CH719081A9 - Vescicole extracellulari derivate da latte e processo per isolare le stesse. - Google Patents

Abstract

La presente invenzione concerne il campo delle biotecnologie e in particolare vescicole extracellulari derivate da latte e fornisce un processo per isolare tali vescicole da latte e da fluidi correlati al latte. La presente invenzione concerne anche composizioni contenenti dette vescicole extracellulari derivate da latte, adatte in particolare all'uso in applicazioni farmaceutiche, veterinarie, cosmetiche e/o nutraceutiche.

Description

Campo dell'Invenzione

[0001] La presente invenzione concerne il campo delle biotecnologie e, in particolare vescicole extracellulari (EV, Extracellular Vesicles) derivate da latte. La presente invenzione fornisce un processo per isolare tali vescicole extracellulari da latte e da fluidi correlati al latte particolarmente adatto alla produzione industriale grazie alla possibilità della sua messa in scala e alla sua capacità di mantenere l'integrità strutturale delle vescicole extracellulari, così come per la sua capacità di fornire soluzioni di purezza omogenea, essendo la purezza ottenuta superiore a quella di preparazioni precedentemente note nel campo. L'invenzione concerne inoltre composizioni di vescicole extracellulari derivate da latte mediante detto processo, che mostrano rese di recupero/estrazione sorprendentemente elevate e fornisce EV che presentano, in particolare, poche proteine contaminanti e altri contaminanti, rendendole adatte alla modificazione chimica, ad esempio mediante marcatura con molecole targeting o caricamento di ingredienti attivi per l'uso in applicazioni farmaceutiche, veterinarie, cosmetiche e nutraceutiche. L'invenzione concerne inoltre composizioni di vescicole extracellulari derivate da latte e metodi per preparare le stesse, in cui le vescicole del latte sono state caricate, ad esempio, con Amfotericina B o suoi derivati, fornendo in tal modo potenti preparazioni antifungine, antiparassitarie e anti-infettive per uso orale.

[0002] L'invenzione fornisce inoltre un metodo per il rilascio sistemico delle EV del latte e dei relativi cargo, che si traduce in un assorbimento sistemico sorprendentemente efficiente e consente di raggiungere numerosi organi attraverso il tratto respiratorio.

Sfondo tecnico

[0003] Le Vescicole Extracellulari (EV) sono una categoria nota di componenti derivati da membrane cellulari comprendenti, tra gli altri, esosomi, ectosomi, corpi apoptotici e microvescicole. Le EV, e in particolare gli esosomi, hanno attirato enorme attenzione come parte di un sistema di comunicazione cellula-cellula a lunga distanza non ancora completamente compreso che apre strade completamente nuove per biomarcatori e prodotti diagnostici clinici, terapia cellulare priva di cellule, vaccini e potenziali carrier di farmaci.

[0004] Gli esosomi sono definiti come particelle racchiuse in una doppia membrana, aventi una dimensione di circa 40-200 nm, derivati dai corpi multivescicolari (MVB, Multivesicular Body) che sono prodotti e rilasciati nello spazio extracellulare in continuo, virtualmente da tutti i tipi di cellule eucariotiche. Inoltre, è stato mostrato che gli esosomi sono presenti in un'ampia gamma di fluidi corporei, come sangue, saliva, urina, così come nel latte di mammiferi.

[0005] A confronto con gli esosomi derivati da colture cellulari, che sono raccolti tipicamente dal surnatante di cellule umane o provenienti da organismi superiori in coltura, gli esosomi derivati da fonti naturali usate nell'industria alimentare (latte, succhi di frutta, ecc.) possiedono il netto vantaggio di essere disponibili in quantità relativamente elevate senza la necessità di stabilire metodi di produzione biotecnologici, bioreattori cellulari e processi per la loro produzione. Tuttavia, le concentrazioni alle quali gli esosomi sono presenti in differenti materiali di partenza sono molto al di sotto dei livelli utili per essere utilizzati direttamente come carrier di farmaci o come agenti terapeutici (così come materiale di partenza di carrier di farmaci o come materiale di partenza per agenti terapeutici), e la presenza di componenti aggiuntivi (come caseina e altre proteine, lipoproteine, zuccheri o acidi grassi) limita le applicazioni in fasi successive.

[0006] Di conseguenza, vi è la necessità di metodi scalabili per l'isolamento e la purificazione di esosomi da queste attraenti fonti naturali.

[0007] Negli ultimi anni, in letteratura sono stati descritti differenti processi per l'isolamento di esosomi derivati da colture cellulari in laboratorio. Tali metodi includono molte procedure differenti come, ad esempio, ultracentrifugazione differenziale e ad elevata velocità, centrifugazione su gradienti di densità, cromatografia ad esclusione dimensionale, cromatografia di affinità, adsorbimento basato su affinità usando eparina, separazioni basate su membrana, microfluidica o precipitazione basata su polietilen glicole, così come vari kit di isolamento commerciali, come, ad esempio, ExoQuick™ (Antes, 2013).

[0008] E' importante notare che i processi di isolamento sopra indicati sono stati riportati principalmente da ricercatori che conducevano isolamenti di EV in scala di laboratorio per indagini analitiche, meccanicistiche o basate su cellule, con volumi relativamente bassi da processare. Inoltre, questi metodi sono stati applicati principalmente all'isolamento dal surnatante di esosomi derivati da colture cellulari, che contiene una concentrazione relativamente bassa di proteine contaminanti e impurezze di peso molecolare superiore.

[0009] Al contrario, l'isolamento di esosomi da fonti naturali pone sfide aggiuntive; le tipiche fonti naturali come il latte contengono un grado elevato di sostanza secca e/o grandi quantità di acidi grassi, zuccheri, altri emulsionanti e/o proteine contaminanti. Inoltre, differenti materiali di partenza rappresentano differenti matrici con un'ampia gamma di contaminanti potenzialmente tossici, interagenti, reagenti in modo incrociato o interferenti (ad esempio, altre proteine, peptidi, lipidi, carboidrati, oligonucleotidi come micro-RNA o altri prodotti naturali e derivati). Di conseguenza, ogni matrice pone sfide specifiche ed uniche nell'isolamento di EV o di frazioni arricchite di EV, che abbiano caratteristiche definite e qualità riproducibile e costante. Questo aspetto è particolarmente importante, dato che solo tali preparazioni riproducibili di EV ad elevata purezza sono adatte per ulteriore funzionalizzazione, caricamento di molecole di farmaci e/o modificazione per differenti strategie di targeting comunemente impiegate in sistemi per il rilascio di farmaci di futura generazione.

[0010] Nel caso di EV derivate da latte, l'ultracentrifugazione per raccogliere le EV in un pellet o in frazioni definite su gradienti di densità è ancora il metodo di elezione usato per il loro isolamento. Tuttavia, oltre alla necessità di una strumentazione specializzata e costosa, l'ultracentrifugazione è difficile da scalare industrialmente dal punto di vista tecnico, è laboriosa e richiede tempo. Inoltre, dato che l'ultracentrifugazione separa porzioni molecolari sulla base delle loro densità relative, essa può portare alla co-precipitazione di proteine aggreganti, lipoproteine e diversi oligonucleotidi, come piccoli e micro RNA. Tali contaminanti possono portare ad una sovrastima significativa dell'effettiva resa della preparazione, specialmente quando la valutazione è basata su metodi che determinano il contenuto totale di proteine di una preparazione. In aggiunta, l'ultracentrifugazione tramite pellettizzazione promuove di per sé la formazione di cluster di esosomi e di aggregati di EV, portando potenzialmente ad ottenere fusioni di vescicole, distorsioni delle distribuzioni dimensionali e alterazioni dell'assorbimento cellulare e di altre attività biologiche. Infine, il processo di ultracentrifugazione produce rese e qualità variabili, rendendo difficile la standardizzazione del processo.

[0011] Metodi alternativi noti nell'arte sono basati su kit commerciali che usano strategie di isolamento basate sull'affinità, che non sono solo notevolmente limitati per quanto riguarda la scala e la resa delle preparazioni, ma necessitano anche di condizioni ostiche per l'eluizione delle vescicole legate alle resine di affinità con conseguenze sconosciute per l'integrità e la funzione delle EV.

[0012] In una recente pubblicazione, Marsh et al. propongono, al fine di purificare EV da latte bovino, due protocolli leggermente differenti, basati entrambi essenzialmente sull'uso combinato dell'agente complessante EDTA, per solubilizzare micelle di caseina e per il frazionamento finale delle EV tramite cromatografia ad esclusione dimensionale dopo pre-purificazione tramite ultracentrifugazione o filtrazione a flusso tangenziale attraverso una membrana con un cut-off molecolare di 500 kDa. Pertanto, entrambi questi protocolli necessitano di un trattamento chimico del latte che utilizza EDTA per la solubilizzazione degli aggregati di caseina e delle micelle. Inoltre, le EV sono recuperate, al termine del processo, dopo un passaggio finale attraverso una colonna di Sepharose (SEC, Size Exclusion Chromatography). Queste due fasi (ovvero l'uso di EDTA e la SEC), insieme alle altre fasi del processo (ultracentrifugazione o filtrazione) sono definite come obbligatorie, al fine di ottenere la qualità desiderata del prodotto EV finale. D'altro canto, queste fasi pongono di per sé una limitazione aggiuntiva al processo. In primo luogo, l'uso di EDTA solubilizza gli aggregati di caseina, aumentando la quantità di impurezze a basso peso molecolare che si diffondono liberamente che devono essere eliminate mediante filtrazione a flusso tangenziale (TFF, Tangential Flow Filtration). Questo porta, nel tempo, alla formazione di incrostazioni della membrana limitando in tal modo, come gli autori stessi hanno commentato, la purezza che può essere ottenuta tramite TFF. In secondo luogo, la necessità di utilizzare il frazionamento mediante SEC per purificare ulteriormente il materiale dopo TFF, porta ad ottenere molteplici differenti frazioni di preparazioni di EV aventi purezza e composizioni variabili, con differenti livelli di impurezze, limitando ulteriormente la possibilità di messa in scala del processo.

[0013] Di conseguenza, nel campo degli esosomi derivati da latte vi è ancora la necessità di sviluppare un processo di isolamento che eviti gli svantaggi dell'ultracentrifugazione, che sia adatto alla manipolazione di grandi volumi di fluido di partenza (ovvero, latte), che possa funzionare senza una strumentazione di laboratorio specializzata, e che consenta di ottenere preparazioni di esosomi aventi una qualità omogenea, ben definita e riproducibile.

[0014] Con riferimento all'uso di preparazioni di EV per il rilascio di farmaci, deve essere posta un'attenzione particolare non solo alle EV e alla loro preparazione, ma anche ai tipi di cargo con i quali è impiegato il sistema di rilascio costituito dalle EV. Le classiche small molecules mostrano spesso una biodisponibilità orale nell'ordine del 20-100%, mentre le macromolecole biologiche e i loro derivati, come oligonucleotidi e proteine, non sono considerate biodisponibili per via orale. In generale, tali molecole, nonostante i vari tentativi nella in letteratura, sono considerate per un uso solo per iniezione endovenosa o sottocutanea o per applicazioni locali. Tuttavia, vi sono anche numerosi prodotti naturali aventi caratteristiche molecolari descritte generalmente nel campo della chimica farmaceutica come non soddisfacenti i criteri della „regola del cinque“ (Lipinsky et al. 2001, Adv. Drug Deliv. Rev. 46) e simili valutazioni basate sulla regola e/o che non mostrano alcuna biodisponibilità orale utile dal punto di vista terapeutico. Ora, sono stati svolti diversi e limitati tentativi per eseguire il caricamento delle EV del latte con molecole cargo.

[0015] WO2018102397A1 descrive preparazioni di EV del latte caricato con macromolecole biologiche. Tuttavia, le procedure di caricamento mostrate sono limitate a macromolecole biologiche modificate principalmente con un'ancora idrofobica al fine di consentire un inserimento fisico o un'interazione del cargo macromolecolare con esosomi e/o mediante una sorta di distruzione fisico-meccanica delle membrane delle EV, ad esempio tramite sonicazione o cicli di congelamento-scongelamento.

