CN118042933A - 制备富含磷脂和骨桥蛋白的乳清衍生的组合物的方法、该组合物本身以及该组合物的营养用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过膜过滤制备富含乳清磷脂和骨桥蛋白(OPN)，并且优选地还富含来自乳清的其他膜组分的乳清衍生的组合物的方法。本发明还涉及乳清衍生的组合物本身、乳清衍生的组合物用于增加营养产品中OPN的含量的用途，以及包含乳清衍生的组合物的营养产品。

Description

制备富含磷脂和骨桥蛋白的乳清衍生的组合物的方法、该组 合物本身以及该组合物的营养用途

发明领域

本发明涉及通过膜过滤制备富含乳清磷脂和骨桥蛋白(osteopontin，OPN)，并且优选地还富含来自乳清的其他膜组分的乳清衍生的组合物的方法。本发明还涉及乳清衍生的组合物本身、乳清衍生的组合物用于增加营养产品中OPN的含量的用途，以及包含乳清衍生的组合物的营养产品。

发明背景

乳脂球膜(milk fat globule membrane，MFGM)是主要包含脂质和蛋白质的复杂且独特的结构，该结构包裹着从人类和其他哺乳动物的产乳细胞分泌的乳脂球。它是多种生物活性化合物的来源，所述多种生物活性化合物包括在脑和肠道中具有重要功能作用的磷脂、糖脂、糖蛋白和碳水化合物。

已知乳衍生的乳脂球状膜组分和乳衍生的功能蛋白，特别是磷脂，是营养组合物的有价值的添加剂，其被报告影响人体的许多功能和发育，包括结肠癌、细胞生长、脑发育、认知功能和记忆。

从US2014106044中已知一种生产富含蛋白质的产品的方法，US2014106044公开了一种通过乳清的超滤以获得作为渗余物的乳清蛋白浓缩物(whey proteinconcentration，WPC)和WPC的微滤以产生作为渗透物的富含蛋白质的产物并且使微滤的渗余物再循环来生产富含蛋白质的产品乳清蛋白分离物(WPI)的方法。

US 7,259,243 B2公开了一种通过任选地将乳材料与钙源混合，并且通过pH调节将含骨桥蛋白的相与乳材料的其余部分分离来用于从包含乳骨桥蛋白的材料中分离乳骨桥蛋白的工艺。

Rocha-Mendoza等人("Invited review:Acid whey trends and healthbenefits",Journal of Dairy Science；第104卷,第2期,2020年12月23日,第1262-1275页)论述了与酸乳清的产品、用途和健康益处相关的多种趋势。

US2019/0388518 A1公开了具有蛋白质组分的制剂，其中蛋白质包含一种或更多种助消化蛋白质和一种或更多种免疫保护蛋白质。一种或更多种助消化蛋白质与一种或更多种免疫保护蛋白质的按重量计的比可以是约12:1至约1:1。制剂还可以包含脂肪组分、碳水化合物组分以及维生素和矿物质。这些制剂可以用于为受试者提供营养支持物作为膳食补充剂或作为主要营养来源，诸如用于婴儿配方产品(infant formula)。这些制剂还可以用于促进或诱导肠细胞的增殖、促进或诱导肠细胞的分化、防止或抑制受试者的消化系统中肠致病性大肠杆菌的生长、防止或抑制肠腔中的细菌生长、增加肠细胞分泌白细胞介素-18或增加肠免疫。

发明概述

本发明人已经令人惊讶地发现，通过受控的膜过滤提供富含乳清磷脂和骨桥蛋白(OPN)两者的乳清衍生的组合物在技术上是可行的。这是特别令人惊讶的，因为OPN预期与磷脂分离并且在膜过滤期间与其他乳清蛋白一起被转移到渗透物中。然而，本发明人发现，可以将大量的OPN与磷脂和其他MFGM组分一起保留在过滤渗余物中。这是有利的，因为OPN组分和MFGM组分两者是用于婴儿发育的重要营养素。因此，过滤渗余物可以有利地被用作婴儿营养品本身中的成分，或者被转化成比液体过滤渗余物更适合于储存和运输的粉末成分。

因此，本发明的方面涉及制备乳清衍生的组合物的方法，该乳清衍生的组合物富含磷脂和骨桥蛋白(OPN)并且优选地还富含其他乳脂球膜组分，该方法包括以下步骤：

a)提供液体进料，该液体进料包括包含骨桥蛋白和α-乳清蛋白(ALA)的乳清蛋白以及源自乳清的磷脂，液体进料包含在相对于总蛋白质的0.2％w/w-2.0％w/w的范围内的骨桥蛋白总量，

b)使液体进料经历膜过滤以提供过滤渗余物和过滤渗透物，优选地其中所述膜过滤被布置和操作成：

-提供基于过滤渗余物的总蛋白质的骨桥蛋白含量，该骨桥蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少150％，以及

-提供基于过滤渗余物的总蛋白质的α-乳清蛋白含量，该α-乳清蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多75％，以及

任选地，c)使过滤渗余物或至少包含源自过滤渗余物的脂质和蛋白质的产物流经历一个或更多个另外的加工步骤，该一个或更多个另外的加工步骤优选地包括以下步骤中的一个或更多个：

i)微滤，

ii)浓缩，

iii)热处理，以及

iv)干燥。

特别优选的是，制备富含乳清磷脂和骨桥蛋白的乳清衍生的组合物的方法作为连续方法进行，即以连续操作进行。本发明人已经发现，相对于例如延长的间歇工艺，连续操作提高了该工艺的总能量效率并且提供了具有减少的微生物污染的产品。然而，间歇式实施或半间歇式实施也是可行的，并且可以提供可接受品质的产品。

本发明的另一个方面涉及乳清衍生的组合物，该乳清衍生的组合物包含：

-相对于总固体的10％w/w至30％w/w的量的总脂质，

-相对于总固体的3％w/w至12％w/w的量的总磷脂，

-在相对于总固体的1％w/w-10％w/w的范围内的灰分含量，

-相对于总固体的至多10％w/w的量的乳糖；

-相对于总固体的65％w/w至80％w/w的量的总蛋白质，以及

-相对于总蛋白质的0.8％w/w-5％w/w的量的OPN。

本发明的乳清衍生的组合物适合作为食品成分。它优选地用作用于生产儿科产品、更优选地婴儿配方产品的成分，或者可选择地用于生产营养组合物的成分，例如用于成人营养品的成分。

本发明的又一个方面涉及本发明的乳清衍生的组合物作为食品成分的用途，优选地用于增加营养产品中OPN和/或维生素B12的含量。

本发明的另外的方面涉及营养产品，该营养产品优选地是儿科产品并且更优选地是婴儿配方产品，该营养产品包含以这样的量的本发明的乳清衍生的组合物，所述量足以：

-提供至少10mg/100g营养产品的总固体、更优选地至少20mg/100g总固体、甚至更优选地至少30mg/100g总固体并且最优选地至少40mg/100g总固体的量的OPN，和/或

-提供至少0.02微克/100g营养产品的总固体、更优选地至少0.05微克/100g总固体、甚至更优选地至少0.10微克/100g总固体并且最优选地至少0.15微克/100g总固体的量的维生素B12。

附图简述

图1示出了用于测定来源于细胞外囊泡的磷脂的含量相对于源自乳清的产品的总磷脂的标准曲线。

详述

本发明的方面涉及制备乳清衍生的组合物的方法，该乳清衍生的组合物富含磷脂和骨桥蛋白(OPN)，并且优选地还富含其他乳脂球膜组分，所述方法包括以下步骤：

a)提供液体进料，该液体进料包括包含骨桥蛋白和α-乳清蛋白(ALA)的乳清蛋白以及源自乳清的磷脂，液体进料包含在相对于总蛋白质的0.2％w/w-2.0％w/w的范围内的骨桥蛋白总量，

b)使液体进料经历膜过滤以提供过滤渗余物和过滤渗透物，优选地其中所述膜过滤被布置和操作成：

-提供基于过滤渗余物的总蛋白质的骨桥蛋白含量，该骨桥蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少150％，以及

-提供基于过滤渗余物的总蛋白质的α-乳清蛋白含量，该α-乳清蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多75％，以及

任选地，c)使过滤渗余物或至少包含源自过滤渗余物的脂质和蛋白质的产物流经历一个或更多个另外的加工步骤，该一个或更多个另外的加工步骤优选地包括以下步骤中的一个或更多个：

i)微滤，

ii)浓缩，

iii)热处理，以及

iv)干燥。

在本发明的上下文中，术语“乳清衍生的”意指给定组合物的至少脂质和蛋白质源自乳清。优选地，除了在pH调节期间添加的矿物质之外，给定的“乳清衍生的”组合物的大体上所有固体源自乳清。

“源自”组合物的组分，例如来自乳清的组分，已经由该组合物提供，并且通常已经通过对该组合物的加工提供，例如通过机械分级诸如例如离心或过滤或者通过对该组合物的其他改性提供。

在本发明的上下文中，术语“乳清”涉及当酪蛋白已经从乳中沉淀和/或去除时留下的液体组合物。酪蛋白可以例如通过微滤或大孔超滤去除，提供不含胶束酪蛋白或基本上不含胶束酪蛋白但包含天然乳清蛋白的液体渗透物。这种液体渗透物有时被称为“理想乳清”、“血清”或“乳血清”。酪蛋白沉淀还可以例如通过乳的酸化和/或通过使用凝乳酶(rennet enzyme)来实现。存在若干种类型的乳清，诸如“甜乳清”，其是通过酪蛋白的基于凝乳酶的沉淀产生的乳清产品；以及“酸乳清(acid whey)”或“酸乳清(sour whey)”，其是通过酪蛋白的基于酸的沉淀产生的乳清产品。酪蛋白的基于酸的沉淀可以例如通过添加食品酸或通过细菌培养来完成。

在本发明的上下文中，短语“富含磷脂和骨桥蛋白的乳清衍生的组合物”意指乳清衍生的组合物具有基于总固体的磷脂和基于总蛋白质的骨桥蛋白的含量，所述含量高于制备乳清衍生的组合物的液体进料中的含量。

在本发明的上下文中，短语“乳清衍生的乳脂球状膜组分”意指主要包含牛乳来源的蛋白质和脂质的结构。它包含多种蛋白质、糖蛋白、磷脂和糖脂。

在本发明的上下文中，术语“细胞外囊泡”或“EV”具有其普通含义。EV通常是脂质双层界定的颗粒，其从几乎所有类型的细胞中自然释放，并且与细胞不同，不能重复。EV通常运送包含蛋白质、核酸、脂质和代谢物的货物。EV还存在于哺乳动物乳中。术语“乳EV”意指源自哺乳动物乳并且在本发明的上下文中通常是牛乳的EV。

在本发明的上下文中，术语“ALA”或“α-乳清蛋白”涉及来自哺乳动物物种的α-乳清蛋白，例如呈天然和/或糖基化形式，并且包括天然存在的遗传变体。优选地，ALA是反刍动物ALA并且更优选地是牛ALA。优选地，ALA源自反刍动物乳并且更优选地源自牛乳。本发明的术语“ALA”或“α-乳清蛋白”不涵盖变性的ALA。

在本发明的上下文中，术语“BLG”或“β-乳球蛋白”涉及来自哺乳动物物种的BLG，例如呈天然和/或糖基化形式，并且包括天然存在的遗传变体。本发明的术语“BLG”或“β-乳球蛋白”不涵盖变性的BLG，诸如例如未折叠的BLG或聚集的BLG。优选地，BLG是反刍动物BLG并且更优选地是牛BLG。优选地，BLG源自反刍动物乳并且更优选地源自牛乳。

在本发明的上下文中，术语“酪蛋白巨肽”或“CMP”是在凝乳酶介导的酪蛋白凝结步骤(通过凝乳酶(chymosin)的作用)期间，通常在干酪制造过程期间从κ-酪蛋白释放的肽。例如，CMP存在于乳清级分中，该乳清级分被称为甜乳清或干酪乳清。CMP有时被称为酪蛋白糖巨肽(cGMP)或糖巨肽(GMP)。优选地，CMP源自反刍动物乳并且更优选地源自牛乳。

在本发明的上下文中，术语“骨桥蛋白”和“OPN”既涉及如存在于乳或乳清中的包括天然存在的变体的全长骨桥蛋白(参见例如，Christensen等人(B.Christensen,/International Dairy Journal 57(2016)1-6)的图1)，又另外涉及全长骨桥蛋白的长片段，该片段天然存在于乳或乳清中。天然存在于乳或乳清中的OPN的长片段通常基于接近全长OPN的RGD序列和SVAYGLR序列的全长OPN的蛋白水解切割。优选地，OPN的长片段基于在牛OPN的氨基酸序列的氨基酸位置130至位置157之间的区域中的切割，并且更优选地基于在Christensen等人的图1的全长牛OPN的氨基酸序列的方框区域中的切割。在本发明的上下文中，术语“OPN的长片段”涉及全长OPN的片段，该片段包含来自全长OPN的氨基酸序列的至少50个连续氨基酸、更优选地来自全长OPN的氨基酸序列的至少80个连续氨基酸、甚至更优选地来自全长OPN的氨基酸序列的至少90个连续氨基酸并且最优选地来自全长OPN的氨基酸序列的至少100个连续氨基酸。

全长乳骨桥蛋白是一种酸性的高度磷酸化的富含唾液酸的钙结合蛋白。例如，全长牛骨桥蛋白包含高达28摩尔的结合磷酸盐每mol骨桥蛋白，并且能够结合高达约50摩尔的Ca每摩尔骨桥蛋白。OPN是与许多生物过程，诸如骨重塑、异位钙化抑制、和细胞粘附和迁移以及若干种免疫功能有关的多功能生物活性蛋白。骨桥蛋白具有细胞因子样性质，并且是启动T辅助细胞1免疫应答的关键因素。骨桥蛋白存在于大多数组织和体液中，其中最高浓度在乳中发现。Christensen等人出于所有目的并入本文。优选地，OPN源自反刍动物乳并且更优选地源自牛乳。

OPN的含量根据分析1来定量。

组合物的总固体含量根据WO 2020/002426的实施例1.15来定量。

组合物的总蛋白质含量根据WO 2020/002426的实施例1.5来定量。

组合物的灰分含量根据WO 2020/002426的实施例1.13来定量。

BLG、ALA和CMP的含量根据WO 2020/002426的实施例1.6来定量。

组合物的pH根据WO 2020/002426的实施例1.16来测量。

组合物的特定矿物质含量根据WO 2020/002426的实施例1.19来定量。

组合物的总脂质含量根据WO 2020/002426的实施例1.27来定量。

在步骤a)中，提供液体进料，该液体进料包括包含骨桥蛋白和α-乳清蛋白(ALA)的乳清蛋白以及源自乳清的磷脂，液体进料包含在相对于总蛋白质的0.2％w/w-2.0％w/w的范围内的骨桥蛋白总量。

在本发明的上下文中，术语“液体进料”用于描述在步骤b)中经历膜过滤的液体。液体进料的蛋白质和磷脂两者源自乳清，并且优选地液体进料的大体上所有固体源自乳清。

液体进料的至少脂质和蛋白质源自的乳清优选地由反刍动物乳制备，并且更优选地由牛乳制备。

液体进料优选地在不干燥源自乳清的脂质和乳清蛋白的情况下制备。

液体进料优选地具有至多30％、更优选地至多20％、甚至更优选地至多10％并且最优选地至多5％的BLG变性程度。BLG变性程度被确定为不是天然BLG的总BLG的百分比。总BLG和天然BLG可以在总BLG的还原条件下和在天然BLG的非还原条件下通过HPLC测定。

在本发明的一些优选的实施方案中，液体进料包含乳清或者甚至由乳清组成。

乳清优选地是甜乳清，即例如在干酪生产期间从基于凝乳酶的酪蛋白凝结获得的乳清；或酸乳清，即从基于酸的酪蛋白凝结获得的乳清，例如从酪蛋白酸盐的生产获得的乳清。

乳清优选地是由全乳、脱脂乳或其混合物的酪蛋白沉淀产生的乳清。

在本发明的其他优选的实施方案中，液体进料包含乳清的蛋白质浓缩物或者甚至由乳清的蛋白质浓缩物组成。

在本发明的上下文中，乳清的“蛋白质浓缩物”是液体组合物，其中至少脂质和蛋白质源自乳清，但是相对于总固体，具有比乳清更高的蛋白质含量。优选地，蛋白质浓缩物的大体上所有固体源自乳清。

