CH710313B1 - Anti-Tumor-Medikament mit aktivem Targeting und dessen Herstellungsmethode. - Google Patents

Anti-Tumor-Medikament mit aktivem Targeting und dessen Herstellungsmethode. Download PDF

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CH710313B1
CH710313B1 CH00295/16A CH2952016A CH710313B1 CH 710313 B1 CH710313 B1 CH 710313B1 CH 00295/16 A CH00295/16 A CH 00295/16A CH 2952016 A CH2952016 A CH 2952016A CH 710313 B1 CH710313 B1 CH 710313B1
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Wu Aiguo
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Ningbo Institute Of Materials Tech & Engineering Chinese Acadamy Of Sciences [Cn/Cn]
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Anti-Tumor-Medikament mit aktivem Targeting und eine Herstellungsmethode dafür. Konkret offenbart die vorliegende Erfindung einen Komplex, der Nanoträger und an die Oberfläche des Nanoträgers gekoppelte Targeting-Moleküle umfasst. Das Targeting-Molekül ist ausgewählt aus: [D-Arg25]-NPY, [D-His26]-NPY, [D-Arg25, D-His26]-NPY, und besitzt eine Partikelgrösse kleiner 200 nm sowie einen Polydispersitätsindex (PDI) kleiner 0,5. Ferner offenbart die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, ein Medikament, deren Herstellungsmethode sowie deren Verwendung. Die Zusammensetzung und das Medikament der vorliegenden Erfindung zeigen einen starken Targetingeffekt gegen Tumorzellen und können Anti-Tumor-Medikamente gerichtet in Tumorzellen transportieren und damit effektiv die Medikamentenkonzentration in Tumorzellen erhöhen, und sie weisen einen starken Abtötungseffekt bei Tumorzellen auf und haben nahezu keine toxischen Nebenwirkungen auf normale Gewebe und Zellen.

Description

Beschreibung
Technisches Gebiet [0001] Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der pharmazeutischen Technologie und insbesondere ein Anti-Tu-mor-Medikament mit aktivem Targeting und eine Herstellungsmethode dafür.
Hintergrund [0002] Ein Medikament mit aktivem Targeting ist eine Art Medikament oder ein Medikamenten-Träger, dessen Oberfläche durch ein aktiv an ein Ziel bindendes Molekül (z.B. ein Antikörper oder Ligand etc.) modifiziert ist, sodass es an spezifische Antigene oder Rezeptoren bestimmter Gewebe oder Zellen binden kann und somit die Funktion des Abzielens auf spezifische Zellen und Gewebe erreicht. Wegen der hohen Spezifität, hohen Selektivität und hohen Affinität zwischen Antigen und Antikörper oder zwischen Rezeptor und Ligand weist aktives Targeting eine höhere Effizienz als passives Targeting auf, daher werden Drug-Targeting-Systeme mit aktivem Targeting im In- und Ausland sehr aktiv untersucht.
[0003] Medikamente mit aktivem Targeting, die basierend auf dem Prinzip der spezifischen Bindung zwischen einem Antigen und einem Antikörper entworfen sind, weisen noch verschiedene Probleme auf, zum Beispiel niedrige effektive Konzentration der zielgeführten Medikamente, starke rassenabhängige Spezifität, hohe Immunogenität und hohe Kosten für Forschung und Entwicklung.
[0004] Indes sind für Medikamente mit aktivem Targeting, die basierend auf dem Prinzip der spezifischen Bindung zwischen Ligand und Rezeptor entworfen sind, hohe Selektivität, keine rassenabhängige Spezifität, keine Immunogenität, hohe Stabilität sowie geringe Kosten charakteristisch; deshalb wurden sie zum gegenwärtigen Brennpunkt beim Entwurf von auf Tumoren abzielenden Verabreichungssystemen. Dies umfasst Forschung an auf Tumoren abzielende, durch Fo-lat-, Transferrin-, Integrin- und Polypeptid-Rezeptoren vermittelte Medikamente. In den letzten Jahren haben auf Tumoren abzielende durch Polypeptid-Rezeptoren vermittelte Medikamente mehr und mehr Aufmerksamkeit erregt.
[0005] Aber bislang zielt die Forschung an Drug-Targeting-Systemen gegen Krebs hauptsächlich auf das Targeting von Tumorgewebe. In den letzten Jahren wurde die Frage, wie mehr Wirkstoff in Tumorzellen gebracht werden kann, nachdem die Medikamente den Tumor erreicht haben, um so ein gezieltes Einbringen von Medikamenten in Tumorzellen zu erreichen, zum Fokus der Forschung auf dem Gebiet der Drug-Targeting-Systeme. Viele pharmazeutische Verabreichungssysteme weisen eine relativ gute Tumorspezifität auf und sie können Medikamente zur Oberfläche von Tumorzellen bringen. Jedoch werden die meisten Medikamente ausserhalb der Zielzelle freigesetzt, nachdem der Träger an die Zielzelle gebunden hat, da der Träger nur geringe Fähigkeiten, in die Zielzelle einzudringen, aufweist. Weiterhin aktivieren die Medikamente wenn sie wirken auch verschiedene Gene der Tumorzellmembran, sodass verschiedene molekulare Mechanismen synergistisch am Entstehen eines resistenten Phänotyps beteiligt sind. Wenn die Medikamentenresistenz erst einmal besteht reduziert sie die Effizienz des Eindringens des Medikamentes in die Tumorzelle weiter, sodass das Ergebnis eine extrem niedrige intrazelluläre Medikamentenkonzentration ist. Somit kann das Wachstum von Tumorzellen nicht effektiv gehemmt werden.
[0006] Neuropeptid Y (NPY) ist eine Art von Hormon, das im Zentral- und peripheren Nervensystem weit verbreitet ist und die Homöostase erhält. Es wurden sechs Arten von NPY-Rezeptoren gefunden und identifiziert, nämlich NPY ΥΊ, Y2, Y3, Y4, Υδ und Y6, die im Zentral- und peripheren Nervensystem von Säugetieren weit verbreitet sind. Die Funktion von NPY ist untrennbar mit seinen Rezeptoren verbunden, mit anderen Worten, die Diversität der Rezeptoren begründet die Funktionsdiversität von NPY. Studien haben gezeigt, dass die bekannten Medikamente für Neuropeptid-Rezeptoren hauptsächlich zur Behandlung von Krankheiten im Bereich physiologischer Beeinträchtigungen, einschliesslich Fettsucht, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, hohen Cholesterinwerten, Epilepsie, Angstzuständen und desgleichen, eingesetzt werden. Jedoch sind Tumormedikamente mit NPY als Angriffspunkt selten, insbesondere wurde nicht über Tumormedikamente zur Behandlung von Nierenkrebs, Magenkrebs, Brustkrebs und Eierstockkrebs berichtet.
[0007] Agonisten und Inhibitoren, die auf NPY-Rezeptoren (d.h. Liganden des Rezeptors) basieren, wurden ausgiebig erforscht, aber es ist immer noch schwierig, einen Liganden zur Modifikation des pharmazeutischen Trägers wegen der Diversität als auch der Universalität von NPY-Rezeptoren auszuwählen. Daher wurde es zum Schlüssel beim Entwurf und der Forschung und Entwicklung von Medikamenten mit Targeting, einen geeigneten Liganden zur Modifikation des pharmazeutischen Trägers auszuwählen, sodass der modifizierte pharmazeutische Träger mit hoher Spezifität an einen Rezeptor der Tumorzelle binden kann, ohne die biologische Aktivität anderer intrazellulärer Rezeptoren zu beeinflussen, und die Tumormedikamente gerichtet in die Tumorzellen einbringen kann, und sich somit die effektive Medikamentenkonzentration in den Tumorzellen erhöht.
Zusammenfassung der Erfindung [0008] Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Tumormedikament mit aktivem Targeting und die Herstellungsmethode dazu bereitzustellen.
[0009] Der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart einen Komplex, der umfasst: einen Nanoträger; und ein an die Oberfläche des Nanoträgers gekoppeltes Targeting-Molekül; wobei das Targeting-Molekül aus folgender Liste ausgewählt ist: [D-Arg25]-NPY, [D-His26]-NPY, [D-Arg25, D-His26]-NPY, [Arg6, Pro34]pNPY, [Asn6, Pro34]pNPY, [Cys6, Pro34]pNPY, [Phe6, Pro34]pNPY, [Arg7, Pro34]pNPY, [D-His26, Pro34]NPY, [Phe7, Pro34]pNPY, [Pro30, Nie31, Bpa32, Leu34]NPY(28-36), [Pro30, Nal32, Leu34]NPY(28-36), [Pro30, Nie31, Nal32, Leu34]NPY(28-36), BIBO3304, PD160170, LY366258, J-104870, LY 357897, J-115814, und Kombinationen davon; und der Nanoträger hat eine Partikelgrösse von < 200 nm und einen Polydispersitätsindex (PDI) kleiner als 0,5.