[0016] US10420723B2 descrive alcune preparazioni di EV del latte con una selezione di prodotti naturali, il caricamento effettuato mediante sospensione del farmaco in PEG-400 o usando etanolo come co-solvente e, dopo co-incubazione, separazione delle EV dall'eccesso di farmaco libero usando metodi di centrifugazione ed ultracentrifugazione, come quelli impiegati per l'isolamento delle EV. Una tale procedura risente delle stesse limitazioni (scalabilità, resa, purezza, ecc.) delle procedure sopra commentate per l'isolamento delle EV del latte, e presenta lo svantaggio aggiuntivo del legame non specifico del farmaco alle proteine non vescicolari presenti di per sé nei campioni di EV, in particolare quando si usano per primi processi basati su ultracentrifugazione per il loro isolamento.

[0017] EP3620519A1 espone l'uso dell'estrusione per eseguire il caricamento delle EV del latte con RNA modificati con un'ancora idrofobica.

[0018] Tali procedure apertamente così generalizzate non portano automaticamente ad ottenere carrier di farmaci biologicamente attivi ma richiedono una sperimentazione laboriosa e caso per caso, e sono sottoposte all'identificazione di una combinazione attuabile testando una lista illimitata di additivi, di variabili e di parametri di ottimizzazione senza una garanzia a priori di successo. Un esempio che dimostra che questo principio è ancora valido per le EV e per i sistemi di carrier di farmaci derivati da EV è fornito da Grossen et al. (Grossen et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Volume 158, 2021), in cui non è stato osservato alcun effetto funzionale dopo somministrazione orale di EV del latte caricate con RNA, come descritto in EP 3 620 519 A1.

[0019] Pertanto, sono necessari nuovi e migliori metodi di preparazione per il caricamento e per l'applicazione di EV del latte caricate con molecole specifiche.

Scopi dell'invenzione

[0020] Un primo scopo della presente invenzione è quello di fornire un metodo per isolare EV dal latte di differenti specie di mammiferi, come comunemente prodotto nell'industria casearia. Dette EV isolate hanno elevata purezza e caratteristiche riproducibili.

[0021] Un ulteriore scopo dell'invenzione è quello di fornire un metodo per isolare EV dal colostro di differenti specie, incluso il colostro umano, così come da latte già processato di differenti specie, come polveri di latte (prodotte mediante liofilizzazione o spray-drying) o latte pastorizzato, scremato o altrimenti processato e polveri derivate da tale latte processato, che ancora contengono EV almeno parzialmente intatte.

[0022] Un altro scopo della presente invenzione è quello di fornire preparazioni di EV particolarmente adatte per ulteriore rifinitura e/o caricamento di farmaci tramite metodi descritti nell'arte.

[0023] Un altro scopo della presente invenzione è quello di fornire anche nuove preparazioni di EV del latte caricate con farmaci basate sul farmaco antifungino e antiparassitario Amfotericina B (AmB).

[0024] Ancora un altro scopo della presente invenzione è quello di fornire metodi efficaci per il rilascio sistemico di preparazioni di EV con conseguente esposizione al farmaco in diversi organi dei mammiferi.

[0025] Di questi scopi, tra gli altri, ci si occuperà in maggiore dettaglio nei paragrafi seguenti, insieme a dati sperimentali e ad esempi, al fine di chiarire completamente l'oggetto della presente invenzione.

Sommario dell'invenzione

[0026] La presente invenzione si occupa delle necessità precedenti e di altro tipo, con riferimento alla tecnica anteriore, fornendo un nuovo processo adatto per l'isolamento industriale di esosomi da differenti tipi di latte come materiale di partenza. La presente invenzione concerne anche composizioni ottenute con tale processo di isolamento, che hanno elevata purezza con riferimento alla possibile presenza di proteine contaminanti, aggregati di proteine, aggregati di impurezze organiche e lipidi, e il loro uso come nano-carrier per il rilascio di farmaci.

[0027] Il metodo di isolamento della presente invenzione è basato sulla scoperta sorprendente che un processo consistente in una serie di fasi distinte, comprendenti una fase di coagulazione della caseina basata su enzimi, seguita da ultrafiltrazione usando membrane aventi specifiche dimensioni dei pori e dialisi a forza ionica controllata, consente di ottenere l'isolamento, la purificazione e la concentrazione di esosomi derivati dal latte (EV) con elevata efficienza.

[0028] L'effetto sorprendente della scoperta dell'invenzione è correlato al fatto che i materiali di partenza ricchi di proteine e grassi, abitualmente soffrono della mancanza di possibilità di essere altamente concentrati a causa dell'aggregazione, della torbidità o della precipitazione crescenti. Allo stesso tempo, la dialisi con acqua pura può portare all'esaurimento di ioni stabilizzanti che sono necessari a prevenire l'aggregazione proteica.

[0029] Inoltre, il processo dell'invenzione comprende una serie pre-determinata di fasi di purificazione, che portano all'isolamento di estratti ricchi di EV aventi intervalli dimensionali medi di 30-200 nm e che portano i marcatori proteici legati alla superficie caratteristici degli esosomi. Detta serie di fasi di purificazione comprende tipicamente una prima fase che implica la coagulazione della maggior parte dei componenti proteici del latte, seguita dalla loro rimozione tramite filtrazione o altri metodi di separazione, ed una seconda fase, comprendente la concentrazione e la dialisi a forza ionica controllata della frazione di EV tramite ultrafiltrazione usando membrane di dimensioni dei pori selezionate in modo specifico.

[0030] Pertanto, l'invenzione consente l'isolamento di grandi quantità di EV, mantenendo la loro funzione biologica intrinseca con un grado comparabile con, o superiore a, quello delle EV isolate per mezzo dei metodi attualmente impiegati in accordo con la tecnica anteriore, che sono basati tipicamente sull'ultracentrifugazione differenziale o sull'ultracentrifugazione su gradienti di densità che sono caratterizzati, come già detto, da numerosi svantaggi, ovvero necessitano di tempo, sono difficili da standardizzare, sono laboriosi e limitano la possibilità di scale-up.

[0031] Sebbene la prima fase del processo, ovvero la coagulazione di caseina, possa essere svolta tecnicamente mediante una coagulazione indotta da acidi, questa soluzione è meno preferita rispetto ad una coagulazione basata su enzimi, a causa delle conseguenze funzionali osservate nelle preparazioni ottenute infine quando è usato un acido. Infatti, le EV isolate impiegando quest'ultimo, mostrano in media dimensioni particellari maggiori ed una abbondanza minore di proteine marcatrici di EV, come TSG101 o CD9 in analisi di Western blot. Pertanto, la coagulazione di caseina indotta da acidi sembra fornire isolati di EV che non soddisfano tutti i requisiti desiderati.

[0032] Pertanto, in accordo con la presente invenzione, le procedure per ottenere preparazioni di EV del latte ampiamente prive di contaminanti proteici non vescicolari sono state applicate per ottenere, ad esempio, EV del latte di due differenti specie (bovini e capre), caricate con Amfotericina B. Quando sono state confrontate differenti condizioni di caricamento per Amfotericina B, è stato sorprendentemente trovato che la co-incubazione per una quantità di tempo specificata in un rapporto specificato di Amfotericina B e di EV del latte, ha fornito preparazioni funzionali di EV caricate con Amfotericina B, contenenti il carico di farmaco più alto di Amfotericina B con un'associazione stabile tra farmaco e carrier. La dialisi basata su TFF con membrane da 750 kDa ha consentito il re-isolamento privo di ultracentrifugazione di EV del latte biologicamente funzionali caricate con Amfotericina B, adatte a trattare condizioni per cui è indicata Amfotericina B in accordo con la pratica medica.

[0033] Nella letteratura scientifica le EV del latte sono state generalmente considerate come carrier di farmaci per applicazioni locali o per ottenere prodotti precedentemente trovati non adatti per il rilascio orale di farmaci. Quando sono state svolte sperimentazioni con preparazioni di EV del latte in accordo con la presente invenzione, è stato sorprendentemente trovato che le preparazioni di EV del latte dell'invenzione possono essere usate per effettuare un trasporto estremamente efficiente attraverso l'epitelio respiratorio e sono in grado di generare elevati livelli di esposizione sistemica in numerosi tessuti, ad esempio in fegato, rene, cuore o cervello e potenzialmente in altri.