通常优选的是，液体进料优选地没有经历加工，加工使液体进料的总磷脂含量相对于与磷脂源自的乳清相关的总固体降低。以这种方式，获得了较高收率的磷脂。

优选地，提供乳清的蛋白质浓缩物涉及从乳清中至少部分去除以下项中的一种或更多种：

-游离碳水化合物，

-矿物质，

-非蛋白氮，

-具有1.5微米或更大的直径的颗粒，以及

-水。

在本发明的一些优选的实施方案中，液体进料是乳清的蛋白质浓缩物，并且提供液体进料包括使乳清经历以下步骤中的一个或更多个步骤：

-浓缩，例如通过超滤或纳滤进行浓缩，

-去矿化，例如通过渗滤或电渗析进行去矿化，

-渗滤，优选地与超滤或纳滤组合，以及

-至少部分去除具有1.5微米或更大的直径的颗粒，例如通过离心或使用具有在约1-2微米的范围内的孔径的膜进行微滤来至少部分去除具有1.5微米或更大的直径的颗粒。

在本发明的一些优选的实施方案中，液体进料通过使乳清经历以下来制备：

-使用具有在1kDa-10kDa的范围内的标称分子量截止值(nominal molecularweight cut-off)的膜通过超滤进行浓缩，任选地与渗滤组合，以及

-至少部分去除具有1.5微米或更大的直径的颗粒，例如通过离心或使用具有在约1-2微米的范围内的孔径的膜进行微滤来至少部分去除具有1.5微米或更大的直径的颗粒。

在本发明的一些优选的实施方案中，液体进料包含在相对于总固体的5％w/w-89％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的30％w/w-86％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的40％w/w-83％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的60％w/w-80％w/w的范围内的量的总蛋白质。

在本发明的其他优选的实施方案中，液体进料包含在相对于总固体的5％w/w-25％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的5％w/w-20％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的5％w/w-15％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的5％w/w-10％w/w的范围内的量的总蛋白质。

优选地，液体进料包含在相对于总蛋白质的10％w/w-70％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的30％w/w-65％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的40％w/w-60％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的45％w/w-55％w/w的范围内的β-乳球蛋白总量。

优选地，液体进料包含在相对于总蛋白质的5％w/w-40％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-35％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-30％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-25％w/w的范围内的α-乳清蛋白总量。

在本发明的一些优选的实施方案中，液体进料包含在相对于总蛋白质的5％w/w-30％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-30％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-25％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-20％w/w的范围内的酪蛋白巨肽(CMP)总量。当乳清蛋白源自甜乳清时，液体进料通常包含CMP。

在本发明的其他优选的实施方案中，液体进料包含相对于总蛋白质的至多5％w/w、更优选地相对于总蛋白质的至多3％w/w、甚至更优选地相对于总蛋白质的至多％w/w并且最优选地相对于总蛋白质的至多0.5％w/w的酪蛋白巨肽(CMP)总量。当乳清蛋白源自例如酸乳清时，液体进料通常包含少量的CMP或者甚至不包含CMP。

在本发明的一些优选的实施方案中，液体进料包含在相对于总蛋白质的0.2％w/w-0.9％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的0.3％w/w-0.8％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的0.4％w/w-0.8％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的0.4％w/w-0.7％w/w的范围内的骨桥蛋白总量。当液体进料的蛋白质源自甜乳清时，通常是这种情况。

在本发明的其他优选的实施方案中，液体进料包含在相对于总蛋白质的1.0％w/w-2.0％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的1.2％w/w-2.0％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的1.3％w/w-2.0％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的1.4％w/w-2.0％w/w的范围内的骨桥蛋白总量。当液体进料的蛋白质源自酸乳清时，通常是这种情况。

优选地，液体进料包含在相对于总固体的1％w/w-10％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的2％w/w-8％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的3％w/w-7％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的4％w/w-7％w/w的范围内的量的总脂质。

另外，液体进料优选地包含在相对于总脂质的10％w/w-50％w/w的范围内、更优选地在相对于总脂质的20％w/w-47％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总脂质的25％w/w-45％w/w的范围内并且最优选地在相对于总脂质的29％w/w-41％w/w的范围内的磷脂总量。

在本发明的优选的实施方案中，液体进料包含在相对于总固体的0.2％w/w-5％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的0.4％w/w-4％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的0.5％w/w-3％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的1％w/w-3％w/w的范围内的磷脂总量。

在本发明的一些优选的实施方案中，液体进料包含相对于总磷脂的至少50％w/w、更优选地至少54％w/w、甚至更优选地至少56％w/w并且最优选地至少58％w/w的量的来源于乳细胞外囊泡(乳EV)的磷脂总量。

根据分析2来确定来源于乳细胞外囊泡(乳EV)的磷脂相对于总磷脂的量。

通常优选的是，液体进料包含相对于总磷脂的50％w/w-75％w/w、更优选地54％w/w-73％w/w、甚至更优选地56％w/w-71％w/w并且最优选地58％w/w-70％w/w的量的来源于乳EV的磷脂总量。本发明人已经发现这些范围对于由甜乳清制备的液体进料是典型的。

在本发明的其他优选的实施方案中，液体进料包含相对于总磷脂的至少76％w/w、更优选地至少80％w/w、甚至更优选地至少85％w/w并且最优选地至少90％w/w的量的来源于乳EV的磷脂总量。本发明人已经发现这些范围对于由酸乳清制备的液体进料是典型的。

液体进料可以包含游离碳水化合物诸如例如乳糖和寡糖，以及与例如蛋白质或复合脂质诸如神经节苷脂结合的碳水化合物。

在本发明的一些优选的实施方案中，液体进料包含在相对于总固体的0％w/w-85％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的1％w/w-55％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的1％w/w-50％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的1％w/w-30％w/w的范围内的游离碳水化合物总量。

液体进料优选地包含在相对于总固体的0％w/w-80％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的0％w/w-55％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的0％w/w-50％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的0％w/w-30％w/w的范围内的乳糖总量。

乳清是维生素B12的来源，并且优选地，液体进料包含在2-16微克/kg总固体的范围内、更优选地在4-14微克/kg总固体的范围内、甚至更优选地在6-12微克/kg总固体的范围内并且最优选地在8-10微克/kg总固体的范围内的量的维生素B12。

液体进料优选地具有在相对于总固体的1％w/w-10％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的1％w/w-8％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的2％w/w-8％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的3％w/w-7％w/w的范围内的灰分含量。

虽然在液体进料中可以使用宽范围的总固体含量，但优选的是，它包含相对于液体进料的重量的1％w/w-20％w/w、更优选地相对于液体进料的重量的2％w/w-15％w/w、甚至更优选地相对于液体进料的重量的4％w/w-12％w/w并且最优选地相对于液体进料的重量的5％w/w-10％w/w的量的总固体。

液体进料的不是固体的物质优选地是水。

优选地，液体进料包含相对于液体进料的重量的0.2％w/w-8％w/w、更优选地相对于液体进料的重量的1％w/w-7％w/w、甚至更优选地相对于液体进料的重量的2％w/w-6％w/w并且最优选地相对于液体进料的重量的2％w/w-5％w/w的量的总蛋白质。

液体进料优选地具有在4.0-8的范围内、更优选地在5.5-7.5的范围内、甚至更优选地在5.7-7.0的范围内并且最优选地在5.9-6.6的范围内的pH。

在本发明的一些优选的实施方案中，液体进料是优选地通过至少超滤制备的乳清蛋白浓缩物(WPC)。

在本发明的上下文中，术语“乳清蛋白浓缩物(WPC)”和“血清蛋白浓缩物(SPC)”涉及干组合物或水性组合物，该干组合物或水性组合物包含相对于总固体的20％w/w-89％w/w的量的总蛋白质。

在本发明的上下文中，术语“乳清蛋白”涉及在乳清或乳血清中发现的蛋白质。乳清蛋白可以是在乳清或乳血清中发现的蛋白质物质的子集，并且甚至是单个乳清蛋白物质，或者它可以是在乳清中或/和在乳血清中发现的整套蛋白质物质。

术语“乳血清蛋白”或“血清蛋白”涉及存在于乳血清中的蛋白质。

WPC或SPC优选地包含相对于总固体的20％w/w至89％w/w的量的总蛋白质、相对于总固体的1％w/w至10％w/w的量的总脂质、相对于总固体的1％w/w至10％w/w的灰分含量、相对于总固体的0％w/w至70％w/w的量的乳糖。这样的WPC或SPC可以例如包含相对于总蛋白质的15％w/w-70％w/w的BLG、相对于总蛋白质的8％w/w-50％w/w的ALA和相对于总蛋白质的0％w/w-40％w/w的CMP。

更优选地，WPC或SPC可以包含相对于总固体的35％w/w至89％w/w的量的总蛋白质、相对于总固体的1％w/w至10％w/w的量的总脂质、相对于总固体的2％w/w至10％w/w的灰分含量、相对于总固体的0％w/w至60％w/w的量的乳糖。这样的WPC或SPC可以例如包含相对于总蛋白质的15％w/w-70％w/w的BLG、相对于总蛋白质的8％w/w-50％w/w的ALA和相对于总蛋白质的0％w/w-40％w/w的CMP。

甚至更优选地，WPC或SPC可以包含相对于总固体的65％w/w至89％w/w的量的总蛋白质、相对于总固体的5％w/w至10％w/w的量的总脂质、相对于总固体的1％w/w至5％w/w的灰分含量、相对于总固体的0％w/w至20％w/w的量的乳糖。这样的WPC或SPC可以例如包含相对于总蛋白质的30％w/w-90％w/w的BLG、相对于总蛋白质的4％w/w-35％w/w的ALA和相对于总蛋白质的0％w/w-25％w/w的CMP。

SPC通常不包含CMP或者仅包含微量的CMP。

步骤b)涉及使液体进料经历膜过滤以提供过滤渗余物和过滤渗透物，并且优选地所述膜过滤被布置和操作成：

-提供基于过滤渗余物的总蛋白质的骨桥蛋白含量，该骨桥蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少150％，以及

-提供基于过滤渗余物的总蛋白质的α-乳清蛋白含量，该α-乳清蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多75％。

短语“被布置和操作成”意指步骤b)的膜过滤以至少提供上文提及的OPN的富集和上文提及的ALA的消耗的参数实施和操作。一般膜过滤，包括其实施和操作，是本领域技术人员熟知的，并且例如在“Membrane filtration and related molecular separationtechnologies”,APV Systems,Nielsen W.K.(编辑),Silkeborg Bogtrykkeri A/S(2003),ISBN 8788016757-9788788016758中描述。作为对本领域技术人员的附加指导，已经在本文中进一步描述了优选的实施方式和工艺参数。

步骤b)可以导致多个过滤渗透物或仅单个过滤渗透物。步骤b)的过滤渗透物被优选地加工以获得另外的乳清蛋白产物。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的β-乳球蛋白含量，该β-乳球蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的至多100％、更优选地基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的至多90％、甚至更优选地基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的至多80％并且最优选地基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的至多70％。

较小的乳清蛋白诸如ALA和CMP以比BLG更快的速率从液体进料中去除。因此，在一些实施方案中，基于过滤渗余物的总蛋白质的BLG含量几乎与液体进料中的相同。这是较小蛋白质的更快速去除的结果。然而，基于总蛋白质的OPN含量从液体进料到过滤渗余物将总是增加。

优选地，步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的β-乳球蛋白含量，该β-乳球蛋白含量在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的10％-100％的范围内、更优选地在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的20％-98％的范围内、甚至更优选地在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的30％-96％的范围内并且最优选地在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的40％-94％的范围内。

可选择地，但也是优选的，步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的β-乳球蛋白含量，该β-乳球蛋白含量在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的10％-90％的范围内、更优选地在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的15％-80％的范围内、甚至更优选地在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的20％-70％的范围内并且最优选地在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的25％-60％的范围内。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的α-乳清蛋白含量，该α-乳清蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多50％、更优选地基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多30％、甚至更优选地基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多20％并且最优选地基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多10％。

优选地，步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的α-乳清蛋白含量，该α-乳清蛋白含量在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的5％-50％的范围内、更优选地在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的10％-45％的范围内、甚至更优选地在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的15％-40％的范围内并且最优选地在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的20％-35％的范围内。

可选择地，但也是优选的，步骤b)的膜过滤可以被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的α-乳清蛋白含量，该α-乳清蛋白含量在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的1％-50％的范围内、更优选地在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的2％-30％的范围内、甚至更优选地在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的3％-20％的范围内并且最优选地在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的4％-10％的范围内。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量，该酪蛋白巨肽含量是基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的至多50％、更优选地基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的至多40％、甚至更优选地基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的至多35％并且最优选地基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的至多30％。

优选地，步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量，该酪蛋白巨肽含量在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的1％-50％的范围内、更优选地在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的2％-40％的范围内、甚至更优选地在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的3％-35％的范围内并且最优选地在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的4％-30％的范围内。

可选择地，但也是优选的，步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量，该酪蛋白巨肽含量在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的1％-45％的范围内、更优选地在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的2％-30％的范围内、甚至更优选地在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的3％-20％的范围内并且最优选地在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的4％-10％的范围内。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的骨桥蛋白含量，该骨桥蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少180％、更优选地基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少200％、甚至更优选地基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少230％并且最优选地基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少250％。

优选地，步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的骨桥蛋白含量，该骨桥蛋白含量在基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的150％-600％的范围内、更优选地在基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的175％-500％的范围内、甚至更优选地在基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的200％-450％的范围内并且最优选地在基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的225％-300％的范围内。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供相对于过滤渗余物的总固体的总磷脂含量，该总磷脂含量是相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的至少200％、更优选地相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的至少225％、甚至更优选地相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的至少250％并且最优选地相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的至少275％。

优选地，步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供相对于过滤渗余物的总固体的总磷脂含量，该总磷脂含量在相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的200％-600％的范围内、更优选地在相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的225％-550％的范围内、甚至更优选地在相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的250％-500％的范围内并且最优选地在相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的275％-450％的范围内。

步骤b)的膜过滤通常涉及使用宽孔超滤膜和/或窄孔微滤膜。

在本发明的一些优选的实施方案中，步骤b)的膜过滤涉及标称分子量截止值在100kDa-2000kDa的范围内、更优选地在300kDa-1600kDa的范围内、甚至更优选地在500kDa-1300kDa的范围内并且最优选地在700kDa-1000kDa的范围内的一个或更多个膜。

步骤b)的膜过滤还可以涉及使用标称分子量截止值低于100kDa的一个或更多个另外的膜，并且这样的膜可用于从液体进料中去除较小的溶质。

膜的标称分子量截止值通常由制造商提供，或者可以根据ASTM标准E 1343-90确定。

步骤b)中使用的膜优选地是聚合物膜。可选择地，膜可以是金属膜或陶瓷膜。

关于有用的膜的更多实例可以在“Membrane filtration and relatedmolecular separation technologies”,APV Systems,Nielsen W.K.(编辑),SilkeborgBogtrykkeri A/S(2003),ISBN 8788016757-9788788016758中找到。

有用的膜的实例是陶瓷膜、有机膜、聚合物膜、螺旋缠绕的膜、中空纤维膜或平板膜(flat sheet membrane)。

目前优选的是，步骤b)的膜过滤涉及使用螺旋缠绕的有机聚合物膜，优选地标称分子量截止值在500kDa-1300kDa的范围内并且最优选地在700kDa-1000kDa的范围内的螺旋缠绕的有机聚合物膜。这样的膜的非限制性实例是例如来自Synder Filtration(USA)的FR(PVDF 800kDa)。具有类似功能的膜从其他制造商可获得。

步骤b)的膜过滤可以以多种方式实施，并且可以例如涉及单程过滤或者可选择地涉及一系列过滤单元，即，其中液体进料和任何中间体渗余物流通过串联布置的多个膜。步骤b)的膜过滤通常使用布置成用于错流过滤(cross flow filtration)的过滤器系统来进行。有用的过滤器布置的非限制性实例是螺旋缠绕的过滤系统、中空纤维膜系统和管状膜系统。

特别优选的是将步骤b)的膜过滤实施为错流过滤。

此外，优选的是步骤b)的膜过滤涉及渗滤，优选地其中一种或更多种中间体渗余物流在步骤b)期间用一种或更多种稀释剂稀释。稀释剂优选地是水和/或无蛋白质过滤渗透物。这样的无蛋白质过滤渗透物优选地通过超滤、纳滤或反渗透制备。渗滤通常持续进行，直到已经获得例如ALA的期望的减少。

