CH717522B1 - Methylenblau und Riboflavin zur prophylaktischen und therapeutischen antiviralen Therapie. - Google Patents

Abstract

Virale epidemische Infektionen aufgrund von Influenza oder Coronaviren, insbesondere Influenza A und SARS-CoV-1- und -2-Viren, verursachen eine signifikante Morbidität und Mortalität. Die signifikante Mutationsrate dieser Gruppe von Viren macht bestehende Impfstoffe oder antivirale Medikamente oft unbrauchbar, was einen Bedarf an breit wirkenden, viralen DNA- oder RNA-Sequenz-unabhängigen antiviralen Medikamenten schafft. Diese Erfindung beschreibt die medikamentöse Neuausrichtung von Methylenblau und Riboflavin, zwei von der FDA zugelassenen Arzneimitteln mit einem ausgezeichneten Sicherheitsprofil. Unter Verwendung eines Virusneutralisationstests von H1N1 Influenza A und SARS-CoV-2 wird die signifikante virizide Aktivität beider Arzneimittel bei pharmakologischer Dosis und unter physiologischen Bedingungen gezeigt. Die prophylaktische und therapeutische Verwendung der Arzneimittel zur antiviralen Anwendung in einem Tiermodell wird beschrieben.

Description

VORHERIGE KUNST UND HINTERGRUND DER ERFINDUNG

[0001] Wu W. et al., 2014, „Method of inactivating virus in circular blood and its applications in treating viral diseases“, US-Patent 8 848 977, beschreiben ein In-vitro-Verfahren, bei dem Methylenblau zu Blut gegeben wird. Das Blut wird dann mit Hilfe einer Pumpe unter einer Lichtquelle zurückgeführt, bis das Virus vollständig neutralisiert ist. Eine Entfernungsvorrichtung wird verwendet, um den Photosensibilisator zu absorbieren, bevor das Blut erneut infundiert wird.

[0002] Floyd R. et al., „Antiviral therapy using thiazine dyes“, US-Patent 6,346,529, beschreiben ein in-vivo-Verfahren zur Behandlung des humanen Immundefizienzvirus (HIV) unter Verwendung von Thiazinfarbstoffen. Diese Erfindung ist auf die Anwendung eines Behandlungsverfahrens auf HIV beschränkt und erwähnt Methylenblau als bevorzugte Ausführungsform.

[0003] Floyd R. et al., „Thiazine dyes used to inactivate HIV in biological fluids“, US-Patent 5,827,644, beschreiben ein In-vitro-Verfahren unter Verwendung von Methylenblau und Licht zur Behandlung biologischer Flüssigkeiten gegen das humane Immundefizienzvirus.

[0004] Zepp Ch. et al., „Method for inactivating non-enveloped viruses using a viricide-potentiating agent with a photoactivatable virucide“, US-Patent 5,663,043, umfasst ein Verfahren zum Inaktivieren von nicht umhüllten Viren im Blut mit Hilfe eines photoaktivierbaren Virucids und der Verabreichung eines virizidpotenzierenden chemischen Mittels wie beispielsweise eines kationischen Lipopolyamins.

[0005] Floyd R. et al., „Thiazine dyes used to inactivate HIV in biological fluids“, US-Patent 5,571,666, beschreiben ein Verfahren zur Behandlung einer biologischen Flüssigkeit, die von einem Menschen zur Verabreichung an einen menschlichen Patienten erhalten wurde, der diese benötigt, um den humanen Immundefizienzvirus in der biologischen Flüssigkeit zu inaktivieren, umfassend die Schritte des Hinzufügens eines Thiazinfarbstoffs und Aussetzen der biologischen Flüssigkeit ans Licht.

[0006] Swartz M. R., „Method for inactivating viruses, bacteria, etc. in vitro and production of vaccines“, US-Patent 4,402,318. Ein Verfahren zur Inaktivierung von Infektionserregern in vitro wird offenbart, bei dem Methylenblau durch gleichzeitiges Anlegen eines elektrischen Feldes und Lichts aktiviert wird.

[0007] Es gibt eine Reihe von Veröffentlichungen, die Methylenblau und Licht oder Riboflavin und Licht verwenden, um virusinfizierte Blutprodukte in vitro zu behandeln. Neutralisierte Viren umfassen SARS-CoV-1, SARS-CoV2, MERS und HIV. Jin, C., et al., „Methylene blue photochemical treatment as a reliable SARS-COV-2 plasma virus inactivation method for blood safety and convalescent plasma therapy for the COVID-19 outbreak.“ ResearchGate-Preprint, DOI: 10.21203 / rs.3.rs-17718 / v1, 2020. Callahan, S. M., et al., „Controlled inactivation of recombinant viruses with vitamin B2“, J Virol Methods, 2008. 148 (1-2): p. 132-45. Eickmann, M., et al., „Inactivation of Ebola virus and Middle East respiratory syndrome coronavirus in platelet concentrates and plasma by ultraviolet C light and methylene blue plus visible light, respectively.“ Transfusion, 2018. 58 (9): p. 2202-2207. Keil, S. D., et al., „Inactivation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in plasma and platelet products using a riboflavin and ultraviolet light-based photochemical treatment.“ Vox Sang, 2020. Xu, J., et al., „Inactivation of SARS coronavirus in human plasma by methylene blue/light method.“ Jun shi yi xue ke xue yuan yuan kan = Bulletin der Akademie der Militärmedizinischen Wissenschaften, 2005. 29 (2): p. 142-144.