Descrizione delle Figure

[0034] Figura 1: Caratterizzazione di differenti fasi di preparazione di EV da latte bovino mediante analisi per il monitoraggio di nanoparticelle (NTA, Nanoparticle Tracking Analysis). Gli istogrammi di distribuzione delle dimensioni particellari, il valore della media e della moda sono stati determinati mediante NTA. I dati sono mostrati per campioni rappresentativi di siero di latte (Figura 1.1, a-c), siero di latte pre-processato (Figura 1.2, d-f) e di preparazioni di EV dopo filtrazione a flusso tangenziale (TFF) di siero di latte pre-processato usando due differenti membrane: con pori di 750 kDa o con pori di 100 kDa (Figura 1.3, g-i). Le concentrazioni particellari sono mostrate come rese, calcolate a ritroso con riferimento al volume di siero di latte. Per il materiale processato mediante TFF, sono mostrate le rese e le dimensioni particellari sia per il siero, sia per il retentato (il fluido trattenuto dalla membrana filtrante) di latte pre-processato (grafici h e i). I campioni sono stati misurati in triplicato; le barre di errore rappresentano le deviazioni standard rispetto ai tre replicati tecnici. Figura 2: Rapporti tra particelle e proteine di fasi di preparazione di differenti EV da latte bovino. I rapporti tra particelle e proteine sono stati determinati misurando i numeri di particelle tramite NTA e la concentrazione di proteine totali è stata determinata usando il reagente di Bradford. I risultati sono espressi come media di n=3 esperimenti. (a) Tre differenti campioni (lotto 1 - 3) di siero di latte pre-processato, (b) due esempi di intermedi del processamento con TFF: Il siero di latte pre-processato è stato diluito 1:1 (barra „input“), concentrato tre volte e sottoposto a dialisi tre volte (barra „retentato“) usando una membrana avente una dimensione dei pori di 750 kDa o di 100 kDa. Figura 3: Caratterizzazione mediante cromatografia ad esclusione dimensionale di fasi di preparazione di differenti EV da latte bovino. I campioni sono stati iniettati in una colonna Superdex S200 ed eluiti a 0,8 ml/min a 4°C in PBS a pH 7,4 (Esempio 14). I cromatogrammi registrati a 280 nm sono mostrati in Figura 3.1 per siero di latte (a), siero di latte pre-processato (b) e preparazione di EV dopo processamento mediante TFF (c). Il cromatogramma di siero di latte è mostrato come una sovrapposizione dei campioni prima (grigio, Esempio 1) e dopo (nero, Esempio 2) filtrazione. Il pannello (b) mostra due lotti indipendenti di siero di latte pre-processato. Il pannello (c) mostra preparazioni di EV del latte dopo processamento mediante TFF su membrane di dimensioni dei pori di 750 kDa (sinistra) o 100 kDa (destra). Il rettangolo nero evidenzia il picco di EV. Figura 3.2, il pannello (d) mostra due cromatogrammi rappresentativi di preparazioni finali di EV del latte in seguito all'isolamento di EV in accordo con il metodo della presente invenzione usando TFF attraverso una membrana avente dimensioni dei pori di 750 kDa (Esempio 5). Figura 4: Esaurimento relativo di contaminanti proteici durante il pre-processamento (taglio di peso molecolare di 100 kDa (MWCO)) di EV da latte bovino. L'esaurimento relativo di contaminanti proteici, come determinato mediante cromatografia ad esclusione dimensionale su una colonna Superdex S200, è stato determinato confrontando l'area (nero) e altezza (grigio) dei picchi 1-6 di siero di latte (Esempio 1) e di siero di latte pre-processato (Esempio 4). Figura 4.1, il pannello (a) mostra i cromatogrammi registrati a 280 nm con assegnazione dei picchi. Il pannello (b) mostra le aree e le altezze dei picchi normalizzati rispetto al picco di EV (picco 1). Il peso molecolare è stato determinato mediante un ciclo di calibratura indipendente con uno standard di esclusione dimensionale. L'esaurimento in % dei contaminanti principali è mostrato come funzione del peso molecolare calcolato in Figura 4.2, pannello (c). Figura 5: Caratterizzazione di differenti preparazioni di EV da latte bovino mediante Western blot. Analisi Western blot di (a) CD9, (b) tsg101 e (c) MFGE8. Il lisato di cellule HEK (CL) è servito come controllo positivo. Sono mostrate EV da latte bovino preparate con metodi differenti: Tramite ultrafiltrazione usando una membrana avente dimensione dei pori di 100 kDa seguita da Cromatografia ad Esclusione Dimensionale (UF SEC), tramite Filtrazione a Flusso Tangenziale usando una membrana avente dimensione dei pori di 750 kDa (TFF, Esempio 5) e tramite Ultracentrifugazione (UC di EV purificate da latte, Esempio 12). Figura 6: Tipica preparazione di EV bovine con il metodo della presente invenzione. Le caratteristiche di EV da latte bovino processato tramite Filtrazione a Flusso Tangenziale (TFF) usando una membrana avente dimensione dei pori di 750 kDa e il corrispondente materiale di partenza per TFF di siero di latte pre-processato: (a) cromatogramma di SEC registrato con assorbanza a 280 nm (b) distribuzione della dimensione particellare (misurata mediante NTA, l'istogramma rappresenta una di tre misurazioni), (c) rapporto tra particelle e proteine sulla base dei numeri di particelle misurato mediante NTA e misurazioni di proteine totali mediante Bradford, n=3, (d) particelle per ml di siero di latte (e) dimensione particellare misurata mediante NTA, n=3. Il lotto mostrato è stato processato mediante 20 cicli di concentrazione 4x e dialisi riempiendo nuovamente fino al volume originale con PBS a pH 7,4 (Esempio 5). Figura 7: Captazione cellulare di EV da latte bovino in cellule di adenocarcinoma polmonare umano (A459). Le EV marcate con TMR/Cy5 ottenute nell'Esempio 17 sono state aggiunte a cellule A459 e la captazione cellulare è stata analizzata mediante microscopia a fluorescenza come nell'Esempio 17. Le immagini rappresentative ottenute mediante visualizzazione („imaging“) in campo grande con un obiettivo da 0,95 NA 40x sono mostrate nel pannello (a). Immagini BW: canale DAPI per la colorazione del nucleo, canale TMR per il rilevamento di EV, canale Cy5 per il rilevamento di EV e canale TMR-Cy5 FRET; immagini in campo chiaro su scala di grigi. Quantificazione della captazione dose-dipendente di EV a 6 ore nel pannello (b) per EV da latte bovino marcate con TMR/Cy5 conservate a 4°C o a -80 °C. Le singole curve rappresentano replicati biologici indipendenti, mentre sono state scattate 5 singole immagini per pozzetto. Le barre di errore illustrano deviazioni standard sopra le singole immagini. Figura 8: Preparazione di EV da latte di capra. Sono mostrate le caratteristiche dei seguenti intermedi della preparazione di EV da latte di capra: Siero di latte di capra, siero di latte di capra pre-processato ed EV purificate da latte di capra su membrana per TFF avente dimensione dei pori di 750 kDa, processati mediante 20 cicli di concentrazione 4x e dialisi riempiendo nuovamente fino al volume originale con PBS a pH 7,4). I campioni sono stati caratterizzati in termini di (a) distribuzione dimensionale delle particelle (misurata mediante NTA, istogramma mostrato per una di tre misurazioni), (b, c) particelle per ml di siero di latte e dimensione particellare, entrambe misurate mediante NTA (n=3) e rapporti tra particelle e proteine sulla base dei numeri di particelle misurati mediante NTA e misurazioni delle proteine totali mediante Bradford (n=3). Figura 9: Caratterizzazione di EV da latte di capra mediante cromatografia analitica ad esclusione dimensionale. I cromatogrammi di SEC registrati con un'assorbanza a 280 nm sono mostrati per (a) siero di latte di capra, (b) siero di latte di capra pre-processato e (c) EV da latte di capra processato su membrana per TFF avente dimensione dei pori di 750 kDa. La purificazione mediante TFF è stata eseguita mediante 20 cicli di concentrazione 4x e dialisi riempiendo nuovamente fino al volume originale con PBS a pH 7,4. Figura 10: Tipica preparazione di EV da latte di capra con il metodo della presente invenzione. Caratteristiche di EV da latte di capra processato tramite Filtrazione a Flusso Tangenziale usando una membrana avente dimensione dei pori di 750 kDa e il corrispondente siero di latte pre-processato come materiale di partenza: (a) cromatogramma di SEC (registrato con assorbanza a 280 nm) (b) distribuzione della dimensione particellare (misurata mediante NTA, l'istogramma rappresenta una di tre misurazioni), (c) rapporto tra particelle e proteine sulla base dei numeri di particelle misurato mediante NTA e misurazioni di proteine totali mediante Bradford, n=3, (d) particelle per ml di siero di latte (e) dimensione particellare misurata mediante NTA, n=3. GW1PPEK1 è stato processato mediante 20 cicli di concentrazione 4x e dialisi riempiendo nuovamente fino al volume originale con PBS a pH 7,4. Figura 11: Captazione cellulare di EV da latte di capra in cellule di adenocarcinoma polmonare umano (A459). Le EV da latte di capra ottenute nell'Esempio 11 sono state marcate con TMR e Cy5 come descritto per EV da latte bovino, sono state aggiunte a cellule A459 e la captazione cellulare è stata analizzata mediante microscopia a fluorescenza come nell'Esempio 17. Le immagini rappresentative ottenute mediante visualizzazione in campo grande con un obiettivo da 0,95 NA 40x sono mostrate nel pannello (a). Immagini BW: canale DAPI per la colorazione del nucleo, canale TMR per il rilevamento di EV, canale Cy5 per il rilevamento di EV e canale TMR-Cy5 FRET; immagini in campo chiaro su scala di grigi. Quantificazione della captazione dose-dipendente di EV a 6 ore nel pannello (b) per EV da latte di capra marcate con TMR/Cy5. Le singole curve rappresentano replicati biologici indipendenti, mentre sono state scattate 5 singole immagini per pozzetto. Le barre di errore illustrano deviazioni standard sopra le singole immagini. Figura 12: Caratteristiche di EV da latte bovino processate mediante Ultracentrifugazione. (a) cromatogramma di SEC con assorbanza a 280 nm (b) distribuzione della dimensione particellare (misurata mediante NTA, istogramma mostrato per una di tre misurazioni), (c) rapporto tra particelle e proteine sulla base dei numeri di particelle misurato mediante NTA e misurazioni di proteine totali mediante Bradford, n=3, (d) particelle per ml di siero di latte (e) dimensione particellare misurata mediante NTA, n=3. Figura 13: Caratterizzazione di EV derivate da latte bovino mediante TEM con colorazione negativa. EV da latte bovino dell'Esempio 5 sono state analizzate mediante TEM con colorazione negativa e sono mostrate con ingrandimento a 40.000x (a) e 80.000x (b). Figura 14: Quantificazione di Amfotericina B usando cromatografia liquida ad elevate prestazioni. Cromatogramma di RP-HPLC di Amfotericina B (50 µl di una soluzione 2,5 µM) con eluizione isocratica (Acetonitrile/20 mM di EDTA (55% / 45% vol/vol, 1 ml/min) su una colonna C18 e rilevamento a 405 nm (a) e curva standard per differenti concentrazioni di Amfotericina B (AmB) derivata dall'area di picco (b). Figura 15: Dipendenza dalla concentrazione del caricamento di AmB su EV da latte di capra. Le EV da latte di capra a 1 nM sono state incubate con concentrazioni crescenti di AmB e la concentrazione di AmB caricata è stata quantificata mediante RP-HPLC (a). AmB a 2 µM è stata incubata con concentrazioni crescenti di EV da latte di capra e la concentrazione di AmB caricata è stata quantificata mediante RP-HPLC (b). Figura 16: Co-frazionamento di AmB con EV da latte bovino e di capra mediante cromatografia ad esclusione dimensionale. Le EV da latte bovino di Figura 16.1 (a) e di capra di Figura 16.2 (b) a 1 µM sono state caricate con Amfotericina B a 2 µM mediante co-incubazione a temperatura ambiente per 6 ore e i campioni sono stati analizzati mediante cromatografia ad esclusione dimensionale con rilevamento mediante UV-VIS a 406 nm prima e dopo lavaggio mediante ultrafiltrazione. I cromatogrammi per AmB libera e per EV del latte libere sono mostrati a titolo comparativo. Figura 17: Captazione di EV da latte di capra in cellule A549 con e senza caricamento di AmB. Le EV da latte di capra sono state marcate con TMR-NHS e Cy5 NHS, caricate con AmB ed incubate con cellule A549 per 6 ore. La captazione è stata poi analizzata mediante visualizzazione mediante fluorescenza in campo grande ed è mostrata per EV di capra marcate con TMR/Cy5 caricate con AmB rispetto a quelle non trattate come numero di vescicole positive per 1000 pixel di area cellulare. Le barre di errore rappresentano deviazioni standard su 25 campi visivi, sono mostrati i dati per tre pozzetti indipendenti. Figura 17.1 (a). Le immagini esemplificative sono mostrate in Figura 17.2 (b).

Descrizione dettagliata dell'invenzione

[0035] Quando si considera la purificazione su larga scala di EV derivate da latte, sono importanti numerosi aspetti; tra gli altri, questi sono: tipo di materiale di partenza, concentrazione di EV che può essere ottenuta (arricchimento) e purezza del prodotto finale (ovvero, quanti altri componenti diversi dalle EV sono presenti in una tipica preparazione). Quest'ultima è particolarmente importante, dato che i fattori contaminanti possono dare origine ad effetti collaterali indesiderati e/o possono interferire con l'ulteriore derivatizzazione di EV, come il caricamento con molecole da veicolare, ecc. e/o possono complicare l'interpretazione dei dati che sono generati con preparazioni di qualità inferiore.

[0036] Come indicato precedentemente, il metodo di purificazione comunemente utilizzato nello stato attuale dell'arte per ottenere preparazioni di EV da latte è essenzialmente basato su numerose fasi di centrifugazione, di cui almeno una, ma comunemente due, sono di ultracentrifugazione (ovvero > 50.000 x g), ciò fa sì che le EV formino pellet e si separino dal liquido e dai componenti contaminanti aventi peso molecolare ridotto/inferiore.

[0037] Gli svantaggi tecnici di tale processo di ultracentrifugazione sono numerosi: – l'ultracentrifugazione è di per sé difficile da scalare e gli impianti sono costosi; – l'ultracentrifugazione porta a co-pellettizzazione di detriti cellulari, così come di aggregati proteici ed oligonucleotidici, tali componenti non-EV spesso portano ad una sovrastima grossolana del contenuto di EV; – l'ultracentrifugazione porta ad una distorsione/modificazione delle EV (cambiamento di dimensione, fusione di vescicole) riducendo potenzialmente l'attività biologica delle preparazioni che le contengono.

[0038] D'altro canto, l'ultracentrifugazione fornisce una metodologia molto efficiente su piccola scala, impiegata comunemente in biochimica per „condensare“ ed estrarre un materiale da un liquido sulla base della sua densità specifica (peso molecolare), anche quando scarsamente presente, e contemporaneamente rimuovere anche un grande eccesso di impurezze aventi densità inferiore e/o maggiore (con peso molecolare inferiore/maggiore). Applicato all'isolamento delle EV, il metodo attualmente generalmente accettato per la preparazione delle EV in accordo con la tecnica anteriore è basato, come prima fase, sulla pellettizzazione di cellule intere, aggregati di lipidi di organuli e strutture più grandi usando una centrifugazione a velocità inferiore. Tale fase di pre-purificazione, rimuovendo le impurezze più grandi, è seguita da una fase di ultracentrifugazione, ad esempio 100.000 x g per 90 minuti, per ottenere le EV desiderate che possono anche essere risospese e ultracentrifugate nuovamente per ottenere una purezza maggiore. Alcuni ricercatori descrivono anche una fase di coagulazione che coinvolge le proteine del latte, che deve essere eseguita prima dell'ultracentrifugazione.

