CH703968A1 - Diagnose und Mittel zur Behandlung von Knorpelzellendefekten. - Google Patents

Abstract

Beschrieben werden ein In-vitro-Diagnoseverfahren und ein Verfahren zur Züchtung von Knorpeltransplantat. Beiden Verfahren gemeinsam ist, dass (a) eine Probe von Knorpelmasse aufgelöst wird, um isolierte Knorpelzellen zu gewinnen, und dass (b) die in Schritt (a) gewonnenen isolierten Knorpelzellen vereinzelt und anschliessend während eines bestimmten Zeitraums proliferiert werden, derart, dass die Proliferation der einzelnen Zellen durch Bildung von Zellpopulationen erkennbar wird. Zur Diagnose wird dann die Proliferationsfähigkeit der Zellen anhand der Grösse der Zellpopulationen bestimmt, während bei der Knorpelzüchtung die Zellen mit der besten Proliferationsfähigkeit selektioniert und auf ein dreidimensionales resorbierbares Gerüst aufgebracht werden, auf dem die Zellen dann so lange gezüchtet werden, bis das Transplantat die gewünschte Grösse und Zelldichte aufweist.

Description

Gebiet der Erfindung

[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Knorpeltransplantationschirurgie einschliesslich damit einhergehender Diagnostik.

Stand der Technik

[0002] Gemäss heute gängigen Verfahren, wird dem Patienten mittels Biopsie gesundes Knorpelgewebe entnommen. Daraus werden Knorpelzellen isoliert und auf ein dreidimensionales Gerüst aus resorbierbarem Material aufgebracht und darauf in vitro vermehrt, bis ein Transplantat gewünschter Grösse aufgebaut ist. Nach Erreichen der gewünschten Grösse bzw. Zelldichte wird das Knorpeltransplantat an der schadhaften Stelle implantiert.

[0003] Bei diesem Vorgehen hat sich die Lebensdauer des Transplantates als kritisch herausgestellt. Bei einer beträchtlichen Anzahl Patienten beträgt die Lebensdauer nur ca. 1 Jahr.

[0004] Ziel der vorliegenden Erfindung war es deshalb, die Lebensdauer und/oder die Qualität von Knorpeltransplantaten zu erhöhen.

[0005] Dieses Ziel wurde durch zwei Massnahmen erreicht, einerseits durch verbesserte Diagnose, andererseits durch ein verbessertes Transplantat.

Darstellung der Erfindung

[0006] Ein Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Diagnoseverfahren zur Feststellung der Qualität einer Knorpelprobe.

[0007] Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Knorpeltransplantates.

[0008] Das Ziel der vorliegenden Erfindung wurde erreicht durch Bereitstellen eines In-vitro-Verfahrens zur Beurteilung der Qualität von Knorpelmasse, das sich dadurch auszeichnet, dass in vitro (a) eine Probe von Knorpelmasse aufgelöst wird, um isolierte Knorpelzellen zu gewinnen, (b) die in Schritt (a) gewonnenen isolierten Knorpelzellen vereinzelt und anschliessend während eines bestimmten Zeitraums proliferiert werden, derart, dass die Proliferation der einzelnen Zellen durch Bildung von Zellpopulationen erkennbar wird, (c) die Proliferationsfähigkeit der Zellen anhand der Grösse der Zellpopulationen bestimmt wird.

[0009] Schritt a) wird im Wesentlichen analog zu heute gängigen Verfahren zur Gewinnung von Knorpelzellen durchgeführt, insbesondere unter Aufschluss der Knorpelmasse, z.B. einer Biopsie, mittels Hyaluronidase.