[0008] Der Stand der Technik verwendet energiereiche Lichtquellen, um Methylenblau bzw. Riboflavin zu aktivieren, um in vitro eine Verbindung mit virizider Aktivität zu erzeugen. Unter Verwendung ungewöhnlich langer Inkubationszeiten (Stunden statt Minuten) zwischen dem Arzneimittel und dem Virus in in-vitro Neutralisationsexperimenten wurden Bedingungen geschaffen, die die In-vivo-Situation simulieren. Zum ersten Mal und unerwartet konnte eine starke virizide Wirksamkeit im Dunkeln (hermetisch geschlossener Kasten) gegen Influenza N1H1-Virus und SARS-CoV-2 nachgewiesen werden. Diese Beobachtung ermöglicht die Verwendung der beiden Verbindungen in vivo, wo nur eine begrenzte Lichtmenge der Absorptionswellenlänge der Arzneimittel durch die Haut übertragen wird.

[0009] Die vorliegende Erfindung beschreibt Methylenblau und Riboflavin als breit wirkende Nukleinsäuresequenz-unabhängige antivirale Verbindungen für prophylaktische sowie therapeutische Anwendungen gegen Viren der Gattungen Influenza- und Coronavirus. Diese Viren haben ein erhebliches Mutationspotential und es ist daher schwierig, Impfstoffe und bis zu einem gewissen Grade auch antivirale Verbindungen für zukünftige Stämme zu entwickeln. Der Hauptmechanismus der beiden Moleküle beruht auf der Korrosion der Nucleobase Guanin sowie anderer viraler Moleküle durch Singulett-Sauerstoffbildung. Es ist daher zu erwarten, dass die beiden Moleküle gegen alle Influenza und Coronaviren virizid wirken.

[0010] Die zwei Arzneimittel sind die bevorzugte Ausführungsform für die prophylaktische und therapeutische Anwendung dieser Erfindung. Beide Moleküle, Methylenblau und Riboflavin, zeigen selbst bei sehr hoher Dosis keine bekannten schwerwiegenden Nebenwirkungen und sind von der FDA zugelassene Arzneimittel. Methylenblau färbt den Urin, die Sklera und bei weißhäutigen Probanden auch die Haut leicht blau, aber die Wirkung ist nach Absetzen der Behandlung reversibel. Riboflavin hat keine färbende Wirkung und kann für eine prophylaktische Anwendung bevorzugt werden. Beide Verbindungen sind von der FDA zugelassene Medikamente zur Verwendung außerhalb der Virologie.

[0011] Die Hauptziele unter den oben genannten Virusgattungen sind das Coronavirus SARS-CoV-1 mit schwerem akutem respiratorischem Syndrom und das Coronavirus SARS-CoV-2, die ein schweres akutes respiratorisches Syndrom (SARS) verursachen. Das Virus ist ein umhülltes einzelsträngiges RNA-Virus mit positivem Sinn, das durch Bindung an den ACE2-Rezeptor in die Wirtszelle gelangt. Das Virus entstand 2003 respektive 2019 und löste eine weltweite Pandemie aus. Ein weiteres ebenso wichtiges Hauptziel sind Influenzaviren, insbesondere Viren der Influenza A und insbesondere des Typs N1H1, die jährliche Grippe Epidemien oder Pandemien mit erheblicher Morbidität und Mortalität verursachen.

[0012] Unter der Bedingung der richtigen galenischen Formulierung, Dosis, Art der Anwendung und des Verabreichungsplans liefern die beiden Verbindungen eine überraschend starke, nicht virensequenzspezifische breite antivirale Aktivität. Beide Verbindungen können je nach Konzentration und Reaktionspartner eine Verbindung reduzieren oder oxidieren. Methylenblau kann Elektronen an seinem aromatischen Thiazinring aufnehmen, um sie zu Leukomethylenblau (MBH2) zu reduzieren, und Elektronen in Abhängigkeit von den Redoxzuständen und der Konzentration von Methylenblau auf andere Verbindungen übertragen. Singulettsauerstoff befindet sich in einem Quantenzustand, in dem alle Elektronen spingepaart sind und dem niedrigsten angeregten Zustand des zweiatomigen Sauerstoffmoleküls entsprechen. Methylenblau als Sensibilisator in Kombination mit Sauerstoff und einer Energiequelle führt zur Produktion von Singulettsauerstoff, einem sehr reaktiven Reaktionspartner, der DNA oder RNA durch Mechanismen wie Guaninoxidation korrumpiert und dadurch eine breite nicht sequenzspezifische virizide Aktivität aufweist. Weitere virizide Läsionen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, a) 8-Oxo-7,8-dihydroguanin (8-OxoGua) -Läsionen, b) modifizierte Carbonylreste auf Proteinen, c) Einzelstrangbrüche (ssb) im RNA-Genom d) RNA-Protein-Vernetzungen, wobei alle Läsionen gut mit der viriziden Aktivität korrelieren. Riboflavin hat einen ähnlichen Wirkmechanismus, der auf der Produktion von Sauerstoff-Singuletts basiert.