[0039] Tale fase di pre-purificazione è descritta, ad esempio da (Wolf et al., 2015), essere di 13.200 x g per 30 minuti, a partire da latte scremato, mentre Izumi et al usano 2x 1.200 xg per 10 min (Izumi et al., 2015), a partire da latte grezzo. Altri valori in gran parte simili possono essere trovati in questo settore. Ad esempio, Gao et al. descrivono un processo di pre-purificazione in due fasi quando le EV sono purificate da latte di Yak, impiegando prima 8.000 x g per 30 minuti, seguito da 13.000 x g al fine di rimuovere le strutture più pesanti (Gao et al., 2019; Gao et al., 2021a; Gao et al., 2021b).

[0040] In generale, tale rimozione delle impurezze più grandi è seguita da una fase di ultracentrifugazione che, in accordo con (Wolf et al., 2015) comprende 100.000 x g per 90 minuti per ottenere un pellet contenente le EV desiderate, che è poi risospeso e il materiale pellettizzato nuovamente alle stesse condizioni. Altri (ad esempio, (Izumi et al., 2015)) impiegano ad esempio 100.000 x g per 90 minuti e scartano il pellet risultante al fine di ottenere poi materiale dal surnatante rimanente usando ancora una forza g maggiore di 120.000 x g per 90 min, che è quindi considerato di qualità sufficiente per essere usato direttamente senza ulteriori lavaggi.

[0041] Per assistere ulteriormente l'isolamento di EV mediante ultracentrifugazione, Gao et al. (Gao et al., 2019; Gao et al., 2021a; Gao et al., 2021b) descrivono anche un processo che prevede la coagulazione di proteine del latte mediante trattamento con caglio, prima di isolare successivamente le EV usando ultracentrifugazione con i parametri comunemente noti (pellettizzazione iniziale a 120.000 x g per 90 minuti e lavaggio seguito da ri-pellettizzazione usando gli stessi parametri).

[0042] Quando si considerano metodi di isolamento alternativi, oltre all'ultracentrifugazione, una metodologia candidata è la separazione su base dimensionale basata sulla cromatografia ad esclusione dimensionale. Blans et al., (Blans et al., 2017) descrivono una tale metodologia in dettaglio. La loro metodologia usa una colonna impaccata con resina di esclusione dimensionale Sephacryl S 500 per ottenere le frazioni di EV, tuttavia solo dopo precedente centrifugazione a 20.000 g. Inoltre, la metodologia descritta dagli autori è mostrata solo su piccola scala (volumi di processamento di ml), e gli autori stessi riconoscono che la fase di esclusione dimensionale è usata per separare la caseina e le proteine del siero rimanenti dal materiale vescicolare dopo le fasi di centrifugazione a 340.000 g o a 20.000 g. Pertanto, una sfida specifica dell'utilizzo del latte come materiale di partenza è l'elevata abbondanza di lipidi, acidi grassi e lipoproteine che, nello stato attuale dell'arte, è abitualmente rimossa precedentemente mediante centrifugazione, dato che altrimenti porterebbe alla formazione di incrostazioni della resina ad esclusione dimensionale o delle membrane di separazione. Per questa ragione, nella tecnica attuale, questi metodi sono stati usati piuttosto come metodi di purificazione aggiuntivi per la separazione delle EV dopo (ultra)centrifugazione iniziale.

[0043] È anche importante menzionare che i processi di esclusione dimensionale con alcuni tipi di resine (ad esempio, Sepharose CL-2B), hanno portato talvolta ad ottenere preparazioni di EV aventi proprietà fisico-chimiche e chimiche modificate, come spostamento verso particelle di dimensioni inferiori, composizione superficiale modificata, mancanza di attività biologica, ecc. Sfortunatamente, è ancora poco chiaro a quali parametri della resina ad esclusione dimensionale siano connessi gli effetti negativi e, per questa ragione, i processi di separazione basati sull'esclusione dimensionale sono pertanto meno preferiti.

[0044] La separazione basata su membrane è stata applicata con successo per ottenere preparazioni di EV derivate da fonti meno complesse del latte. Infatti, nel caso dell'uso di latte come materiale grezzo per il loro isolamento, deve essere posta attenzione specifica alle altre strutture colloidali che sono presenti in questo fluido naturale e si trovano nello stesso intervallo dimensionale delle EV, come globuli grassi del latte (intervallo dimensionale: 0,1-15 µm) e micelle di caseina (intervallo dimensionale: 100-200 nm). In aggiunta, il latte contiene un grande eccesso di proteine non associate a EV aventi un'ampia distribuzione dimensionale ed una tendenza a coagulare a concentrazioni al di sopra dell'intervallo di 10 mg/ml. A causa di questi fattori di complicazione, è comunemente noto che l'uso di filtrazioni tramite membrana è sconveniente e può portare al verificarsi di artefatti e alla formazione di incrostazioni della membrana, partendo da latte come fonte di EV.

[0045] Comunque, e contrariamente rispetto all'insegnamento derivante dalla tecnica nota è stato trovato sorprendentemente che il processo in accordo con la presente invenzione, basato sulla filtrazione su membrana, può essere impiegato con successo per l'efficiente isolamento di EV ad elevata purezza da latte o da derivati del latte, quando preceduto sia da una fase di pre-purificazione di coagulazione di proteine intenzionale, che da una fase di chiarificazione su un letto di filtrazione inerte.

[0046] Sulla base di queste premesse, la presente invenzione concerne un processo per l'isolamento di EV derivate da latte e il loro uso come carrier di farmaci o di preparazioni aventi attività biologica intrinseca, utili per una gamma di applicazioni comprendenti, ma non limitate a, applicazioni farmaceutiche, veterinarie, cosmetiche e/o nutraceutiche o come additivi per diete umane o animali.

[0047] Il termine generale „latte“, se non altrimenti specificato, è usato per definire il prodotto fornito da tutte le specie di mammiferi, come comunemente trattato nell'industria casearia. Esempi di tipi di latte comprendono, ma non sono limitati a, latte bovino, colostro bovino, latte umano, colostro umano, latte di pecora, latte di capra, latte di bufala, latte di asina o latte di cammello, incluse le loro rispettive forme di colostro.

[0048] In accordo con la presente invenzione, è fornito un processo per l'isolamento delle EV purificate da latte, detto processo essendo caratterizzato dal fatto di comprendere almeno una fase di coagulazione di proteine del latte ed almeno una fase di ultrafiltrazione e di concentrazione basata su membrana, fornendo almeno una singola frazione omogenea avente caratteristiche uniformi, ad esempio in termini di parametri bioanalitici, concentrazione delle particelle, rapporto di proteine/particelle, purezza cromatografica, distribuzione della dimensione particellare, ecc. In particolare, in accordo con la presente invenzione, il processo per l'isolamento delle EV purificate da latte della presente invenzione, fornisce una singola frazione omogenea delle EV purificate da latte avente caratteristiche uniformi.

[0049] Il processo per l'isolamento delle EV purificate secondo la presente invenzione comprende le seguenti fasi di: a) fornire un campione di latte; b) chiarificare facoltativamente detto campione per mezzo di processi tradizionalmente noti di filtrazione o decantazione per ottenere latte chiarificato; c) sottoporre detto latte o detto latte chiarificato ad un trattamento con una miscela di enzimi adatta alla coagulazione di proteine del latte ad una temperatura e in un tempo pre-definiti per ottenere un liquido contenente proteine coagulate; d) separare detta proteina coagulata dal loro surnatante svolgendo una o più filtrazioni di detto liquido con uno strato inerte di un mezzo filtrante, per ottenere una soluzione trasparente; e) sottoporre detta soluzione trasparente ad almeno una fase di ultrafiltrazione e concentrazione usando membrane con dimensioni dei pori definite e mezzo di dialisi, acqua o tampone di regolata forza ionica, al fine di ottenere una preparazione concentrata di EV; f) trattare facoltativamente detta preparazione concentrata di EV con un agente stabilizzante, come sorbato di potassio e, contemporaneamente, regolare il pH ottenendo una preparazione concentrata di EV stabilizzata; g) sottoporre detta preparazione concentrata di EV, o detta preparazione concentrata di EV stabilizzata, ad una seconda fase di filtrazione/chiarificazione al fine di ottenere un isolato chiarificato essenzialmente puro di EV da latte; h) sottoporre facoltativamente detto isolato chiarificato essenzialmente puro di EV da latte ad una filtrazione sterilizzante usando filtri sterili standard di dimensioni tipiche dei pori inferiori a 1 µm, preferibilmente tra 0,45 µm e 0,2 µm, al fine di ottenere un isolato chiarificato essenzialmente puro e sterile di EV da latte.

[0050] Facoltativamente, detto isolato chiarificato essenzialmente puro di EV da latte ottenuto dalla fase (g) o detto un isolato chiarificato essenzialmente puro e sterile di EV da latte ottenuto da detta fase (h) possono essere conservati a 4°C fino ad ulteriore uso o congelati a temperature tra 1°C e -80°C o più preferibilmente ancora, congelati rapidamente in azoto liquido e conservati a temperature tra -20 e -80 °C o liofilizzati in assenza o in presenza di crioconservanti comuni come, ma non limitati a, mannitolo, saccarosio, trealosio o proteine come BSA o caseina, per ottenere una preparazione di EV congelata o liofilizzata.

[0051] In un'altra forma di realizzazione della presente invenzione è stato trovato che l'isolato di EV ottenuto dal processo dell'invenzione è adatto a essere conservato mediante congelamento con perdite minime di particelle di EV dopo scongelamento. Tale procedura necessita il congelamento di preparazioni di EV sostanzialmente pure contenenti concentrazioni particellari quanto più numerose possibile nell'ordine di 10^12 particelle per ml, più preferibilmente 10^13 e superiori. In generale, è stato trovato che preparazioni di EV aventi una certa purezza, così come richiesta per modificazioni chimiche precise e caricamento controllati, tendono a mostrare ampie perdite di particelle dopo congelamento/scongelamento. Pertanto, è un vantaggio intrinseco del processo dell'invenzione il fatto che esso porti ad ottenere preparazioni di EV che consistono in una singola frazione avente concentrazioni particellari controllabili ed uniformemente elevate, adatte al congelamento e alla conservazione.

[0052] Le filtrazioni secondo le fasi (d) e (g) del processo sopra descritto, in accordo con la presente invenzione, possono essere eseguite usando qualsiasi metodo noto nell'arte, ad esempio, impiegando filtri fisici monouso o riutilizzabili comprendenti un materiale filtrante come un filtro di cartone o altri rivestimenti o tessuti filtranti, o usando o altrimenti usando adeguati metodi di chiarificazione e filtrazione noti nell'arte.

[0053] Nella seguente descrizione, differenti forme di realizzazione della presente invenzione verranno indicate come parte della presente invenzione. Le informazioni qui fornite, insieme ai dettagli specifici degli esempi, sono ivi riportati per scopi di chiarezza e non dovrebbero essere intesi come limitativi dell'invenzione né dovrebbero essere tratte da queste forme di realizzazioni esemplificative e dai dettagli contenuti negli esempi conclusioni limitative non necessarie.

[0054] È da notare che, in una forma di realizzazione della presente invenzione, possono essere usate varie forme pre-processate di latte e di derivati del latte come materiali di partenza al posto del campione di latte puro. Ad esempio, questi possono essere, ma non sono limitati a, latte in polvere, latte scremato, latte trattato con calore, latte pastorizzato o colostro, a condizione che questi derivati contengano EV „intatte“, ovvero EV aventi il potenziale per esercitare le proprie funzioni biologiche.

[0055] Quando sono forniti latte in polvere o colostro in polvere, il processo della presente invenzione comprende inoltre una fase di re-idratazione, in cui detti polveri e granulati sono dispersi in acqua a dare una sospensione uniforme. Questo è abitualmente ottenuto combinando le polveri o i granuli con acqua ed agitando la miscela per produrre una sospensione omogenea. Tutti i metodi di reidratazione e di sospensione noti sono adatti per detta fase aggiuntiva, a condizione che essi non danneggino le particelle di EV.