[0010] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Gehalt des Targeting-Moleküls 1,11 bis 22,2 Gewichts-% des Gesamtgewichtes des Komplexes.
[0011] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Gehalt des Targeting-Moleküls 5,60 bis 11,1 Gewichts-% des Gesamtgewichtes des Komplexes.
[0012] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat der Komplex eine oder mehrere der folgenden Charakteristiken: (a) der Komplex bindet an Brustkrebszellen, Eierstockkrebszellen, Nierenkrebszellen oder Magenkrebszellen mit hoher Spezifität; (b) die Partikelgrösse des Nanoträgers beträgt 10-200 nm.
[0013] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Nanoträger aus folgender Liste ausgewählt:
Proteinbasiertes Nanopartikel, oligopeptidbasiertes Nanopartikel, phospholipidbasiertes Nanoliposom, polysaccharidbasiertes Nanopartikel, polyetherbasiertes Nanopartikel, polyesterbasiertes Nanopartikel, polyesterbasierte polymere Mizel-le.
[0014] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das proteinbasierte Nanopartikel ausgewählt aus: ein Nanopartikel aus menschlichem Serum-Albumin oder ein Nanopartikel aus Rinderserum-Albumin.
[0015] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das phospholipidbasierte Nanopartikel ausgewählt aus: Phosphatidylcholin-Nanoliposom, Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin-Nanoliposom, Distearoyl-Phosphatidylcholin-Nanolipo-som, Dipalmitoyl-Phosphatidylethanolamin-Nanoliposom, Distearoyl-Phosphatidylethanolamin-Nanoliposom, oder Dipal-mitoyl-Phosphatidylglycerol-Nanoliposom.
[0016] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das polyesterbasierte Nanopartikel ausgewählt aus: Polyethy-lenglycol-Polymilchsäure-Nanopartikel, Polyethylenglycol-Polylactid-Glycolid-Nanopartikel, oder Polyethylenglycol-Poly-caprolacton-Nanopartikel.
[0017] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das polysaccharidbasierte Nanopartikel ein Chitosan-Na-nopartikel.
[0018] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die polyesterbasierte polymere Mizelle ausgewählt aus: Poly-ethylenglycol-Polymilchsäure-Mizelle, Polyethylenglycol-Polycaprolacton-Mizelle, Polyethylenglycol-Distearoyl-Phosphati-dylethanolamin-Mizelle, oder Polyethylenglycol-Polyethylenimin-Mizelle.
[0019] Der zweite Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart eine Zusammensetzung, die umfasst: den Komplex des ersten Aspekts; und ein Anti-Tumor-Medikament, das vom Nanoträger des Komplexes eingeschlossen wird.
[0020] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Anti-Tumor-Medikament aus folgender Liste ausgewählt: Doxorubicin, Paclitaxel, Docetaxel, Cisplatin, Mitoxantron, Daunorubicin, Vincristin, All-trans Retinsäure, Pharmorubicin, Lurtotecan, Irinotecan, 2-Methoxyestradiol, Gemcitabin, Vinorelbin, 5-Fluorouracil, Methotrexat, Capecitabin, Lomustine, Etoposid, oder Kombinationen davon.
[0021] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Anti-Tumor-Medikament in den Nanoträger des Komplexes eingebettet.
[0022] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist in der Zusammensetzung die Verkapselungs-Effizienz des Nanoträgers für das Anti-Tumor-Medikament über 80%, und vorzugsweise 90% oder mehr.
[0023] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Abtötungsrate von Tumorzellen durch die Zusammensetzung über 60%, und vorzugsweise über 70%, wenn die Konzentration des Anti-Tumor-Medikaments in der Zusammensetzung 5-10 pg/ml beträgt.
[0024] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen Tumorzellen die Tumorzellen von Brustkrebs, Eierstockkrebs, Nierenkrebs oder Magenkrebs.
[0025] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Gehalt des Anti-Tumor-Medikaments 1,0 bis 3,0 Gewichts-% und vorzugsweise 1,5 bis 2,7 Gewichts-% des Gesamtgewichtes der Zusammensetzung.
[0026] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Gehalt des Targeting-Moleküls 1,11 bis 22,2 Gewichts-% und vorzugsweise 5,60 bis 11,1 Gewichts-% des Gesamtgewichtes der Zusammensetzung.
[0027] Der dritte Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart eine Methode zur Herstellung der Zusammensetzung des zweiten Aspekts, wobei die Methode folgende Schritte umfasst: (1) Bereitstellen eines mit Anti-Tumor-Medikament beladenen Nanoträgers; und (2) Koppeln des Nanoträgers von Schritt (1) mit einem Targeting-Molekül, dabei wird die Zusammensetzung erhalten.
[0028] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Partikelgrösse des Nanoträgers 200 nm oder kleiner, und vorzugsweise 10-200 nm.
[0029] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Methode zur Herstellung des Nanoträgers folgende Schritte: (a) jeweils Bereitstellen einer wässrigen Lösung und einer organischen Lösung, wobei die wässrige Lösung ein An-ti-Tumor-Medikament und ein hydrophiles Membranmaterial umfasst, und die organische Lösung einen Emulgator umfasst; (b) Mischen der wässrigen Lösung mit der organischen Lösung aus Schritt (a), dabei wird eine Emulsion erhalten; (c) Aushärten der Emulsion aus Schritt (b), dabei wird der Nanoträger erhalten.
[0030] Oder die Methode zur Herstellung des Nanoträgers umfasst folgende Schritte: (a) jeweils Bereitstellen einer wässrigen Lösung und einer organischen Lösung, wobei die wässrige Lösung einen Emulgator umfasst, und die organische Lösung ein Anti-Tumor-Medikament und ein hydrophobes Membranmaterial umfasst; (b) Mischen der wässrigen Lösung mit der organischen Lösung aus Schritt (a), dabei wird eine Emulsion erhalten; (c) Aushärten der Emulsion aus Schritt (b), dabei wird der Nanoträger erhalten.
[0031] Oder die Methode zur Herstellung des Nanoträgers umfasst folgende Schritte: (a) jeweils Bereitstellen einer wässrigen Lösung und einer organischen Lösung, wobei die wässrige Lösung ein Anti-Tumor-Medikament umfasst, und die organische Lösung ein hydrophobes Membranmaterial und einen Emulgator umfasst; (b) Mischen der wässrigen Lösung mit der organischen Lösung aus Schritt (a), dabei wird eine erste Emulsion erhalten; (c) Mischen der ersten Emulsion aus Schritte (b) mit der wässrigen Lösung, die gelösten Emulgator enthält, dabei wird eine zweite Emulsion erhalten; (d) Aushärten der zweiten Emulsion aus Schritt (c), dabei wird der Nanoträger erhalten.
[0032] Oder die Methode zur Herstellung des Nanoträgers umfasst folgende Schritte: (a) Bereitstellen einer Suspension, die ein Anti-Tumor-Medikament, einen Nanoträger und ein organisches Lösungsmittel umfasst; (b) Aushärten der Suspension aus Schritt (a), dabei wird der Nanoträger erhalten.
[0033] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das hydrophile Membranmaterial ausgewählt aus: Polyethylenglycol (PEG), Polyoxyethylen (PEO), Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder Polyvinylalkohol (PVA).
[0034] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das hydrophobe Membranmaterial ausgewählt aus: Polyoxypropylen (PPO), Polystyrol (PS), Polyaminosäure, Polymilchsäure (PLA), Spermin oder kurzkettiges Phospholipid.
[0035] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Emulgator ausgewählt aus:
Pluronic F68, Dextran 70 oder Natriumcholat.
[0036] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Kopplungsreaktion ausgewählt aus: (1) einer Kondensationsreaktion einer Carboxygruppe und einer Aminogruppe; (2) einer Additionsreaktion einer Sulfhydrylgruppe mit einer Maleimidgruppe; oder (3) einer nichtkovalenten Bindung von Avidin und Biotin.
[0037] Der vierte Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart die Verwendung des Komplexes des ersten Aspekts zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
[0038] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst Krebs Brustkrebs, Eierstockkrebs, Nierenkrebs und Magenkrebs. Mehr bevorzugt umfasst Krebs Nierenkrebs und Magenkrebs.
[0039] Der fünfte Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart die Verwendung der Zusammensetzung des zweiten Aspekts zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
[0040] Der sechste Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart ein Medikament, das umfasst: den Komplex des ersten Aspekts; ein Anti-Tumor-Medikament, das im Nanoträger der Zusammensetzung eingeschlossen wird; und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
[0041] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Zubereitungsform des Medikaments aus folgender Liste ausgewählt: festes Präparat, flüssiges Präparat und Injektionen.
[0042] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Medikament an Säugetieren eingesetzt, vorzugsweise am Menschen.