PRÄSENTATION DER ERFINDUNG, BESTE EMBODIMENTE

MATERIALIEN, BEGRIFFE, BEGRIFFSBESTIMMUNGEN

Methylenblau:

[0013] FDA-zugelassenes Medikament, NDA 204630. Methylenblau-Kation; 3,7-Bis (dimethylamino) phenothiazin-5-lum; Methylthioninium; Verbindungs-CID: 4139, MF: C 16 H 18 N 3 S + MW: 284,4 g / mol InChlKey: RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N, IUPAC Name: [7- (Dimethylamino) phenothiazin-3-yliden] -dimethylazan. Methylenblau; Verbindung CID: 6099, MF: C16H18ClN3S, MW: 319,9 g / mol InChlKey: CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M, IUPAC Name: [7- (Dimethylamino) phenothiazin-3-yliden] dimimylazan; Absorptionsmaximum: 668, 609 nm (PubChem-Datenbank). Methylenblau ist ein Redoxfarbstoff, der je nach Konzentration und Reaktionspartner eine Verbindung reduzieren oder oxidieren kann. Genauer gesagt kann es Elektronen an seinem aromatischen Thiazinring aufnehmen, um sie zu Leukomethylenblau (MBH2) zu reduzieren, und Elektronen in Abhängigkeit von den Redoxzuständen und der Konzentration von Methylenblau auf andere Verbindungen übertragen. Singulettsauerstoff ist Sauerstoff in einem Quantenzustand, in dem alle Elektronen spingepaart sind, entsprechend dem niedrigsten angeregten Zustand des zweiatomigen Sauerstoffmoleküls. Methylenblau oder Riboflavin als Sensibilisator in Kombination mit Sauerstoff und einer Energiequelle führen zur Produktion von Singulettsauerstoff, einem sehr reaktiven Reaktionspartner, der DNA oder RNA durch Mechanismen wie Guaninoxidation korrumpiert und dadurch eine breite nicht sequenzspezifische virizide Aktivität aufweist: Beobachtete chemische Läsionen in einem Q-Beta-Phagen-System umfassen: a) 8-Oxo-7,8-Dihydroguanin (8-OxoGua) -Läsionen, b) modifizierte Carbonylreste auf Proteinen, c) Einzelstrangbrüche (ssb) im RNA-Genom d) RNA-Protein-Vernetzungen, die gut mit der gemessenen viriziden Wirkung korrelieren. Schneider, J. E., Jr., et al., „Potential mechanisms of photodynamic inactivation of virus by methylene blue. I. RNA-protein crosslinks and other oxidative lesions in Q beta bacteriophage. “ Photochem Photobiol, 1998. 67 (3): p. 350-7.

[0014] Andere in der Literatur gefundene pharmakologische Wirkungen von Methylenblau können zu seiner viriziden Wirksamkeit beitragen oder eine klinisch vorteilhafte Wirkung haben: Verteilungsschock (hypovolämisch): Methylenblau erzeugt eine Vasokonstriktion im Verteilungsschock durch Hemmung der Stickoxidsynthase und der Guanylatcyclase. Dies ist eine begleitende und unerwartete vorteilhafte Wirkung von Methylenblau, da Virusinfektionen im Endstadium häufig den klinischen Status eines Verteilungsschocks aufweisen (Porizka, M., et al., „Methylene blue administration in patients with refractory distributive shock - a retrospective study.“ Sci Rep, 2020. 10 (1): S. 1828, Jang, DH, LS Nelson und RS Hoffman, „Methylene blue for distributive shock: a potential new use of an old antidote. “ J Med Toxicol, 2013. 9 (3): S. 242-9) Bei der Alzheimer-Krankheit: Methylenblau oxidiert Cysteinsulfhydrylgruppen auf Tau Protein, um das Tau Protein monomer zu halten. Eine präklinische Behandlungsstudie an Tauopathie-Mäusen berichtete über entzündungshemmende oder neuroprotektive Wirkungen, die durch das Nrf2 / Antioxidans Response Element (ARE) vermittelt werden. Ein anderer berichtete von einer unlöslichen Tau-Reduktion und einem Lern- und Gedächtnisvorteil, wenn das Medikament früh verabreicht wurde. Bei Methämoglobinämie: Methylenblau reagiert in roten Blutkörperchen unter Bildung von Leukomethylenblau, einem Reduktionsmittel für oxidiertes Hämoglobin, das das Eisen (III) - Ion (fe +++) wieder in sein sauerstofftragendes Ferrousstat (fe ++) umwandelt.

[0015] Als Antimalariamittel: Methylenblau, ein spezifischer Inhibitor der P. falciparum-Glutathionreduktase, kann die CQ (Chloroquin) -Resistenz umkehren und verhindert die Polymerisation von Häm zu Hämozoin ähnlich wie 4-Amino-Chinolin-Antimalariamittel.

[0016] Für Ifosfamid-induzierte Neurotoxizität: Methylenblau fungiert als alternativer Elektronenakzeptor. Es wirkt, um die durch Glukoneogenese in der Leber verursachte NADH-Hemmung umzukehren, während es die Umwandlung von Chlorethylamin in Chloracetaldehyd blockiert. Darüber hinaus hemmt es verschiedene Aminoxidaseaktivitäten, wodurch auch die Bildung von Chloracetaldehyd verhindert wird.