[0056] In un'altra forma di realizzazione della presente invenzione, la fase (c) è eseguita usando una miscela enzimatica contenente pepsina e chimosina, che è adatta alla coagulazione basata su caseina delle proteine del latte. Miscele enzimatiche adatte ad ottenere questa coagulazione sono composte, ad esempio, da pepsina (in un intervallo dallo 0 al 90 %) e da chimosina (in un intervallo dal 100 al 10 %). Miscele preferite sono composte dal 5% di pepsina e dal 95% di chimosina, ancor più preferibilmente dal 20% di pepsina e dall'80% di chimosina. La miscela enzimatica può essere usata in una quantità e per tempi ben noti dall'esperto nell'arte, ad esempio circa 40 mg di miscela enzimatica o circa 50 unità internazionali di coagulazione del latte (IMCU, International Milk Clotting Units) per litro di latte. Il tempo di reazione dipenderà dalla quantità di miscela enzimatica e può variare da pochi minuti a diversi giorni. In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, sono usate temperature nell'intervallo di 25-37°C per eseguire la reazione. Il pH è regolato ad un valore debolmente acido, tra 5 e 7, usando metodi ed ingredienti standard noti nell'arte, o lasciato non regolato al valore iniziale del materiale di partenza.

[0057] La miscela enzimatica maggiormente preferita da usare in accordo con l'invenzione è caglio di origine bovina, contenente il 5% di pepsina e il 95% di chimosina. La possibilità di impiegare questa miscela enzimatica può essere considerata uno dei molti vantaggi della presente invenzione rispetto alla tecnica anteriore che ad esempio, contrariamente descrive, l'uso di soluzioni acide o di agenti complessanti come EDTA. Il caglio, di fatto, è usato abitualmente per la produzione di differenti tipi di formaggi e, pertanto, può essere considerato completamente sicuro per il suo utilizzo nel processo di isolamento delle EV da usare ulteriormente per somministrazioni umane o animali.

[0058] In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione, dopo detta fase (c) può essere prevista un'ulteriore fase (c') al fine di migliorare le caratteristiche microbiologiche del prodotto, svolgendo una breve pastorizzazione. Preferibilmente, il liquido contenente le proteine coagulate ottenute nella fase (c) è riscaldato a 45-65°C, preferibilmente tra 53-56°C per almeno decine di minuti.

[0059] In seguito, la miscela è raffreddata e sottoposta ad una o più filtrazioni, in accordo con la fase (d). In una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, la fase (d) prende in considerazione una prima filtrazione grossolana per rimuovere la maggior parte della proteina coagulata, seguita da una filtrazione profonda usando un coadiuvante di filtrazione come una terra diatomacea o simili coadiuvanti di filtrazione, così come disponibili in commercio ed abitualmente impiegati come strati filtranti nella filtrazione profonda. Il materiale chiarificato ottenuto al termine della fase (d) ha un indice di rifrazione di 3-5°Brix.

[0060] Il liquido chiarificato e de-caseinizzato ottenuto al termine della fase (d) è poi sottoposto ad una serie di almeno una fase di concentrazione e di dialisi in accordo con la fase (e). In una forma di realizzazione preferita è eseguita una prima fase di pre-concentrazione, seguita da dialisi per rimuovere in modo efficiente le rimanenti proteine contaminanti ed altri componenti, più piccoli, prima di eseguire una fase finale di concentrazione al fine di raggiungere la concentrazione finale desiderata delle EV del latte.

[0061] Per le fasi di concentrazione e di dialisi sono state testate membrane aventi differenti dimensioni dei pori. In generale, la maggior parte delle proteine contaminanti sarà rimossa mediante membrane aventi un limite di cut-off dimensionale superiore a 70 kDa, in modo più appropriato aventi un cut-off vicino a o superiore a 100 kDa, in modo ancora più appropriato aventi un cut-off vicino a o superiore a 300 kDa, e più preferibilmente una membrana avente un cut-offdi 750 kDa. In particolare, l'uso di una membrana avente un cut-offdi peso molecolare di o vicino a 750 kDa in almeno una fase di ultrafiltrazione in seguito alla coagulazione di caseina, consente di eliminare virtualmente tutte le proteine vescicolari contaminanti (come misurato mediante cromatografia SEC analitica, ad esempio, su una colonna Sephadex S-200 30/10). La scelta di una tale membrana non è ovvia a priori a coloro esperti nell'arte dato che da un lato le proteine contaminanti hanno tipicamente pesi molecolari molto inferiori a 300 kDa e dall'altro lato è stato mostrato che le EV passano sostanzialmente senza impedimenti attraverso membrane aventi dimensioni dei pori di 0,22 µm o coadiuvanti inerti di filtrazione, in grado di rimuovere aggregati solubili, suggerendo in tal modo che dimensioni maggiori delle membrane possano portare a perdite significative delle EV, non migliorando l'eliminazione di proteine. Ancora, per EV non derivate da latte, l'uso di membrane di ultrafiltrazione con tagli di peso molecolare significativamente maggiori di 100kDa, come 300 kDa e superiore, è stato associato con perdite di EV. Inoltre, membrane con cut-off di peso molecolare di 750 kDa non sono abitualmente comunemente disponibili.

[0062] È da notare che per il metodo di isolamento dell'invenzione, la frazione da recuperare (ovvero, quella contenente le EV) è quella che rimane sopra il filtro, non la frazione che passa attraverso di esso.

[0063] In una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, al fine di ottenere la concentrazione e la purezza desiderate, è svolta una prima pre-concentrazione, durante la quale il materiale è concentrato numerose volte, tipicamente 2-6 volte con una membrana appropriata. Questa prima pre-concentrazione è seguita da un'altra filtrazione, in modalità dialisi, e sono scambiati almeno 5-10 volumi. È stato trovato che per questa dialisi deve essere controllata la forza ionica dell'acqua o del tampone acquoso al fine di prevenire l'aggregazione delle macromolecole rimanenti e che le soluzioni diventino torbide. È stato trovato che l'inclusione di cloruro di sodio in concentrazioni nell'intervallo tra 0,5 e 1,5%, più preferibilmente tra 0,8-1% è sufficiente a tal scopo. Per coloro esperti nell'arte, saranno evidenti altre soluzioni, come un cambiamento della specifica forma salificata o un cambiamento di uno dei numerosi sistemi tampone usati nelle preparazioni biochimiche, come, ma non limitatamente a, tamponi basati su fosfato, citrato, carbonato, Tris, HEPES ed altri.

[0064] Al termine della dialisi, la preparazione di EV può essere ulteriormente concentrata fino alla desiderata concentrazione finale di EV. Questa concentrazione finale può essere determinata con metodi consolidati nell'arte, come l'analisi di monitoraggio delle nano particelle (Nano-Particle Tracking analysis). Generalmente, i valori per i numeri di particelle raggiunti con il metodo secondo l'invenzione sono nell'intervallo di 10^12-10^13 particelle/ml, con valori tipici di particelle/mg di proteina totale anch'essi nell'intervallo di 10^12-10^14 particelle/mg di proteina.

[0065] Come fase finale del metodo di preparazione, il materiale ottenuto nella fase (e) è ulteriormente chiarificato nella fase (g), usando ad esempio una terra diatomacea come nella fase (d).

[0066] Facoltativamente, una tale fase di filtrazione può essere necessaria anche dopo le prime fasi di ultrafiltrazione e concentrazione del pre-processamento o durante l'ultrafiltrazione se, ad esempio, il materiale da processare è particolarmente ricco di grassi, a seconda delle sue esatte caratteristiche e delle specie da cui è derivato il materiale di partenza. Tali fasi di filtrazione servono anche per rimuovere precocemente aggregati di proteine solubili, derivati ad esempio da stress da taglio a cui il materiale è sottoposto durante la dialisi, e che potrebbero altrimenti catalizzare o indurre ulteriore aggregazione proteica. Tali aggregati possono portare ulteriormente alla formazione di incrostazioni della membrana durante le successive fasi di dialisi e di concentrazione, o dare origine alla precipitazione o alla perdita di materiale di EV dopo conservazione prolungata in forma di liquido o congelata o dopo ricostituzione in seguito a liofilizzazione o spray-drying.

[0067] Queste fasi di filtrazione per la chiarificazione possono essere utili per ottenere una preparazione di EV priva di aggregati, ben solubile e stabile.

[0068] Facoltativamente, in un'ulteriore forma di realizzazione dell'invenzione, la preparazione può essere sottoposta ad ulteriore filtrazione, che riduce la contaminazione microbica, o ad un'effettiva filtrazione sterile (h). L'esperto dell'arte è perfettamente in grado di scegliere un metodo adatto per questa fase, ad esempio, l'uso di filtri sterili standard aventi dimensioni dei pori inferiori a 1 µm.

[0069] Inoltre, in un'altra forma di realizzazione, possono essere applicati differenti metodi alla preparazione al fine di migliorarne la stabilità e la durata di conservazione. A titolo esemplificativo, possono essere aggiunti stabilizzatori al prodotto finale e/o gli estratti di EV possono essere congelati con o senza differenti crioprotettori, liofilizzati e/o sottoposti a spray-drying.

[0070] La presente invenzione concerne pertanto anche preparazioni di EV, ottenute tramite il processo di cui sopra, che soddisfino numerosi criteri di qualità eccezionalmente elevata. Tali standard qualitativi stringenti sono importanti per l'utilizzo di isolati naturali, come EV in preparazioni farmaceutiche o in prodotti farmaceutici finiti. Le preparazioni di EV in accordo con la presente invenzione sono preparazioni di EV sostanzialmente pure e mostrano le seguenti caratteristiche analitiche: elevate concentrazioni particellari di almeno 10^12 particelle/ml, ancora più preferibilmente almeno 10^13 particelle per ml, o più preferibilmente almeno 10^14 particelle come determinato mediante analisi NTA e tipicamente un elevato rapporto tra particelle e proteine nell'ordine di 5x10^12 particelle/mg di proteina o più preferibilmente almeno 10^13 particelle/mg di proteina ed una purezza del picco delle EV non inferiore al 75% o più preferibilmente almeno l'80% e più preferibilmente ancora avente una purezza del picco delle EV superiore all'85% o in modo maggiormente preferibile avente una purezza del picco delle EV superiore al 90%, come misurato mediante FPLC usando una colonna analitica Sephadex-S200 30/10 con un rilevamento a 280 nm o un allestimento cromatografico equivalente.

[0071] La presente invenzione concerne anche l'uso del prodotto di EV, isolato dal latte o da derivati del latte seguendo il metodo in accordo con l'invenzione, nei campi farmaceutico, veterinario, nutraceutico e/o cosmetico. In particolare, le EV ottenute possono essere rifinite usando i metodi noti nell'arte al fine di potenziare la loro captazione e/o il loro veicolamento verso organi o tessuti specifici e/o esse possono essere caricate con principi attivi e, di conseguenza, essere impiegate come carrier di farmaci e sistemi di rilascio.

[0072] Di fatto, le preparazioni di EV ottenute in accordo con la presente invenzione sono particolarmente adatte all'uso come carrier di farmaci dato che esse sono caratterizzate da un basso grado di proteine contaminanti, tipicamente derivate altrimenti dalla co-precipitazione con le EV durante l'ultracentrifugazione usando latte come materiale di partenza. È noto che tali contaminanti e co-precipitati proteici interferiscono con le successive fasi di modificazione e caricamento degli esosomi e/o possono dare origine a falsi positivi o a reazioni collaterali indesiderate, ad esempio, durante la bioconiugazione, l'inserimento di lipidi o altri metodi chimici o fisici per il caricamento di EV con molecole di farmaci attive o con pro-farmaci.

[0073] I termini „principio attivo“ e „farmaco“ possono essere considerati sinonimi ed essi possono indicare differenti tipi di molecole o composti in grado di avere un effetto sul corpo umano o animale in termini di miglioramento della salute o di trattamento o prevenzione di sindromi o malattie. Oltre ai composti farmaceuticamente attivi noti, nella presente invenzione possono essere considerati un „principio attivo“ anche composti con valore cosmetico e/o nutraceutico. La persona esperta nell'arte è perfettamente in grado di selezionare il composto più adatto e il modo corretto di caricarlo nelle EV in relazione allo scopo per il quale è prevista la preparazione di EV.

[0074] In una forma di realizzazione specifica della presente invenzione, le EV derivate da latte o da derivati del latte in seguito al processo di isolamento dell'invenzione sono caricate con Amfotericina B, un composto ben noto avente attività antifungina e antiparassitaria.

[0075] Un ulteriore aspetto della presente invenzione è correlato alle preparazioni contenenti le EV isolate seguendo il processo dell'invenzione, usate per essere somministrate, e se presente, con il loro farmaco caricato, ad un soggetto umano o animale.