[0043] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Zubereitungsform des Medikaments eine Injektion.
[0044] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Injektionsweise intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder intrakavitäre Gabe.
[0045] Der siebte Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart eine Methode zur Behandlung von Krebs, die einen Schritt der Verabreichung einer sicheren und effektiven Menge der Zusammensetzung nach Aspekt zwei oder des Medikaments nach Aspekt sechs umfasst.
[0046] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst Krebs Brustkrebs, Eierstockkrebs, Nierenkrebs und Magenkrebs. Mehr bevorzugt umfasst Krebs Nierenkrebs und Magenkrebs.
[0047] Es soll klar sein, dass bei der vorliegenden Erfindung alle technischen Merkmale, die oben und unten (sowie in den Beispielen) spezifisch beschrieben werden, miteinander kombiniert werden können, und dabei neue oder bevorzugte technische Lösungen bilden, die nicht im Einzelnen hier redundant beschrieben werden.
Beschreibung der Abbildungen [0048]
Fig. 1 zeigt ein TEM-Muster und ein Diagramm der Verteilung der DLS-Partikelgrösse der Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT.
Fig. 2 zeigt die Änderung der Partikelgrösse der Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT in NaCI-Lösung, PBS-Lösung und Serum für 1-15 Tage.
Fig. 3 zeigt ein Vergleichsprofil von Tumorzellen MCF-7 und HEC-1B-Y5, die die Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT aufnehmen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung [0049] Durch umfangreiche, intensive und lange Forschungsarbeit haben die Erfinder unerwartet herausgefunden, dass eine Zusammensetzung, die durch Kopplung bestimmter Targeting-Moleküle mit dem mit Anti-Tumor-Medikament beladenen Nanoträger hergestellt wurde, an Neuropeptid-Rezeptoren von spezifischen Tumorzellen hochspezifisch binden kann und das Anti-Tumor-Medikament gerichtet in diese Zellen einbringen kann, wobei die effektive Konzentration des Medikaments in den Tumorzellen gesteigert wird, während die Zusammensetzung nahezu keine toxischen Nebenwirkungen auf normale Gewebe und Zellen hat. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung hat eine starke Abtötungswirkung auf Tumorzellen, insbesondere auf Tumorzellen von Brustkrebs, Eierstockkrebs, Nierenkrebs und Magenkrebs, und somit kann sie zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oben erwähnter Krebsarten verwendet werden. Auf diesen Erkenntnissen aufbauend haben die Erfinder die vorliegende Erfindung vervollständigt.
[0050] Wie hier verwendet bezieht sich «Biotin» auf Vitamin H, auch Vitamin B7 oder Coenzym R genannt, mit dem Molekulargewicht von 244,31 Da.
[0051] Wie hier verwendet bezieht sich «Avidin» auf ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 60 kDaund umfasst hauptsächlich das Protein Avidin (auch natürliches Avidin, Ovoalbumin Avidin oder Anti-Biotin genannt), Strepta-vidin, Dotteravidin und Ähnliches.
Targeting-Molekül [0052] Das Targeting-Molekül der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Peptid-Agonist-Molekül oder ein nicht-Pep-tid-Antagonist-Molekül, das an Neuropeptid-Rezeptoren mit hoher Spezifität und Effizienz binden kann und dadurch verschiedene biologische Aktivität auslöst. Das Peptid-Agonist-Molekül umfasst (ist aber nicht begrenzt auf): [D-Arg25]-NPY, [D-His26]-NPY, [D-Arg25,D-His26]-NPY, [Arg6, Pro34]pNPY, [Asn6, Pro34]pNPY, [Cys6, Pro34]pNPY, [Phe6, Pro34]pNPY, [Arg7, Pro34]pNPY, [D-His26, Pro34]NPY, [Phe7, Pro34]pNPY, [Pro30, Nie31, Bpa32, Leu34]NPY(28-36), [Pro30, Nal32, Leu34lNPY(28-36) und [Pro30, Nie31, Nal32, Leu34]NPY(28-36), und das nicht-Peptid-Antagonist-Molekül umfasst (ist aber nicht begrenzt auf): BIBO3304, PD160170, LY366258, J-104870, LY357897 und J-115814.
[0053] Durch Forschungsarbeiten haben die Erfinder unerwartet herausgefunden, dass das obige Targeting-Molekül der vorliegenden Erfindung an Brustkrebs-, Eierstockkrebs-, Nierenkrebs- und Magenkrebs-Zellen hochspezifisch binden kann, aber nicht spezifisch an Gehirntumor- und Endometriumtumor-Zellen binden kann.
[0054] Wie hier verwendet bezieht sich «hochspezifisch binden» darauf, dass unter gleichen Bedingungen, jeweils nach der Bindung an Tumorzellen und nicht-Tumorzellen (d.h. normalen Zellen) die Aufnahmerate des Komplexes der vorliegenden Erfindung folgende Bedingung erfüllt: ΒΊ/Β0 > 2,5, vorzugsweise ΒΊ/Β0 > 3, mehr bevorzugt ΒΊ/Β0 > 4; wobei ΒΊ die Aufnahmerate des Komplexes durch 10 000 Tumorzellen ist, und Bo die Aufnahmerate des Komplexes durch 10 000 normale Zellen ist.
Der Komplex und dessen Herstellungsmethode [0055] Der Komplex der vorliegenden Erfindung ist ein binärer Komplex, der aus einem biologisch abbaubaren Nanoträ-ger und Targeting-Molekülen besteht, wobei die Targeting-Moleküle an die Oberfläche des Nanoträgers gekoppelt sind. Überschüssige Targeting-Moleküle können zu Ausfällung oder Verklumpung der Nanopartikel des Komplexes führen und dabei den Durchmesser der Nanopartikel des Komplexes erhöhen (>200 nm). In der vorliegenden Erfindung ist der Gehalt an Targeting-Molekülen 1,11 bis 22,2% (Gewichts-%), und vorzugsweise 5,60 bis 11,1% (Gewichts-%), bezogen auf das Gesamtgewicht des Komplexes; der Rest besteht aus dem biologisch abbaubaren Nanoträger.
[0056] Der Komplex der vorliegenden Erfindung hat eine gute Feinverteilung und Stabilität in wässriger NaCI-Lösung, wässriger PBS-Lösung oder Serum, ohne Ausfällungs- oder Verklumpungsphänomene.
[0057] In der vorliegenden Erfindung kann das Nanopartikel ausgewählt werden aus: Proteinbasiertes Nanopartikel, oligopeptidbasiertes Nanopartikel, phospholipidbasiertes Nanoliposom, polysaccharidbasiertes Nanopartikel, polyetherbasiertes Nanopartikel, polyesterbasiertes Nanopartikel, polyesterbasierte polymere Mizelle, oder Kombinationen davon. Bevorzugt sind proteinbasiertes Nanopartikel, phospholipidbasiertes Nanoliposom und polysaccharidbasiertes Nanopartikel.
[0058] Das bevorzugte proteinbasierte Nanopartikel umfasst Nanopartikel aus menschlichem Serum-Albumin (HSA) oder Nanopartikel aus Rinderserum-Albumin (BSA), oder Kombinationen davon.
[0059] Das bevorzugte phospholipidbasierte Nanoliposom umfasst Phosphatidylcholin (PC)-Nanoliposom, Dipalmi-toylphosphatidylcholin (DPPC)-Nanoliposom, Distearoylphosphatidylcholin (DSPC)-Nanoliposom, Dipalmitoylphosphati-dylethanolamin (DPPE)-Nanoliposom, Distearoylphosphatidylethanolamin (DSPE)-Nanoliposom, Dipalmitoylphosphati-dylglycerol (DPPG)-Nanoliposom, oder Kombinationen davon.
[0060] Das bevorzugte polyesterbasierte Nanopartikel umfasst Polyethylenglycol-Polymilchsäure (PEG-PLA)-Nanoparti-kel, Polyethylenglycol-Polylactidglycolid (PEG-PLGA)-Nanopartikel, Polyethylenglycol-Polycaprolacton (PEG-PCL)-Nano-partikel, oder Kombinationen davon.
[0061] Das bevorzugte polysaccharidbasierte Nanopartikel umfasst Chitosan-Nanopartikel.
[0062] Die bevorzugte polyesterbasierte polymere Mizelle umfasst Polyethylenglycol-Polymilchsäure (PEG-PLA)-Mizel-len, Polyethylenglycol-Polycaprolacton (PEG-PCL)-Mizellen, Polyethylenglycol-Distearoylphosphatidylethanolamin (PEG-DSPE)-Mizellen, Polyethylenglycol-Polyethyleneimin (PEG-cl-PEI)-Mizellen, oder Kombinationen davon.