[0010] Die in Schritt a) gewonnenen Zellen werden dann vereinzelt und während einer vorbestimmten Zeit, z.B. während 4 Tagen, unter Bedingungen, die Proliferation erlauben, kultiviert. Um möglichst naturnahe Verhältnisse zu schaffen, sollte das Kulturmedium nicht speziell mit Hormonen und/oder Proteinen/Peptiden angereichert sein. Vorteilhaft ist vielmehr ein Minimalmedium, wie Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium. Dieses enthält Anorganische Salze als Quelle für Ca, Fe, Mg, SO4<2><->, PO4<3><->sowie NaCl, KCl für Isotonie; Aminosäuren; Vitamine; Andere Komponenten, nämlich die Energiequellen D-Glucose, und Natriumpyruvat sowie gegebenenfalls Phenolrot zur Feststellung von kritischen Veränderungen im pH-Wert.

[0011] Nicht enthalten in diesem Medium sind Hormone und Proteine/Peptide, da die Knorpelqualität unter möglichst naturnahen Bedingungen ermittelt werden soll. Wie bereits oben erwähnt, werden solche vorzugsweise auch nicht zugegeben und wenn, so ist sicherzustellen, dass sie immer in gleichen Konzentrationen und in gleichbleibender Reinheit/Aktivität eingesetzt werden, da die Beurteilung der Proliferationsfähigkeit anhand von Erkenntnissen erfolgt, die mit Knorpelmaterial bekannter Qualität gewonnen wurden, weshalb die Tests möglichst standardisiert sein müssen. In speziellen Fällen kann ein Antikörper gegen TNF-alpha zugegeben werden, da es sich herausgestellt hat, dass eine schlechte Knorpelproliferation bei vielen (bis zu 70%) der Patienten mit einer hohen TNF-alpha-Konzentration einhergeht.

[0012] Parallel dazu (oder in speziellen Fällen alleine) kann die Prolifertion in Kulturmedim getestet werden, das autologes Blutserum enthält, d.h. Blutserum des Patienten, von dem das Knorpelmaterial stammt. Da das autologe Blutserum wachstumsinhibierende Faktoren enthalten kann, gibt Proliferation in einem solches Serum enthaltenden Medium Informationen zur zu erwartende Proliferationsfähigkeit im Körper, nicht aber notwendigerweise Informationen zur Qualität des Knorpelmaterials als solchem. Ergibt der Parallelversuch wesentlich schlechtere Proliferation, so ist es angezeigt, das Blut auf wachstumsinhibierende Faktoren zu untersuchen und solche gezielt zu inhibieren.

[0013] Bei der erfindungsgemässen Qualitätsprüfung werden die Zellen beispielsweise stark verdünnt in eine Petrischale gegeben und auf Agar-Agar/Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium bei 37 °C gezüchtet.

[0014] Die Anzahl Zellteilungen der einzelnen Zellen bzw. der proliferationsfähigsten x % der Zellen (beispielsweise der besten 5 % der Zellen) nach einer vorbestimmten Zeit werden bestimmt und der Mittelwert berechnet.

[0015] Für einen Zeitraum von 4 Wochen haben sich in nicht angereichertem Minimalmedium bisher bis zu drei Zellteilungen als schlecht, ca. 5 Teilungen als gut und 10 Teilungen als sehr gut herausgestellt. Bei guter oder sogar sehr guter Proliferationsfähigkeit ist mit guter Lebensdauer eines Knorpelimplantates zu rechnen, bei 3 Teilungen und weniger ist der Erfolg grundsätzlich in Frage gestellt. Die oben angegebene Teilungsfähigkeit wurde in einem Verfahren ermittelt, in dem das Kulturmedium während der Diagnosedauer von 4 Wochen unverändert beibehalten, d.h. weder Supplementiert noch erneuert, wurde. Bei Supplementierung oder Erneuerung des Kulturmediums können sich diese Werte bzw. der Zeitraum etwas ändern.

[0016] Das Diagnoseergebnis, insbesondere die unter Diagnosebedingung am besten proliferierenden Zellen, können selektioniert und auf ein dreidimensionales Gerüst aus resorbierbarem Material aufgebracht und darauf gezüchtet werden. Als Zuchtmedium dient wiederum ein Minimalmedium, wie Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium. Für die Temperatur und die relative Feuchtigkeit (r.h.) können Standardwerte gewählt werden. Die Temperatur liegt üblicherweise bei ca. 37 °C.