[0076] In particolare, le EV eventualmente funzionalizzate e/o caricate con uno o più principi attivi possono essere formulate in differenti preparazioni per la somministrazione sistemica e/o topica. Ad esempio, ma non in modo limitato, le EV possono essere miscelate con eccipienti appropriati al fine di ottenere formulazioni adatte alla somministrazione orale e/o parenterale, per l'inalazione, per la somministrazione topica sulla pelle o sulla mucosa.

[0077] Grazie alle loro caratteristiche intrinseche, di fatto, le particelle di EV sono particolarmente biocompatibili con le barriere biologiche dei corpi umani ed animali. La loro struttura e composizione possono facilitare l'assorbimento delle EV a livello della membrana cellulare potenziando, come conseguenza, la biodisponibilità del farmaco caricato ogni volta che è presente una barriera fisica. A titolo esemplificativo, l'uso di EV come sistema di rilascio, può potenziare la biodisponibilità del farmaco trasportato lungo il tratto gastrointestinale, la mucosa bronchiale e/o la pelle, portando ad una concentrazione potenziata del principio attivo nel flusso sanguigno e in corrispondenza del sito bersaglio.

[0078] In una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, è stato trovato che le preparazioni di EV del latte sono particolarmente adatte all'inclusione in una formulazione per inalazione.

[0079] È stato sorprendentemente trovato che la somministrazione di preparazioni di EV del latte, in accordo con la presente invenzione, effettua un'esposizione sistemica molto efficiente dopo averle portate a contatto con l'epitelio respiratorio di individui di tutte le età, inclusi gli adulti.

[0080] È pertanto sorprendente e da notare che per l'efficiente meccanismo di rilascio sistemico tramite l'epitelio respiratorio in accordo con la presente invenzione, non è necessaria alcuna modificazione ulteriore delle EV del latte ed è stato trovato che tale esposizione sistemica in seguito al contatto con l'epitelio respiratorio è maggiore di numerosi ordini di grandezza rispetto all'esposizione sistemica ottenuta con dosaggi equivalenti delle EV del latte per via orale. Dopo applicazione di piccoli volumi di preparazioni di EV del latte tramite via nasale, l'esposizione sistemica in numerosi tessuti, inclusi il tessuto cerebrale e il fegato, è stata rilevata in mammiferi adulti.

[0081] Tutti i vantaggi discussi presentati dall'invenzione saranno ulteriormente comprovati nella seguente parte sperimentale che non intende essere limitativa con riferimento all'ambito completo dell'invenzione riportato precedentemente.

Sezione sperimentale

Esempio 1:

[0082] Latte fresco di vacca (2,5 L) è stato raccolto e lasciato riposare in un cilindro graduato a 10°C per 22 ore, durante tale tempo è avvenuta la scrematura naturale. Lo strato superiore del latte (ca. 150 mL) è stato rimosso mediante decantazione.

[0083] Il pH del latte scremato è stato regolato a pH = 6,4 usando acido citrico. Poi, il latte scremato (2 L) è stato pre-riscaldato a 35°C per 15 minuti con un'unità di scambio termico collegata ad un serbatoio incamiciato. A questa soluzione riscaldata è stato aggiunto caglio di origine bovina contenente 20% di pepsina e 80% di chimosina, ad un dosaggio di 50 IMCU (unità internazionali di coagulazione del latte) per L. La temperatura di coagulazione è stata mantenuta a 35°C per 25 minuti. Dopo di che la miscela è stata riscaldata, quanto più velocemente possibile, a 56°C ed è stata mantenuta a tale temperatura per 10 minuti. La miscela è stata poi raffreddata rapidamente al di sotto di 10°C e il siero liquido di latte è stato separato dalla massa solida di proteina caseina coagulata usando un imbuto in vetro sinterizzato avente porosità 1 con un ingresso di filtrazione rivestito. In totale, sono stati ottenuti circa 1,7 L di siero del latte leggermente torbido.

[0084] Il materiale risultante è stato caratterizzato tramite il numero di particelle e la loro distribuzione dimensionale, così come il contenuto totale di proteina, come descritto negli Esempi 13 e 15. 1.14E+12 1.29E+11 186,5 1.6 154.8 5.8 1.55 0,04 7,32E+11 1,14E+12

Esempio 2:

[0085] Il siero di latte torbido (1,5 L) ottenuto nell'Esempio 1 è stato sottoposto a chiarificazione mediante filtrazione su un coadiuvante di filtrazione (Diacel CF/S con 0.1 -0,2 unità Darcy, dimensione particellare media di 13 µm) usando un imbuto di filtrazione standard in vetro sinterizzato avente porosità 3 per ottenere una soluzione giallognola trasparente con un indice di rifrazione di circa 6.

Esempio 3:

[0086] Il prodotto dell'Esempio 2 (1,5 L) è stato poi processato usando un sistema di TFF Vivaflow 200 (Sartorius) con cartucce di membrana monouso aventi un taglio di MW di 100 kDa. Il materiale è stato innanzitutto concentrato quattro volte per raggiungere un volume totale di ca. 370 mL. Poi sono stati aggiunti quattro volumi (1,5 L) di una soluzione all' 1% di cloruro di sodio e il materiale è stato concentrato nuovamente a dare il volume precedente di 370 mL. L'esaurimento relativo di contaminanti proteici con differenti pesi molecolari durante questa fase di pre-processamento è stato determinato mediante Cromatografia ad Esclusione Dimensionale (SEC), come descritto nell'Esempio 14 ed è mostrato nell'Esempio 4.

Esempio 4:

[0087] Il prodotto dell'Esempio 3 è stato chiarificato seguendo la procedura descritta nell'Esempio 2. Dopo chiarificazione, il campione è stato filtrato a sterilità su un'unità di filtrazione monouso da 0.45 µm per ottenere ca. 350 mL di una soluzione opaca trasparente avente un indice di rifrazione di 2. Il prodotto è stato poi suddiviso in differenti aliquote da 50 mL ciascuna ed alcune aliquote sono state congelate rapidamente per una conservazione a lungo termine.

[0088] Il materiale risultante è stato caratterizzato tramite il numero di particelle e la loro distribuzione dimensionale, così come il contenuto totale di proteina, come descritto negli Esempi 13 e 15. 1,80E+12 4,97E+11 161,1 2,3 147,0 9,6 1,14 0,14 1,57E+12 4,49E+11

Esempio 5:

[0089] Il prodotto congelato dell'Esempio 4 (4x 50 mL) è stato scongelato lentamente per tutta la notte e chiarificato nuovamente con il metodo descritto nell'Esempio 2. Il materiale è stato poi sottoposto ad un secondo ciclo di concentrazione/dialisi usando una membrana a fibre cave avente un taglio di peso molecolare di 750 kDa (MWCO) (D02-E750-10-N mPES). Il materiale è stato concentrato quattro volte per raggiungere un volume 50 mL. Poi, un totale di 20 volumi è stato scambiato mediante dialisi aggiungendo ripetutamente 100 mL di PBS pH 7.4. Infine, il campione è stato concentrato per ottenere ca. 40 mL di EV da latte purificate e concentrate. Il materiale è stato filtrato a sterilità usando un filtro su siringa in PES da 0,2 µM. Il materiale risultante è stato caratterizzato tramite il numero di particelle e la loro distribuzione dimensionale, così come il contenuto totale di proteina, come descritto negli Esempi 13 e 15. 9,26E+12 5,90E+11 165,33 0,6 146,17 7,87 1,67 0,016 5,55E+12 2,01E+11

Esempio 6:

[0090] Latte fresco di vacca (1.500 L) è stato raccolto e parzialmente scremato lasciandolo sedimentare in un serbatoio per 24 ore.

[0091] Il latte scremato (1.300 L) è stato poi pre-riscaldato a 35°C per 15 min. A questa soluzione riscaldata è stato aggiunto caglio di origine bovina (contenente 5% di pepsina-95% di chimosina) ad un dosaggio di 50 IMCU/L. La temperatura di coagulazione è stata mantenuta a 32°C per 60 minuti. Dopo di che la miscela è stata riscaldata, quanto più velocemente possibile, a 56°C ed è stata mantenuta a tale temperatura per 15 minuti. La miscela è stata poi lasciata raffreddare e il siero liquido di latte è stato separato dalla massa solida di proteina caseina coagulata usando un filtro con maglie metalliche.

[0092] In totale, sono stati ottenuti circa 1.000 L di siero di latte leggermente torbido.

Esempio 7:

[0093] Il siero di latte (600 L) ottenuto nell'Esempio 6 è stato chiarificato usando un dispositivo di filtrazione a piastre e telai. La pressa del filtro è stata innanzitutto assemblata con fogli filtranti (filtri di Pall EK) e pre-rivestita facendo passare una soluzione di coadiuvante di filtrazione (Diacel CF/S, 10 kg) in acqua. Poi, altri 5 kg di tale coadiuvante di filtrazione sono stati aggiunti al siero di latte e il siero è stato fatto passare sopra il filtro. Dopo filtrazione sono stati ottenuti 500 L di siero trasparente. Il siero trasparente così ottenuto è stato poi concentrato a 100 L usando una cartuccia in fibre cave da 5" con un MWCO di 100 kDa. Poi, 500 L di una soluzione all' 1% di NaCl in acqua distillata sono stati aggiunti al prodotto e la soluzione è stata nuovamente concentrata ad un volume finale di 100 L. Questo materiale è stato poi chiarificato un'altra volta usando l'allestimento per filtrazione profonda ed immediatamente dopo il filtro è stato fatto passare attraverso una cartuccia di filtrazione sterile (Filtrox, 0,5 µm). Sono stati quindi ottenuti e congelati 80 L di EV da latte pre-concentrato chiarificato. 5,52E+12 5,90E+11 147,1 0,8 139,2 5,1 1,54 0,021 3,57E+12 7,36E+11

Esempio 8:

[0094] Un campione da 6 L ottenuto dall'Esempio 7 è stato concentrato sei volte (a dare IL) e sottoposto a sei cicli di dialisi/concentrazione, come descritto nell'Esempio 5 usando una membrana in fibre cave con un MWCO di 750 kDa (D02-E750-10-N mPES) mediante aggiunta di 6 volumi (6L) di PBS (pH 7.4) per ottenere IL di EV da latte filtrate a sterilità e purificate. 2,41E+13 4,40E+11 142,4 1,7 126,0 5,3 1,0 0,021 2,41E+13 5,13E+11

Esempio 9:

[0095] Il siero di latte (2.000 L) ottenuto come descritto nell'Esempio 6 è stato chiarificato usando un dispositivo di filtrazione a piastre e telai. La pressa del filtro è stata innanzitutto assemblata con fogli filtranti (filtri di Pall EK) e pre-rivestita facendo passare una soluzione di coadiuvante di filtrazione (Diacel CF/S, 10 kg) in acqua. Poi, altri 5 kg di tale coadiuvante di filtrazione sono stati aggiunti al siero di latte e il siero è stato fatto passare sopra il filtro. Dopo filtrazione sono stati ottenuti 1800 L di siero trasparente. Il siero trasparente così ottenuto è stato inizialmente concentrato a 400 L usando una cartuccia in fibre cave da 5" con un MWCO di 500 kDa. Poi, 2.000 L di una soluzione all' 1% di NaCl in acqua distillata sono stati aggiunti al prodotto e la soluzione è stata nuovamente concentrata per ottenere 100 L. A questo punto, sono stati aggiunti altri 500 L di PBS (pH 7.4) al prodotto e la soluzione è stata concentrata a ca. 60 L. Questo materiale è stato poi chiarificato un'altra volta usando l'allestimento per filtrazione profonda ed immediatamente dopo il filtro è stato fatto passare attraverso una cartuccia di filtrazione sterile (Filtrox, 0,5 µm). Sono stati ottenuti quindi 50 L di EV da latte purificati.

Esempio 11:

[0096] Questo esempio procede come gli Esempi da 1 a 5, a partire da latte di capra fresco (2,5 L) per ottenere 20 mL di EV da latte di capra purificate.