在本发明的一些优选的实施方案中，在步骤b)期间的中间体渗余物流包含相对于中间体渗余物流的重量的0.5％w/w-10％w/w、更优选地相对于中间体渗余物流的重量的1％w/w-8％w/w、甚至更优选地相对于中间体渗余物流的重量的2％w/w-7％w/w并且最优选地相对于中间体渗余物流的重量的2％w/w-5％w/w的量的总蛋白质。

优选地，步骤b)的膜过滤在0.1巴-5巴、更优选地0.2巴-3巴并且最优选地0.3巴-1巴的跨膜压力的情况下操作。

优选地，步骤b)的膜过滤在1℃-60℃、更优选地2℃-30℃、甚至更优选地5℃-20℃并且最优选地8℃-15℃的温度操作。

在步骤b)期间的液体进料的温度可以在宽范围内变化，但是通常优选的是温度在1℃-60℃的范围内。例如，在步骤b)期间的液体进料的温度可以在2℃-30℃的范围内、优选地在5℃-20℃的范围内、甚至更优选地在8℃-15℃的范围内。

目前优选的是将液体进料的温度保持在上文提及的区间的下端。因此，在本发明的一些优选的实施方案中，在步骤b)期间的液体进料的温度在5℃-20℃的范围内、更优选地在7℃-16℃的范围内并且最优选地在8℃-12℃的范围内。

优选的是，除了在巴氏灭菌和喷雾干燥期间，该方法的中间体渗余物流和最终产物流的温度保持在1℃-60℃的范围内、更优选地在2℃-30℃的范围内、甚至更优选地在5℃-20℃的范围内并且最优选地在8℃-15℃的范围内。

过滤渗余物优选地包括：

-相对于总固体的10％w/w至30％w/w的量的总脂质，

-相对于总固体的3％w/w至12％w/w的量的总磷脂，

-在相对于总固体的1％w/w-10％w/w的范围内的灰分含量，

-相对于总固体的至多10％w/w的量的乳糖；

-相对于总固体的65％w/w至80％w/w的量的总蛋白质，

-相对于总蛋白质的0.8％w/w-5％w/w的量的OPN。

优选地，过滤渗余物包含在相对于总固体的66％w/w-78％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的68％w/w-76％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的70％w/w-76％w/w的范围内的量的总蛋白质。

在本发明的一些优选的实施方案中，过滤渗余物包含在相对于总蛋白质的10％w/w-45％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的15％w/w-40％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的20％w/w-40％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的25％w/w-35％w/w的范围内的β-乳球蛋白总量。

在本发明的一些优选的实施方案中，过滤渗余物包含在相对于总蛋白质的0％w/w-10％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的0.1％w/w-8％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的0.3％w/w-5％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的0.5％w/w-3％w/w的范围内的α-乳清蛋白总量。

可选择地，但也是优选的，过滤渗余物包含在相对于总蛋白质的1％w/w-10％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的1％w/w-9％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的2％w/w-8％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的3％w/w-7％w/w的范围内的α-乳清蛋白总量。

在本发明的一些优选的实施方案中，过滤渗余物包含在相对于总蛋白质的0％w/w-10％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的1％w/w-8％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的2％w/w-7％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的3％w/w-7％w/w的范围内的酪蛋白巨肽总量。

可选择地，但也是优选的，过滤渗余物包含在相对于总蛋白质的0％w/w-9％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的0.1％w/w-7％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的0.3％w/w-5％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的0.5％w/w-3％w/w的范围内的酪蛋白巨肽总量。

在本发明的一些优选的实施方案中，过滤渗余物包含在相对于总蛋白质的0.9％w/w-5％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的1.0％w/w-4％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的1.1％w/w-3％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的1.1％w/w-1.7％w/w的范围内的骨桥蛋白总量。

在本发明的其他优选的实施方案中，过滤渗余物包含在相对于总蛋白质的2.0％w/w-5％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的2.2％w/w-4.5％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的2.5％w/w-4.0％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的3.0％w/w-3.7％w/w的范围内的骨桥蛋白总量。

优选地，过滤渗余物包含在相对于总固体的10％w/w-29％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的11％w/w-27％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的13％w/w-25％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的16％w/w-22％w/w的范围内的量的总脂质。

优选地，过滤渗余物包含在相对于总脂质的10％w/w-50％w/w的范围内、更优选地在相对于总脂质的20％w/w-47％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总脂质的25％w/w-45％w/w的范围内并且最优选地在相对于总脂质的29％w/w-41％w/w的范围内的磷脂总量。

在本发明的一些优选的实施方案中，过滤渗余物包含在相对于总固体的4％w/w-12％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的4％w/w-11％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的5％w/w-11％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的6％w/w-10％w/w的范围内的磷脂总量。

最突出的磷脂通常是鞘磷脂(SPH)、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)。在一些实施方案中，SPH、PC和PE占磷脂总量的高达90％。在本发明的优选的实施方案中，SPH、PC和PE占磷脂总量的从50％至90％、更优选地从60％至90％、甚至更优选地从70％至90％并且最优选地从80％至90％。过滤渗余物的三种最突出的磷脂中的每一种通常以在从1.2％w/w至2.5％w/w的范围内，诸如在从1.5％w/w至2％w/w的范围内的量存在。过滤渗余物可以另外包含其他磷脂，例如磷脂酰肌醇(PI)和/或磷脂酰丝氨酸(PS)。

过滤渗余物和其他组合物的磷脂含量可以用磷-31NMR或本领域中已知的多种色谱方法(例如，HPLC或GC)进行分析。

在本发明的一些优选的实施方案中，过滤渗余物包含在相对于总固体的0％w/w-8％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的0％w/w-5％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的0％w/w-1％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的0％w/w-0.5％w/w的范围内的游离碳水化合物总量。

优选地，过滤渗余物包含在相对于总固体的0％w/w-8％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的0％w/w-5％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的0％w/w-1％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的0％w/w-0.5％w/w的范围内的乳糖总量。

在本发明的一些优选的实施方案中，过滤渗余物包含在20-60微克/kg总固体的范围内、更优选地在24-50微克/kg总固体的范围内、甚至更优选地在26-45微克/kg总固体的范围内并且最优选地在30-40微克/kg总固体的范围内的量的维生素B12。

本发明人已经发现这对于例如儿科营养是有利的，并且已经看到乳清衍生的维生素B12和乳清磷脂的组合协同地支持婴儿认知发育的迹象。

优选地，过滤渗余物具有在相对于总固体的0.5％w/w-5％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的1.0％w/w-3％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的1.5％w/w-3％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的1.6％w/w-2％w/w的范围内的灰分含量。

在本发明的一些优选的实施方案中，过滤渗余物包含相对于过滤渗余物的重量的1％w/w-30％w/w、更优选地相对于过滤渗余物的重量的2％w/w-15％w/w、甚至更优选地相对于过滤渗余物的重量的4％w/w-12％w/w并且最优选地相对于过滤渗余物的重量的5％w/w-10％w/w的量的总固体。这例如对于呈液体产品的形式的乳清衍生的组合物是有用的。

过滤渗余物通常包含相对于过滤渗余物的重量的0.5％w/w-10％w/w、更优选地相对于过滤渗余物的重量的1％w/w-8％w/w、甚至更优选地相对于过滤渗余物的重量的2％w/w-7％w/w并且最优选地相对于过滤渗余物的重量的2％w/w-5％w/w的量的总蛋白质。

过滤渗余物的不是固体的物质优选地是水。

过滤渗余物优选地具有在4.0-8的范围内、更优选地在5.5-7.5的范围内、甚至更优选地在5.7-7.0的范围内并且最优选地在5.9-6.6的范围内的pH。

通常，过滤渗余物包含相对于总固体的至多10％w/w的酪蛋白、优选地相对于总固体的重量的至多5％w/w的酪蛋白、更优选地相对于总固体的重量的至多1％w/w的酪蛋白并且甚至更优选地相对于总固体的重量的至多0.5％w/w的酪蛋白。在一些实施方案中，过滤渗余物可以不包含可检测量的酪蛋白。

另外，过滤渗余物优选地包含胆固醇。胆固醇的量优选地在相对于总固体的从3mg/g至20mg/g的范围内、更优选地在相对于总固体的从4mg/g至15mg/g的范围内并且最优选地在相对于总固体的从5mg/g至10mg/g的范围内。

过滤渗余物优选地包含神经节苷脂。过滤渗余物的最突出的神经节苷脂通常是GD3和GM3。

在本发明的一些优选的实施方案中，过滤渗余物包含在相对于总固体的从1800mg/kg至3800mg/kg的范围内、最优选地在相对于总固体的从2000mg/kg至3500mg/kg的范围内的量的GD3。

在本发明的一些优选的实施方案中，过滤渗余物包含在相对于总固体的从65mg/kg至90mg/kg的范围内并且最优选地在相对于总固体的从70mg/kg至85mg/kg的范围内的量的GM3。过滤渗余物的神经节苷脂的总量可以在相对于总固体的从1800mg/kg至4000mg/kg的范围内。

过滤渗余物的神经节苷脂含量可以用LC-MS方法GANGLIO-r-LC-TOF进行分析。

优选地，过滤渗余物包含在相对于总固体的从1％w/w至10％w/w的范围内并且更优选地在相对于总固体的从3％w/w至8％w/w的范围内的免疫球蛋白G(IgG；诸如例如IgG1和IgG2)。IgG的量可以用放射免疫扩散进行分析。

在一些实施方案中，过滤渗余物包含牛血清白蛋白(BSA)。BSA优选地以相对于总固体的1％-5％并且最优选地相对于总固体的2％w/w至3.5％w/w的量存在。

在一些实施方案中，过滤渗余物还可以包含糖基化依赖性细胞粘附分子(PP3)。PP3可以例如以相对于过滤渗余物的总固体的从1％w/w至3.5％w/w的量存在。

在一些实施方案中，过滤渗余物还可以包含乳运铁蛋白(或乳铁蛋白)。乳铁蛋白可以例如以相对于过滤渗余物的总固体的从1％w/w至1.6％w/w的量存在。

过滤渗余物还可以包含其他膜组分。

在本发明的一些优选的实施方案中，该方法还包括步骤c)，即，使过滤渗余物或至少包含源自过滤渗余物的脂质和蛋白质的产物流经历一个或更多个另外的加工步骤，该一个或更多个另外的加工步骤优选地包括以下子步骤中的一个或更多个：

i)微滤，

ii)浓缩，

iii)热处理，以及

iv)干燥。

在本发明的一些优选的实施方案中，该方法还包括步骤c)，并且步骤c)包括i)微滤，优选地将过滤渗余物或至少包含源自过滤渗余物的脂质和蛋白质的产物流微滤，优选地使用孔径在1.0微米-2微米的范围内并且最优选地在1.2微米-1.8微米的范围内的MF膜微滤。子步骤i)的微滤具有减少微生物的含量，并且更进一步减少在该方法期间早期未去除的残余的乳脂球和大聚集体的目的。子步骤i)的渗透物被回收，并且可以经历进一步加工，优选地使用上文提及的子步骤中的一个或更多个子步骤经历进一步加工。

在本发明的上下文中，短语“至少包含源自过滤渗余物的脂质和蛋白质的产物流”意指在子步骤i)-子步骤iv)中加工的液体可以是由于步骤c)的进一步加工而导致的轻微改性的过滤渗余物，但是其中产物流的脂质和蛋白质仍然源自过滤渗余物。

轻微改性可以例如是：

-在子步骤ii)的浓缩期间部分去除水和小的溶质，

-在子步骤i)的微滤期间至少部分去除微生物和残余的乳脂球，

-在子步骤iii)的热处理期间部分变性，或

-由于pH调节和/或稀释而添加水和矿物质。

此外，优选的是，产物流的大体上所有固体源自过滤渗余物。优选地，在步骤c)期间的产物流包含相对于产物流的固体的重量的至少90％w/w的来自过滤渗余物的固体、更优选地相对于产物流的固体的重量的至少95％w/w的来自过滤渗余物的固体、甚至更优选地相对于产物流的固体的重量的至少97％w/w的来自过滤渗余物的固体并且最优选地相对于产物流的固体的重量的至少99％w/w的来自过滤渗余物的固体。

本发明人已经发现，在不破坏产品的情况下提供具有可接受微生物学的高磷脂乳清产品是具有挑战性的。他们已经发现，过于苛刻的热处理似乎使高磷脂乳清产品的一些生物活性组分变性或降解，并且他们已经发现，传统的细菌过滤往往使产品的组成改变太多。然而，他们发现使用具有在1.0微米-2微米的范围内的孔径的膜的细菌过滤可以令人惊讶地用于细菌过滤，该细菌过滤使乳清衍生的组合物的例如磷脂和蛋白质的含量几乎没有任何变化，并且还发现，如果在子步骤iii)期间将这种微过滤与温和的热处理相结合，则获得具有令人惊讶的低微生物含量的乳清衍生的组合物。

温和的热处理优选地涉及将待热处理的液体加热到至少60℃的温度，持续足以获得至少部分微生物减少的持续时间，但是其中热处理使待热处理的液体的至多5％的BLG、更优选地至多2％的BLG、甚至更优选地至多0.5％的BLG并且最优选地至多0.1％的BLG变性。

在本发明的优选的实施方案中，温和的热处理涉及将待热处理的液体加热到在62℃-70℃的范围内的温度且保持时间为5秒-180秒，或者更优选地加热到在62℃-69℃的范围内的温度且保持时间为10秒-180秒，并且最优选地加热到在62℃-69℃的范围内的温度且保持时间为10秒-120秒。

子步骤i)的微滤优选地与渗滤一起进行，以将尽可能多的磷脂洗出到微滤渗透物中。优选地使用水作为稀释剂。

优选地，步骤c)-i的微滤在0.1巴-10巴、更优选地0.2巴-5巴并且最优选地0.3巴-1巴的跨膜压力的情况下操作。

优选地，步骤c)-i的微滤在1℃-60℃、更优选地2℃-30℃、甚至更优选地5℃-20℃并且最优选地8℃-15℃的温度操作。

在本发明的一些优选的实施方案中，该方法还包括步骤c)，并且步骤c)包括ii)浓缩，优选地使用超滤、纳滤、反渗透和蒸发中的一种或更多种浓缩。

通过超滤、纳滤、反渗透或其组合的浓缩是特别优选的。

优选地，步骤c)-ii的浓缩在1℃-60℃、更优选地2℃-30℃、甚至更优选地5℃-20℃并且最优选地8℃-15℃的温度操作。

待浓缩的液体优选地浓缩至在5％w/w-30％w/w的范围内、更优选地在10％w/w-28％w/w的范围内、甚至更优选地在12％w/w-26％w/w的范围内并且更优选地在14％w/w-24％w/w的范围内的总固体含量。

在本发明的一些优选的实施方案中，该方法还包括步骤c)，并且步骤c)包括iii)热处理，优选地包括热处理到至少60℃的温度，持续足以获得至少部分微生物减少的持续时间。

如上文提及的，通常优选的是采用温和的热处理以避免损害产品。

温和的热处理优选地涉及将待热处理的液体加热到至少60℃的温度，持续足以获得至少部分微生物减少的持续时间，但是其中热处理使待热处理的液体的至多5％的BLG、更优选地至多2％的BLG、甚至更优选地至多0.5％的BLG并且最优选地至多0.1％的BLG变性。

在本发明的优选的实施方案中，温和的热处理涉及将待热处理的液体加热到在62℃-70℃的范围内的温度且保持时间为5秒-180秒，或者更优选地加热到在62℃-69℃的范围内的温度且保持时间为10秒-180秒，并且最优选地加热到在62℃-69℃的范围内的温度且保持时间为10秒-120秒。

可选择地但也优选地，热处理可以涉及将待热处理的液体加热到至少70℃的温度，持续足以获得至少部分微生物减少的持续时间，但是其中热处理使待热处理的液体的至多20％的BLG、更优选地至多10％的BLG、甚至更优选地至多5％的BLG并且最优选地至多1％的BLG变性。

在本发明的优选的实施方案中，热处理涉及将待热处理的液体加热到在70℃-80℃的范围内的温度且保持时间为1秒-60秒、更优选地加热到在70℃-76℃的范围内的温度且保持时间为2秒-50秒，并且最优选地加热到在70℃-74℃的范围内的温度且保持时间为5秒-30秒。