[0063] Die Methode zur Herstellung des Komplexes der Erfindung umfasst hauptsächlich folgende Schritte: (1) Herstellung des Nanoträgers und (2) Reaktion der Nanoträger mit den Targeting-Molekülen. Die Methoden zur Herstellung des Nanoträgers können dem Fachmann bekannte Methoden sein, und die Reaktion zwischen dem Nanoträger und dem Targeting-Molekül können über chemische Kopplungsmethoden realisiert werden.
[0064] Eine bevorzugte Kopplungsmethode ist folgende:
Wenn die Nanoträger Carboxygruppen enthalten (wie Polyglutamisäure, Polyasparaginsäure, Peptide und Proteine, die Glutaminsäure und Asparaginsäure enthalten, und Polysaccharide, die eine Carboxygruppe tragen), kann man Targeting-Moleküle, die eine Aminogruppe enthalten, wählen und Carboxygruppen an der Oberfläche des Nanoträgers mit EDAC und NHS (N-Hydroxysuccinimid) aktivieren, und dann tropfenweise eine Lösung des Targeting-Moleküles mit terminalen
Aminogruppen zugeben, um eine kovalente Reaktion zwischen den aktivierten Carboxygruppen und den Aminogruppen des Targeting-Moleküls zu bewirken und damit eine stabile Amidbindung zu bilden; wenn die Nanoträger Aminogruppen enthalten (wie Polylysin, Histidin, Polyarginin, Peptide und Proteine, die Lysin, Arginin und Histidin enthalten, und Polysaccharide mit Aminogruppen), kann man Targeting-Moleküle, die eine Carboxygruppe enthalten, wählen und die Carboxygruppen des Targeting-Moleküls mit der oben angegebenen Methode aktivieren, um die aktivierten Carboxygruppen auf die Oberfläche des Nanoträgers zu pfropfen; bei biologisch abbaubaren Nanoträgern, die weder Carboxy- noch Aminogruppen enthalten (wie Polyether- und Polyester-Polymere), kann die Copolymerisations-Methode eingesetzt werden, damit die biologisch abbaubaren Nanoträger Amino- oder Carboxygruppen bekommen, und nach dem Formieren zu Nanoträgern kann dieselbe Methode wie oben angegeben werden, um die Targeting-Moleküle auf die Oberfläche des Nanoträgers zu pfropfen.
[0065] Die andere bevorzugte Kopplungsmethode ist folgende:
Mercaptogruppen werden am Targeting-Molekül eingeführt und Maleimid-Gruppen werden an der Oberfläche des Medi-kamententrägersystems eingeführt, und dann wird eine Additionsreaktion in neutraler oder alkalischer wässriger Umgebung (z.B. in Phosphatpuffer) bei Zimmertemperatur durchgeführt.
[0066] Thiolierte Targeting-Moleküle werden hauptsächlich über die Reaktion zwischen Sulfhydryl-Reagenzien (wie 2-IT, SPDP, SATP und SSDD etc.) und Aminogruppen der Targeting-Moleküle hergestellt.
[0067] Um Maleimid ins Medikamententrägersystem einzuführen, werden Lipidmoleküle und mit Maleimid (MAL) modifizierte Polymermaterialien (wie MAL-PEG-PLA, MAL-PEG-PLGA, MAL-PEG-PCL, MAL-PEG-DSPE) gemischt und in einem organischen Lösungsmittel gelöst, und über Dünnschicht-Hydration und Hochdruckhomogenisierung können ma-leimidierte Liposomen mit hydrophoben Enden (wie PLA, PLGA, PCL und DSPE), die in der Lipiddoppelschicht mit den PEG-Maleimid-Enden an der Oberfläche der Lipidmembranen orientiert sind, erhalten werden.
[0068] Ausserdem kann Maleimid direkt an der Oberfläche des Medikamententrägersystems eingeführt werden. Zum Beispiel sind bifunktionelle Linker, die Maleimidgruppen bilden können (wie bifunktionelle Propionsäurelinker, bei denen die aktiven Ester des Moleküls mit Aminogruppen zu Maleimidgruppen reagieren können), nützlich, um Maleimidgruppen in die Nanoträger einzuführen.
[0069] Eine weitere bevorzugte Kopplungsmethode ist folgende:
Biotin wird separat ins Targeting-Molekül und das Medikamententrägersystem eingeführt, und Avidin wird als Brückenreagens verwendet um das Drug-Targeting-System herzustellen. Mit anderen Worten werden zuerst Avidin und das Biotin-tragende Trägersystem gemischt, und dann reagieren ungebundene Stellen mit den Biotin-tragenden Targeting-Molekülen.
[0070] Zum Beispiel wird zur Herstellung von Biotin-tragendem PEG-PLGA PLGA-COOH (Molekulargewicht 20 kDa) in Dichlormethan gelöst. NHS und EDC in der 8-fachen Menge des PLGA-COOH werden unter Rühren bei Raumtemperatur zugefügt, um PLGA-COOH zu aktivieren. Die resultierenden aktiven Ester und NH2-PEG-Biotin (Molekulargewicht 3400 Da) werden gemischt und in Chloroform gelöst. Eine angemessene Menge Ν,Ν-Diisopropylethylamin wird zugegeben, die Reaktion erfolgt über Nacht. Die überschüssigen PEG-Moleküle werden mit Methanol ausgewaschen und das Reaktionsprodukt wird mit Ether ausgefällt und im Vakuum getrocknet um PLGA-PEG-Biotin zu erhalten. Dann wird eine gewisse Menge PLGA-PEG-COOH und PLGA-PEG-Biotin gemischt und in Aceton gelöst, die Mischung wird langsam tropfenweise in entionisiertes Wasser gegeben und das Aceton wird durch Rotationsverdampfung bei Raumtemperatur entfernt. Das organische Lösungsmittel wird durch Ultrafiltrationskonzentration entfernt, um Biotin-tragende PEG-PLGA-Nanopartikel zu erhalten. Die Lösung von Biotin-tragenden PEG-PLGA-Nanopartikeln und Avidin wird bei Raumtemperatur eine gewisse Zeit inkubiert, dann wird das freie Avidin durch Zentrifugieren und Waschen entfernt. Eine bestimmte Menge Biotin-tragender Targeting-Moleküle und das resultierende Produkt werden bei Raumtemperatur gerührt und dann werden die freien Biotin-tragenden Targeting-Moleküle durch Zentrifugieren entfernt, dabei wird das Drug-Targeting-Sys-tem aus PEG-PLGA-Nanopartikeln erhalten.
Die Zusammensetzung und deren Herstellungsmethode sowie deren Verwendung [0071] Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst den Komplex der vorliegenden Erfindung und Anti-Tumor-Medikamente, die im Nanoträger des Komplexes getragen werden. Ausgehend vom Gesamtgewicht der Zusammensetzung ist der Gehalt an Anti-Tumor-Medikamenten gewöhnlich 1,5 bis 3,0 Gewichts-%, vorzugsweise 2,0 bis 3,0 Gewichts-%; und der Gehalt an Targeting-Molekülen ist gewöhnlich 1,11 bis 22,2 Gewichts-%, und vorzugsweise 5,60 bis 11,1 Gewichts-%.
[0072] Um ein verbessertes langsames Freisetzen und einen gesteuerten Freisetzungseffekt der Anti-Tumor-Medikamen-te zu erreichen und um das Auftreten von in-vivo-Opsonisierung zu vermeiden, beträgt die Partikelgrösse des Komplexes der vorliegenden Erfindung vorzugsweise 200 nm oder weniger, und vorzugsweise 10-200 nm.
[0073] Die bevorzugten Anti-Tumor-Medikamente umfassen (sind aber nicht begrenzt auf): Doxorubicin, Paclitaxel, Do-cetaxel, Cisplatin, Mitoxantron, Daunorubicin, Vincristin, All-Trans-Retinolsäure, Pharmorubicin, Lurtotecan, Irinotecan, 2-Methoxyestradiol, Gemcitabin, Vinorelbin, 5-Fluorouracil, Methotrexat, Capecitabin, Lomustine, Etoposid, oder Kombinationen davon; und umfassen vorzugsweise Doxorubicin, Paclitaxel, Docetaxel, Mitoxantron, Daunorubicin, Irinotecan, Gemcitabin, Vinorelbin, Capecitabin, oder Etoposid.
[0074] Die Herstellungsmethode der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst hauptsächlich die Schritte: (1) Bereitstellen eines mit Anti-Tumor-Medikament beladenen Nanoträgers; und (2) Koppeln des Nanoträgers von Schritt (1) mit Targeting-Molekülen, dabei wird die Zusammensetzung erhalten.
