发明使用氨基修饰的多壁碳纳米管(Acc.Chem.Res.2002，35，1096)，这种碳纳米管材料经氨基修饰带有大量正电荷，既可与DNA结合，又可与细胞膜结合，与DNA(含有绿色荧光蛋白的质粒载体pEGFP-N1)相互作用，以这种多壁碳纳米管为转染介质，将绿色荧光蛋白基因导入真核细胞(A375细胞)，观察细胞内绿色荧光蛋白的表达，从而建立了以多壁碳纳米管为转染介质的新型转染方法。

本实验所用的DNA是pEGFP-N1(美国Clontech公司购买)，所用的真核细胞为人源黑色素瘤细胞A375(美国ATCC产品，CRL 1619)。本实验分为实验组和对照组，实验组是氨基修饰的多壁碳纳米管与pEGFP-N1结合介导细胞转染，对照组是pEGFP-N1直接进行细胞转染。

表6.真核细胞转染中实验组和对照组的实验设计

实验步骤：

1.氨基修饰的多壁碳纳米管与DNA预混合：取一定量的碳纳米管与DNA预混合于超纯水中(见表6实验组)，室温作用10-30分钟，对照组按上表对照组配制；

2.A375细胞培养与处理：A375细胞培养于24孔板，细胞密度长至80-90％时去掉原有的培养基(DMEM(Dulbecco′s modification of Eagle′s mediumDulbecco，HyClone公司产品))高糖培养基，10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素)，加入不含血清和抗生素的DMEM培养基洗涤1-2次，然后加入500μl含有10％血清的DMEM培养基；

3.将步骤1中两组DNA混合物分别加入步骤2处理的含有A375细胞的细胞培养孔中，在细胞培养箱(Forma Scientific，CO₂ WATERJACKETED INCUBATOR，USA)中培养，5％CO₂，37℃，培养24-48小时；

4.细胞在荧光显微镜(OLYMPUS，IX71，Japan)下观察，488nm光激发，524nm观察荧光，记录转染细胞并观察细胞形态。氨基修饰的多壁碳纳米管将pEGFP-N1导入A375细胞，见附图6。

从附图6可以看出，在实验组中氨基修饰的多壁碳纳米管可以将外源DNA导入A375细胞，而对照组中的DNA不能进入真核细胞，这一转染方法以氨基修饰的多壁碳纳米管为介质将外源DNA导入真核细胞，从而建立了以多壁碳纳米管为转染介质的新型转染方法，在真核细胞转染、基因治疗中具有潜在的应用前景。

Claims

1.多壁碳纳米管在提高PCR基因扩增产率中的应用，其中在PCR反应体系中加入多壁碳纳米管。

2.根据权利要求1的应用，其中所述多壁碳纳米管是羧基或羟基修饰的多壁碳纳米管。