Riboflavin:

[0017] Vitamin B2, von der FDA zugelassenes Arzneimittel, NDA 203324. Verbindung CID: 493570, MF: C17H2ON4O6 MW: 376,4 g / mol, InChlKey: AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N, IUPAC Name: 7,8-Dimethyl-10 - [(2S, 3S, 4R) -2,3,4,5-Tetrahydroxypentyl] benzo [g] pteridin-2,4-dion. UV-Max-Absorption: 220-225 nm, 266 nm, 371 nm, 444 nm, 475 nm ... Wässrige Lösungen sind gelb und zeigen eine grüne Fluoreszenz mit Max bei 565 nm, O'Neil, M. J. (Hrsg.). Der Merck-Index - Eine Enzyklopädie der Chemikalien, Drogen und Biologika. Whitehouse Station, NJ: Merck und Co., Inc., 2006., p. 1413. Riboflavin ist ein Vorläufer der Coenzyme Flavinmononukleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD). Diese Coenzyme sind von entscheidender Bedeutung für die normale Gewebeatmung, die Pyridoxinaktivierung, die Umwandlung von Tryptophan in Niacin, den Fett-, Kohlenhydrat- und Proteinstoffwechsel sowie die durch Glutathionreduktase vermittelte Entgiftung. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist Riboflavin ein Photosensibilisator, der Singulettsauerstoff erzeugt, der virale DNA und RNA denaturiert. Wir nehmen an, dass der wichtigste Schritt für seine virizide Aktivität darin besteht, Guanin in seine 8-Oxo-7,8-dihydroguanin-Form zu korrodieren, ein Effekt, der auf Singulettsauerstoff basiert, wobei die Photoaktivierung die virizide Wirkung verstärkt.

Epidemie Pandemie:

[0018] Die rasche Ausbreitung einer Krankheit auf eine große Anzahl von Menschen in einer bestimmten Bevölkerung innerhalb kurzer Zeit ist eine Epidemie. Wenn sie mehrere Länder umfasst, spricht man von einer Pandemie.

Influenzavirus, Coronavirus:

[0019] Humane Influenza A-, B- und C-Viren verursachen saisonale Epidemien. Influenza A ist das typische Grippepandemievirus. Influenzaviren enthalten sieben oder acht Stücke segmentierter Negativ-Sense-RNA. Influenza-A-Viren werden nach Hämagglutinin (H) und Neuraminidase (N) auf ihrer Oberfläche in Subtypen unterteilt. Methylenblau und Riboflavin sind virizid, basierend auf einem Mechanismus, der nicht virensequenzspezifisch ist, und die mit dem N1H1-Stamm gezeigte virizide Aktivität ist theoretisch für alle Stämme gültig.

[0020] Coronaviren haben ein Kapsid und enthalten ein einzelsträngiges RNA-Genom mit positivem Sinn. Es gibt 7 Stämme, die Menschen infizieren, von denen 3 beim Menschen schwere Krankheiten verursachen können: Coronavirus im Zusammenhang mit dem respiratorischen Syndrom im Nahen Osten (MERS-CoV oder MERS), Coronavirus 1 mit schwerem akutem respiratorischem Syndrom (SARS-CoV-1), Coronavirus mit schwerem akutem respiratorischem Syndrom 2 (SARS-CoV-2) oder SARS bezeichnen beide. Methylenblau und Riboflavin sind virizid, basierend auf einem Mechanismus, der nicht virensequenzspezifisch ist, und die mit dem SARS-CoV-2-Stamm gezeigte virizide Aktivität ist aus theoretischen Gründen für alle Corona-Stämme gültig.

[0021] Prophylaktische Anwendung und therapeutische Anwendung einer antiviralen Verbindung: Im ersten Fall ist der Proband noch nicht infiziert und im zweiten Fall ist der Proband bereits infiziert. Die Kandidaten zur prophylaktischen Anwendung sind insbesondere die Gruppe von Personen, von der bekannt ist, dass sie einem erhöhten Risiko für Virusinfektionen ausgesetzt ist, wie z. B. das medizinische Personal, das virusinfizierte Personen behandelt, Personen mit Komorbiditäten (Diabetes, Leukämie, Immunsuppression usw.) oder Personen im fortgeschrittenen Alter behandelt. Das Fehlen von Nebenwirkungen ist für eine prophylaktische Anwendung besonders wichtig, da es sich in den meisten Fällen um eine gesunde Bevölkerung handelt. Bei prophylaktischen Dosen hat Riboflavin keine bekannten Nebenwirkungen. Methylenblau färbt Urinblau und nach längerer Prophylaxe auch Haut und Sklera. Dieser Effekt ist vollständig reversibel.

Virusneutralisationstest, Plaque Forming Unit (PFU):

[0022] Eine Plaque bildende Einheit ist ein Maß, das in der Virologie verwendet wird, um die Anzahl von Viruspartikeln zu beschreiben, die Plaques pro Volumeneinheit bilden können und eine Monoschicht anfälliger Zellen infizieren. PFU wird häufig als Maß für die Viruswirksamkeit in in-vitro- und in-vivo-Experimenten verwendet. Beispielsweise zeigt eine Lösung des Influenzavirus mit einer Konzentration von 1.000 PFU / Mikroliter an, dass 1 Mikroliter der Lösung genügend Viruspartikel enthält, um 1000 infektiöse Plaques in einer Zellmonoschicht zu produzieren. Die Zählung von Plaques in der Monoschicht von Zellen wird heutzutage häufig durch eine immunologische Färbung ersetzt, die das Virus in infizierten Zellen mit Hilfe von enzymmarkierten Antikörpern nachweist, wodurch das Verfahren beschleunigt wird.