[0075] In der Erfindung können die Nanoträger durch Ultraschall-Emulgieren hergestellt werden. Vorzugsweise können die Nanoträger durch folgende drei Methoden hergestellt werden: (1) Verwendung einer wässrigen Lösung als wässrige Phase, in der hydrophile Anti-Tumor-Medikamente und hydrophiles Membranmaterial (z.B. Polyethylenglycol) gelöst sind, und Verwendung eines organischen Lösungsmittels (z.B. Dichlormethan) als Ölphase, in der öllösliche Emulgatoren (z.B. Natriumcholat) gelöst sind; Mischen der wässrigen Phase mit der Ölphase und Rühren der Mischung, um grobe Dispersion zu erreichen; Emulgieren der Mischung mit einem Ultraschall-Zellaufbrecher, dabei erhält man eine Wasser-in-ÖI-Nanoemul-sion; dann unter magnetischem Rühren Zugabe eines Vernetzungsagens (z.B. Glutaraldehyd) zur erhaltenen Nanoemulsion, um Vernetzung und Härtung zu bewirken; Entfernung des überschüssigen Vernetzungsagens und Emulgators, dabei erhält man biologisch abbaubare Nanoträger, in denen Anti-Tumor-Medikamente eingebettet sind; (2) Verwendung eines organischen Lösungsmittels (z.B. Dichlormethan) als Ölphase, in der hydrophobe Anti-Tumor-Medikamente und hydrophobes Mebranmaterial (z.B. PACA) gelöst sind, und Verwendung einer wässrigen Lösung als wässrige Phase, in der wasserlöslicher Emulgator (z.B. Pluronic F68, Dextran 70) gelöst ist; Mischen der Ölphase mit der wässrigen Phase und Rühren der Mischung, um grobe Dispersion zu erreichen; Emulgieren der Mischung mit einem Ultraschall-Zellaufbrecher, dabei erhält man eine ÖI-in-Wasser-Nanoemul-sion; dann unter magnetischem Rühren Zugabe eines Vernetzungsagens (z.B. Glutaraldehyd) zur erhaltenen Nanoemulsion, um Vernetzung und Härtung zu bewirken; Entfernung des überschüssigen Vernetzungsagens und Emulgators, dabei erhält man biologisch abbaubare Nanoträger, in denen Anti-Tumor-Medikamente eingebettet sind; (3) Verwendung einer wässrigen Lösung als wässrige Phase, in der hydrophile Anti-Tumor-Medikamente gelöst sind, und Verwendung eines organischen Lösungsmittels als Ölphase, in der hydrophobes Mebranmaterial (z.B. PEG-PLA) und öllösliche Emulgatoren (z.B. Natriumcholat) gelöst sind; Mischen der wässrigen Phase mit der Ölphase und Rühren der Mischung, um grobe Dispersion zu erreichen; Emulgieren der Mischung mit einem Ultraschall-Zellaufbrecher, dabei erhält man eine Wasser-in-ÖI-Nanoemulsion; dann Zugabe der erhaltenen Wasser-in-ÖI-Nanoemulsion zu einer wässrigen Phase, in der wasserlösliche Emulgatoren gelöst sind, und Durchführung einer Ultraschall-Emulgierung, dabei erhält man eine Wasser/Öl/Wasser-Nanoemulsion; dann unter magnetischem Rühren Zugabe eines Vernetzungsagens (z.B. Glutaraldehyd) zur erhaltenen Wasser/ Öl/Wasser-Nanoemulsion, um Vernetzung und Härtung zu bewirken; Entfernung des überschüssigen Vernetzungsagens und Emulgators, dabei erhält man biologisch abbaubare Nanoträger, in denen Anti-Tumor-Medikamente eingebettet sind.
[0076] Obige Nanoträger der vorliegenden Erfindung können auch mit der Lösungsmittel-Entfernungs-Methode hergestellt werden. Eine bevorzugte Methode umfasst die Schritte: Lösen von wasserlöslichen Anti-Tumor-Medikamenten und Oligopeptid- oder Protein-Nanoträgern in wässriger NaCI-Lösung, und tropfenweises Zugeben von Ethanol bei kontinuierlichem magnetischem Rühren, und sobald die Lösung zu einer milchig-weissen Suspension wird, Zugabe von Glutaraldehyd zur Vernetzung und Härtung; Entfernen von überschüssigem Vernetzungsagens, dabei erhält man biologisch abbaubare Nanoträger, in denen Anti-Tumor-Medikamente eingebettet sind.
[0077] Die Reaktion des obigen Schrittes (2) ist dieselbe wie die zwischen Nanoträgern und Targeting-Molekülen des Komplexes der vorliegenden Erfindung.
[0078] Es soll klar sein, dass die obige Zusammensetzung auch durch Verpacken der Anti-Tumor-Medikamente in den vorbereiteten Komplex der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann.
[0079] Die Zusammensetzung der Erfindung kann zur Herstellung von Anti-Tumor-Medikamenten, besonders für Medikamente zur Behandlung von Brustkrebs, Eierstockkrebs, Nierenkrebs und Magenkrebs verwendet werden.
Medikamente, Zusammensetzung und deren Verabreichungsmethode [0080] Das Arzneimittel oder Medikament der vorliegenden Erfindung umfasst eine effektive Menge der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff.
[0081] Wie hier benutzt, umfasst der Ausdruck «umfassen» oder «beinhalten» «umfassend», «wesentlich bestehend aus ...» und «bestehend aus ...». Wie hier benutzt bedeutet der Ausdruck «pharmazeutisch annehmbare» Komponente, dass die Komponente für Menschen und/oder Tiere geeignet ist, ohne übermässige Nebenwirkungen (wie Giftigkeit, Stimulierung und Allergien). Mit anderen Worten ist die Komponente eine Substanz mit angemessenem Nutzen-Riskio-Ver-hältnis. Wie hier benutzt bezieht sich der Ausdruck «effektive Menge» auf eine Menge, die Wirkung oder Aktivität bei Menschen und/oder Tieren zeigt und von Menschen und/oder Tieren vertragen werden kann.
[0082] Wie hier benutzt, bezieht sich der Ausdruck «pharmazeutisch annehmbarer Träger» auf Träger, die zur Verabreichung des therapeutischen Agens eingesetzt werden, umfassend verschiedene Hilfsstoffe und Verdünnungsmittel. Der Ausdruck bezieht sich auf solche Medikamententräger: Sie selbst sind keine essentiellen aktiven Ingredienzen und ohne übermässige Toxizität nach der Anwendung. Geeignete Träger sind dem Fachmann auf dem Gebiet sehr bekannt. Eine detaillierte Diskussion des pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffs kann in Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J., 1991) gefunden werden.
[0083] Die Zubereitung des Medikaments der vorliegenden Erfindung umfasst: festes Präparat, flüssiges Präparat oder Injektion, und vorzugsweise Injektion.
[0084] Das Medikament der vorliegenden Erfindung ist für Säugetiere, und vorzugsweise für Menschen.
[0085] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Arzneimittel oder die Zusammensetzung der Erfindung ein- oder mehrmals täglich verabreicht, z.B. 1-, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-mal. Die Verabreichungsweise umfasst, ist aber nicht begrenzt auf: orale Verabreichung, Verabreichung durch Injektion, intrakavitäre Verabreichung, transdermale Verabreichung; und vorzugsweise Verabreichung durch Injektion, umfassend intravenöse, intramuskuläre, subcutane und intrakavitäre Verabreichung. Um die spezifische Dosierung bei der Verabreichung des Arzneimittels oder der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zu ermitteln, sollten folgende Faktoren berücksichtigt werden: Verabreichungsweg, Gesundheitszustand des Patienten etc., die im Erfahrungsbereich eines erfahrenen Arztes liegen. Die sichere und effektive Menge der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung liegt normalerweise mindestens bei ungefähr 10 mg pro kg Körpergewicht pro Tag oder mindestens bei ungefähr 85 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, und in den meisten Fällen bei nicht mehr als ungefähr 200 mg pro kg Körpergewicht pro Tag oder bei nicht mehr als ungefähr 115 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, und vorzugsweise bei einer Dosis von ungefähr 100 mg pro kg Körpergewicht pro Tag. [0086] Im Vergleich zum Stand der Technik hat die vorliegende Erfindung folgende Hauptvorteile: (1) Der Komplex und die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung haben gute Dispersion und Stabilität in wässriger NaCI-Lösung, wässrige PBS-Lösung oder Serum, und es tritt kein Ausfällungs- oder Verklumpungs-Phänomen auf. (2) Der Komplex und die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung können hochspezifisch an Brustkrebs-, Eierstockkrebs-, Nierenkrebs- und Magenkrebszellen binden, und weisen einen hohen Targeting-Effekt für Tumorzellen auf. (3) Die Zusammensetzung und das Medikament der vorliegenden Erfindung können gerichtet Anti-Tumor-Medika-mente in die Tumorzellen transportieren und dabei effektiv die Medikamentenkonzentration in den Tumorzellen erhöhen, und haben eine starken Abtötungseffekt gegenüber Tumorzellen, und haben nahezu keine toxischen Nebenwirkungen auf normales Gewebe und Zellen.
