Anwendungsgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Extrakts mit einer starken Antiinflammations-, Antiblutplättchenaggregations- und Antifungi-Aktivität aus Zingiber officinale sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die diesen Extrakt enthalten.
Hintergrund der Erfindung
Chinesische Roharzneimittel oder -gewürze, z.B. Zingiber officinale, Eugenia caryophyllata, Allium sativum, werden in der Medizin und zum Würzen von Nahrungsmitteln verwendet. Roher Ingwer wird als Antiemetikum und Expektorans als Antitussivum und Verdauungsbeschleuniger verwendet. Halbgetrockneter alter roher Ingwer wird auch gegen Magenschmerzen, Brustschmerzen, Rückenschmerzen im unteren Bereich, Husten, gewöhnliche Erkältung und als Heilmittel für eine Form eines \dems, die als "Wasserstau" bezeichnet wird, verwendet. Zingeron ist die Hauptkomponente, die für die Würzungs-Eigenschaften von Ingwer verantwortlich ist; Gingerol und Shogaol sind weitere scharfe Komponenten im Ingwer.
Gingerol weist eine cardiotonische Wirkung auf, unterdrückt die Kontraktion von isolierten Portalvenen bei Mäusen und moduliert die durch Eicosanoid induzierte Kontraktion der Blutgefässe bei Mäusen und Ratten. Shogaol weist eine den Blutdruck erhöhende Wirkung auf. Sowohl Gingerol als auch Shogaol sind mutagen, während Zinger und Zingeron, wie gefunden wurde, eine antimutagene Aktivität aufweisen. Shogaol weist eine Inhibitor-Aktivität gegenüber dem durch Carrageenin induzierten Pfotenödem und gegenüber Blutplättchenaggregation auf [US-Patent Nr. 5 804 603, "Hintergrund der Erfindung"].
Bisher haben viele Veröffentlichungen gezeigt, dass Zingiber officinale verschiedene physiologische Aktivitäten aufweist. Zu typischen Beispielen gehören ein die Krebsmetastase unterdrückendes Agens, beschrieben in der japanischen Patentpublikation Nr. 7-258 104; ein Synthese-Promotor für den neurotropen Faktor, der wirksam ist bei Nervenschädigungs-Erkrankungen wie der Alzheimer-Dementia oder der Parkinson'schen Krankheit, wie in der japanischen Patentpublikation Nr. 7-25 777 beschrieben; ein Antirheumamittel, wie es in der japanischen Patentpublikation Nr. 6-293 653 und in den US-Patenten Nr. 5 494 668 und 5 683 698 beschrieben ist; eine Antimikroben-Zusammensetzung, wie sie in der japanischen Patentpublikation Nr. 6-227 931 beschrieben ist; und eine analgetische Zusammensetzung, wie sie in der japanischen Patentpublikation Nr. 6-107 556 beschrieben ist.
Ingwer enthält 1 bis 4% ätherisches \l (\lharz).
Während der letzten 45 Jahre wurden viele chemische Untersuchungen bezüglich der Bestandteile des ätherischen \ls durchgeführt. Insgesamt wurde mehr als 200 unterschiedliche flüchtige Materialien in dem ätherischen \l identifiziert, dessen pharmakologische Aktivität begrenzt ist. Das ätherische \l enthält ein Gemisch von verschiedenen Terpenen sowie einige andere Nicht-Terpenoid-Verbindungen. Obgleich dies höchst spekulativ ist, lassen die experimentellen Daten und Beobachtungen vermuten, dass Ingwer sowohl die Cyclooxygenase- als auch die Lipoxygenase-Produkte hemmt, d.h. ein dualer Inhibitor der Eicosanoid-Synthese sein kann. Insgesamt 56 Patienten (28 mit Rheumatoider Arthritis, 18 mit Osteoarthritis und 10 mit Muskelbeschwerden) verwendeten gepulverten Ingwer gegen ihre Beschwerden.
Unter den Arthritis-Patienten wurden bei mehr als drei Vierteln in unterschiedlichem Grade die Schmerzen und die Schwellung gelindert. Bei allen Patienten mit Muskelbeschwerden trat eine Linderung der Schmerzen ein. Keiner der Patienten berichtete über nachteilige Wirkungen während der Dauer der Ingwer-Einnahme, die in dem Bereich von 3 Monaten bis 2,5 Jahren lag (Srivastava und Mustafa, "Medical Hypotheses" 1992; 39, 342-348).
Die nicht-steroidalen antiinflammatorischen (entzündungshemmenden) Arzneimittel weisen drei Hauptwirkungen auf, die alle in Beziehung stehen zur Cyclooxygenase-Hemmung, die zu einer verminderten Bildung von Prostanoiden führt. Erstens wird eine antiinflammatorische Wirkung erzielt durch die verminderte Bildung von Vasodilator-Prostaglandinen (PGE2, PGI2), die zu einer geringeren Gefässerweiterung und indirekt zu einem geringeren \dem führt. Zweitens wird ein analgetischer Effekt erzielt durch eine verminderte Prostaglandin-Bildung (eine geringere Sensibilisierung der nozizeptiven Nervenenden gegenüber den inflammatorischen Mediatoren Bradykinin und 5-Hydroxytryptamin). Drittens ist ein antipyretischer Effekt wahrscheinlich zurückzuführen auf eine Abnahme des Mediators PGE2, der als Antwort auf inflammatorische Pyrogene gebildet wird, so wie Interleukin-1.