Virizide Aktivität, virizide Wirksamkeit:

[0023] Dies beschreibt die pharmakologische Wirkung einer Verbindung, die die Infektiosität des Virus verringert. Das typische Maß in vitro ist daher die Zählung von PFU in einem Virusneutralisationstest und LD50 oder eines klinischen Ersatzes wie erhöhter Temperatur in in-vivo-Tests. Die Zählung von PFU ist auch in in-vivo-Experimenten möglich: Nach der Infektion kann ein Organ homogenisiert und das Verhältnis von PFU zu Gewicht bestimmt werden. Darüber hinaus verwendet der Fachmann allgemein anerkannte statistische Verfahren, um LD50 in PFU auszudrücken und umgekehrt.

Passive Immunisierung:

[0024] Historisch gesehen wird bei der passiven Immunisierung einem Patienten ein Rekonvaleszenzserum oder Serum, das durch aktive Immunisierung hergestellt wurde und neutralisierende Antikörper enthält, zum Schutz vor einer Krankheit verabreicht. Das Rekonvaleszenzserum kann durch Neutralisierung monoklonaler Antikörper gegen das Virus ersetzt werden. Methylenblau oder Riboflavin können in Kombination mit passiver Immunisierung angewendet werden. Methylenblau und Riboflavin können gleichzeitig mit poly- oder monoklonalen Antikörpern verabreicht werden. Es ist bekannt, dass Antikörper nahe der Bindungsseite eine katalytische Stelle aufweisen, die in Gegenwart von Wasser Singulettsauerstoff produzieren kann. [1, 2] Datta, D., et al., Mechanism for antibody catalysis of the oxidation of water by singlet dioxygen. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99 (5): p. 2636-41. Wentworth, P., Jr., et al., Antibody catalysis of the oxidation of water. Science, 2001. 293 (5536): p. 1806-11. Das Vorhandensein von Singulett-Sauerstoff produzierenden Molekülen wie Methylenblau kann diesen Effekt verstärken.

[0025] Lichtquelle, emittierende Wellenlänge einer Lichtquelle und Absorptionswellenlänge von Methylenblau oder Riboflavin: Die Beispiele zeigen eine Verstärkung der viriziden Wirkung von Methylenblau und Riboflavin in Gegenwart einer Lichtquelle, die Licht innerhalb des Absorptionsspektrums der Arzneimittel emittiert. In den Beispielen ist bekannt und gezeigt, dass die Energieübertragung durch Licht die Singulett-Sauerstoffproduktionskapazität der Arzneimittel erhöht, was zu einer erhöhten Schädigung von RNA und DNA führt. Licht mit den Absorptionsmaxima von Methylenblau und Riboflavin wandert 4 bis 5 mm unter die Haut, ein Bereich unter der Epidermis, der bereits gut vaskularisiert ist. Es ist daher anzunehmen, dass eine externe Lichtquelle, die Licht mit der Absorptionswellenlänge der in vivo zu Arzneimitteln emittierenden Mittel emittiert, teilweise in die Haut eindringt und die virizide Wirkung verstärkt. Asche C, Dubec M, Donne K, Bashford T. Effect of wavelength and beam width on penetration in light-tissue interaction using computational methods. Laser Med Sci. 2017; 32 (8): 1909-1918.

Angewandte Dosis Methylenblau oder Riboflavin:

[0026] Die Erfindung beschreibt eine Verbindung, die Methylenblau und / oder Riboflavin enthält, zur Prophylaxe und / oder Behandlung von Influenza- oder Coronavirus-Infektionen von Menschen, die aufgrund ihrer viriziden Wirksamkeit nach oraler, intravenöser, subkutaner, intramuskulärer, rektaler oder vernebelnder Anwendung wirken. wobei die tägliche Dosis nicht weniger als 10 Mikrogramm und nicht mehr als 20 Milligramm pro kg für die beiden Verbindungen zusammen beträgt.

Virologische Methoden:

[0027] Der Fachmann ist mit den hier beschriebenen weit verbreiteten virologischen Verfahren vertraut. Das Virology Methods Manual, 1996, herausgegeben von Brian Mahy und Hillar Kangro, ist eines von vielen umfassenden Handbüchern für die Methoden zum Studieren, Manipulieren und Erkennen von Viren. Das Buch vervollständigt die prägnante Beschreibung der hier angegebenen Methoden und Verfahren und integriert deren Inhalt.

BEISPIELE

Beispiel 1, Methylenblau, galenische Formel für verschiedene Anwendungswege:

Formel für die Injektion:

[0028] Methylthioniniumchlorid wird in destilliertem Wasser als Lösung zur intravenösen Injektion in einer Konzentration von 5 mg / ml verdünnt. Die lonenstärke von reinem Wasser wird mit KCl eingestellt, da Chloridionen die Löslichkeit verringern. Der pH-Wert wird auf 4,5 eingestellt, da die Langzeitstabilität bei höherem pH-Wert beeinträchtigt wird. Die Lösung wird in dunklen Glasampullen mit einem Volumen von 5, 10 und 20 ml aufbewahrt. Dunkles Glas aufgrund der Lichtempfindlichkeit von Methylenblau. Die Lösung ist mit 5% iger Glucose- oder 5% iger Dextroselösung kompatibel, jedoch aufgrund des Fällungsrisikos nicht mit 0,9% iger Kochsalzlösung.