在本发明的一些优选的实施方案中，该方法还包括步骤c)，并且步骤c)包括iv)干燥。

步骤c)-iv的干燥可以包括以下项或者甚至由以下项组成：喷雾干燥、冷冻干燥、流化床干燥、转鼓式干燥/滚筒干燥(drum/roller drying)、搁板式干燥器(shelf dryer)和/或超临界干燥。

通过喷雾干燥的干燥是特别优选的。

步骤c)-iv的干燥优选地在步骤i)-步骤iii)中的任何步骤之后进行。

步骤c)还可以包括包装从子步骤iv)获得的干燥的乳清衍生的组合物的子步骤。

在本发明的一些优选的实施方案中，该方法还包括步骤c)，并且步骤c)包括使过滤渗余物经历：

i)微滤，优选地使用具有在1.0微米-2微米的范围内的孔径的MF膜微滤，随后

ii)浓缩，优选地使用超滤、纳滤和/或反渗透进行浓缩，随后

iii)热处理，优选地涉及将待热处理的液体加热到至少60℃的温度，持续足以获得至少部分微生物减少的持续时间，但是其中热处理使待热处理的液体的至多5％的BLG变性，以及随后

iv)干燥，优选地包括喷雾干燥或者甚至由喷雾干燥组成。

优选的是，本发明的方法不涉及溶剂提取或流体提取，诸如例如超临界流体提取或近临界流体提取。

在本发明的一些优选的实施方案中，该方法包括以下步骤：

a)提供液体进料，该液体进料包括包含骨桥蛋白和α-乳清蛋白(ALA)的乳清蛋白以及源自乳清的磷脂，液体进料包含在相对于总蛋白质的0.2％w/w-2.0％w/w的范围内的骨桥蛋白总量，

b)使液体进料经历膜过滤以提供过滤渗余物和过滤渗透物，其中所述膜过滤被布置和操作成：

-提供基于过滤渗余物的总蛋白质的骨桥蛋白含量，该骨桥蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少150％，以及

-提供基于过滤渗余物的总蛋白质的α-乳清蛋白含量，该α-乳清蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多75％，以及

-提供相对于过滤渗余物的总固体的总磷脂含量，该总磷脂含量是相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的至少200％，并且其中步骤b)的膜过滤还：

-涉及标称分子量截止值在100kDa-2000kDa的范围内、更优选地在300kDa-1600kDa的范围内、甚至更优选地在500kDa-1300kDa的范围内并且最优选地在700kDa-1000kDa的范围内的一种或更多种膜，

-涉及渗滤，

-在0.1巴-5巴、更优选地0.2巴-3巴并且最优选地0.3巴-1巴的跨膜压力的情况下操作，

-在1℃-60℃、更优选地2℃-30℃、甚至更优选地5℃-20℃并且最优选地8℃-15℃的温度操作。

任选地，c)使过滤渗余物或至少包含源自过滤渗余物的脂质和蛋白质的产物流经历一个或更多个另外的加工步骤，该一个或更多个另外的加工步骤优选地包括以下步骤中的一个或更多个：

i)微滤，

ii)浓缩，

iii)热处理，以及

iv)干燥。

在本发明的其他优选的实施方案中，该方法包括以下步骤：

a)提供液体进料，该液体进料包括包含骨桥蛋白和α-乳清蛋白(ALA)的乳清蛋白以及源自乳清的磷脂，液体进料包含在相对于总蛋白质的0.2％w/w-2.0％w/w的范围内的骨桥蛋白总量，

b)使液体进料经历膜过滤以提供过滤渗余物和过滤渗透物，其中所述膜过滤被布置和操作成：

-提供基于过滤渗余物的总蛋白质的骨桥蛋白含量，该骨桥蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少150％，以及

-提供基于过滤渗余物的总蛋白质的α-乳清蛋白含量，该α-乳清蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多75％，以及

-提供相对于过滤渗余物的总固体的总磷脂含量，该总磷脂含量是相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的至少200％，并且其中步骤b)的膜过滤还：

-涉及标称分子量截止值在100kDa-2000kDa的范围内、更优选地在300kDa-1600kDa的范围内、甚至更优选地在500kDa-1300kDa的范围内并且最优选地在700kDa-1000kDa的范围内的的一种或更多种膜，

-涉及渗滤，

-在0.1巴-5巴、更优选地0.2巴-3巴并且最优选地0.3巴-1巴的跨膜压力的情况下操作，

-在1℃-60℃、更优选地2℃-30℃、甚至更优选地5℃-20℃并且最优选地8℃-15℃的温度操作。

c)使过滤渗余物或至少包含源自过滤渗余物的脂质和蛋白质的产物流经历一个或更多个另外的加工步骤，该一个或更多个另外的加工步骤优选地包括以下步骤中的一个或更多个：

i)微滤，

ii)浓缩，

iii)热处理，以及

iv)干燥。

本发明的另一个方面涉及乳清衍生的组合物，该乳清衍生的组合物包含：

-相对于总固体的10％w/w至30％w/w的量的总脂质，

-相对于总固体的3％w/w至12％w/w的量的总磷脂，

-在相对于总固体的1％w/w-10％w/w的范围内的灰分含量，

-相对于总固体的至多10％w/w的量的乳糖；

-相对于总固体的65％w/w至80％w/w的量的总蛋白质，

-相对于总蛋白质的0.8％w/w-5％w/w的量的OPN。

优选地，乳清衍生的组合物包含在相对于总固体的66％w/w-78％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的68％w/w-76％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的70％w/w-76％w/w的范围内的量的总蛋白质。

在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含在相对于总蛋白质的10％w/w-45％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的15％w/w-40％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的20％w/w-40％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的25％w/w-35％w/w的范围内的β-乳球蛋白总量。

在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含在相对于总蛋白质的0％w/w-10％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的0.1％w/w-8％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的0.3％w/w-5％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的0.5％w/w-3％w/w的范围内的α-乳清蛋白总量。

可选择地，但也是优选的，乳清衍生的组合物包含在相对于总蛋白质的1％w/w-10％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的1％w/w-9％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的2％w/w-8％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的3％w/w-7％w/w的范围内的α-乳清蛋白总量。

在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含在相对于总蛋白质的0％w/w-10％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的1％w/w-8％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的2％w/w-7％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的3％w/w-7％w/w的范围内的酪蛋白巨肽总量。

可选择地，但也是优选的，乳清衍生的组合物包含在相对于总蛋白质的0％w/w-9％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的0.1％w/w-7％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的0.3％w/w-5％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的0.5％w/w-3％w/w的范围内的酪蛋白巨肽总量。

在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含在相对于总蛋白质的0.9％w/w-5％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的1.0％w/w-4％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的1.1％w/w-3％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的1.1％w/w-1.7％w/w的范围内的骨桥蛋白总量。

在本发明的其他优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含在相对于总蛋白质的2.0％w/w-5％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的2.2％w/w-4.5％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的2.5％w/w-4.0％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的3.0％w/w-3.7％w/w的范围内的骨桥蛋白总量。

优选地，乳清衍生的组合物包含在相对于总固体的10％w/w-29％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的11％w/w-27％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的13％w/w-25％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的16％w/w-22％w/w的范围内的量的总脂质。

优选地，乳清衍生的组合物包含在相对于总脂质的10％w/w-50％w/w的范围内、更优选地在相对于总脂质的20％w/w-47％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总脂质的25％w/w-45％w/w的范围内并且最优选地在相对于总脂质的29％w/w-41％w/w的范围内的磷脂总量。

在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含在相对于总固体的4％w/w-12％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的4％w/w-11％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的5％w/w-11％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的6％w/w-10％w/w的范围内的磷脂总量。

最突出的磷脂通常是鞘磷脂(SPH)、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)。在一些实施方案中，SPH、PC和PE占磷脂总量的高达90％。在本发明的优选的实施方案中，SPH、PC和PE占磷脂总量的从50％至90％、更优选地从60％至90％、甚至更优选地从70％至90％并且最优选地从80％至90％。乳清衍生的组合物的三种最突出的磷脂中的每一种通常以在从1.2％w/w至2.5％w/w的范围内，诸如在从1.5％w/w至2％w/w的范围内的量存在。乳清衍生的组合物可以另外包含其他磷脂，例如磷脂酰肌醇(PI)和/或磷脂酰丝氨酸(PS)。

乳清衍生的组合物的磷脂含量可以用磷-31NMR或本领域中已知的多种色谱方法(例如，HPLC或GC)进行分析。

如实施例4所提及的，本发明人已经发现乳细胞外囊泡(乳EV)可以以大量存在于本发明的乳清衍生的组合物中(在干燥步骤之前和在通过喷雾干燥获得的重构的乳清衍生的粉末中)。在不受理论束缚的情况下，认为液体进料和随后的产物流的相对温和的处理，并且特别是细菌过滤和温和的热处理的组合，导致完整乳EV的高回收率，而微生物的含量在最终产品中非常低。乳EV被认为对例如婴儿发育是重要的，并且例如是有价值的磷脂和微小RNA的丰富来源。科学文献指出乳miRNA是婴儿胃肠健康和免疫系统发育的中心调节因子，并且在现有技术中已经示出，人类EV衍生的miRNA在胃肠通道中存活下来，用于受体细胞在胃肠道中摄取(参见实施例5中的更多细节)。

因此，通常优选的是乳清衍生的组合物包含乳EV，并且优选地完整的乳EV。

本发明人已经发现，乳EV通常对本发明的乳清衍生的组合物的磷脂总含量做出重大贡献。

在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含相对于总磷脂的至少50％w/w、更优选地至少54％w/w、甚至更优选地至少56％w/w并且最优选地至少58％w/w的量的来源于乳EV的磷脂总量。

根据分析2来确定来源于乳EV的磷脂相对于总磷脂的量。

通常优选的是，乳清衍生的组合物包含相对于总磷脂的50％w/w-75％w/w、更优选地54％w/w-73％w/w、甚至更优选地56％w/w-71％w/w并且最优选地58％w/w-70％w/w的量的来源于乳EV的磷脂总量。本发明人已经发现这些范围对于由甜乳清制备的乳清衍生的组合物是典型的。

在本发明的其他优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含相对于总磷脂的至少76％w/w、更优选地至少80％w/w、甚至更优选地至少85％w/w并且最优选地至少90％w/w的量的来源于乳EV的磷脂总量。本发明人已经发现这些范围对于由酸乳清制备的乳清衍生的组合物是典型的。

如实施例5中描述的，本发明人已经发现，本发明的乳清衍生的组合物可以包含完整的乳微小RNA(miRNA)。更具体地。发现实施例1的乳清衍生的粉末和乳清衍生的液体(在喷雾干燥之前)两者都包含大量的miRNA，其中20种最丰富的miRNA物质中的5-6种与来自人乳EV的miRNA相同。已知乳衍生的miRNA在关于婴儿发育中起重要作用，并且因此本发明使得能够制备儿科营养品，并且特别是制备富含在人乳中发现的miRNA物质的婴儿营养品。由于现今的常规婴儿配方产品在很大程度上缺乏miRNA，这代表了‘人性化差距’。本发明人已经记录了在WD液体和粉末两者中保存的EV结构和miRNA的事实，强调了采用乳清衍生的粉末和乳清衍生的液体在具有完整miRNA含量的生物活性乳EV方面进一步人性化婴儿营养品的适用性。

因此，在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含微小RNA(miRNA)、更优选地存在于哺乳动物乳中的miRNA并且最优选地存在于牛乳和/或人乳中的miRNA。

在本发明的一些优选的实施方案中，miRNA包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含选自由以下项组成的组的至少一种miRNA物质：let-7a-5p、let-7b、let-7f、let-7i、miR-103、miR-16b、miR-191、miR-199a-3p、miR-21-5p、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-423-3p和miR-486。

优选地，miRNA包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含let-7a-5p、let-7b、let-7f、let-7i、miR-103、miR-16b、miR-191、miR-199a-3p、miR-21-5p、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-423-3p和miR-486。

在本发明的其他优选的实施方案中，miRNA包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含选自由以下项组成的组的至少一种miRNA物质：let-7a-5p、let-7b、let-7f、miR-191、miR-21-5p和miR-26a。

优选地，miRNA包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含miRNA物质let-7a-5p、let-7b、let-7f,miR-191、miR-21-5p和miR-26a。

在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含在相对于总固体的0％w/w-8％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的0％w/w-5％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的0％w/w-1％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的0％w/w-0.5％w/w的范围内的游离碳水化合物总量。

优选地，乳清衍生的组合物包含在相对于总固体的0％w/w-8％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的0％w/w-5％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的0％w/w-1％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的0％w/w-0.5％w/w的范围内的乳糖总量。

在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含在20-60微克/kg总固体的范围内、更优选地在24-50微克/kg总固体的范围内、甚至更优选地在26-45微克/kg总固体的范围内并且最优选地在30-40微克/kg总固体的范围内的量的维生素B12。

本发明人已经发现这对于例如儿科营养是有利的，并且已经看到乳清衍生的维生素B12和乳清磷脂的组合协同地支持婴儿认知发育的迹象。

优选地，乳清衍生的组合物具有在相对于总固体的0.5％w/w-5％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的1.0％w/w-3％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的1.5％w/w-3％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的1.6％w/w-2％w/w的范围内的灰分含量。

本发明人已经发现具有低灰分含量的乳清衍生的组合物对于例如婴儿配方产品(infant formula product)特别有利。

在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含相对于乳清衍生的组合物的重量的1％w/w-30％w/w、更优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的2％w/w-15％w/w、甚至更优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的4％w/w-12％w/w并且最优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的5％w/w-10％w/w的量的总固体。这例如对于呈液体产品的形式的乳清衍生的组合物是有用的。

液体乳清衍生的组合物通常包含相对于乳清衍生的组合物的重量的0.5％w/w-10％w/w、更优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的1％w/w-8％w/w、甚至更优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的2％w/w-7％w/w并且最优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的2％w/w-5％w/w的量的总蛋白质。

在本发明的其他优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含相对于乳清衍生的组合物的重量的90％w/w-99％w/w、更优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的93％w/w-98％w/w、甚至更优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的94％w/w-97％w/w并且最优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的94％w/w-97％w/w的量的总固体。这例如对于呈粉末或固体产品的形式的乳清衍生的组合物是有用的。

乳清衍生的组合物的不是固体的物质优选地是水。

液体进料的不是固体的物质优选地是水。

过滤渗余物的不是固体的物质优选地是水。

乳清衍生的组合物优选地具有在4.0-8的范围内、更优选地在5.5-7.5的范围内、甚至更优选地在5.7-7.0的范围内并且最优选地在5.9-6.6的范围内的pH。

通常，乳清衍生的组合物可以包含相对于总固体的至多10％w/w的酪蛋白、优选地相对于总固体的重量的至多5％w/w的酪蛋白、更优选地相对于总固体的重量的至多1％w/w的酪蛋白并且甚至更优选地相对于总固体的重量的至多0.5％w/w的酪蛋白。在一些实施方案中，乳清衍生的组合物可以不包含可检测量的酪蛋白。

另外，乳清衍生的组合物优选地包含胆固醇。胆固醇的量优选地在相对于总固体的从3mg/g至20mg/g的范围内、更优选地在相对于总固体的从4mg/g至15mg/g的范围内并且最优选地在相对于总固体的从5mg/g至10mg/g的范围内。

乳清衍生的组合物优选地包含神经节苷脂。乳清衍生的组合物的最突出的神经节苷脂通常是GD3和GM3。

在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含在相对于总固体的从1800mg/kg至3800mg/kg的范围内、最优选地在相对于总固体的从2000mg/kg至3500mg/kg的范围内的量的GD3。

在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含在相对于总固体的从65mg/kg至90mg/kg的范围内并且最优选地在相对于总固体的从70mg/kg至85mg/kg的范围内的量的GM3。乳清衍生的组合物的神经节苷脂总量可以在相对于总固体的从1800mg/kg至4000mg/kg的范围内。

乳清衍生的组合物的神经节苷脂含量可以用LC-MS方法GANGLIO-r-LC-TOF进行分析。

优选地，乳清衍生的组合物包含在相对于总固体的从1％w/w至10％w/w的范围内并且更优选地在相对于总固体的从3％w/w至8％w/w的范围内的免疫球蛋白G(IgG，诸如IgG1和IgG2)。IgG的量可以用放射免疫扩散进行分析。