[0017] Für die Knorpelzüchtung kann ebenfalls autologes Blutserum zugegeben werden, beispielsweise, wenn dieses im Parallelversuch zu einer erhöhten Proliferationsfähigkeit geführt hat oder wenn gezielt Inhibitoren gegen das Zellwachstum beeinträchtigende Stoffe, wie TNF-alpha, zugegeben werden.

[0018] Das Kulturmedium wird vorzugsweise alle paar Tage ausgewechselt. Die Auswechslung erfolgt beispielsweise alle 2 bis 8 Tage, üblicherweise alle 3 bis 6 Tage, insbesondere alle 4 bis 5 Tage. Die übliche Proliferationsdauer bis zum fertigen Transplantat beträgt 3 bis 8 Wochen, üblicherweise mindestens 4 Wochen, insbesondere 4 bis 6 Wochen.

[0019] Da die Proliferationsfähigkeit der Zellen genetisch bedingt ist, kann bei Knorpelzellen mit sehr tiefer Proliferationsfähigkeit mittels Gentherapie, z.B. durch partielle Rückführung in Richtung Embryonalzustand vor der Herstellung des Knorpeltransplantats eine Steigerung der Proliferationsfähigkeit erzielt werden. Eine solche Rückführung kann beispielsweise erzielt werden durch Beschiessen mit Antisense-RNA, die beispielsweise gegen (i) drei spezielle Loci auf den Chromosomen 1 und 6 gerichtet ist und/oder (ii) gegen Telomere. Von derart «verjüngten» Zellen werden dann analog dem oben beschriebenen Verfahren die am besten proliferierenden Zellen für die Herstellung des Transplantats selektioniert und wie oben beschrieben eingesetzt.

[0020] Wie bereits oben kurz erwähnt, hat es sich ferner herausgestellt, dass neben der Bestimmung der Proliferationsfähigkeit auch die Bestimmung des Gehalts an Oberflächenzytokinen, insbesondere TNF-alpha, ein wichtiger Indikator für den Zustand des Knorpels und damit auch für das Gelingen der Transplantation ist.

[0021] Zur Erhöhung des TNF-alpha Gehalts können verschiedene Faktoren führen, beispielsweise eine genetische Prädisposition, die sich auch in Form bestimmter Krankheiten, wie beispielsweise Psoriasis, äussern kann, oder ein oft viele Jahre zurückliegender Zeckenbiss. Eine entsprechende Prädisposition kann durch Nachweis eines speziellen Polymorphismus auf Chromosom 6, der insbesondere in Verbindung mit erhöhtem TNF-alpha Gehalt und Psoriasis gefunden wird, und/oder durch Nachweis von Zeckengenen im Körper des Patienten, z.B. durch In-vitro-Untersuchung einer Blutprobe, z.B. mittels PCR unter Verwendung geeigneter, möglichst selektiver Primer, festgestellt werden.

[0022] Informationen dazu finden sich z.B. in Kerstin Bade, Identifikation Psoriasis-assoziierter Polymorphismen im MHC (2004), Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel und darin zitierter Literatur.

[0023] TNF-alpha (Tumornekrosefaktor) ist ein multifunktionales proinflammatorisches Cytokin, das an der schnellen Abwehr von Infektionen beteiligt ist. In erkrankter Haut von an Psoriasis vulgaris erkrankten Personen wurde festgestellt, dass eine Überexpression von TNF-alpha erfolgt und dieser Promoter-Polymorphismus auf Chromosom 6, Position -238, mit Typ I-Psoriasis und psoriatischer Arthritis assoziiert. (Bade, K. (2004), insbesondere Seite 112 und darin zitierte Literatur).