[0029] Die empfohlene Dosis für die virizide Behandlung beträgt 3 mg / kg bei Erwachsenen pro 24 Stunden. Wenn es als Bolus verabreicht wird, sollte es über einen Zeitraum von mindestens 5 Minuten angewendet werden. Die maximale Dosis sollte 5 mg / kg nicht überschreiten. Bei eingeschränkter Nierenfunktion ist Vorsicht geboten. Die Empfindlichkeit gegenüber Thiazinfarbstoffen und der G-6-PD-Mangel sind weitere Kontraindikationen. Pulsoximeter können nicht verwendet werden.

Formel für die orale Anwendung:

[0030] Die Formel für die Injektion kann auch oral eingenommen werden. Die Bioverfügbarkeit von Methylenblau nach oraler Verabreichung beträgt 72%, mit maximalen Plasmakonzentrationen nach zwei Stunden und einer Eliminationshalbwertszeit von 18 Stunden. Die Halbwertszeit von Methylenblau beim Menschen beträgt fünf bis 10 Stunden. Die empfohlene Dosis pro kg für 24 Stunden ist identisch mit der für die Injektion empfohlenen Dosis. Die ausgezeichnete Resorption von Methylenblau nach oraler Einnahme macht die orale Einnahme zu einer attraktiven Wahl. Methylenblau kann natürlich auch in trockener Form in Kombination mit einem Füllstoff als Tablette oder Kapsel konfektioniert werden.

Formel für langsame Freisetzung zur oralen Anwendung:

[0031] 300 mg Methylenblau werden als Tabletten mit langsamer Freisetzung mit 2,1 g einer Mischung aus pharmazeutischer Glasur, Reiskleie, Hydroxypropylmethylcellulose, Dicalciumphosphat, Stearinsäure, Magnesiumstearat und Siliciumdioxid konfektioniert. Die maximale Plasmakonzentration ist signifikant verlängert.

Formel zur Anwendung mit einem Zerstäuber:

[0032] Ein Vernebler ist ein Arzneimittelabgabegerät, das zur Verabreichung von Medikamenten in Form eines in die Lunge eingeatmeten Nebels verwendet wird. Klassische Anwendungen sind die Behandlung von Asthma, Mukoviszidose, COPD und anderen Atemwegserkrankungen oder -störungen. Vernebler verwenden Sauerstoff, Druckluft oder Ultraschall, um Lösungen und Suspensionen in kleine Aerosoltröpfchen aufzubrechen, die vom Mundstück des Geräts eingeatmet werden. Die flüssige Methylenblau-Formel zur Injektion kann direkt oder mit Wasser gefüllt werden, das in das Flüssigkeitsreservoir des Zerstäubers verdünnt ist. Die Anwendung mit einem Zerstäuber kann mit einer Sauerstoffverabreichung und einer Sauerstoffmaske kombiniert werden. Diese Art der Anwendung ist besonders attraktiv im Falle einer viralen Lungeninfektion. Es ist bekannt, dass Methylenblau die virusinduzierte Lungenfibrose minimiert, was eine zusätzliche wertvolle therapeutische Wirkung darstellt.

Beispiel 2, Riboflavin, galenische Formel für verschiedene Anwendungswege:

Formel zur oralen Anwendung:

[0033] Riboflavin wird von Dutzenden verschiedener Anbieter als OTC-Medikament (Over The Counter) als Vitamin B2 verkauft, typischerweise als 100-mg-Tabletten zu sehr wettbewerbsfähigen Preisen. Die Resorption von Vitamin B2 pro Anwendung ist ab einer oralen Dosis, die einem Erwachsenen verabreicht wird, auf jeweils etwa 27 mg begrenzt. Eine regelmäßige Mehrfachaufnahme ist erforderlich, um eine virizide Dosis von 3 mg /kg/ Tag für einen Erwachsenen zu erhalten. Alternativ und oder in Kombination mit Mehrfachaufnahme verbessert eine Formel mit langsamer Freisetzung die Aufnahme erheblich. Nahezu nichts von dem Medikament wird in Leber, Milz, Herz und Nieren gespeichert und überschüssiges Riboflavin wird unverändert im Urin ausgeschieden. Das Arzneimittel zeigt eine zweiphasige Pharmakokinetik mit anfänglichen und terminalen Halbwertszeiten von 1,4 und 14 Stunden (D. B. McCormick, in Encyclopedia of Toxicology, Third Edition, 2014).

Formel für die intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Anwendung:

[0034] Farbiges Glas ist für die Lagerung obligatorisch, da die Flavine in Lösung lichtempfindlich sind. Riboflavin ist wasserlöslich (1 g löst sich je nach Kristallstruktur in 3 - 15 l Wasser) und in absolutem Alkohol schwer löslich (45 mg Riboflavin lösen sich in 1 l absolutem Ethanol). Riboflavin ist in verdünnten Alkalien sehr gut löslich, aber instabil. Neutrale und saure Riboflavinlösungen sind im Dunkeln stabil, zersetzen sich jedoch bei 27 ° C und pH 6 monatlich um 3%. Vitamin B2 zur intra-muskulären oder intra-venösen Anwendung ist im Handel in einer Konzentration von typischerweise 5 mg / ml in einer Wasser-NaCI-Lösung (z. B. Vitamin B2, Streuli Pharma AG, Schweiz) erhältlich.