[0097] Il latte di capra è stato pre-processato secondo le fasi descritte negli Esempi 1-4. 150 mL di siero di latte di capra pre-processato sono stati lentamente scongelati durante la notte. Il materiale è stato poi sottoposto ad un secondo ciclo di concentrazione/dialisi usando una membrana a fibre cave avente un MWCO di 750 kDa (D02-E750-10-N mPES). Il materiale è stato concentrato quattro volte per raggiungere un volume 38 mL. Poi, un totale di 20 volumi è stato scambiato mediante dialisi aggiungendo ripetutamente 112 mL di PBS pH 7.4. Infine, il campione è stato concentrato per ottenere ca. 20 mL di EV da latte di capra purificate e concentrate. Il materiale è stato filtrato a sterilità usando un filtro su siringa in PES da 0,2 µM. Il materiale risultante è stato caratterizzato tramite il numero di particelle e la loro distribuzione dimensionale, così come il contenuto totale di proteina, come descritto Esempi 13 e 15. 1.18E+13 1,12E+12 137,5 1,5 103,0 6,4 1.44 0.13 8.19E+12 4.33E+11

Esempio 12:

[0098] A titolo comparativo, è stato svolto un protocollo tratto dalla letteratura per l'isolamento di EV da latte basato su ultracentrifugazione. Il protocollo era basato su procedure sperimentali riportate nelle sezioni dei materiali e metodi di Betker et al., 2019; Agrawal et al., 2017; Munagala et al., 2017.

[0099] Latte intero fresco è stato sgrassato mediante vorticazione per 30 min a 4°C a 13.000 g. Il surnatante è stato fatto passare attraverso una carta da filtro Whatman. Il latte sgrassato è stato centrifugato per 60 min a 4°C a 100.000 g (corrispondente a una rcf max 31.400 rpm, Sorvall Discovery Ultracentrifuge, con rotore ad angolo fisso T865). Il surnatante (non superiore al 70% del volume totale) è stato raccolto attentamente con una pipetta in vetro senza perturbare lo strato di poltiglia inferiore. Le EV sono state pellettizzate facendo vorticare il surnatante per 90 min a 4°C a 135.000 g, corrispondente ad una rcf max = 36.400 rpm (Figura 12). I pellet sono stati lavati 3 volte con PBS pH 7.4, disciolti in PBS pH 7.4 e filtrati a sterilità usando una siringa con filtro in PES da 0,2 µM. 1,14E+11 0.20E+11 142.8 1.6 119,0 3,0 0.287 n a 2.28E+11 2.13E+09

Esempio 13: Analisi per il Monitoraggio di Nanoparticelle (NTA) di preparazioni di EV

[0100] I numeri e la distribuzione dimensionale delle particelle sono stati analizzati usando uno strumento NanoSight LM10 (Malvern), configurato con un laser a 488 nm. I video sono stati raccolti ed analizzati usando il software NTA 3.1.

[0101] Le misurazioni sono state eseguite in triplicato ad una temperatura controllata di 25°C. Ciascun campione è stato diluito da 1 a 100 in PBS filtrato a sterilità pH 7.4 fino a 1 mL. I campioni sono stati diluiti ulteriormente al fine di svolgere le misurazioni in un intervallo di 80-120 particelle/telaio. Il livello della videocamera è stato mantenuto a 12 durante tutte le misurazioni e sono state effettuate cinque registrazioni consecutive da 60 secondi per ciascun campione. I campioni sono stati analizzati con una soglia di rilevamento di 5. La caratterizzazione di preparazioni di EV da latte mediante i metodi della presente invenzione usando NTA è illustrata in Figura 1, nelle Figure 2, 6 (b-e), 8, 10 (b-e) e 12 (b-e).

Esempio 14: Analisi mediante Cromatografia ad Esclusione Dimensionale (SEC) della Preparazione di EV

[0102] 50 µL dei campioni sono stati sottoposti a cromatografia ad esclusione dimensionale usando una colonna Superdex 200 10/300 (Cytiva) su un sistema Shimadzu LC-20Ai dotato di un Rivelatore a Serie di Diodi SPD-M20A PDA ed un Rilevatore a Fluorescenza RF-20A. L'esclusione dimensionale è stata eseguita in PBS a pH 7.4 ad una portata di 0,8 mL/min. La dimensione dei picchi eluiti è stata determinata usando uno standard di filtrazione su gel (BioRad # 5119011, Figura 4). La caratterizzazione di preparazioni di EV del latte mediante i metodi della presente invenzione usando SEC è illustrata nelle Figure 3, 4, 6 (a), 9, 10 (a) e 12(a).

Esempio 15: Analisi Proteica della Preparazione di EV

[0103] Le concentrazioni proteiche dei campioni di EV sono state determinate con i reagenti di Bradford (Pierce Detergent Compatible Bradford Assay Kit, Thermo Fisher Scientific 23246) o BCA (Pierce BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific 23225) in accordo con le istruzioni del produttore usando diluizioni seriali di BSA come standard. Le concentrazioni proteiche sono state determinate in triplicato.

Esempio 16: Analisi Western Blot delle Preparazioni di EV

[0104] I campioni di EV sono stati analizzati mediante SDS-PAGE usando Gel di TGX al 4-20% (BioRad) in condizioni riducenti (per i marcatori MFGE8, tsg101) o non riducenti (CD9) a 150 Volt per approssimativamente 50 min. Le proteine separate sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa da 0,45 µM mediante blot semi-asciutto a 20 Volt per 45 min. Il bloccaggio è stato eseguito usando TBS + 0,2% di Tween-20 + 5% di BSA (per i marcatori MFGE8, CD9) o TBS + 0,2% di Tween-20 + 2% di latte in polvere senza grassi (tsg101) per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione. Dopo il bloccaggio, le membrane sono state incubate a 4°C o/n con i seguenti anticorpi primari: MFGE8 (HPA002807, Sigma, diluizione 1:1000), tsg101 (ab83, Abcam diluizione 1:1000) o CD9 (AHS0902, Invitrogen, diluizione 1:2000) diluiti in TBS + 0,2% di Tween-20 + 1% di BSA (MFGE8, CD9) o TBS + 0,2% di Tween-20 + 2% di latte in polvere senza grassi (tsg101) con agitazione. Dopo incubazione, la membrana è stata lavata 5 volte con TBS + 0,2% di Tween-20 per 5 min ogni volta ed incubata successivamente con il corrispondente anticorpo secondario (LI-COR) per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione (1:15000 di IRDye 680RD anti-topo per rilevare tsg101 e CD9 o 1:15000 di IRDye 800 CW anti-coniglio per rilevare MFGE8). Le membrane sono state lavate 5 volte per 5 minuti con TBS + 0,2% di Tween-20 prima dell'analisi in uno strumento di visualizzazione LI-COR. La caratterizzazione di preparazioni di EV del latte con i metodi della presente invenzione usando Western Blot è illustrata in Figura 5.

Esempio 17: Captazione cellulare dopo marcatura di EV

[0105] Le EV del latte ottenute nell'Esempio 8, così come nell'Esempio 11, sono state diluite ognuna a 10 µM in PBS a pH 7.4 e fatte reagire con 25 µM di (5',6'-)TMR-NHS e 50 µM di Cy5-NHS per 1 ora a 37°C. Il colorante non reagito è stato rimosso mediante sei cicli di concentrazione/dialisi ogni volta con sei volumi di PBS a pH 7.4 su una membrana in mPES a fibre cave da 750kDa come descritto nell'Esempio 5. Le concentrazioni delle EV sono state determinate mediante NTA come descritto nell'Esempio 13. Cellule A549 (adenocarcinoma polmonare umano) sono state piastrate in piastre a 96 pozzetti pre-rivestiti con collagene e fatte crescere in condizioni di coltura cellulare standard fino ad una confluenza cellulare del 50-60% (5% CO2, umidità del 95%, 37°C). Vescicole extracellulari marcate doppie con Cy5/TMR (EV derivate da siero di latte bovino conservate a 4°C o a -80°C (Figura 7) o EV derivate da siero di latte di capra conservate a 4°C (Figura 11) sono state aggiunte a concentrazioni crescenti con tre replicati biologici indipendenti per condizione. Dopo 6 ore di incubazione, le cellule sono state fissate con PenFix (Richard Allen Scientific) arricchito con Hoechst 33258 a 0,5 µM. Le cellule sono state visualizzate mediante microscopia a fluorescenza a campo largo (Olympus IX83) usando un obiettivo ApoPlan 40x con un'apertura numerica di 0,95. Sono state scattate oltre 10 immagini per pozzetto, laddove ogni immagine rappresentava una proiezione di intensità massima di 7 singole immagini Z e sono stati visualizzati 5 differenti canali: Campo chiaro, Hoechst (ex385nm, em417-477nm), TMR (ex545nm, em605/70nm), CY5 (ex640nm, em700/75nm) e TMR- CY5 FRET (ex545, em700/75). Il rilevamento di cellule e vescicole è stato eseguito con un plugin ImageJ Fiji auto-programmato. In breve, le cellule sono state rilevate mediante rilevamento angolare del canale in campo chiaro seguito da lisciamento e applicazione di una soglia all'immagine. Le EV sono state rilevate usando l'auto soglia Li (soglie simili sono usate in tutte le concentrazioni) sul canale CY5. Le EV nell'area cellulare sono state contate e sono mostrate come area cellulare „EV/1.000 pixel“.

Esempio 18: Microscopia Elettronica a Trasmissione di EV con colorazione negativa

[0106] Le EV del latte ottenute nell'Esempio 8 sono state diluite ad una concentrazione da 1 a 5x10^10 particelle per mL in PBS e sono state pipettate su griglie rivestite con Formvar e carbonio. Dopo asciugatura all'aria per 30-45 min a temperatura ambiente, l'eccesso della soluzione di EV è stato rimosso premendo le griglie su carta da filtro con un angolo di ca. 45°. Le griglie sono state poi lavate 3x con acqua distillata posizionandole su gocce da 100 µL su parafilm, seguito da fissazione con 1% di glutaraldeide in PBS per 5 minuti su gocce da 40 µL, lavaggio 8 x con acqua in gocce da 40µL e colorazione negativa con uranil acetato acquoso al 2% per 5 minuti. I campioni sono stati asciugati all'aria per 1 ora e visualizzati su un Microscopio Elettronico a Trasmissione EM 910 di Zeiss a 80.000 kV e ingrandimento di 40.000 x (videocamera Tröndle). Le immagini tipiche delle preparazioni di EV del latte dell'Esempio 8 sono mostrate in Figura 13.

Esempio 19: Quantificazione di Amfotericina B (caricata su EV del latte) usando cromatografia liquida ad elevate prestazioni

[0107] La quantificazione di Amfotericina B (AmB) è stata eseguita usando cromatografia liquida ad elevate prestazioni in fase inversa (RP-HPLC, Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography) in uno strumento Shimadzu Prominence. I campioni di MEV caricati erano campioni da 50 µL e sono stati iniettati e separati su una colonna C18 (3,0 × 150 mm con dimensioni particellari di 5 µm) mediante eluizione isocratica con una fase mobile di Acetonitrile/20 mM di EDTA (55% / 45% vol/vol) con una portata di 1 mL/min. EDTA è stato usato nella fase mobile, dato che esso migliora il comportamento cromatografico di AmB mediante competizione diretta rispetto ad Amfotericina B per la chelazione con ioni metallici. AmB è stata rilevata mediante misurazione dell'assorbanza di UV a 406 nm. Le soluzioni standard di calibratura sono state preparate a concentrazioni variabili nell'intervallo di 0,0125 - 10 µg/mL. I cromatogrammi rappresentativi e le curve di calibratura di AmB sono mostrati in Figura 14 a e b, rispettivamente.