[0024] Bei hohem oder sehr hohem Gehalt an TNF-alpha ist die Wahrscheinlichkeit für eine rheumatologische Erkrankung wie Arthrose/Arthritis hoch und die Wahrscheinlichkeit für einen guten Langzeiterfolg einer Knorpeltransplantation gering. Die Wahrscheinlichkeit für einen Langzeiterfolg kann erhöht werden, wenn TNF-alpha blockiert wird, z.B. durch TNF-alpha Inhibitoren wie Antikörper oder Antisense-RNA. Solche TNF-alpha-Inhibitoren können prophylaktisch und/oder vor der Transplantation und/oder mit dem Transplantat und/oder nachfolgend auf die Transplantation verabreicht werden. Eine gute Verabreichungsart ist mittels eines Depots im Transplantat selbst. Ein solches kann in Form von Wirkstoffhaltigen Mikroglobuli mit rascher und/oder verzögerter Freisetzung ins Transplantat, z.B. in die resorbierbare Matrix eingearbeitet werden, so dass die Freisetzung durch Auflösungs-, Diffusions- und Resorptionsvorgänge gesteuert wird. Alternativ können sowohl Antikörper, wie auch Antisense-RNA mittels Spritze ins geschädigte Gelenk oder in dessen unmittelbare Nähe appliziert werden. Als weitere Variante können Zellen, die für die Knorpelbildung herangezogen werden sollen, in vitro genetisch modifiziert werden, so dass zumindest ein Teil derselben fähig ist, selbst einen Antikörper oder Antisense-RNA gegen TNF-alpha herzustellen.

Beschreibung von Ausführungsformen der Erfindung

[0025] Sowohl zur Beurteilung der Qualität von Knorpelmasse, als auch für die Herstellung des Transplantats wird in vitro eine Probe von Knorpelmasse aufgelöst, um isolierte Knorpelzellen zu gewinnen. Dies geschieht nach bekannten Verfahren, z.B. mittels Hyaluronidase.

[0026] Die im obigen Schritt gewonnenen isolierten Knorpelzellen werden so vereinzelt, dass um jede Zelle genügend Raum bleibt, damit die Zellhaufen auch bei ca. zehnmaliger Proliferation klar unterscheidbar bleiben. Anschliessend werden die Zellen unter Proliferationsbedingungen während eines bestimmten Zeitraums proliferiert. Die gebildeten Zellpopulationen werden dann beurteilt und im Falle der Diagnose mit unter identischen Bedingungen gewonnenen Vergleichsdaten verglichen, für die Züchtung eines Transplantats selektioniert.

[0027] Die Proliferation der vereinzelten Zellen für die Qualitätsbeurteilung erfolgt vorzugsweise in zweidimensionalen Zellkulturen, damit die durch die einzelnen Zellen gebildeten Populationen gut erkennbar bzw. auszählbar sind. Übliche zweidimensionale Zellkulturen werden in Petrischalen auf Agar-Agar gezüchtet. Speziell an diesem Diagnoseverfahren ist, dass das für die Proliferation erforderliche Kulturmedium vorzugsweise ein Minimalmedium ist, das vorzugsweise nur die für die Proliferation notwendigen Bestandteile aufweist, wie die wesentlichsten Spurenelemente, Vitamine, Aminosäuren und Energiespender, also beispielsweise ein Medium, das Anorganische Salze als Quelle für Ca, Fe, Mg, SO4<2><->, PO4<3><->sowie NaCl und KCl; Aminosäuren; Vitamine; D-Glucose, und Natriumpyruvat sowie gegebenenfalls Phenolrot enthält oder aus diesen Stoffen und Wasser besteht.

[0028] Ein gut geeignetes Medium ist beispielsweise ein Medium, das für die Züchtung von Lymphozyten geeignet ist. Ein solches ist beispielsweise das Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, das neben Wasser die in Tabelle 1 aufgeführten Stoffe enthält und insbesondere nur diese Stoffe enthält.

[0029] In einer speziell bevorzugten Ausführungsform sollte das Minimalmedium frei sein von Hormonen und/oder Proteinen/Peptiden. Insbesondere sollte es keinerlei Wachstumsfaktoren enthalten oder falls doch in genau reproduzierbaren Mengen, Reinheit und Aktivität.