[0087] Die oben genannten Merkmale der vorliegenden Erfindung oder die in den Beispielen genannten Charakteristika können beliebig kombiniert werden. Alle in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung offenbarten Merkmale können beliebig kombiniert werden, jedes in der Beschreibung offenbarte Merkmal kann durch ein beliebiges Ersatzmerkmal ersetzt werden, das identische, gleiche oder ähnliche Zwecke erfüllt. Daher, wenn nicht anders angegeben, stellen offenbarte Merkmale nur allgemeine Beispiele für gleiche oder ähnliche Merkmale dar.
[0088] Die vorliegende Erfindung wird unten weiter mit Bezug auf spezifische Beispiele verdeutlicht. Es soll klar sein, dass diese Beispiele nur die Erfindung verdeutlichen sollen, aber nicht den Schutzumfang der Erfindung einschränken sollen. Die in den folgenden Beispielen ohne spezifische Bedingungen beschriebenen experimentellen Methoden werden generell unter üblichen Bedingungen oder gemäss den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. Wenn nicht anders angegeben, werden Anteile und Prozentanteile auf das Gewicht bezogen.
[0089] Wenn nicht anders definiert, haben alle im Text benutzten Fachausdrücke und wissenschaftlichen Ausdrücke die dem Fachmann bekannten Bedeutungen. Weiterhin können alle Methoden und Materialien, die ähnlich oder gleich den in dieser Erfindung genannten sind, für diese Erfindung benutzt werden. Die Methode der hier beschriebenen bevorzugten Ausführungsform und die Materialien sind nur für demonstrative Zwecke.
Beispiel 1: Herstellung der Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT
[0090]
(1) Die Herstellung von BSA-Nanoträgern (ANP) mit eingebettetem TXT
Eine wässrige 10 mM NaCI-Lösung mit pH 10,8 wurde hergestellt, und die erhaltene Lösung wurde benutzt, um eine wässrige BSA-Lösung mit einer Konzentration von 20 mg/ml herzustellen. Dann wurden 2,0 ml Ethanol in 2,0 ml wässrige BSA-Lösung zugefügt, und nach 10 min magnetischem Rühren wurden 4,0 ml Ethanol tropfenweise mit einer Rate von 2,0 ml/min zugegeben (das Volumenverhältnis des gesamten zugegebenen Ethanols zur wässrigen Lösung des Nanoträgers war 3,0); während der Zugabe wurde kontinuierlich magnetisch gerührt. Sofort nach Beendigung der tropfenweise Ethanolzugabe wurde 8%ige wässrige Glutaraldehydlösung zugegeben (das Massenverhältnis von Glutaraldehyd zur BSA war 0,24) und für 24 Stunden vernetzt (oder gehärtet). Dann wurde 1,0 ml Glycin (40 mg/ml) zugegeben, um überschüssiges Glutaraldehyd zu neutralisieren, und nach 2,0 Stunden Reaktionszeit wurde die Probe zentrifugiert (20000xg, 20 min), die erhaltene Probe wurde zweimal mit 10 mM wässriger NaCI-Lösung gewaschen, und nach Gefriertrocknung für 48 Stunden wurden BSA-Nanoträger erhalten. Eine Lösung von TXT wurde in einer wässrigen Lösung von 20 mg/ml BSA-Nanoträ-ger dispergiert. ANP-TXT-Nanoträger mit eingebetteten Anti-Tumor-Medikamenten wurden mit derselben Methode wie oben beschrieben hergestellt. (2) Kopplung von [D-Arg25]-NPY-Targeting-Molekülen an die Oberfläche von Nanoträgern.
[0091] Unter Katalyse von EDAC (l-Ethyl-(3-Dimethylaminopropyl)Carbodiimid) und über die chemische Reaktion zwischen Aminogruppen des Targeting-Moleküls [D-Arg25]-NPY und Carboxygruppen an der Oberfläche des Nanoträgers ANP wurde das Targeting-Molekül [D-Arg25]-NPY an die Oberfläche des Nanoträgers gekoppelt. Die spezifische Herstellungsmethode war wie folgt: 500 pg/ml Targeting-Molekül [D-Arg25]-NPY-Lösung wurde mit Phosphatpufferlösung (PBS) als Lösungsmittel hergestellt. Im Eisbad wurden 50 mg EDAC in 10 ml Targeting-Molekül-Lösung gelöst, danach wurden 90 ml ANP-TXT-Suspension (5,0 mg/ml) in PBS zugegeben, die Mischung wurde bei Raumtemperatur magnetisch gerührt, und die Reaktion dauerte 4 bis 24 Stunden. Die Probe wurde zentrifugiert (20000xg, 20 min), und die erhaltene Probe wurde zweimal mit PBS gewaschen. Abschliessend wurde die Probe für 48 Stunden gefriergetrocknet und die Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT, die an der Oberfläche das Targeting-Molekül gekoppelt und Anti-Tumor-Medi-kamente im Nanoträger eingebettet hatte, wurde erhalten.
[0092] Die Veränderungen der Partikelgrösse der Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT in NaCI-Lösung, PBS-Lö-sung und Serum über 1-15 Tage sind in Tabelle 1 und Fig. 2 gezeigt.
[0093] Tabelle 1:
Durchschnittlicher Durchmesser (nm)
Tag(e) -——--
NaCl PBS Serum I 116.6 115.2 118.6 3 115.2 116.8 117.5 5 113.4 114.3 116.4 7 111.6 116.9 115.2 9 111.8 115.2 111.9 II 112.6 113.4 114.6 13 110.5 111.6 113.1 15 110.4 110.3 111.9 [0094] Wie aus Tabelle 1 und Fig. 2 ersichtlich hatten die Nanopartikel des Komplexes einheitliche Partikelgrösse und gute Dispersion in drei verschiedenen Lösungsmitteln, und die Partikelgrösse lag stabil zwischen 110 und 120 nm.
[0095] Nach der Messmethode mit einem Nanopartikelgrössenanalysator hatte jede der beschriebenen Nanopartikel-Komplexe einen PDI-Index kleiner als 0,5.
Beispiel 2: Aktivitätstest der Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT an Tumorzellen MCF-7 und HEC-1B-Y5 (1) MTT-Test (Zelltoxizitätstest) [0096] 1. Herstellen einer Einzelzellsuspension in einem Medium, das 10% fötales Kälberserum enthält, dann Impfen der Suspension in 96-Well-Platten (1,0 χ 105 Zellen/Well). Das Volumen pro Well war 150 μΙ. 2. Einlegen der Platten in einen Zellinkubator bei 37°C und Kultur für 24 Stunden. 3. Absorbieren und Verwerfen des Überstands des Mediums im Well, und Zugabe von 200 μΙ frischem Medium mit TXT oder 200 μΙ Lösung mit Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT derselben Konzentration wie TXT.
4. Einlegen der Platten in einen Zellinkubator bei 37°C und Kultur für 4 Stunden, Absorbieren und Verwerfen des Überstands des Mediums im Well und Ersetzen mit frischem Medium, das kein Medikament oder Nanopartikel-Zusammensetzung enthält, und Fortführen der Kultur für 44 Stunden. 5. Zugeben von 10 μΙ MTT-Lösung (5 mg/ml, in PBS, pH = 7.4) zu jedem Well, Einlegen der Platten in einen Zellinkubator bei 37 °C und Fortführen der Kultur für 4 Stunden, Beenden der Kultur, und dann Absorbieren und Verwerfen des Überstands des Mediums im Well. 6. Zugeben von 150 μΙ DMSO zu jedem Well, Oszillieren für 10 Minuten, sodass der Kristall vollständig aufgetaut ist. 7. Messen der Lichtextinktion bei 550 nm Wellenlänge eines jeden Wells mit Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay und Aufzeichnen der Ergebnisse. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
[0097] Die in den Zellexperimenten verwendeten Zellen umfassen menschliche MCF-7-Brustkrebszellen, menschliche HEC-1B-Y5-Endometriumtumor-Zellen (bezogen von der American Type Culture Collection [ATCC] und von der Firma Sciencell [USA]).
[0098] Tabelle 2:
Abtötungseffekt der Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT gegenüber MCF-7 und HEC-1B-Y5 Überlebensrate der Zellen (%)__ _ Zusammensetzung Zusammensetzung
Ctxt TXT 1X1 [D-Arg2S]-NPY-ANP-TXT [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT (pg/ml) Tumorzellen Tumorzellen MCF-7 HEC-IB-Yj MCF-7 HEC-1B-Y5 0.0 ' 100 100 "100 100_ 0.5__90 91__93__98_ 1.0__80 79__86__90_ 2.0__50 55__60__85_ 5.0__20 40__32__75_ 10.0 1 20 [ 30 25 I 60 [0099] Aus Tabelle 2 und Fig. 3 ist ersichtlich, dass Docetaxel (TXT) einen exzellenten Abtötungseffekt bei MCF-7- und HEC-1B-Y5-Zellen hat, und die Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT einen exzellenten Abtötungseffekt bei MCF-7-Zellen hat, jedoch ist der Abtötungseffekt bei HEC-1 B-Y5-Zellen nicht signifikant. Folglich zeigen diese Ergebnisse, dass die Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT unerwartet und signifikant MCF-7-Zellen abtöten kann in hochselektiver Weise bei exzellentem Abtötungseffekt.