[0035] Formel zur Anwendung mit einem Zerstäuber: wie oben für Methylenblau.

Beispiel 3: In-vitro-Viruswirksamkeit von Methylenblau gegen Influenza N1H1 und SARS-CoV-2-Virus:

[0036] Für die folgenden In-vitro-Experimente ist die Inkubationszeit des Virus mit dem antiviralen Arzneimittel besonders lang, 16 Stunden für das Experiment gamäss Abbildung 1 und 20 Stunden für Abbildung 2, was es ermöglichte, die starke antivirale Wirksamkeit des Arzneimittels auch in Abwesenheit von Licht zu belegen.

[0037] Abbildung 1 zeigt die virizide Wirksamkeit von niedrig dosiertem Methylenblau (0,25 mg / l), das mit H1N1-Influenzavirus 16 Stunden lang unter weißem Licht (sterile Haube, Leuchtstofflampe) bzw. ohne weißes Licht (sterile Haube, in geschlossener Box) inkubiert wurde. Die y-Achse zeigt logarithmische PFU-Einheiten, die x-Achse unterschiedliche Versuchsbedingungen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Balkenhöhe und die virizide Wirksamkeit umgekehrt proportional sind. Das Fehlen eines Balkens bedeutet kein nachweisbares Virus und daher maximale virizide Wirksamkeit. Ein Balken in maximaler Höhe bedeutet keine Abschwächung der PFU und daher keine virizide Wirkung. Abbildung 1 zeigt keine virizide Wirkung in Abwesenheit von Licht. Die sehr diskrete Abnahme der viriziden Wirkung in Gegenwart von Licht und nicht virusspezifischem Immunglobulin ist sehr wahrscheinlich auf die unspezifische Adsorption des geladenen Methylenblau-Moleküls an Immunglobulin zurückzuführen.

[0038] Abbildung 2 zeigt die virizide Wirksamkeit einer physiologischen Dosis Methylenblau (2,5 mg /l), die mit SARS-CoV-2-Virus 20 Stunden unter weißem Licht bzw. ohne weißes Licht inkubiert wurde. Unter diesen Bedingungen gibt es eine vollständige virizide Wirkung (keine Balken) mit Methylenblau und Methylenblau plus IgG, selbst wenn kein Licht vorhanden ist. Die mässige pseudo-virizide Effekt in Gegenwart von Licht in der Kontrolle ohne Immunglobulin und Kontrolle mit Immunglobulin beruht auf dem Effekt einer erhöhten Temperatur unter der sterilen Haube aufgrund der Lichtquelle nach 20 Stunden Inkubation.

[0039] Bei der Inkubation wie oben beschrieben wurde der Virustiter wie folgt auf MDCK (Madin-Darby Canine Kidney Cells) bestimmt. MDCK-Zellen wurden 24 h im Voraus in 96-Well-Platten vorplattiert. Reihenverdünnungen jeder Mischung wurden doppelt auf eine konfluente Zellschicht für 2 Stunden bei 37 ° C inokuliert. Nach der Virusabsorption wurde das virale Inokulum (200 ul) entfernt, die Zellen wurden gewaschen und frisches DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium) + GlutaMAX TM (Thermofisher-Katalognummer 35050061) wurde zugegeben. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37 ° C wurden infizierte Zellen durch einen immunzytochemischen (ICC) Assay unter Verwendung eines Maus-mAb-Influenza-A-Antikörpers (Light Diagnostics) und eines Anti-Maus-HRP-konjugierten Antikörpers nachgewiesen, und die Färbung wurde unter Verwendung des DAB-Substrats sichtbar gemacht (Abbildung 1). Für SARS-CoV-2 wurden Vero-E6-Zellen 24 Stunden im Voraus in 96-Well-Platten vorplattiert. Serienverdünnungen jeder Mischung wurden im Duplikat mit 1:10 Verdünnungen in 180 mikro-liter inokuliert. Nach 72-stündiger Inkubation wurden die Platten mit 4% Paraformaldehyd fixiert, mit Kristallviolett angefärbt und die Vertiefungen wurden nach Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer zytopathischen Wirkung bewertet und der Titer mit der TCID50-Methode berechnet. Die Nachweisgrenze (LOD) für SARS CoV-2 beträgt 176 für alle TCIDs. Alternativ wurde nach 16-stündiger Inkubation der Gemische ein Plaque-Assay durchgeführt. VERO-E6 wurden 24 Stunden im Voraus in einer Platte mit 12 Vertiefungen ausplattiert, die Gemische wurden seriell verdünnt und die Zellen wurden 1 Stunde lang mit 300 mikro-liter infiziert. Anschließend wurde das Inokulum entfernt und ausgewaschen und die Zellen wurden mit 1 ml DMEM + GlutaMAX ™, ergänzt mit 1,2% Avicel 581 (Dupont Pharma) und 5% FBS (Fetal Bovine Serum), überschichtet. Nach 72 h Inkubation wurden die Platten mit 4% Paraformaldehyd fixiert, mit Kristallviolett angefärbt und Plaques gezählt. Für die Belichtung wurde das Kaltkathoden-Fluoreszenzlicht (220 W) der sterilen Haube verwendet. PRIVIGEN sol perf 2,5 g / 25 ml i. v. (CSL Behring AG) wurde als Quelle für menschliches Immunglobulin (IG) verwendet. Dieses Serum enthält keine antiviralen Antikörper. Die statistische Analyse wurde mit der Prism-Software (Prism 8, GraphPad) durchgeführt. Experimente wurden in einer von den Behörden genehmigten BSL-3-Einrichtung durchgeführt. Ergebnisse mit Riboflavin sind nicht gezeigt, aber eine ähnliche Wirksamkeit wird erwartet.