Tabelle 1:

[0030] <tb>Stoffgruppe<sep>Stoff<sep>Menge [mg/l] <tb>Anorganische Salze:<sep>CaCl2 (wasserfrei)<sep>200,00 <tb><sep>Fe(NO3) ⋅ 9 H2O<sep>0,10 <tb><sep>KCl<sep>400,00 <tb><sep>MgSO4 (wasserfrei)*<sep>97,67 <tb><sep>NaCl<sep>6400,00 <tb><sep>NaH2PO4 ⋅ H2O<sep>125,00 <tb>Aminosäuren:<sep>L-Arginin ⋅ HCl<sep>84,00 <tb><sep>L-Cystin-2HCl<sep>63,00 <tb><sep>L-Glutamin<sep>584,00 <tb><sep>Glycine<sep>30,00 <tb><sep>L-Histidin-HCl-H2O<sep>42,00 <tb><sep>L-Isoleucin<sep>105,00 <tb><sep>L-Leucin<sep>105,00 <tb><sep>L-Lysin-HCl<sep>146,00 <tb><sep>L-Methionin<sep>30,00 <tb><sep>L-Phenylalanin<sep>66,00 <tb><sep>L-Serine<sep>42,00 <tb><sep>L-Threonin<sep>95,00 <tb><sep>L-Tryptophan<sep>16,00 <tb><sep>L-Tyrosine 2Na ⋅ 2H2O<sep>104,33 <tb><sep>L-Valin<sep>94,00 <tb>Vitamine:<sep>D-Calciumpantothenat<sep>4,00 <tb><sep>Cholinchlorid<sep>4,00 <tb><sep>Folsäure<sep>4,00 <tb><sep>i-Inositol<sep>7,20 <tb><sep>Niacinamid<sep>4,00 <tb><sep>Riboflavin<sep>0,40 <tb><sep>Thiamin HCl<sep>4,00 <tb>Andere Komponenten:<sep>D-Glucose<sep>4500,00 <tb><sep>Phenolrot<sep>15,00 <tb><sep>Natriumpyruvat<sep>110,00* die Magnesiumkonzentration kann auf Knorpelzellen angepasst werden, während dem die anderen Mengen üblicherweise im angegebenen Rahmen bleiben.

[0031] Die Temperatur wird sowohl für die Proliferation als auch für die Transplantatzüchtung um ca. 37 °C gehalten, insbesondere bei 37 ± 0.5 °C.

[0032] Wird für die Proliferation bzw. die Transplantatzüchtung ein hormon- und protein-/peptid-freies Medium verwendet, so hat sich für die Beurteilung der Proliferationsfähigkeit ein Zeitraum von mindestens 3 Wochen, vorzugsweise von ca. 4 Wochen als günstig herausgestellt, für die Züchtung ein Zeitraum von 3 bis 8 Wochen, insbesondere von 4 bis 6 Wochen.

[0033] Für die Bestimmung der Proliferationsfähigkeit können alle Zellpopulationen einer Probe oder auch nur ein Teil der Zellpopulationen herangezogen werden. Wesentlich ist, dass die am besten proliferierenden Zellen berücksichtigt werden und dass die Untersuchung der Referenzproben identisch erfolgte. Beispielsweise können die besten 5 % ausgewertet werden, erkennbar an den grössten Zellpopulationen oder auch die besten 10%.

[0034] Bei der Transplantatzüchtung werden vorzugsweise nur die Zellen mit der besten Proliferationsfähigkeit selektioniert und auf ein dreidimensionales, resorbierbares Gerüst aufgebracht. Diese Selektion kann je nach Prolifarationsfähigkeit und Menge eine grössere oder eine kleinere Anzahl Zellen ergeben. Soll z.B. mit massig proliferierenden Zellen ein grosses Transplantat hergestellt werden, so werden vorzugsweise mehr Zellen auf das resorbierbare Gerüst aufgebracht, als wenn die Teilungsfähigkeit sehr hoch ist. Bei schlechter Proliferation kann auch eine Behandlung der Zellen mit Antisense-RNA zur Erhöhung der Proliferationsfähigkeit der Zellen vorgesehen werden. Bei dieser wird den Zellen In-vitro-RNA zugegeben, beispielsweise werden diese mit Antisense-RNA beschossen. Diese Antisense-RNA kann beispielsweise gegen 3 spezielle Loci auf den Chromosomen 1 und 6 gerichtet sein, oder gegen Telomere.