Beispiel 3: Aktivitätstest der Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT an verschiedenen Tumorzellen [0100] (1) Die Methode des Aktivitätstests war dieselbe wie in Beispiel 2. Die Testergebnisse werden in den Tabellen 3-1 und 3-2 gezeigt. In diesem Beispiel umfassten die in den Zellexperimenten verwendeten Zellen menschliche UWB1.289-Eierstocktumorzellen, menschliche GIST-H1-Magenkrebszellen, menschliche SW-13-Nierenkrebszellen und menschliche SMS-KAN-Gehirntumorzellen. Normale Zellen umfassten menschliche MCF-10a-Brustepithelzellen, menschliche HOSE-piC-Eierstockoberflächenepithelzellen, menschliche HRCEpiC-Nierenkortexepithelzellen, menschliche GES-1 -Magenzellen und menschliche HA-Gehirnastrozyten, menschliche HUM-CELL-0111-Endometriumepithelzellen, (bezogen von American Type Culture Collection (ATCC), Firma Sciencell (USA) und Zellbank des Chinese Science Academy Type Culture Collection Committee).
[0101] Tabelle 3-1:
Vergleich des Abtötungseffekts der Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT an verschiedenen Tumorzellen Überlebensrate der Zellen (%)_ ™ Tumorzellen ____ (Mgm) MCF-7 |UWB1.289 |SW-13 IGIST-Hl |SMS-KAN |hEC-1B-Y5 0Ό_100_100_100 100 100_100_ CL5_93_94_90_91_97_95_ LO_86_88_85_82_89_86_ 10_60_65_63_60_82_80_ 5Ό_32_40_35_33_76_74_ 10.0 j25 |26 ßO |24 [71 [70 ~ [0102] Tabelle 3-2:
Vergleich des Abtötungseffekts der Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT an verschiedenen normalen Zellen Überlebensrate der Zellen (%)_ ,, Normale Zellen_____ (gg/m) MCF-lOa iHOSEpiC [HRCEpiC IgES-1 IhA IhUM-CELL-011 1 0Ό_100 100_100 100 100 100_ 075_93_94_90_91_97_98_ LO_90_91_88_90_94_95_ 2Ό_88_84_81_84_87_85_ 5Ό_85_78_13_80_82_81_ 10.0 |78 [75 [76 |75 |73 V5 [0103] Aus Tabelle 3-1 ist ersichtlich, dass die Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT der vorliegenden Erfindung einen hervorragenden Abtötungseffekt bei UWB1.289-Zellen, SW-13-Zellen und GIST-H1-Zellen wie bei MCF-7-Zellen aufweist. Jedoch ist der Abtötungseffekt der Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT bei SMS-KANN-Zellen nicht signifikant. Somit zeigen diese Ergebnisse, dass die Zusammensetzung UWB1.289-Zellen, SW-13-Zellen und GIST-H1-Zellen hochselektiv abtöten kann, und einen exzellenten Abtötungseffekt aufweist.
[0104] Aus den Testergebnissen von Tabelle 2, Tabelle 3-1 und Tabelle 3-2 ist ersichtlich, dass die Zusammensetzung [D-Arg25]-NPY-ANP-TXT an Brustkrebs-, Eierstockkrebs-, Nierenkrebs- und Magenkrebszellen hochspezifisch binden kann, sie hat einen starken Targetingeffekt gegen Tumorzellen und kann Anti-Tumor-Medikamente gerichtet in Tumorzellen transportieren und damit effektiv die Medikamentenkonzentration in Tumorzellen erhöhen, und sie weist einen starken Abtötungseffekt bei Tumorzellen auf und hat nahezu keine toxischen Nebenwirkungen auf normale Gewebe und Zellen.
Beispiel 4: Aktivitätstest verschiedener Zusammensetzungen mit eingebettetem Docetaxel an MCF-7- und UWB1.289-Zellen (1) Herstellung der Zusammensetzung [0105]
(a) Herstellung einer Chitosan-Nanoträger-Zusammensetzung mit eingebettetem TXT
(i) Herstellung von Chitosan-Nanoträgern mit eingebettetem TXT
Eine 0,2%ige (w/v) Chitosan-Lösung wurde mit 1% (w/v) Essigsäure als Lösungsmittel hergestellt. Das Docetaxel (TXT) wurde in der Chitosan-Lösung dispergiert, und der pH-Wert der Lösung wurde mit Natriumhydroxid auf 4,7-4,8 eingestellt. Ein wässriges 0,3%iges (w/v) Natriumtripolyphosphat (TPP) wurde hergestellt. Unter magnetischem Rühren wurden 0,1 ml TPP-Lösung zu 0,5 ml Chitosan-Lösung gegeben, dabei wurden ionenvernetzte Chitosan-Nanoträger mit eingebettetem TXT erhalten. (ii) Koppeln des Targeting-Moleküls an die Oberfläche der Chitosan-Nanoträger
Die Kopplungsreaktion der Targeting-Moleküle wurde an der Oberfläche der erhaltenen Nanoträger in der gleichen Weise wie in Schritt (2) von Beispiel 1 durchgeführt, ausser, dass das Targeting-Molekül [D-Arg25]-NPY durch diejenigen aus Tabelle 5 ersetzt wurde. (b) Herstellung einer BSA-Nanoträger(ANP)-Zusammensetzung mit eingebettetem TXT. Die Herstellung wurde analog zu Beispiel 1 durchgeführt, dabei wurde das Targeting-Molekül [D-Arg25]-NPY durch diejenigen aus Tabelle 5 ersetzt. (2) Cytotoxizitätstest [0106] Die Aktivitätstests wurden nach der Methode aus Beispiel 2 durchgeführt, wobei die in den Experimenten verwendeten Zellen MCF-7- und UWB1.289-Zellen umfassten.
[0107] Die Testergebnisse sind in Tabellen 5 dargestellt, wobei «+» bedeutet, dass die Zusammensetzung einen Abtötungseffekt bei Tumorzellen aufweist, «-» bedeutet, dass die Zusammensetzung nahezu keinen oder einen schwachen Abtötungseffekt bei Tumorzellen aufweist.
[0108] Die spezifischen Bedeutungen der Symbole werden in Tabelle 4 gezeigt, (es wurde eine repräsentative Konzentration gewählt, und verschiedene Symbole wurden je nach Wertebereich zugeordnet): [0109] Tabelle 4:
C'rx(T ι\ Werte Symbole (gg/ml)___ >80_—_ 60< Überlebensrate der Zellen < 80 -_ $ 50< Überlebensrate der Zellen < 60 -_ 40< Überlebensrate der Zellen <50 +_ 30< Überlebensrate der Zellen < 40 ++_ _20< Überlebensrate der Zellen < 30 +++_ [0110] Tabelle 5:
Vergleich der Abtötungseffekt verschiedener Zusammensetzungen an MCF-7- und UWB1.289-Zellen ___ Nanoträger BSA-Nanoträger_Chitosan-Nanoträger_
Targeting-Molekül ~ MCF-7 UWB 1.289 MCF-7 UWB 1.289 [D-Arg25]-NPY_++_++_++_++_ [D-His26]-NPY_++_++_++_++_ [D-Arg25,D-His26]-NPY_++_++_++_++_.
[D-His26, Pro34]NPY_++_++_++_++_ [Phe7, Pro34]pNPY_+++ +++_+++ +++_ [Arg6, Pro34]pNPY_+++_+++_+++_+++_ [Asn6, Pro34]pNPY_+++_+++_+++_+++_ [Cys6, Pro3lt]pNPY_+++_+++_+++_+++_ [Phe6, Pro34]pNPY_+++ +++_+++ +++_ [Pro30, Nie31, Bpa32, Leu34]NPY(28-36) +++ +++_+++ -1-++_ [Pro30, Nal32, Leu34]NPY(28-36)_+++ +++_+++____+++_ [Pro30, Nie31, Nal32, Leu34]NPY(28-36) +++ +++_+++ +++_ BIBO3304_+++_+++_+++_+++_ • PD160170_++_++_++_++_ LY366258 + ++ + ++ 1-104870_++_++_++_±±_ LY 357897_+_+_+_+_ 1-115814 ++ ++ ++ ++
Beispiel 5: Aktivitätstest verschiedener Zusammensetzungen mit eingebettetem Docetaxel an GIST-H1- und SW-13-Zellen [0111] Die Herstellungsmethode und die Cytotoxizitätstests verschiedener Zusammensetzungen wurden wie in Beispiel 4 durchgefühlt. Die Testergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt.