Da Ingwer die Prostanoid-Synthese hemmt und auch 5-Lipoxygenase bildet, könnten seine Besserungseffekte bei Arthritis und Muskelbeschwerden in Beziehung stehen zu einer verminderten Bildung von Prostanoiden und Leukotrienen. Wegen dieser Möglichkeit wurde eine Abnahme der durch Carrageenan-induzierten \dem-Bildung an der Rattenpfote nach Verabreichung von 3 g Ingwerextrakt nachgewiesen, und die Wirksamkeit des Extrakts in einem akuten Inflammationstest scheint vergleichbar zu sein mit derjenigen, die Acetylsalicylsäure in der gleichen Studie aufwies (N. Mascolo et al., "Journal of Ethnopharmocology" 1989, 27, 129-140).
Dermatophytes, insbesondere Trichophyton rubrum und Trichophyton mentagrophytes, sind die üblichen Pathogene der Onychomycose und Tinea pedis [DT. Roberts, "British Journal of Dermatology", 141. Ergänzung 56: 1-4, Nov. 1999; YB. Roldan et al., "Mycoses", 43(5): 181-183, 2000]. Pityrosporum ovale (Malassezia furfur) ist das ethiologische Agens von Pityriasis vesicolor, Pityrosporum folliculitis und Malassezia intertrigo. Mehrere Untersuchungen weisen auf einen starken Zusammenhang von Pityrosporum ovale mit seborrhoischer Dermatitis und Schuppenbildung, einer milderen Form der seborrhoischen Dermatitis hin [P. Nenoff et al., "Dermatology", 191(4): 311-314, 1995; A. C. Bulmer et al., "Mycopathologia", 147(2): 63-65, 1999].
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Extrakte aus Ingwer-Rhizomen (-Wurzelstöcken), die eine Aktivität in einem in vitro-Antiblutplättchen-Aggregationstest, eine inhibierende Wirkung auf das durch Carrageenin induzierte Pfotenödem und eine Antifungi-Aktivität gegenüber Trichophyton mentagrophytes und Pityrosporum ovale aufweisen. Die Extrakte werden hergestellt durch Extrahieren von Ingwer-Rhizomen bzw. -Wurzelstöcken mit einem organischen Lösungsmittel (z.B. Ethylether, Aceton, Methanol und Ethanol) oder überkritischem CO2 oder durch Wasserdampf-Destillation von Ingwer-Rhizomen, wobei man eine rohe Flüssigkeit erhält, und Durchführung einer Umkehrphasen-Chromatografie mit der genannten rohen Flüssigkeit, wobei man die Extrakte erhält, die Shogaole, Gingerole und/oder Dehydrogingerdion enthalten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie in dem "Hintergrund der Erfindung" angegeben, wird Ingwer gegen Entzündung und zur Schmerzlinderung verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein wirksames Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit einer starken Antiinflammations-, Antiblutplättchen-Aggregations- und Antifungi-Aktivität aus Ingwer-Rhizomen (-Wurzelstöcken). Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte stark wirksame Pro dukt hat eine im Wesentlichen konstante Zusammensetzung, sodass seine pharmakologischen Effekte festgelegt sind.