[0035] Anschliessend erfolgt vorzugsweise eine Selektion der am besten proliferierenden Zellen.

[0036] Die Behandlung mit Antisense-RNA kann an einer nicht selektionierten Knorpelzellprobe vorgenommen werden und Selektion anschliessend erfolgen, oder die Knorpelzellprobe kann hinsichtlich der optimal proliferierenden Zellen (vor)selektioniert und nur die am besten proliferierenden Zellen einer Behandlung mit Antisense-RNA unterzogen werden, gegebenenfalls gefolgt von einer zweiten Selektion nach erfolgter Behandlung.

[0037] Die selektionierten Zellen werden dann auf ein resorbierbares Gerüst aufgebracht und auf diesem resorbierbaren Gerüst so lange gezüchtet, bis das Transplantat die gewünschte Grösse und Zelldichte aufweist. Dies ist je nach Bedingungen meist nach 3 bis 8, insbesondere 4 bis 6 Wochen in Minimalmedium der Fall. Werden Hormone und/oder Proteine und/oder Peptide, insbesondere Wachstumsfaktoren zugegeben, so kann das Knorpelwachstum beschleunigt werden, allerdings mit dem Risiko, dass schadhaftes Gewebe entsteht, das zur Bildung von Tumoren neigt.

[0038] Als resorbierbare Gerüstmaterialien geeignet sind beispielsweise filzartige Fasergewebe in der Grösse des zu behandelnden Defekts, beispielsweise Gerüstmaterialien aus Polylactonen (PLA), oder Gerüste, aufgebaut aus Alginatkügelchen.

[0039] Ein weiterer wesentlicher Faktor, der zum Gelingen der Transplantation und auch zur Beurteilung des Arthrose/Arthritis-Risikos dienen kann, ist die Bestimmung des Zytokin-Gehalts auf dem Knorpelgewebe, insbesondere des Gehalts and TNF-alpha. Dieser Gehalt kann auf eine Prädisposition hinweisen, beispielsweise bedingt durch eine Krankheit wie Psoriasis oder durch einen gegebenenfalls viele Jahre zurückliegenden Zeckenbiss.

[0040] Überraschenderweise wurde nämlich gefunden, dass bei bis zu 70% der Patienten mit Knorpeldefekten die TNF-alpha-Werte zu hoch sind und dass bei dieser Patientengruppe der Anteil an unter Psoriasis leidenden Personen überdurchschnittlich hoch ist. Diesen Patienten können verschiedene Polymorphismen zugeordnet werden, z.B. einer auf Chromosom 6.

[0041] Im Rahmen der Ursachenermittlung wurde ferner vollkommen überraschend festgestellt, dass bei Patienten mit Knorpeldefekten und erhöhter Konzentration an TNF-alpha Zeckengene mit signifikant höherer Wahrscheinlichkeit nachgewiesen werden können als bei einer Referenzgruppe an Personen analoger Alters- und Geschlechtsstruktur.

[0042] Grundsätzlich können alle Zeckengene verwendet werden, bevorzugte Gensequenzen sind aber jene mit einer hohen Selektivität, da dadurch der Untergrund vermindert und die Nachweisgrenze gesenkt werden kann.

[0043] Die übliche Nachweisgrenze mittels PCR liegt etwa bei 10~10 neuere Forschungen legen aber nahe, dass bei Verwendung speziell selektiver Primer viel tiefere Nachweisgrenzen erreichbar sind.