优选地，乳清衍生的组合物包含牛血清白蛋白(BSA)。BSA优选地以相对于总固体的1％-5％并且最优选地相对于总固体的2％w/w至3.5％w/w的量存在。

在一些实施方案中，乳清衍生的组合物还可以包含糖基化依赖性细胞粘附分子(PP3)。PP3可以以相对于乳清衍生的组合物的总固体的从1％w/w至3.5％w/w的量存在。

在一些实施方案中，乳清衍生的组合物还可以包含乳运铁蛋白(或乳铁蛋白)。乳铁蛋白可以以相对于乳清衍生的组合物的总固体的从1％w/w至1.6％w/w的量存在。

乳清衍生的组合物还可以包含其他膜组分。

如本文使用的，术语“和/或”意图意指组合(“和”)使用和排他性(“或”)使用，即“A和/或B”意图意指“单独的A、或单独的B、或A和B一起”。

乳清衍生的组合物的微生物负载量优选地保持在最低限度，以使其在婴儿产品中安全使用。然而，获得乳清衍生的组合物的高度生物活性和低含量微生物两者是一个挑战，因为用于微生物减少的过程往往导致乳清衍生的组合物的生物活性组分的变性和降解。本发明使得可以获得非常低含量的微生物，同时避免损害乳清衍生的组合物的组分。

优选地，乳清衍生的组合物包含至多10000菌落形成单位(CFU)/g总固体、更优选地至多6000CFU/g总固体、甚至更优选地至多3000CFU/g总固体，并且最优选地乳清衍生的组合物包含至多1000CFU/g总固体。

本发明人已经发现，可以获得甚至更低含量的微生物(参见例如实施例3)。因此，在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物包含至多600菌落形成单位(CFU)/g总固体、更优选地至多400CFU/g总固体、甚至更优选地至多200CFU/g总固体，并且最优选地乳清衍生的组合物包含小于100CFU/g总固体。

本发明人还已经发现，在本发明的方法中使用具有1.0微米-2微米并且最优选地1.2微米-1.8微米的孔径的微滤膜的基于MF的细菌过滤的使用导致乳清衍生的组合物中显著降低的内毒素含量。因此，本发明使得能够生产富含磷脂的乳清衍生的产品，该富含磷脂的乳清衍生的产品包含非常低浓度的内毒素或者甚至没有可检测的内毒素。

根据ISO 4833-1，菌落形成单位的测定是基于在30℃孵育之后的总板计数。

在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物是液体。

在本发明的其他优选的实施方案中，乳清衍生的组合物是粉末，优选地通过喷雾干燥获得的粉末。

在本发明的一些优选的实施方案中，乳清衍生的组合物具有：

-在4.0-8的范围内、更优选地在5.5-7.5的范围内、甚至更优选地在5.7-7.0的范围内并且最优选地在5.9-6.6的范围内的pH，并且

包含：

-相对于总固体的10％w/w至30％w/w的量的总脂质，

-相对于总固体的3％w/w至12％w/w的量的总磷脂，

-在相对于总固体的1％w/w-10％w/w的范围内的灰分含量，

-相对于总固体的至多10％w/w的量的乳糖；

-相对于总固体的65％w/w至80％w/w的量的总蛋白质，

-相对于总蛋白质的0.8％w/w-5％w/w的量的OPN，以及

-在20-60微克/kg总固体的范围内的量的维生素B12。

在本发明的其他优选的实施方案中，乳清衍生的组合物具有：

-在4.0-8的范围内、更优选地在5.5-7.5的范围内、甚至更优选地在5.7-7.0的范围内并且最优选地在5.9-6.6的范围内的pH，并且

包含：

-相对于总固体的10％w/w至30％w/w的量的总脂质，

-相对于总固体的3％w/w至12％w/w的量的总磷脂，

-在相对于总固体的1％w/w-10％w/w的范围内的灰分含量，

-相对于总固体的至多10％w/w的量的乳糖；

-相对于总固体的65％w/w至80％w/w的量的总蛋白质，

-相对于总蛋白质的0.8％w/w-5％w/w的量的OPN，

-在20-60微克/kg总固体的范围内的量的维生素B12，以及

-至多10000菌落形成单位/g总固体。

在本发明的另外优选的实施方案中，乳清衍生的组合物是粉末，优选地通过喷雾干燥制备的粉末，并且具有：

-在4.0-8的范围内、更优选地在5.5-7.5的范围内、甚至更优选地在5.7-7.0的范围内并且最优选地在5.9-6.6的范围内的pH，并且

包含：

-相对于总固体的10％w/w至30％w/w的量的总脂质，

-相对于总固体的3％w/w至12％w/w的量的总磷脂，

-在相对于总固体的1％w/w-10％w/w的范围内的灰分含量，

-相对于总固体的至多10％w/w的量的乳糖；

-相对于总固体的65％w/w至80％w/w的量的总蛋白质，

-相对于总蛋白质的0.8％w/w-5％w/w的量的OPN，以及

-在20-60微克/kg总固体的范围内的量的维生素B12。

在本发明的甚至另外优选的实施方案中，乳清衍生的组合物是粉末，优选地通过喷雾干燥制备的粉末，并且具有：

-在4.0-8的范围内、更优选地在5.5-7.5的范围内、甚至更优选地在5.7-7.0的范围内并且最优选地在5.9-6.6的范围内的pH，并且

包含：

-相对于总固体的10％w/w至30％w/w的量的总脂质，

-相对于总固体的3％w/w至12％w/w的量的总磷脂，

-在相对于总固体的1％w/w-10％w/w的范围内的灰分含量，

-相对于总固体的至多10％w/w的量的乳糖；

-相对于总固体的65％w/w至80％w/w的量的总蛋白质，

-相对于总蛋白质的0.8％w/w-5％w/w的量的OPN，

-在20-60微克/kg总固体的范围内的量的维生素B12，以及

-至多10000菌落形成单位/g总固体。

在本发明的一些优选的实施方案中，本发明的乳清衍生的组合物通过本发明的方法可获得。

本发明的又一个方面涉及本发明的乳清衍生的组合物作为食品成分的用途，优选地用于增加营养产品中OPN的含量，并且优选地其中营养产品是儿科产品并且更优选地是婴儿配方产品；优选地以足以向营养产品提供至少10mg/100g营养产品的总固体、更优选地至少20mg/100g总固体、甚至更优选地至少30mg/100g总固体并且最优选地至少40mg/100g总固体的OPN含量的量使用所述乳清衍生的组合物。

乳清衍生的组合物优选地以足以向营养产品提供10-500mg/100g营养产品的总固体、更优选地20-400mg/100g总固体、甚至更优选地30-200mg/100g总固体并且最优选地40-100mg/100g总固体的OPN含量的量使用。

此外，优选的是本发明的乳清衍生的组合物作为食品成分用于增加营养产品中维生素B12的含量，并且优选地其中营养产品是儿科产品并且更优选地是婴儿配方产品；优选地以足以向营养产品提供至少0.02微克/100g营养产品的总固体、更优选地至少0.05微克/100g总固体、甚至更优选地至少0.10微克/100g总固体并且最优选地至少0.15微克/100g总固体的维生素B12含量的量使用乳清衍生的组合物。

乳清衍生的组合物优选地以足以向营养产品提供0.02-1.0微克/100g营养产品的总固体、更优选地0.05-0.7微克/100g总固体、甚至更优选地至少0.10-0.5微克/100g总固体并且最优选地0.12-0.4微克/100g总固体的维生素B12含量的量使用。

本发明的又一个方面涉及本发明的乳清衍生的组合物作为食品成分的用途，用于增加营养产品中乳细胞外囊泡的含量，并且优选地其中营养产品是儿科产品并且更优选地是婴儿配方产品。

本发明的另外的方面涉及本发明的乳清衍生的组合物作为食品成分的用途，用于增加营养产品中miRNA、优选地存在于哺乳动物乳中的miRNA并且最优选地存在于牛乳和/或人乳中的miRNA的含量，并且优选地其中营养产品是儿科产品并且更优选地是婴儿配方产品。

miRNA优选地包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含选自由以下项组成的组的至少一种miRNA物质：let-7a-5p、let-7b、let-7f、let-7i、miR-103、miR-16b、miR-191、miR-199a-3p、miR-21-5p、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-423-3p和miR-486。

在本发明的一些优选的实施方案中，miRNA包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含let-7a-5p、let-7b、let-7f、let-7i、miR-103、miR-16b、miR-191、miR-199a-3p、miR-21-5p、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-423-3p和miR-486。

可选择地，但也是优选的，miRNA可以包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含选自由以下项组成的组的至少一种miRNA物质：let-7a-5p、let-7b、let-7f、miR-191、miR-21-5p和miR-26a。

在本发明的其他优选的实施方案中，miRNA包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含miRNA物质let-7a-5p、let-7b、let-7f,miR-191、miR-21-5p和miR-26a。

本发明的乳清衍生的组合物优选地以足以向营养产品提供至少0.1g/100g营养产品的总固体、更优选地至少0.5g/100g总固体、甚至更优选地至少2g/100g总固体并且最优选地至少3g/100g总固体的固体含量的量使用。

优选地，乳清衍生的组合物以足以向营养产品提供0.1-30g/100g营养产品的总固体、更优选地0.5-20g/100g总固体、甚至更优选地2-15g/100g总固体并且最优选地3g-12g/100g总固体的固体含量的量使用。

本发明的另外的方面涉及营养产品，该营养产品优选地是儿科产品并且更优选地是婴儿配方产品，该营养产品包含以这样的量的本发明的乳清衍生的组合物，所述量足以：

-提供至少10mg/100g营养产品的总固体、更优选地至少20mg/100g总固体、甚至更优选地至少30mg/100g总固体并且最优选地至少40mg/100g总固体的量的OPN，和/或

-提供至少0.02微克/100g营养产品的总固体、更优选地至少0.05微克/100g总固体、甚至更优选地至少0.10微克/100g总固体并且最优选地至少0.15微克/100g总固体的量的维生素B12，和/或

-向营养产品提供0.1-30g/100g营养产品的总固体、更优选地0.5-20g/100g总固体、甚至更优选地2-15g/100g总固体并且最优选地3-12g/100g总固体的固体含量。

在本发明的一些优选的实施方案中，优选地是儿科产品并且更优选地是婴儿配方产品的营养产品包含以这样的量的本发明的乳清衍生的组合物，所述量足以：

-提供至少10mg/100g营养产品的总固体、更优选地至少20mg/100g总固体、甚至更优选地至少30mg/100g总固体并且最优选地至少40mg/100g总固体的量的OPN，和/或

-提供至少0.02微克/100g营养产品的总固体、更优选地至少0.05微克/100g总固体、甚至更优选地至少0.10微克/100g总固体并且最优选地至少0.15微克/100g总固体的量的维生素B12。

优选地，营养产品包含以这样的量的本发明的乳清衍生的组合物，所述量足以提供10-500mg/100g营养产品的总固体、更优选地20-400mg/100g总固体、甚至更优选地30-200mg/100g总固体并且最优选地40-100mg/100g总固体的量的OPN。

优选地，营养产品包含以这样的量的本发明的乳清衍生的组合物，所述量足以提供0.02-1.0微克/100g营养产品的总固体、更优选地0.05-0.7微克/100g总固体、甚至更优选地至少0.10-0.5微克/100g总固体并且最优选地0.12-0.4微克/100g总固体的量的维生素B12。

优选地，营养产品包含以这样的量的本发明的乳清衍生的组合物，所述量足以向营养产品提供0.1-30g/100g营养产品的总固体、更优选地0.5-20g/100g总固体、甚至更优选地2-15g/100g总固体并且最优选地3-12g/100g总固体的固体含量。

在下文中，描述了本发明的优选的编号的实施方案。

编号的实施方案1.一种制备乳清衍生的组合物的方法，该乳清衍生的组合物富含磷脂和骨桥蛋白(OPN)，并且优选地还富含其他乳脂球膜组分，所述方法包括以下步骤：

a)提供液体进料，该液体进料包括包含骨桥蛋白和α-乳清蛋白(ALA)的乳清蛋白以及源自乳清的磷脂，液体进料包含在相对于总蛋白质的0.2％w/w-2.0％w/w的范围内的骨桥蛋白总量，

b)使液体进料经历膜过滤以提供过滤渗余物和过滤渗透物，所述膜过滤被布置和操作成：

-提供基于过滤渗余物的总蛋白质的骨桥蛋白含量，该骨桥蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少150％，以及

-提供基于过滤渗余物的总蛋白质的α-乳清蛋白含量，该α-乳清蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多75％，以及

任选地c)使过滤渗余物或至少包含源自过滤渗余物的脂质和蛋白质的产物流经历一个或更多个另外的加工步骤，该一个或更多个另外的加工步骤优选地包括以下步骤中的一个或更多个：

i)微滤，

ii)浓缩，

iii)热处理，以及

iv)干燥。

编号的实施方案2.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤a)的乳清是甜乳清或酸乳清。

编号的实施方案3.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料是乳清。

编号的实施方案4.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料是乳清的蛋白质浓缩物。

编号的实施方案5.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料是乳清的蛋白质浓缩物，并且提供液体进料包括使乳清经历以下步骤中的一个或更多个步骤：

-浓缩，

-去矿化，

-渗滤，以及

-至少部分去除具有1.5微米或更大的直径的颗粒。

编号的实施方案6.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含在相对于总固体的5％w/w-89％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的30％w/w-86％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的40％w/w-83％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的60％w/w-80％w/w的范围内的量的总蛋白质。

编号的实施方案7.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含在相对于总固体的5％w/w-25％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的5％w/w-20％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的5％w/w-15％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的5％w/w-10％w/w的范围内的量的总蛋白质。

编号的实施方案8.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含在相对于总蛋白质的10％w/w-70％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的30％w/w-65％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的40％w/w-60％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的45％w/w-55％w/w的范围内的β-乳球蛋白总量。

编号的实施方案9.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含在相对于总蛋白质的5％w/w-40％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-35％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-30％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-25％w/w的范围内的α-乳清蛋白总量。

编号的实施方案10.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含在相对于总蛋白质的5％w/w-30％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-30％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-25％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-20％w/w的范围内的酪蛋白巨肽总量。

编号的实施方案11.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含在相对于总蛋白质的0.2％w/w-0.9％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的0.3％w/w-0.8％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的0.4％w/w-0.8％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的0.4％w/w-0.7％w/w的范围内的骨桥蛋白总量。

编号的实施方案12.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含在相对于总蛋白质的1.0％w/w-2.0％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的1.2％w/w-2.0％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的1.3％w/w-2.0％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的1.4％w/w-2.0％w/w的范围内的骨桥蛋白总量。

编号的实施方案13.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含在相对于总固体的1％w/w-10％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的2％w/w-8％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的3％w/w-7％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的4％w/w-7％w/w的范围内的量的总脂质。

编号的实施方案14.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含在相对于总脂质的10％w/w-50％w/w的范围内、更优选地在相对于总脂质的20％w/w-47％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总脂质的25％w/w-45％w/w的范围内并且最优选地在相对于总脂质的29％w/w-41％w/w的范围内的磷脂总量。

编号的实施方案15.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含在相对于总固体的0.2％w/w-5％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的0.4％w/w-4％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的0.5％w/w-3％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的1％w/w-3％w/w的范围内的磷脂总量。

编号的实施方案16.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含在相对于总固体的0％w/w-85％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的1％w/w-55％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的1％w/w-50％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的1％w/w-30％w/w的范围内的游离碳水化合物总量。

编号的实施方案17.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含在相对于总固体的0％w/w-80％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的0％w/w-55％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的0％w/w-50％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的0％w/w-30％w/w的范围内的乳糖总量。

编号的实施方案18.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含在2-16微克/kg总固体的范围内、更优选地在4-14微克/kg总固体的范围内、甚至更优选地在6-12微克/kg总固体的范围内并且最优选地在8-10微克/kg总固体的范围内的量的维生素B12。

编号的实施方案19.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料具有在相对于总固体的1％w/w-10％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的1％w/w-8％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的2％w/w-8％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的3％w/w-7％w/w的范围内的灰分含量。

编号的实施方案20.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含相对于液体进料的重量的1％w/w-20％w/w、更优选地相对于液体进料的重量的2％w/w-15％w/w、甚至更优选地相对于液体进料的重量的4％w/w-12％w/w并且最优选地相对于液体进料的重量的5％w/w-10％w/w的量的总固体。