[0112] Tabelle 6:
Vergleich des Abtötungseffekts verschiedener Zusammensetzungen bei GIST-H1- und SW-13-Zellen
~~ __________ Nanoträger BSA-Nanoträger_Chitosan-Nanoträger_
Targeting-Molekül ~~~~ -------- SW-13 GIST-Hl SW-13 GIST-Hl [D-Arg25]-NPY_++_++_++_++_ [D-His26]-NPY_++_++_++_++_ [D-Arg25,D-His26]-NPY_++_++_++_++_ [D-His26, Pro34]NPY_++_++_++_++_ [Phe7, Pro34]pNPY_+++_+++_+++_+++_ [Arg6, Pro34]pNPY_+++_+++_+++_+++_ [Asn6, Pro34]pNPY 4-++ 4-++ 4-4-4- 4-4-4- [Cys6, PrO34]pNPY 4-4-4- 4-4-4- 4-4-4- 4-4-4- [Phe6, Pro34]pNPY_4-+4-_+++_+++_+++_ [Pro30, Nie31, Bpa32, Leu34]NPY(28-36) +++_+++_+++_+++_ [Pro30, Nal32, Leu34]NPY(28-36)_+++_+++_+++_+++_ [Pro30, Nie31, Nal32, Leu34]NPY(28-36) +++_+++_+++_+++_ BIBQ3304_+++_+++_+++_+++_ PD160170 ++ ++ ++ ++ LY366258_+_++_+_++_ J-104870 ++ ++ ++ ++ LY 357897_+_+_+_+_ J-l 15814_++_++_++_++_
Beispiel 6: Aktivitätstest verschiedener Zusammensetzungen mit eingebettetem Docetaxel an SMS-ΚΑΝ- und HEC-1B-Y5-Zellen [0113] Die Herstellungsmethode und die Cytotoxizitätstests verschiedener Zusammensetzungen wurden wie in Beispiel 4 durchgeführt. Die Testergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt.
[0114] Tabelle 7:
Vergleich des Abtötungseffekts verschiedener Zusammensetzungen bei SMS-ΚΑΝ- und HEC-1B-Y5-Zellen

Claims (9)

  1. —Nanoträger BSA-Nanoträger_Chitosan-Nanoträger_ Target-Molekül ~~~~ ~~----- SMS-ΚΑΝ 1HEC-1B-Y5 SMS-ΚΑΝ HEC-1B-Y5 [D-Arg25]-NPY_~_-_-_-_ [D-His26]-NPY_--_2_-_-_ [D-Arg25,D-His26]-NPY_~_--_ [D-His26, Pro34]NPY_--__--_-_ [Phe7, Pro34]pNPY__—_--_—_ [Arg6, Pro34jpNPY_--_--_--_—_ [Asn6, Pro34]pNPY_~~_ [Cys6, Pro34]pNPY_--_--__—_ [Phe6, Pro34]pNPY__ [Pro30, Nie31, Bpa32, Leu34]NPY(28-36) __--_ [Pro30, Nal32, Leu34]NPY(28-36)_--_---__ [Pro30, Nie31, Nal32, Leu34]NPY(28-36) _—_—_=_ BIBO3304_~_—_--__ PD160170_--_--_-_Z_ LY366258_-_~_--_»_ J-104870__—_---_2;_ LY 357897_--_=_-_z_ M15814 I— I— I— I— [0115] Aus den Testergebnissen der Tabellen 5-7 ist ersichtlich, dass die mit dem Targeting-Molekül der vorliegenden Erfindung gekoppelten Zusammensetzungen einen starken Abtötungseffekt bei MCF-7-, UWB1.289-, GIST-H1- und SW-13-Zellen aufweist. Bei einer CTxt von 5 pg/ml lagen die Überlebensraten der MCF-7-, GIST-H1- und SW-13-Zellen wesentlich unter 30%, und die Überlebensrate der UWB1.289-Zellen lag bei 60%. Jedoch war der Abtötungseffekt bei den SMS-ΚΑΝ- und HEC-1B-Y5-Zellen nicht signifikant, die Überlebensrate lag wesentlich über 80%. Somit weisen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung gute Selektivität auf, sie besitzen einen starken Targetingeffekt bei Brustkrebs-, Eierstockkrebs-, Nierenkrebs- und Magenkrebszellen, und sie zeigen einen starken Abtötungseffekt bei Krebszellen und einen geringen Abtötungseffekt bei Gehirntumoren und Endometriumtumorzellen. [0116] Die gesamte in der vorliegenden Anmeldung zitierte Literatur soll als Inhalt der Anmeldung betrachtet werden, sowie jedes einzelne zitierte Dokument. Ausserdem soll klar sein, dass ein Fachmann nach der Durchsicht obiger Offenbarungen vielfältige Verbesserungen und Veränderungen vornehmen kann, und diese Äquivalenzen der vorliegenden Erfindung ebenfalls in den Schutzbereich der folgenden Ansprüche fallen. Patentansprüche
    1. Komplex, gekennzeichnet dadurch, dass der Komplex umfasst: einen Nanoträger; und ein Targeting-Molekül gekoppelt an die Oberfläche des Nanoträgers; wobei das Targeting-Molekül ein Peptid-Agonist-Molekül oder ein Nicht-Peptid-Antagonist-Molekül ist, welches mit Neuropeptid-Y-Rezeptoren in hoher Spezifizität und Effizienz, dabei verschiedene biologische Aktivität bewirkend; wobei das Peptid-Agonist-Molekül aus folgender Liste ausgewählt ist: [D-Arg25]-NPY, [D-His26]-NPY, [D-Arg25, D-His26]-NPY, [Arg6, Pro34]pNPY, [Asn6, Pro34]pNPY, [Cys6, Pro34]pNPY, [Phe6, Pro34]pNPY, [Arg7, Pro34]pNPY, [D-His26, Pro34]NPY, [Phe7, Pro34]pNPY, [Pro30, Nie31, Bpa32, Leu34]NPY(28-36), [Pro30, Nal32, Leu34]NPY(28-36), [Pro30, Nie31, Nal32, Leu34]NPY(28-36), oder Kombinationen davon; wobei das Nicht-Peptid-Antagonist-Molekül aus folgender Gruppe ausgewählt ist: BIBO3304, PD160170, LY366258, J-104870, LY357897, J-115814, oder Kombinationen davon; und der Nanoträger hat eine Partikelgrösse von 200 nm oder kleiner und einen Polydispersitätsindex (PDI) kleiner als 0,5.
  2. 2. Komplex nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass der Gehalt an Targeting-Molekül 1,11 bis 22,2 Gewichts-% des Gesamtgewichts des Komplexes beträgt.
  3. 3. Komplex nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Partikelgrösse des Nanoträgers 10-200 nm beträgt.
  4. 4. Komplex nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass der Nanoträger aus folgender Liste ausgewählt ist: Proteinbasiertes Nanopartikel, oligopeptidbasiertes Nanopartikel, phospholipidbasiertes Nanoliposom, polysaccharidbasiertes Nanopartikel, polyetherbasiertes Nanopartikel, polyesterbasiertes Nanopartikel, polyesterbasierte polymere Mizelle.
  5. 5. Zusammensetzung, gekennzeichnet dadurch, dass die Zusammensetzung umfasst: einen Komplex nach Anspruch 1; und ein Anti-Tumor-Medikament, das in dem Nanoträger des Komplexes eingeschlossen ist.
  6. 6. Zusammensetzung nach Anspruch 5 als Mittel zur Behandlung von Krebs.
  7. 7. Herstellungsmethode der Zusammensetzung nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, dass sie folgende Schritte umfasst: (1) Bereitstellen eines mit Anti-Tumor-Medikament beladenen Nanoträgers; und (2) Koppeln des Nanoträgers von Schritt (1) mit einem Targeting-Molekül, dabei wird die Zusammensetzung erhalten.
  8. 8. Herstellungsmethode nach Anspruch 7, gekennzeichnet dadurch, dass die Kopplungsreaktion ausgewählt ist aus: (1) einer Kondensationsreaktion einer Carboxygruppe mit einer Aminogruppe; (2) einer Additionsreaktion einer Sulfhydrylgruppe mit einer Maleimidgruppe; oder (3) einer nichtkovalenten Bindung von Avidin und Biotin.
  9. 9. Medikament, das umfasst: den Komplex nach Anspruch 1; ein Anti-Tumor-Medikament, das in dem Nanoträger des Komplexes eingeschlossen ist; und ein pharmazeutisch annehmbarer Träger.
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