Claims (17)

1. In-vitro-Verfahren zur Beurteilung der Qualität von Knorpelmasse, worin in vitro (a) eine Probe von Knorpelmasse aufgelöst wird, um isolierte Knorpelzellen zu gewinnen, (b) die in Schritt (a) gewonnenen isolierten Knorpelzellen vereinzelt und anschliessend während eines bestimmten Zeitraums proliferiert werden, derart, dass die Proliferation der einzelnen Zellen durch Bildung von Zellpopulationen erkennbar wird, (c) die Proliferationsfähigkeit der Zellen anhand der Grösse der Zellpopulationen bestimmt wird.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Auflösung der Knorpelmasse die Zugabe von Hyaluronidase einschliesst.

3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Proliferation in zweidimensionalen Zellkulturen, beispielsweise auf Agar-Agar-Platten, mit einem Minimalmedium erfolgt.

4. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Minimalmedium – Anorganische Salze als Quelle für Ca, Fe, Mg, SO4<2><->, PO4<3><-> sowie NaCl und KCl; – Aminosäuren; – Vitamine; – D-Glucose, und Natriumpyruvat sowie gegebenenfalls Phenolrot enthält.

5. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Minimalmedium frei ist von Hormonen und/oder Proteinen/Peptiden.

6. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitraum in Schritt (b) ca. 4 Wochen beträgt.

7. Verfahren gemäss irgend einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Proliferationsfähigkeit in Schritt (c) nur ein bestimmter Anteil der Zellpopulationen verwendet wird, insbesondere ein bestimmter Prozentsatz der am besten proliferierenden Zellen bzw. der grössten Zellpopulationen.

8. Verfahren gemäss irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Proliferationsfähigkeit parallel mit reinem Minimalmedium und mit Minimalmedium, das mit autologem Blutserum angereichert ist, bestimmt und anschliessend verglichen wird.

9. Verfahren zur Herstellung eines Knorpeltransplantats, dadurch gekennzeichnet, dass (i) in vitro eine Probe von Knorpelmasse aufgelöst wird, um isolierte Knorpelzellen zu gewinnen, (ii) die in Schritt (i) gewonnenen isolierten Knorpelzellen vereinzelt und anschliessend während eines bestimmten Zeitraums proliferiert werden, derart, dass die Proliferation der einzelnen Zellen durch Bildung von Zellpopulationen erkennbar wird, (iii) die Zellen mit der besten Proliferationsfähigkeit selektioniert und auf eine dreidimensionales resorbierbares Gerüst aufgebracht werden, (iv) die Zellen auf dem resorbierbaren Gerüst so lange gezüchtet werden, bis das Transplantat die gewünschte Grösse und Zelldichte aufweist.

10. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Auflösung der Knorpelmasse die Zugabe von Hyaluronidase einschliesst.

11. Verfahren gemäss Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Proliferation in Schritt (ii) in zweidimensionalen Zellkulturen, beispielsweise auf Agar-Agar-Platten, mit einem Minimalmedium erfolgt.

12. Verfahren gemäss irgend einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung auf dem resorbierbaren Gerüst mit einem Minimalmedium erfolgt.

13. Verfahren gemäss Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Minimalmedium – Anorganische Salze als Quelle für Ca, Fe, Mg, SO4<2><->, PO4<3><->sowie NaCl und KCl; – Aminosäuren; – Vitamine; – D-Glucose, und Natriumpyruvat sowie gegebenenfalls Phenolrot enthält.

14. Verfahren gemäss irgend einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Minimalmedium frei ist von Hormonen und/oder Proteinen/Peptiden.

15. Verfahren gemäss irgend einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitraum in Schritt (ii) ca. 4 Wochen beträgt und/oder im Schritt (iv) 4 bis 6 Wochen.

16. Verfahren gemäss irgend einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in Schritt (ii) und/oder Schritt (iii) mittels Antisens-RNA in einen besser proliferierenden Zustand überführt werden.

17. Verfahren gemäss irgendeinem der Ansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in einem Kulturmedium gezüchtet werden, das einen Inhibitor für TNF-alpha enthält.