[0040] Beispiel 4, in vivo antivirale Wirksamkeit von Methylenblau und Riboflavin. Prophylaxe und Behandlung von Balb / c-Mäusen nach InfluenzaN1H1-Infektion mit Methylenblau: Für alle Mäuse außer Kontrollen: Methylenblau (MB, C16H18CIN3S * 3 H2O, Sigma) wurde über das mit Saccharin (1 Tablette pro 200 ml) ergänzte Trinkwasser verabreicht. Mäuse erhielten eine tägliche MB-Dosis von 5 mg / kg, basierend auf einem täglichen Trinkvolumen von ~ 5-6 ml und einem Körpergewicht von 25-35 g. Die Kontrollgruppe erhielt Trinkwasser mit Saccharin, jedoch ohne Methylenblau.

Prophylaktische Behandlung mit Methylenblau (Behandlung vor der Virusbelastung):

[0041] Gruppen von 6 weiblichen Balb / c-Mäusen (8-10 Wochen alt) erhielten am Tag 0 (Tag 0) Methylenblau in Trinkwasser und wurden am Tag 10 intranasal mit 105 TCID50 pro Tier von Influenza A N1H1 infiziert, und die Lungen wurden drei Tage entfernt später und zur Bestimmung des Virustiters bei ≤ -60 ° C eingefroren. Die Kontrollgruppe von 6 weiblichen Balb / c-Mäusen (8-10 Wochen alt) erhielt die gleiche Behandlung, aber das Trinkwasser enthielt kein Methylenblau.

Therapeutische Behandlung mit Methylenblau (Behandlung nach Virusbelastung):

[0042] Gruppen von 6 weiblichen Balb / c-Mäusen (8-10 Wochen alt) erhielten am Tag 11 (Tag 11) Methylenblau in Trinkwasser und wurden am Tag 10 intranasal mit 105 TCID50 pro Tier von Influenza A N1H1 belastet, und die Lungen wurden drei Tage entfernt später und zur Bestimmung des Virustiters bei - 60 ° C eingefroren. Die Kontrollgruppe von 6 weiblichen Balb / c-Mäusen (8-10 Wochen alt) erhielt die gleiche Behandlung, aber das Trinkwasser enthielt kein Methylenblau.

Vorbereitung der Lungenproben für die Virustitration:

[0043] Die Mäuse wurden eingeschläfert und die Lungen wurden am Tag 3 nach der Exposition mit dem Influenza-H1N1-Virus entfernt. Diese Gewebeproben wurden bei <-60 ° C gelagert, bis sie in Homogenisierungsröhrchen überführt wurden, die 1 ml Zellmedium enthielten, das mit Antibiotika ergänzt war. Die Lungen wurden zweimal bei 5000 U / min für 20 Sekunden mit einer Pause von 10 Sekunden zwischen den Intervallen mit einem Gewebehomogenisator homogenisiert. Der infektiöse H1N1-Virustiter in homogenisierten Lungenproben wurde durch einen TCID50-Assay bestimmt, der durch Titration an Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) -Zellen wie oben beschrieben durchgeführt wurde. Die Ergebnisse des TCID50-Assays zeigen eine signifikante virizide Wirksamkeit von Methylenblau bei prophylaktischer und therapeutischer Anwendung. Analoge Ergebnisse werden erwartet, wenn Methylenblau durch Riboflavin ersetzt wird.

Claims (2)

1. Zusammensetzung, die Methylenblau und/ oder Riboflavin enthält, zur Prophylaxe oder Behandlung von Influenza Infektionen, insbesondere Influenza A Infektionen und/oder Coronavirus-Infektionen, insbesondere SARS-CoVI, SARS-CoV2, MERS-Virus Infektionen von Menschen, die aufgrund ihrer viriziden Wirksamkeit nach oraler, intravenöser, subkutaner, intramuskulärer, rektaler oder Anwendung eines Verneblers wirkt und deren tägliche Dosis nicht weniger als 10 Mikrogramm und nicht mehr als 20 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag beträgt.

2. Zusammensetzung, nach Anspruch 1, für eine orale Applikation, wobei die Konfektionierung von 300 mg Methylenblau mit 2.1 g einer Mischung aus pharmazeutischer Glasur, Reiskleie, Hydroxypropylmethylcellulose, Dicalciumphosphat, Stearinsäure, Magnesiumstearat und Siliciumdioxid eine verzögert auftretende maximale Plasmakonzentration des aktiven Prinzipes im Körper bewirkt.