Esempio 20: Caricamento di Amfotericina B su esosomi di latte bovino

[0108] Per il caricamento di AmB su esosomi di latte bovino, sono stati testati numerosi metodi, inclusa incubazione a temperatura ambiente, incubazione a 37 °C, condizione ipotonica, sonicazione, estrusione, incubazione con saponina e congelamento-scongelamento. AmB è stata aggiunta da una soluzione stock 1 mM in DMSO nei campioni di EV del latte in PBS a dare concentrazioni finali di MEV a 1 nM, di AmB a 2 µM e di DMSO a 0,5 % e sono stati trattati in differenti condizioni, come segue: – Incubazione: le formulazioni sono state incubate a temperatura ambiente (21 °C), a 37 °C o a 50°C per tempi differenti (come specificato nella Tabella 1) in PBS. – Saponina: saponina è stata aggiunta ad una concentrazione finale del 2% p/v e le formulazioni sono state incubate in condizioni differenti (come specificato nella Tabella 1). – Sonicazione: le formulazioni sono state sonicate usando un sonicatore con sonda (potenza all'80 % con impulso di 30 secondi / pausa di 30 secondi). – Condizione ipotonica: le formulazioni sono state diluite con H2O fino ad una concentrazione finale di PBS 0,5 x. – Congelamento-scongelamento: le formulazioni sono state congelate rapidamente, mantenute a -80°C per 0,5 ore e scongelate a temperatura ambiente per 3 cicli. – Estrusione: le formulazioni sono state estruse (x10 volte e x20 volte) usando un estrusore Avanti Lipids avente un diametro dei pori di 200 nm.

[0109] Per rimuovere la AmB libera dalla formulazione, la miscela è stata ultrafiltrata sei volte con PBS mediante centrifugazione in unità di ultrafiltrazione Vivaspin (MWCO di 10 kDa) a 10.000 x g per 15 minuti. La fase finale di lavaggio ha portato ad ottenere campioni concentrati 10 volte. La AmB è stata poi estratta aggiungendo acetonitrile al volume originale, risultando in una concentrazione finale di ACN:H2O di 90:10. La miscela è stata fatta vorticare a temperatura ambiente a 1.000 rpm per 30 minuti e centrifugata a 1.000 x g per 15 minuti prima dell'iniezione per determinare la concentrazione di AmB usando RP-HPLC come descritto nell'Esempio 19. Le concentrazioni di AmB ritenuta per le differenti condizioni sono elencate in Tabella 1, rivelando che il caricamento mediante incubazione a temperatura ambiente per ≥ 6 ore ha permesso di ottenere le densità di caricamento maggiori.

Tabella 1. Concentrazione di AmB ritenuta in esosomi di latte bovino in differenti condizioni di caricamento

[0110] Temperatura ambiente 1 ora 0 nM Temperatura ambiente 2 ore 21 nM Temperatura ambiente 4 ore 179 nM Temperatura ambiente 6 ore 227 nM Temperatura ambiente 24 ore 252 nM 37°C per 6 ore 171 nM 37°C per 24 ore 128 nM 50°C per 6 ore 87 nM 50°C per 24 ore 52 nM Condizione ipotonica 189 nM Sonicazione per 2,5 min (bagno di ghiaccio) 294 nM Sonicazione per 5 min (bagno di ghiaccio) 162 nM Sonicazione per 10 min (bagno di ghiaccio) 81 nM Sonicazione per 2,5 min (senza bagno di ghiaccio) 44 nM Sonicazione per 5 min (senza bagno di ghiaccio) 24 nM Estrusione 10 volte 184 nM Estrusione 20 volte 172 nM Temperatura ambiente per 24 ore + 0,2% di Saponina 254 nM 37°C per 24 ore + 0,2% di Saponina 132 nM 50°C per 24 ore + 0,2% di Saponina 54 nM 3 Cicli di congelamento-scongelamento 108 nM

Esempio 21: Caricamento di Amfotericina B su esosomi di latte di capra

[0111] Il caricamento di AmB su esosomi di latte di capra è stato testato usando le procedure come descritte nell'Esempio 20. La concentrazione di AmB ritenuta è stata eseguita usando RP-HPLC come descritto nell'Esempio 19.

Tabella 2: Concentrazione di AmB ritenuta in EV da latte di capra (1 nM) in differenti condizioni

[0112] Temperatura ambiente 2 ore 82 nM Temperatura ambiente 4 ore 271 nM Temperatura ambiente 6 ore 392 nM Temperatura ambiente 24 ore 388 nM 37°C per 6 ore 199 nM 37°C per 24 ore 112 nM 50°C per 6 ore 91 nM 50°C per 24 ore 48 nM Sonicazione per 2,5 min (bagno di ghiaccio) 209 nM Sonicazione per 5 min (bagno di ghiaccio) 103 nM Sonicazione per 10 min (bagno di ghiaccio) 73 nM

Esempio 22: Saturazione del caricamento di AmB su EV da latte di capra

[0113] Per testare in aggiunta la saturazione del caricamento di EV come funzione della concentrazione di AmB, sono state incubate per 6 ore EV da latte di capra 1 nM a temperatura ambiente con concentrazioni crescenti di AmB variabili nell'intervallo da 1 µM a 10 µM (DMSO a 1 % v/v in tutti i campioni). Inoltre, abbiamo testato la formulazione di esosomi caricati con AmB con concentrazione crescente di EV mantenendo costante il rapporto di EV:AmB. Le concentrazioni di MEV: AmB erano a 1 nM: 2 µM; 2 nM: 4 µM; 3 nM: 6 µM; 4 nM: 8 µM e 5 nM: 10 µM. Tutte le formulazioni contenevano 1 % di DMSO. La concentrazione di AmB ritenuta è stata eseguita usando RP-HPLC come descritto nell'Esempio 19. I risultati sono mostrati in Figura 15.

Esempio 23. Co-frazionamento di AmB con EV del latte usando cromatografia ad esclusione dimensionale

[0114] Per testare se AmB ritenuta con le EV dopo caricamento è effettivamente associata fisicamente con le vescicole, abbiamo usato cromatografia analitica ad esclusione dimensionale in condizioni native per verificare il co-frazionamento. 10 µL dei campioni come preparati nell'Esempio 20 (1 nM di EV da latte bovino o di capra caricate con 2 µM di AmB mediante incubazione per 6 ore a temperatura ambiente) prima e dopo l'eliminazione di AmB libera mediante ultrafiltrazione sono stati iniettati su una colonna Sephadex 200 30/10 e separati mediante eluizione isocratica con PBS a pH 7.4 ad una portata di 0,8 mL/min in uno strumento Shimadzu LC-20Ai dotato di un rivelatore a serie di diodi UV/Vis e di fluorescenza. AmB è stata rilevata con un'assorbanza a 406 nm, le EV del latte sono state rivelate mediante autofluorescenza a 488nm/510 nm (ex/em). Oltre alle formulazioni, sono state anche analizzate AmB e MEV libere. Come mostrato in Figura 16, AmB caricata sia su EV da latte bovino (Figura 16a) che da EV da latte di capra (Figura 16b) è anche co-frazionata con il picco di MEV come analizzato mediante cromatografia nativa ad esclusione dimensionale, dimostrando l'associazione fisica di AmB con le vescicole.

Esempio 24: Captazione cellulare di EV da latte di capra caricate con AmB

[0115] Le EV da latte di capra sono state marcate con Cy5 NHS e Tamra NHS come descritto nell'Esempio 17 e caricate con AmB come descritto nell'Esempio 21 (1 nM di EV da latte di capra caricate con 2 µM di AmB mediante incubazione per 6 ore a temperatura ambiente). La captazione cellulare in cellule A549 è stata poi quantificata mediante microscopia a fluorescenza, come descritto nell'Esempio 17. Come mostrato in Figura 17, gli esosomi di latte di capra caricati con AmB sono stati captati dalle cellule in modo identico alle EV da latte di capra non caricate, confermando che il caricamento di AmB non influenza la funzionalità delle EV del latte nella captazione cellulare.

Esempio 25: Esposizione sistemica di EV del latte della presente invenzione dopo rilascio nasale tramite il tratto respiratorio.

[0116] Le EV da latte bovino marcate con TMR e Cy5 ottenute nell'Esempio 17 sono state usate per la somministrazione intranasale in topi C57/B16 (femmina 8 settimane). Dopo aspirazione di 5 µL delle EV marcate a 3,4x10^13 particelle/mL in PBS tramite il naso, i topi sono stati sacrificati dopo 6 ore, gli organi sono stati fissati con 4 % di PFA, trasferiti in un Cryobuffer (30% p/v di saccarosio, 1 % p/v di polivinilpirrolidone-40, 30 % v/v di etilen glicole in 100 mM di PBS a pH 7,4) ed analizzati mediante visualizzazione tramite epifluorescenza in uno strumento di visualizzazione IVIS Spectrum. Le intensità dei segnali di fluorescenza relativi agli organi da animali trattati con PBS sono mostrate in Tabella 3.

Tabella 3: Intensità dei segnali di fluorescenza di differenti organi da topi a cui sono state somministrate EV a confronto con gli organi corrispondenti di animali di controllo trattati con PBS:

[0117] Cervello 1,2 Tratto GI 44,2 Cuore 7,7 Rene sinistro 32,4 Rene destro 29,5 Fegato 18,5 Linfonodo 5,7 Polmone sinistro 386,0 Polmone destro 412,7 Milza 7,0

Claims (10)

1. Un processo per l'isolamento di EV purificate da latte, caratterizzato dal fatto di comprendere almeno una fase di coagulazione delle proteine del latte ed almeno una fase di ultrafiltrazione e concentrazione basata su membrana.

2. Un processo per l'isolamento di EV purificate da latte secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fasi: a) fornire un campione di latte; b) chiarificare facoltativamente detto campione per mezzo di processi tradizionalmente noti di filtrazione o decantazione per ottenere latte chiarificato; c) sottoporre detto latte o detto latte chiarificato ad un trattamento con una miscela di enzimi adatta a coagulare proteine del latte ad una temperatura e in un tempo pre-definiti, per ottenere un liquido contenente proteine coagulate; d) separare dette proteine coagulate dal loro surnatante svolgendo almeno una filtrazione di detto liquido, con uno strato inerte di un mezzo filtrante, per ottenere una soluzione trasparente; e) sottoporre detta soluzione trasparente ad almeno una fase di ultrafiltrazione e concentrazione usando membrane con dimensioni dei pori definite e acqua o tampone di regolata forza ionica come mezzo di dialisi al fine di ottenere una preparazione concentrata di EV; f) trattare facoltativamente detta preparazione concentrata di EV con un agente stabilizzante, come sorbato di potassio e, contemporaneamente, regolare il pH ottenendo una preparazione concentrata di EV stabilizzata; g) sottoporre detta preparazione concentrata di EV o detta preparazione concentrata di EV stabilizzata ad una seconda fase di filtrazione/chiarificazione al fine di ottenere un isolato chiarificato essenzialmente puro di EV da latte; h) sottoporre facoltativamente detto isolato chiarificato essenzialmente puro di EV da latte ad una filtrazione sterilizzante usando filtri sterili standard di dimensioni tipiche dei pori inferiori a 1 µm, preferibilmente tra 0,45 µm e 0,2 µm, al fine di ottenere un isolato chiarificato essenzialmente purosterile di EV da latte.

3. Il processo secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2 caratterizzato dal fatto che detta fase di coagulazione di proteine del latte o miscela di enzimi della fase (c) contengono pepsina e chimosina, preferibilmente ottenuta tramite fermentazione o è caglio, contenente preferibilmente 5% di pepsina e 95% di chimosina.

4. Il processo secondo la rivendicazione 1, 2 o 3 caratterizzato dal fatto che detta almeno una fase (e) di ultrafiltrazione e concentrazione è svolta attraverso una membrana avente un cut-off molecolare di 750 kDa ed è preceduta preferibilmente da una fase di pre-concentrazione ed ultrafiltrazione attraverso una membrana avente un cut-off di peso molecolare di 100 - 500 kDa.

5. Isolato chiarificato essenzialmente puro di EV da latte secondo qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 per l'uso come carrier per principi attivi nei campi farmaceutico, veterinario, nutraceutico e/o cosmetico.

6. Composizione comprendente l'isolato chiarificato essenzialmente puro di EV da latte secondo le rivendicazioni 1-4 ed eccipienti farmaceuticamente accettabili.

7. Composizione secondo la rivendicazione 6, caratterizzata dal fatto che essa comprende inoltre Amfotericina B caricata in detto isolato chiarificato essenzialmente puro di EV da latte.

8. Composizione secondo la rivendicazione 6 per l'uso come carrier per principi attivi nei campi farmaceutico, veterinario, nutraceutico e/o cosmetico.

9. Composizione secondo la rivendicazione 8 per inalazione.

10. Composizione secondo la rivendicazione 7 per l'uso come antifungino e/o antiparassitario.