编号的实施方案21.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料包含相对于液体进料的重量的0.2％w/w-8％w/w、更优选地相对于液体进料的重量的1％w/w-7％w/w、甚至更优选地相对于液体进料的重量的2％w/w-6％w/w并且最优选地相对于液体进料的重量的2％w/w-5％w/w的量的总蛋白质。

编号的实施方案22.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中液体进料具有在4.0-8的范围内、更优选地在5.5-7.5的范围内、甚至更优选地在5.7-7.0的范围内并且最优选地在5.9-6.6的范围内的pH。

编号的实施方案23.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的β-乳球蛋白含量，该β-乳球蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的至多100％、更优选地基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的至多90％、甚至更优选地基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的至多80％并且最优选地基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的至多70％。

编号的实施方案24.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的β-乳球蛋白含量，该β-乳球蛋白含量在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的10％-100％的范围内、更优选地在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的20％-98％的范围内、甚至更优选地在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的30％-96％的范围内并且最优选地在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的40％-94％的范围内。

编号的实施方案25.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的β-乳球蛋白含量，该β-乳球蛋白含量在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的10％-90％的范围内、更优选地在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的15％-80％的范围内、甚至更优选地在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的20％-70％的范围内并且最优选地在基于液体进料的总蛋白质的β-乳球蛋白含量的25％-60％的范围内。

编号的实施方案26.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的α-乳清蛋白含量，该α-乳清蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多50％、更优选地基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多30％、甚至更优选地基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多20％并且最优选地基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多10％。

编号的实施方案27.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的α-乳清蛋白含量，该α-乳清蛋白含量在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的1％-50％的范围内、更优选地在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的2％-30％的范围内、甚至更优选地在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的3％-20％的范围内并且最优选地在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的4％-10％的范围内。

编号的实施方案28.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的α-乳清蛋白含量，该α-乳清蛋白含量在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的5％-50％的范围内、更优选地在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的10％-45％的范围内、甚至更优选地在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的15％-40％的范围内并且最优选地在基于液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的20％-35％的范围内。

编号的实施方案29.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量，该酪蛋白巨肽含量是基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的至多50％、更优选地基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的至多40％、甚至更优选地基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的至多35％并且最优选地基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的至多30％。

编号的实施方案30.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量，该酪蛋白巨肽含量在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的1％-50％的范围内、更优选地在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的2％-40％的范围内、甚至更优选地在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的3％-35％的范围内并且最优选地在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的4％-30％的范围内。

编号的实施方案31.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量，该酪蛋白巨肽含量在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的1％-45％的范围内、更优选地在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的2％-30％的范围内、甚至更优选地在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的3％-20％的范围内并且最优选地在基于液体进料的总蛋白质的酪蛋白巨肽含量的4％-10％的范围内。

编号的实施方案32.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的骨桥蛋白含量，该骨桥蛋白含量是基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少180％、更优选地基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少200％、甚至更优选地基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少230％并且最优选地基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少250％。

编号的实施方案33.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供基于过滤渗余物的总蛋白质的骨桥蛋白含量，该骨桥蛋白含量在基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的150％-600％的范围内、更优选地在基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的175％-500％的范围内、甚至更优选地在基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的200％-450％的范围内并且最优选地在基于液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的225％-300％的范围内。

编号的实施方案34.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供相对于过滤渗余物的总固体的总磷脂含量，该总磷脂含量是相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的至少200％、更优选地相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的至少225％、甚至更优选地相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的至少250％并且最优选地相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的至少275％。

编号的实施方案35.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，步骤b)的膜过滤被布置和操作成提供相对于过滤渗余物的总固体的总磷脂含量，该总磷脂含量在相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的200％-600％的范围内、更优选地在相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的225％-550％的范围内、甚至更优选地在相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的250％-500％的范围内并且最优选地在相对于液体进料的总固体的总磷脂含量的275％-450％的范围内。

编号的实施方案36.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤涉及标称分子量截止值在100kDa-2000kDa的范围内、更优选地在300kDa-1600kDa的范围内、甚至更优选地在500kDa-1300kDa的范围内并且最优选地在700kDa-1000kDa的范围内的一个或更多个膜。

编号的实施方案37.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤涉及渗滤。

编号的实施方案38.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中在步骤b)期间的中间体渗余物流(如果有的话)包含相对于中间体渗余物流的重量的0.5％w/w-10％w/w、更优选地相对于中间体渗余物流的重量的1％w/w-8％w/w、甚至更优选地相对于中间体渗余物流的重量的2％w/w-7％w/w并且最优选地相对于中间体渗余物流的重量的2％w/w-5％w/w的量的总蛋白质。

编号的实施方案39.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤在0.1巴-5巴、更优选地0.2巴-3巴并且最优选地0.3巴-1巴的跨膜压力的情况下操作。

编号的实施方案40.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中步骤b)的膜过滤在1℃-60℃、更优选地2℃-30℃、甚至更优选地5℃-20℃并且最优选地8℃-15℃的温度操作。

编号的实施方案41.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法还包括步骤c)。

编号的实施方案42.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法还包括步骤c)，并且步骤c)包括i)微滤，优选地将过滤渗余物或至少包含源自过滤渗余物的脂质和蛋白质的产物流微滤，优选地使用孔径在1.0微米-2微米的范围内的MF膜微滤。

编号的实施方案43.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法还包括步骤c)，并且步骤c)包括ii)浓缩，优选地使用超滤、纳滤、反渗透和蒸发中的一种或更多种进行浓缩。

编号的实施方案44.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法还包括步骤c)，并且步骤c)包括iii)热处理，优选地包括热处理到至少60℃的温度，持续足以获得至少部分微生物减少的持续时间。

编号的实施方案45.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法还包括步骤c)，并且步骤c)包括iv)干燥，优选地包括喷雾干燥或者甚至由喷雾干燥组成。

编号的实施方案46.根据前述编号的实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法还包括步骤c)，并且步骤c)包括使过滤渗余物或至少包含源自过滤渗余物的脂质和蛋白质的产物流经历：

i)微滤，优选地使用孔径在1.0微米-2微米的范围内的MF膜微滤，随后

ii)浓缩，优选地使用超滤、纳滤和/或反渗透进行浓缩，随后

iii)热处理，优选地涉及将待热处理的液体加热到至少60℃的温度，持续足以获得至少部分微生物减少的持续时间，但是其中热处理使待热处理的液体的至多5％的BLG变性，以及随后

iv)干燥，优选地包括喷雾干燥或者甚至由喷雾干燥组成。

编号的实施方案47.一种乳清衍生的组合物，包含：

-相对于总固体的10％w/w至30％w/w的量的总脂质，

-相对于总固体的3％w/w至12％w/w的量的总磷脂，

-在相对于总固体的1％w/w-10％w/w的范围内的灰分含量，

-相对于总固体的至多10％w/w的量的乳糖；

-相对于总固体的65％w/w至80％w/w的量的总蛋白质，

-相对于总蛋白质的0.8％w/w-5％w/w的量的OPN。

编号的实施方案48.根据编号的实施方案47所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含在相对于总固体的66％w/w-78％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的68％w/w-76％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的70％w/w-76％w/w的范围内的量的总蛋白质。

编号的实施方案49.根据编号的实施方案47-48中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含在相对于总蛋白质的10％w/w-45％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的15％w/w-40％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的20％w/w-40％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的25％w/w-35％w/w的范围内的β-乳球蛋白总量。

编号的实施方案50.根据编号的实施方案47-49中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含在相对于总蛋白质的0％w/w-10％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的0.1％w/w-8％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的0.3％w/w-5％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的0.5％w/w-3％w/w的范围内的α-乳清蛋白总量。

编号的实施方案51.根据编号的实施方案47-50中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含在相对于总蛋白质的1％w/w-10％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的1％w/w-9％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的2％w/w-8％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的3％w/w-7％w/w的范围内的α-乳清蛋白总量。

编号的实施方案52.根据编号的实施方案47-51中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含在相对于总蛋白质的0％w/w-10％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的1％w/w-8％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的2％w/w-7％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的3％w/w-7％w/w的范围内的酪蛋白巨肽总量。

编号的实施方案53.根据编号的实施方案47-52中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含在相对于总蛋白质的0％w/w-9％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的0.1％w/w-7％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的0.3％w/w-5％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的0.5％w/w-3％w/w的范围内的酪蛋白巨肽总量。

编号的实施方案54.根据编号的实施方案47-53中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含在相对于总蛋白质的0.9％w/w-5％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的1.0％w/w-4％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的1.1％w/w-3％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的1.1％w/w-1.7％w/w的范围内的骨桥蛋白总量。

编号的实施方案55.根据编号的实施方案47-54中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含在相对于总蛋白质的2.0％w/w-5％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的2.2％w/w-4.5％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的2.5％w/w-4.0％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的3.0％w/w-3.7％w/w的范围内的骨桥蛋白总量。

编号的实施方案56.根据编号的实施方案47-55中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含在相对于总固体的10％w/w-29％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的11％w/w-27％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的13％w/w-25％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的16％w/w-22％w/w的范围内的量的总脂质。

编号的实施方案57.根据编号的实施方案47-56中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含在相对于总脂质的10％w/w-50％w/w的范围内、更优选地在相对于总脂质的20％w/w-47％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总脂质的25％w/w-45％w/w的范围内并且最优选地在相对于总脂质的29％w/w-41％w/w的范围内的磷脂总量。

编号的实施方案58.根据编号的实施方案47-57中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含在相对于总固体的4％w/w-12％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的4％w/w-11％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的5％w/w-11％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的6％w/w-10％w/w的范围内的磷脂总量。

编号的实施方案59.根据编号的实施方案47-58中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含在相对于总固体的0％w/w-8％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的0％w/w-5％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的0％w/w-1％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的0％w/w-0.5％w/w的范围内的游离碳水化合物总量。

编号的实施方案60.根据编号的实施方案47-59中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含在相对于总固体的0％w/w-8％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的0％w/w-5％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的0％w/w-1％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的0％w/w-0.5％w/w的范围内的乳糖总量。

编号的实施方案61.根据编号的实施方案47-60中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含在20-60微克/kg总固体的范围内、更优选地在24-50微克/kg总固体的范围内、甚至更优选地在26-45微克/kg总固体的范围内并且最优选地在30-40微克/kg总固体的范围内的量的维生素B12。

编号的实施方案62.根据编号的实施方案47-61中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物具有在相对于总固体的0.5％w/w-5％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的1.0％w/w-3％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的1.5％w/w-3％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的1.6％w/w-2％w/w的范围内的灰分含量。

编号的实施方案63.根据编号的实施方案47-62中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含相对于乳清衍生的组合物的重量的1％w/w-30％w/w、更优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的2％w/w-15％w/w、甚至更优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的4％w/w-12％w/w并且最优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的5％w/w-10％w/w的量的总固体。

编号的实施方案64.根据编号的实施方案63所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含相对于乳清衍生的组合物的重量的0.5％w/w-10％w/w、更优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的1％w/w-8％w/w、甚至更优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的2％w/w-7％w/w并且最优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的2％w/w-5％w/w的量的总蛋白质。

编号的实施方案65.根据编号的实施方案47-64中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物包含相对于乳清衍生的组合物的重量的90％w/w-99％w/w、更优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的93％w/w-98％w/w、甚至更优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的94％w/w-97％w/w并且最优选地相对于乳清衍生的组合物的重量的94％w/w-97％w/w的量的总固体。

编号的实施方案66.根据编号的实施方案47-65中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物具有在4.0-8的范围内、更优选地在5.5-7.5的范围内、甚至更优选地在5.7-7.0的范围内并且最优选地在5.9-6.6的范围内的pH。

编号的实施方案67.根据编号的实施方案47-66中任一项所述的乳清衍生的组合物，其中乳清衍生的组合物是液体或粉末。

编号的实施方案68.根据编号的实施方案47-67中任一项所述的乳清衍生的组合物，通过编号的实施方案1-46中的一项或更多项可获得。

编号的实施方案69.根据编号的实施方案47-68中任一项所述的乳清衍生的组合物作为食品成分的用途，优选地用于增加营养产品中OPN的含量，并且优选地其中营养产品是儿科产品并且更优选地是婴儿配方产品；优选地以足以向营养产品提供至少10mg/100g营养产品的总固体、更优选地至少20mg/100g总固体、甚至更优选地至少30mg/100g总固体并且最优选地至少40mg/100g总固体的OPN含量的量使用乳清衍生的组合物。

编号的实施方案70.根据编号的实施方案69所述的用途，其中乳清衍生的组合物以足以向营养产品提供10-500mg/100g营养产品的总固体、更优选地20-400mg/100g总固体、甚至更优选地30-200mg/100g总固体并且最优选地40-100mg/100g总固体的OPN含量的量使用。

编号的实施方案71.根据编号的实施方案47-68中任一项所述的乳清衍生的组合物作为食品成分的用途，优选地用于增加营养产品中维生素B12的含量，并且优选地其中营养产品是儿科产品并且更优选地是婴儿配方产品；优选地以足以向营养产品提供至少0.02微克/100g营养产品的总固体、更优选地至少0.05微克/100g总固体、甚至更优选地至少0.10微克/100g总固体并且最优选地至少0.15微克/100g总固体的维生素B12含量的量使用乳清衍生的组合物。

编号的实施方案72.根据编号的实施方案71所述的乳清衍生的组合物的用途，其中乳清衍生的组合物以足以向营养产品提供0.02-1.0微克/100g营养产品的总固体、更优选地0.05-0.7微克/100g总固体、甚至更优选地至少0.10-0.5微克/100g总固体并且最优选地0.12-0.4微克/100g总固体的维生素B12含量的量使用。

编号的实施方案73.一种营养产品，所述营养产品优选地是儿科产品并且更优选地是婴儿配方产品，所述营养产品包含以这样的量的根据编号的实施方案47-68中任一项所述的乳清衍生的组合物，所述量足以：

-提供至少10mg/100g营养产品的总固体、更优选地至少20mg/100g总固体、甚至更优选地至少30mg/100g总固体并且最优选地至少40mg/100g总固体的量的OPN，和/或

-提供至少0.02微克/100g营养产品的总固体、更优选地至少0.05微克/100g总固体、甚至更优选地至少0.10微克/100g总固体并且最优选地至少0.15微克/100g总固体的量的维生素B12。

编号的实施方案74.根据编号的实施方案73所述的营养产品，包含以这样的量的根据编号的实施方案47-68中任一项所述的乳清衍生的组合物，所述量足以提供10-500mg/100g营养产品的总固体、更优选地20-400mg/100g总固体、甚至更优选地30-200mg/100g总固体并且最优选地40-100mg/100g总固体的量的OPN。

编号的实施方案75.根据编号的实施方案73或74所述的营养产品，包含以这样的量的根据编号的实施方案47-68中任一项所述的乳清衍生的组合物，所述量足以提供0.02-1.0微克/100g营养产品的总固体、更优选地0.05-0.7微克/100g总固体、甚至更优选地至少0.10-0.5微克/100g总固体并且最优选地0.12-0.4微克/100g总固体的量的维生素B12。

实施例

分析

分析1-包括全长OPN和天然存在的长OPN片段的OPN的定量

分析原理：

通过0.22μm过滤器过滤液体样品，并用阴离子交换柱MonoQ HR 5/5(1ml),Pharmacia经历HPLC，并在280nm处检测。通过外标法(与具有已知OPN含量的标准品的峰面积比较)来计算样品的浓度。已经证实，使用本发明的方法，乳或乳清的全长OPN和天然存在的长OPN片段两者在同一峰中洗脱。

试剂：OPN标准品，Milli Q水，HPLC级，NaCl，Merck，Tris HCl，Sigma

缓冲液A：10mM NaCl，20mM Tris HCL，pH 8.0

缓冲液B：0.8M NaCl，20mM Tris HCl，pH 8.0

由缓冲液A中浓度范围为1-10mg/ml的OPN标准品中的5个标准品制成标准校准曲线。所有标准品在加载到柱上之前通过0.22μm过滤器过滤。

取样和预处理：

粉末样品最初通过将粉末样品溶解在Milli Q水中而转化为液体样品。如果用于分析的液体样品超出标准校准曲线的范围，则用于分析的液体样品用Milli Q水、HPLC级稀释。如果存在来自洗脱液的大量NaCl，则稀释在一些情况下也是必要的以使得能够实现OPN与阴离子交换树脂的结合。注射相当于25μL的1-10mg/mL OPN的量用于分析。样品在注射到HPLC之前通过0.22μm过滤器过滤。

HPLC条件：流量1ml/min，注射体积25μL，梯度：0-3min 0％ B，3-17min 0-60％ B，17-30min 60-100％ B，30-33min 100％ B，33-34min 100-0％ B，34-40min 0％ B。

结果的计算和表达：

通过参考标准曲线并通过观察所采用的稀释度来计算每个样品中OPN的浓度。OPN相对于总蛋白质或总固体的重量百分比还要求测定样品的总蛋白质或总固体的含量。

分析2-乳EV衍生的磷脂相对于总磷脂的百分比的测定

分析基准：

在乳/乳清中发现的磷脂库主要由源自细胞外囊泡和乳脂球膜的材料构成。由于这两种磷脂膜具有不同的生物学来源，它们可以通过其蛋白质货物来区分。作为MFGM的良好(但非唯一)标志物的整合膜蛋白是嗜乳脂蛋白(Butyrophilin)，并且四旋蛋白(tetraspanin)CD9是细胞外囊泡材料的良好的非唯一整合膜蛋白标志物。定量这两种蛋白质并评估它们之间的摩尔比成为磷脂来源中乳EV和MFGM材料之间的比率的良好无量纲测量。使用纯乳EV和MFGM参考材料(Blans等人；Pellet-free isolation of human andbovine milk extracellular vesicles by size-exclusion chromatography；2017；Journal of Extracellular Vesicles,6:1,DOI:10.1080/20013078.2017.1294340)，该BTN/CD9摩尔比可以直接转换为标准曲线，该标准曲线示出构成总磷脂库的乳EV和MFGM材料的百分比。这种分析设计的主要优点之一是它不需要支持性测量，如干物质/蛋白质/磷脂等的浓度，从而使其不容易累积实验误差，并且完全独立于样品的物理状态。

标准品的制备：

未标记的合成肽作为粉末购自Thermo Fisher Scientific GmbH(Ulm,Germany)，并且根据制造商的使用说明溶解在Milli-Q纯净水(Milli-Q academic,Merck Millipore)中，以达到50μM的浓度。将等分试样储存在-20℃，直到进一步使用。

样品的制备：

将样品在50mM TEAB(50mM四乙基溴化铵(TEAB)pH 8.5)中稀释至1.5mg·mL^-1的蛋白质浓度。相应地处理具有较低蛋白质浓度的样品。使所有粉末样品在4℃溶解过夜。

将在50mM TEAB中的100μL 1.5mg·mL^-1蛋白质样品与40μL 100mM DTT混合。将样品在100℃还原持续30min。在还原之后，添加140μL 100mM碘乙酰胺。将样品在室温避光酰胺化持续30min。在酰胺化之后，将25μL 0.3μg·μL^-1胰蛋白酶(经TPCK处理的，牛胰腺，10,000BAEE单位/mg蛋白质，T1426，Sigma Aldrich)添加到样品中，并且随后用180μL 50mMTEAB稀释。将样品在37℃消化持续20小时。通过用15μL 10％ TFA将pH降低至3至最终浓度为0.3％TFA来灭活胰蛋白酶。蛋白质的最终浓度为0.3mg·mL^-1，并且体积为500μL。

RP-HPLC-ESI-QQQ：

胰蛋白酶肽的分离在45℃在Agilent 1200系列系统(Agilent Technologies)上进行，该Agilent 1200系列系统配备有RP Symmetry300^TMC18柱(5μm,2.1×150mm,WatersCorp.)和保护柱Sentry RP Symmetry300^TMC18柱(3.5μm,2.1×5mm,Waters Corp.)。注射体积为25μL。分离在0.35mL·min^-1的流量用以下梯度实现：

MS检测在以下条件以阳性ESI模式在Agilent 6410Triple-Quad LC/MS(AgilentTechnologies)上进行：

设置	值
		气体温度	300℃
气体流量	10L·min-1
		雾化器气压	50psi
毛细管电压	4000V
		喷嘴电压600V	600V
电池加速器电压	7V

MS分析以单一反应监测模式进行，在色谱分辨率允许的范围内应用时间段。在214nm处记录UV光谱。用MassHunter定量分析软件(B.06.00,Agilent Technologies)进行数据处理。

用于检测嗜乳脂蛋白(蛋白质ID：P18892)的肽是TPLPLAGPPR，并且用于CD9(蛋白质ID：P30932)的肽是NLIDSLK。

准备标准曲线：

使用嗜乳脂蛋白(BTN)作为MFGM材料的非唯一标志物并且使用CD9作为乳EV的非唯一标志物，分析乳EV和MFGM的纯样品中的两种蛋白质，并且对两种蛋白质进行线性外推，并用于计算标准曲线，该标准曲线示出乳EV衍生的磷脂相对于总磷脂的计算的含量与BTN和CD9之间的摩尔比(即BTN/CD9)。所得到的标准曲线在图1中示出。

乳EV衍生的磷脂相对于总磷脂的百分比的定量：

乳EV衍生的磷脂相对于乳清衍生的产品的总磷脂的百分比通过使用上文描述的程序测量乳清衍生的产品的样品的BTN和CD9的含量并通过计算样品的BTN和CD9之间的摩尔比(即BTN/CD9)来确定。然后将摩尔比与标准曲线进行比较，以确定乳EV衍生的磷脂相对于总磷脂的相应百分比。

实施例1-富含乳脂球状膜组分的乳清衍生的组合物的生产

以下列方式制备富含乳清磷脂和OPN的乳清衍生的粉末。

通过对来自干酪生产的牛甜乳清的超滤直到获得总固体的70％蛋白质来制备乳清蛋白浓缩物(WPC70)。超滤膜具有5kDa的标称分子量截止值，并且操作温度为约15℃。

然后使用Synder FR膜(800kDa的标称分子量截止值；具有聚合物膜(基于聚偏二氟乙烯的聚合物膜))的螺旋缠绕的元件)，使用采用水作为稀释剂、约0.5巴的跨膜压力和约10℃的工艺温度的渗滤来使WPC70经历膜过滤。继续膜过滤，直到渗余物的ALA含量已经降低到WPC70的初始ALA含量的约33％。

收集约1200kg的最终过滤渗余物，并且分析渗余物的样品(参见表1)。

将1000kg的收集的过滤渗余物用水稀释至4600kg，并且使用采用TAMI 1.4微米Isoflux陶瓷元件的微滤和渗滤经历微生物减少(细菌过滤)，以洗涤MF渗透物中的乳清蛋白、磷脂和其他生物活性组分。细菌过滤在15℃操作。MF渗透物随后在15℃通过反渗透浓缩，热处理至66℃的温度并在该温度保持持续15秒，并且最后喷雾干燥。分析乳清衍生的粉末的样品，并且其化学组成在表1中示出。

表1液体进料(WPC70)、过滤渗余物和富含磷脂的乳清衍生的粉末的组成。重量百分比是相对于所提及的组合物的总固体，除了所提供的蛋白质物质相对于总蛋白质的重量百分比。

乳清衍生的粉末含有明显小于10000菌落形成单位/g总固体。

结论

本发明人令人惊讶地发现骨桥蛋白(OPN)和维生素B12两者在膜过滤期间与乳清磷脂一起富集，这与先前预期的相反。因此，本发明使得能够生产具有增加的OPN和维生素B12的含量的改进的乳清磷脂产品。这对于婴儿营养品是特别有利的，因为OPN和维生素B12两者是用于婴儿发育的重要组分。

OPN是用于婴儿免疫系统和神经组织的发育的重要营养组分，并且补充例如唾液酸、免疫球蛋白和复合乳清脂质诸如乳清磷脂和神经节苷脂，它们也在乳清衍生的粉末中发现并富集。

维生素B12对于婴儿的认知发育是重要的，并且补充上文提及的生物活性组分，这些生物活性组分还被发现有助于婴儿认知的发育。本发明人还已经看到本发明的乳清衍生的B12对婴儿营养品特别有用的迹象，因为维生素似乎与乳清衍生的粉末中的其他生物活性组分相关联，并且可能具有更好的生物利用度。

本发明人还证实了他们的初步发现，即具有受控孔径的细菌过滤可以用于减少产品的微生物负载量，而乳清衍生的粉末的组成相对于过滤渗余物没有大的变化。

另外，本发明人发现，细菌过滤与温和的热处理的组合提供了具有非常低的微生物负载的乳清衍生的粉末。这些发现在实施例3中被更详细地表征。

本发明人还发现，本发明的方法的产物流令人惊讶地可以包含大量乳衍生的细胞外囊泡和微小RNA。在实施例4和实施例5中更详细地描述了这些发现。

实施例2-包含高OPN乳清衍生的组合物的婴儿配方产品的生产

通过将下表中描述的成分充分混合来制备婴儿配方产品(IF)粉末的两个样品。样品“WDP IF粉末”除了乳清蛋白浓缩物粉末(80％蛋白质)、棕榈油、乳糖和脱脂乳粉之外还包含实施例1的新的乳清衍生的粉末(WDP)，而样品“参考IF粉末”仅包含传统的IF组分。

“即饮”值是基于IF粉末样品和水的混合物，其量足以得到每1L最终饮品129g IF粉末。

实施例3-对实施例1的工艺和产品的进一步研究

进一步研究实施例1中描述的工艺，以定量在基于MF的细菌过滤期间营养素的损失。进一步测试实施例1的大规模实施，以进一步表征基于MF的细菌过滤对所得到的乳清衍生的产品的微生物质量的影响。

由于细菌过滤而导致的有价值的营养素的损失

在根据实施例1运行的两个批次的基于MF的细菌过滤步骤中计算质量平衡，以评估有价值的营养素诸如蛋白质和磷脂在多大程度上损失到细菌过滤的渗余物流中。结果总结在表2中。

表2由于基于MF的细菌过滤而导致的蛋白质、磷脂和脂肪的损失。对根据实施例1生产的两个批次(批次A和批次B)的计算。

本发明人惊讶地发现，仅约1％的磷脂和仅2-3％的蛋白质损失，而约7％的脂肪损失。脂肪的选择性损失和对磷脂的最小影响在本发明的乳清衍生的组合物的大多数应用中是有益的。

本发明人还已经发现，由于细菌过滤，磷脂相对于总固体的含量通常在乳清衍生的产物流中增加，这与表2的结果非常吻合，表2表明脂肪去除的趋势高于磷脂去除的趋势。本发明人另外观察到，当乳清衍生的产物流被细菌过滤时，多不饱和脂肪酸相对于总脂肪酸的含量也倾向于增加。

由于微滤而导致的菌落形成单位的减少

九个批次的WPC70进料在以下项中加工：a)实施例1的大规模实施，但没有细菌过滤(“仅HT”)；以及b)实施例1的相同大规模实施，包括基于MF的细菌过滤和随后的热处理两者(“MF+HT”)。随后分析所获得的乳清衍生的粉末关于其每克固体的菌落形成单位(CFU)的含量，并且结果在表3中报告。实施例1的大规模实施使用了与实施例1相同的参数设置，包括膜孔径和加热温度，但适用于加工较大量的WPC70进料。

表3基于MF的细菌过滤对在实施例1的大规模实施中加工的9个批次的WPC进料的影响。CFU＝菌落形成单位。“<100”的CFU含量甚至可以为零。

当应用基于MF的细菌过滤和热处理的组合时，乳清衍生的粉末的CFU含量始终小于100CFU/g固体。另外，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)(包括孢子)的含量始终小于10CFU/g固体。

除了CFU的显著减少之外，本发明人还观察到，内毒素的含量由于细菌过滤而令人惊讶地显著减少。因此，基于MF的细菌过滤和热处理的组合使得可以生产具有非常低浓度的内毒素的富含磷脂的乳清衍生的产品，并且甚至可以生产几乎不含内毒素的富含磷脂的乳清衍生的产品。这是令人惊讶的，因为内毒素具有预期将不被基于MF的细菌过滤保留的分子大小。本发明人推测，这种效果是由通过基于MF的细菌过滤去除微生物引起的，如果允许这些微生物留在乳清衍生的产品中，则这些微生物可能已经释放肠毒素。

结论：

本实施例中描述的结果记录了用于生产富含磷脂的乳清衍生的产品的工艺流可以有利地经历基于MF的细菌过滤和温和的热处理的组合。这允许有效减少富含磷脂的乳清衍生的产品的微生物含量，同时保持产品的高营养品质。

实施例4-实施例1的产品中乳衍生的细胞外囊泡的发现和研究

对实施例1的工艺流和最终WDP(呈重构形式)的基于电子显微镜的研究揭示了大量细胞外囊泡(EV)的存在，其令人惊讶地在乳清加工步骤以及还有基于MF的微生物减少和最终热处理中存活下来。

为了研究本发明的产品中EV相对于乳脂球膜材料的普遍性和丰度，根据分析2来分析实施例1的新的WDP，以估计WDP中来源于EV的磷脂来源的百分比。

程序

根据分析2来分析实施例1的新的WDP，该分析2被设计成确定EV衍生的磷脂(PL)相对于总PL的百分比。

结果与讨论

实施例1的WDP被发现包含相对于总PL的约59％的EV衍生的PL，这与实施例1的产物流和最终粉末中EV的上文提及的电子显微镜观察结果一致。在分离的乳EV、脱脂乳粉、乳脂(cream)和甜酪乳粉(sweet buttermilk powder，BMP)中发现的EV衍生的PL的可比百分比也在表4中示出。如将预期的，BMP和乳脂的磷脂主要由来源于乳脂球膜的磷脂组成，并且因此具有来自EV的相对小的贡献。在光谱的相对端中，脱脂乳粉和由鲜乳制备的EV分离物两者具有来自EV的非常高的磷脂贡献。本发明人还已经注意到，实施例1的WDP的MFGM衍生的PL和EV衍生的PL之间的重量比为约1:1。WP粉末的基本BTN/CD9比率(即，用于计算EV对总磷脂含量的贡献的BTN/CD9比率；更多细节参见分析2)与在人乳中发现的BTN/CD9比率非常良好地对应(参见例如Sari等人；Comparative Proteomics of Human Milk From EightCities in China During Six Months of Lactation in the Chinese Human MilkProject Study；Front.Nutr.,2021年8月12日Sec.Food Chemistry https://doi.org/10.3389/fnut.2021.682429)，表明新的WDP的磷脂具有与人乳磷脂库非常相似的组成和来源。

表4在不同乳制品中EV衍生的磷脂相对于总磷脂的百分比。根据分析2来确定百分比。

乳品流	EV衍生的PL相对于总PL的百分比(％)
		从新鲜牛乳中分离的纯EV	100％
脱脂乳粉	80％
		实施例1的新的WDP(根据本发明)	59％
乳脂	24％
		甜酪乳粉	5％
从新鲜牛乳中分离的纯MFGM	约0％

结论

本发明人已经观察到(通过电子显微镜成像)在实施例1的工艺流和重构的粉末产品中大量明显完整的细胞外囊泡。使用整合膜蛋白作为用于细胞外囊泡和乳脂球膜材料的标志物，本发明人已经确定实施例1的WDP的约59％的PL来源于细胞外囊泡。本发明的产品的磷脂组成似乎与人乳的磷脂组成非常相似，并且因此非常适合于例如婴儿营养品。

实施例5-在实施例1的产品中发现人乳微小RNA的存在

本发明人研究了EV的微小RNA(miRNA)负载量在多大程度上仍然存在于实施例1的乳清衍生(WD)的产物流中。miRNA是小的～22个核苷酸RNA序列，其可以通过序列互补、结合和随后的mRNA转录物降解来调节靶基因表达。乳细胞外囊泡是miRNA的丰富来源，并且科学文献指出乳miRNA是婴儿胃肠健康和免疫系统发育的中心调节因子(Leroux等人)。人类EV衍生的miRNA在胃肠道通道中存活下来，用于受体细胞在胃肠道中摄取(Liao等人)。另一方面，现今的常规婴儿配方产品在很大程度上缺乏牛乳miRNA(Leiferman等人)，这是由于常规的苛刻加工步骤导致EV分解并将miRNA释放到周围的液体乳清空间中，该液体乳清空间包含快速降解游离miRNA的内源性RNA酶。因此，将miRNA包含在EV内代表了防止miRNA的RNA酶降解的保护性环境并确保它们的持久性。因此，在特定加工步骤之前和之后对miRNA的定量可以用作最终婴儿配方产品中EV完整性和生物活性潜力的替代标志物。

程序

在本研究中分析以下四个样品：

-乳清衍生的液体(WDL)：实施例1的细菌过滤的热处理的MF渗透物(3次重复)

-WDP：实施例1的乳清衍生的粉末(3次重复)

-EV：使用尺寸排阻色谱法(根据doi.org/10.1080/20013078.2017.1294340)从脱脂乳中分离的实验室纯化的细胞外囊泡(EV)(3次重复)

-MFG：根据Hvarregaard等人从牛乳的乳脂相中分离的乳脂球(MFG)(3次重复)

使用RNeasy试剂盒(Qiagen)从四个样品中分离RNA。测量RNA浓度，并且使用Qiagen的QIAseq小RNA文库制备型试剂盒制备分离的RNA用于小RNA测序。使用Agilent生物分析仪2100对成品文库进行品质控制，并通过使用qPCR进行定量。将文库的三个技术重复汇集，并在Illumina NextSeq500测序仪上测序。

使用fastxtoolkit对来自测序的原始数据进行品质过滤和修整，并使用cutadapt去除衔接子(adaptor)。使用FastQC进行品质控制，以确保高品质分数和预期的长度概况。过滤后的测序读数被映射到相关转录组学数据集的连续列表，以便识别相关的小RNA。所涉及的映射顺序：

1.所有读数都映射在牛tRNA上

2.然后将与牛tRNA不匹配的读数映射在牛微小RNA(miRNA)上

3.将与tRNA和miRNA不匹配的读数针对牛小核RNA(snRNA)映射

4.剩余的读数被映射到牛核糖体RNA(rRNA)中

5.剩余的读数被映射到牛信使RNA(mRNA)。

结果

在样品中鉴定出独特的miRNA的数量。术语“独特的miRNA”用于指定看到多少不同的注释的miRNA，而不考虑表达水平。此外，通过测序读数的数量来评估相对丰度。

一般来说，独特的miRNA的数量在MFG样品和EV样品的重复中最稳定，而在WDP/WDL重复样品(液体和粉末)中观察到更多波动。然而，在WDL和WDP两者中检测到>180个独特的miRNA。

miRNA接下来根据基于测序读数的数量的丰度在每种样品类型中进行排序(从3个重复样品的平均值计算)。结果在表5中示出。根据Herwijnen等人，将鉴定的miRNA物质与来源于人乳的细胞外囊泡中20种最丰富的miRNA物质进行比较。比较测试的样品中前20种丰富的人类EV-miRNA和前20种丰富的牛EV-miRNA揭示了若干个重叠的miRNA，它们1)是相同的(人类相对于牛)，2)在最丰富的miRNA中，以及3)在如实施例1所描述的加工步骤之后保持完整性(在表5中加下划线的miRNA)。

由于miRNA对加工条件和乳清中的内源性RNA酶两者敏感，令人惊讶的发现，在温和纯化(实验室规模)的牛EV中鉴定的291种独特的miRNA中，这些独特的miRNA中的204种在WDL中检测到(70％)，并且这些独特的miRNA中的191种在WDP中检测到(66％)。此外，评估人乳EV中存在的前20种丰富的miRNA的特性(Herwijnen等人)，发现关于牛乳EV(温和实验室规模纯化的)以及WDL和WDP，在WDL和WDP两者中鉴定出相同miRNA的大量重叠(表5，加下划线的miRNA)。

表5在分析的样品中检测到的最丰富的miRNA(重复的平均值)。还在人乳的最高排序的miRNA中发现的miRNA已经被加下划线。WDL＝实施例1的乳清衍生液体产品；WDP＝实施例1的乳清衍生的粉末产品。

此外，观察到即使读数分布示出可变的miRNA百分比，每个样品中的miRNA表达水平在内部非常一致。这意味着可变的miRNA百分比似乎不影响miRNA概况。WDL和WDP与EV样品具有相似的概况，而所观察到的与MFG样品有关的miRNA概况更远。

结论

发现本发明的WDP和WDL两者包含大量的miRNA(温和实验室规模分离方法的65％-70％)，其中20种最丰富的miRNA物质中的5-6种与来自人乳EV的miRNA相同。已知乳衍生的miRNA在关于婴儿发育中起重要作用(参见例如Leroux等人)，并且因此本发明使得能够制备儿科营养品，并且特别是制备富含人乳中发现的miRNA物质的婴儿营养品。由于现今的常规婴儿配方产品在很大程度上缺乏miRNA，这代表了‘人性化差距’。本发明人已经记录在WDL和WDL两者中保存的EV结构和miRNA的事实，强调了采用WDL或WDP在具有完整miRNA含量的生物活性EV方面进一步人性化婴儿营养品的适用性。选定的参考文献：

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Claims (39)

1.一种制备乳清衍生的组合物的方法，所述乳清衍生的组合物富含磷脂和骨桥蛋白(OPN)，并且优选地还富含其他乳脂球膜组分，所述方法包括以下步骤：

a)提供液体进料，所述液体进料包括包含骨桥蛋白和α-乳清蛋白(ALA)的乳清蛋白以及源自乳清的磷脂，所述液体进料包含在相对于总蛋白质的0.2％w/w-2.0％w/w的范围内的骨桥蛋白总量，所述液体进料优选地具有在4.0-8的范围内、更优选地在5.5-7.5的范围内、甚至更优选地在5.7-7.0的范围内并且最优选地在5.9-6.6的范围内的pH。

b)使所述液体进料经历膜过滤以提供过滤渗余物和过滤渗透物，所述膜过滤被布置和操作成：

提供基于所述过滤渗余物的总蛋白质的骨桥蛋白含量，所述骨桥蛋白含量是基于所述液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少150％，以及

优选地，提供相对于所述过滤渗余物的总固体的总磷脂含量，所述总磷脂含量是相对于所述液体进料的总固体的至少200％，并且

提供基于所述过滤渗余物的总蛋白质的α-乳清蛋白含量，所述α-乳清蛋白含量是基于所述液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多75％，以及

任选地c)使所述过滤渗余物或至少包含源自所述过滤渗余物的脂质和蛋白质的产物流经历一个或更多个另外的加工步骤，所述一个或更多个另外的加工步骤优选地包括以下步骤中的一个或更多个：

i)微滤，

ii)浓缩，

iii)热处理，以及

iv)干燥。

2.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)的所述乳清是甜乳清或酸乳清。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体进料包含在相对于总固体的5％w/w-89％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的30％w/w-86％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的40％w/w-83％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的60％w/w-80％w/w的范围内的量的总蛋白质。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体进料包含在相对于总蛋白质的5％w/w-40％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-35％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-30％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的10％w/w-25％w/w的范围内的α-乳清蛋白总量。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体进料包含在相对于总蛋白质的0.2％w/w-0.9％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的0.3％w/w-0.8％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的0.4％w/w-0.8％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的0.4％w/w-0.7％w/w的范围内的骨桥蛋白总量，或者其中所述液体进料包含在相对于总蛋白质的1.0％w/w-2.0％w/w的范围内、更优选地在相对于总蛋白质的1.2％w/w-2.0％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总蛋白质的1.3％w/w-2.0％w/w的范围内并且最优选地在相对于总蛋白质的1.4％w/w-2.0％w/w的范围内的骨桥蛋白总量。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体进料包含在相对于总固体的0.2％w/w-5％w/w的范围内、更优选地在相对于总固体的0.4％w/w-4％w/w的范围内、甚至更优选地在相对于总固体的0.5％w/w-3％w/w的范围内并且最优选地在相对于总固体的1％w/w-3％w/w的范围内的磷脂总量。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体进料包含相对于总磷脂的至少50％w/w、更优选地至少54％w/w、甚至更优选地至少56％w/w并且最优选地至少58％w/w的量的来源于乳细胞外囊泡(乳EV)的磷脂总量。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体进料包含相对于总磷脂的50％w/w-75％w/w、更优选地54％w/w-73％w/w、甚至更优选地56％w/w-71％w/w并且最优选地58％w/w-70％w/w的量的来源于乳EV的磷脂总量。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体进料包含相对于总磷脂的至少76％w/w、更优选地至少80％w/w、甚至更优选地至少85％w/w并且最优选地至少90％w/w的量的来源于乳EV的磷脂总量。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体进料包含相对于所述液体进料的重量的0.2％w/w-8％w/w、更优选地相对于所述液体进料的重量的1％w/w-7％w/w、甚至更优选地相对于所述液体进料的重量的2％w/w-6％w/w并且最优选地相对于所述液体进料的重量的2％w/w-5％w/w的量的总蛋白质。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)的所述膜过滤被布置和操作成提供基于所述过滤渗余物的总蛋白质的α-乳清蛋白含量，所述α-乳清蛋白含量是基于所述液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多50％、更优选地基于所述液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多30％、甚至更优选地基于所述液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多20％并且最优选地基于所述液体进料的总蛋白质的α-乳清蛋白含量的至多10％。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)的所述膜过滤被布置和操作成提供基于所述过滤渗余物的总蛋白质的骨桥蛋白含量，所述骨桥蛋白含量是基于所述液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少180％、更优选地基于所述液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少200％、甚至更优选地基于所述液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少230％并且最优选地基于所述液体进料的总蛋白质的骨桥蛋白含量的至少250％。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)的所述膜过滤被布置和操作成提供相对于所述过滤渗余物的总固体的总磷脂含量，所述总磷脂含量是相对于所述液体进料的总固体的总磷脂含量的至少225％、甚至更优选地至少250％并且最优选地至少275％。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)的所述膜过滤涉及标称分子量截止值在100kDa-2000kDa的范围内、更优选地在300kDa-1600kDa的范围内、甚至更优选地在500kDa-1300kDa的范围内并且最优选地在700kDa-1000kDa的范围内的一个或更多个膜。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)的所述膜过滤涉及渗滤。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)的所述膜过滤：

在0.1巴-5巴、更优选地0.2巴-3巴并且最优选地0.3巴-1巴的跨膜压力的情况下操作，和/或

在1℃-60℃、更优选地2℃-30℃、甚至更优选地5℃-20℃并且最优选地8℃-15℃的温度操作。

17.一种乳清衍生的组合物，包含：

相对于总固体的10％w/w至30％w/w的量的总脂质，

相对于总固体的3％w/w至12％w/w的量的总磷脂，

在相对于总固体的1％w/w-10％w/w的范围内的灰分含量，

相对于总固体的至多10％w/w的量的乳糖；

相对于总固体的65％w/w至80％w/w的量的总蛋白质，

相对于总蛋白质的0.8％w/w-5％w/w的量的OPN。

18.根据权利要求17所述的乳清衍生的组合物，包含相对于总磷脂的至少50％w/w、更优选地相对于总磷脂的至少54％w/w、甚至更优选地相对于总磷脂的至少56％w/w并且最优选地相对于总磷脂的至少58％w/w的量的来源于乳EV的磷脂总量。

19.根据权利要求17-18中任一项所述的乳清衍生的组合物，包含相对于总磷脂的50％w/w-75％w/w、更优选地54％w/w-73％w/w、甚至更优选地56％w/w-71％w/w并且最优选地58％w/w-70％w/w的量的来源于乳EV的磷脂总量。

20.据权利要求17-18中任一项所述的乳清衍生的组合物，包含相对于总磷脂的至少76％w/w、更优选地至少80％w/w、甚至更优选地至少85％w/w并且最优选地至少90％w/w的量的来源于乳EV的磷脂总量。

21.根据权利要求17-20中任一项所述的乳清衍生的组合物，包含乳EV，并且优选地完整的乳EV。

22.根据权利要求17-21中任一项所述的乳清衍生的组合物，包含微小RNA(miRNA)、优选地存在于哺乳动物乳中的miRNA并且最优选地存在于牛乳和/或人乳中的miRNA。

23.根据权利要求22所述的乳清衍生的组合物，其中所述miRNA包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含选自由以下项组成的组的至少一种miRNA物质：let-7a-5p、let-7b、let-7f、let-7i、miR-103、miR-16b、miR-191、miR-199a-3p、miR-21-5p、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-423-3p和miR-486。

24.根据权利要求22所述的乳清衍生的组合物，其中所述miRNA包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含let-7a-5p、let-7b、let-7f、let-7i、miR-103、miR-16b、miR-191、miR-199a-3p、miR-21-5p、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-423-3p和miR-486。

25.根据权利要求22所述的乳清衍生的组合物，其中所述miRNA包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含选自由以下项组成的组的至少一种miRNA物质：let-7a-5p、let-7b、let-7f、miR-191、miR-21-5p和miR-26a。

26.根据权利要求22所述的乳清衍生的组合物，其中所述miRNA包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含miRNA物质let-7a-5p、let-7b、let-7f、miR-191、miR-21-5p和miR-26a。

27.根据权利要求17-26中任一项所述的乳清衍生的组合物，呈粉末的形式。

28.根据权利要求17-26中任一项所述的乳清衍生的组合物，呈液体的形式。

29.根据权利要求17-28中任一项所述的乳清衍生的组合物，通过根据权利要求1-27中一项或更多项所述的方法可获得。

30.根据权利要求17-29中任一项所述的乳清衍生的组合物作为食品成分的用途，优选地用于增加营养产品中OPN的含量，并且优选地其中所述营养产品是儿科产品，并且更优选地是婴儿配方产品；优选地以足以向所述营养产品提供至少10mg/100g所述营养产品的总固体、更优选地至少20mg/100g总固体、甚至更优选地至少30mg/100g总固体并且最优选地至少40mg/100g总固体的OPN含量的量使用所述乳清衍生的组合物。

31.根据权利要求17-29中任一项所述的乳清衍生的组合物作为食品成分的用途，优选地用于增加营养产品中细胞外囊泡的含量，并且优选地其中所述营养产品是儿科产品并且更优选地是婴儿配方产品。

32.根据权利要求17-29中任一项所述的乳清衍生的组合物作为食品成分的用途，用于增加营养产品中miRNA、优选地存在于哺乳动物乳中的miRNA并且最优选地存在于牛乳和/或人乳中的miRNA的含量，并且优选地其中所述营养产品是儿科产品并且更优选地是婴儿配方产品。

33.根据权利要求32所述的用途，其中所述miRNA包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含选自由以下项组成的组的至少一种miRNA物质：let-7a-5p、let-7b、let-7f、let-7i、miR-103、miR-16b、miR-191、miR-199a-3p、miR-21-5p、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-423-3p和miR-486。

34.根据权利要求32所述的用途，其中所述miRNA包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含let-7a-5p、let-7b、let-7f、let-7i、miR-103、miR-16b、miR-191、miR-199a-3p、miR-21-5p、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-423-3p和miR-486。

35.根据权利要求32所述的用途，其中所述miRNA包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含选自由以下项组成的组的至少一种miRNA物质：let-7a-5p、let-7b、let-7f、miR-191、miR-21-5p和miR-26a。

36.根据权利要求32所述的用途，其中所述miRNA包含多于一种miRNA物质，所述多于一种miRNA物质包含miRNA物质let-7a-5p、let-7b、let-7f、miR-191、miR-21-5p和miR-26a。

37.根据权利要求30-36中任一项所述的用途，其中所述乳清衍生的组合物以足以向所述营养产品提供至少0.1g/100g所述营养产品的总固体、更优选地至少0.5g/100g总固体、甚至更优选地至少2g/100g总固体并且最优选地至少3g/100g总固体的固体含量的量使用。

38.根据权利要求30-37中任一项所述的用途，其中所述乳清衍生的组合物以足以向所述营养产品提供0.1-30g/100g所述营养产品的总固体、更优选地0.5-20g/100g总固体、甚至更优选地2-15g/100g总固体并且最优选地3-12g/100g总固体的固体含量的量使用。

39.一种营养产品，所述营养产品优选地是儿科产品并且更优选地是婴儿配方产品，所述营养产品包含以这样的量的根据权利要求17-29中一项或更多项所述的乳清衍生的组合物，所述量足以：

提供至少10mg/100g所述营养产品的总固体、更优选地至少20mg/100g总固体、甚至更优选地至少30mg/100g总固体并且最优选地至少40mg/100g总固体的量的OPN，和/或

提供至少0.02微克/100g所述营养产品的总固体、更优选地至少0.05微克/100g总固体、甚至更优选地至少0.10微克/100g总固体并且最优选地至少0.15微克/100g总固体的量的维生素B12，和/或

向所述营养产品提供0.1-30g/100g所述营养产品的总固体、更优选地0.5-20g/100g总固体、甚至更优选地2-15g/100g总固体并且最优选地3-12g/100g总固体的固体含量。