Das wirksame Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit einer hohen Antiinflammations-, Antiblutplättchen-Aggregations- und Antifungi-Aktivität aus Ingwer-Rhizomen (-Wurzelstöcken) gemäss der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Stufen:
a) Herstellung einer rohen Flüssigkeit aus Ingwer-Rhizomen;
b) Einführung der rohen Flüssigkeit in eine Umkehrphasen-Chromatografie-Kolonne und Eluieren der Kolonne nacheinander mit Wasser, einem ersten Eluierungsmittel und einem zweiten Eluierungsmittel, wobei das genannte zweite Eluierungsmittel eine Polarität aufweist, die schwächer ist als diejenige des ersten Eluierungsmittels, jedoch stärker ist als diejenige von Chloroform, sodass ein erstes Eluat beim Eluieren mit dem ersten Eluierungsmittel und ein zweites Eluat beim Eluieren mit dem zweiten Eluierungsmittel erhalten werden;
c) Entfernung des ersten Eluierungsmittels aus dem ersten Eluat durch Verdampfen, sodass ein erstes konzentriertes Eluat erhalten wird, das als stark wirksames (potentes) Produkt verwendet werden kann; und
d) Entfernen des zweiten Eluierungsmittels aus dem zweiten Eluat durch Verdampfen, sodass ein zweites konzentriertes Eluat erhalten wird, das als stark wirksames (potentes) Produkt verwendet werden kann;
wobei die Stufe (a) die Stufen (i) bis (iv) oder die Stufe (I), die Stufe (I min ) oder die Stufe (I min min ) umfasst, wobei die genannten Stufen (i) bis (iv) die Folgenden sind:
(i) das Zerkleinern von frischen Ingwer-Rhizomen und das Filtrieren der resultierenden Mischung unter Bildung eines Filtrats und eines Rückstandes;
(ii) das Extrahieren des Filtrats mit einem ersten organischen Lösungsmittel, die Abtrennung der resultierenden Extraktionslösung des ersten organischen Lösungsmittels und das Verdampfen des ersten organischen Lösungsmittels aus der Extraktions-Lösung unter Bildung einer ersten konzentrierten Extraktions-Lösung;
(iii) das Extrahieren des Rückstandes mit einem zweiten organischen Lösungsmittel, das Abtrennen der resultierenden Extraktionslösung des zweiten organischen Lösungsmittels und das Verdampfen des zweiten organischen Lösungsmittels aus der Extraktionslösung unter Bildung einer zweiten konzentrierten Extraktionslösung; und
(iv) das Kombinieren der ersten konzentrierten Extraktionslösung mit der zweiten konzentrierten Extraktionslösung unter Bildung der rohen Flüssigkeit;
wobei es sich bei der genannten Stufe (I) handelt um:
(I) das Extrahieren eines Pulvers aus getrockneten Ingwer-Rhizomen mit einem organischen Lösungsmittel, das Abtrennen der resultierenden Extraktionslösung des organischen Lösungsmittels und das Verdampfen des organischen Lösungsmittels aus der Extraktionslösung unter Bildung der rohen Flüssigkeit;
wobei es sich bei der genannten Stufe (I min ) handelt um:
(i min ) das Wasserdampf-Destillieren eines Pulvers aus getrockneten Ingwer-Rhizomen und das Einengen des resultierenden Destillats durch Verdampfen unter Bildung der rohen Flüssigkeit; und
wobei es sich bei der genannten Stufe (I min ) handelt um:
(I min min ) das Extrahieren eines Pulvers aus getrockneten Ingwer-Rhizomen mit überkritischem CO2, das Abtrennen der resultierenden Extraktionslösung des überkritischen CO2 und das Verdampfen des CO2 aus der Extraktionslösung, wobei man die rohe Flüssigkeit erhält.
Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Produkt mit einer hohen Antiinflammations-, Antiblutplättchenaggregations- und Antifungi-Aktivität umfasst vorzugsweise 0 bis 10 mg 6-Shogaol pro g Produkt, 1 bis 150 mg 6-Gingerol pro g Produkt und 0 bis 40 mg 6-Dehydrogingerdion pro g Produkt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ausserdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine starke Antiinflammations-, Antiblutplättchenaggregations- oder Antifungi-Aktivität aufweist und eine therapeutisch wirksame Menge der genannten, in der Stufe (a) des erfindungsgemässen Verfahrens erhaltenen rohen Flüssigkeit als Wirkstoff (aktiven Bestandteil) im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel für den Wirkstoff enthält.
Die vorliegende Erfindung betrifft ausserdem eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einer starken Antiinflammations-, Antiblutplättchenaggregations- oder Antifungi-Aktivität, die eine therapeutisch wirksame Menge des genannten Produkts, das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt worden ist, als Wirkstoff (aktiven Bestandteil) im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel für den Wirkstoff enthält. Vorzugsweise ist das genannte Produkt, das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt worden ist, das in der Stufe (c) hergestellte erste konzentrierte Eluat. Alternativ ist das genannte Produkt, das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt worden ist, das in der Stufe (d) hergestellte zweite konzentrierte Eluat.
Vorzugsweise ist das genannte erste Eluierungsmittel Methanol und das genannte zweite Eluierungsmittel ist vorzugsweise Aceton.
Vorzugsweise umfasst die Stufe (a) des erfindungsgemässen Verfahrens die Stufen (i) bis (iv).
Vorzugsweise ist das genannte erste organische Lösungsmittel Ethylether.
Vorzugsweise ist das genannte zweite organische Lösungsmittel Aceton, Methanol, Ethanol oder eine Kombination davon. Als zweites organisches Lösungsmittel besonders bevorzugt ist Aceton.
Vorzugsweise umfasst die Stufe (a) des erfindungsgemässen Verfahrens die Stufe (I).
Vorzugsweise umfasst die Stufe (a) des erfindungsgemässen Verfahrens die Stufe (I min ).
Vorzugsweise umfasst die Stufe (a) des erfindungsgemässen Verfahrens die Stufe (I min min ).
Eine geeignete Umkehrphasen-Chromatografie-Kolonne für die Verwendung in dem erfindungsgemässen Verfahren umfasst (ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, eine Umkehrphasen-Chromatografie-Kolonne, die mit einem porösen Harz, beispielsweise Diaion HP-20 (Mitsubishi Co.), Sephadex LH-20 (Pharmicia Co.) und RP-18 (Nacalei tesque Co.), gefüllt ist.
Die erfindungsgemässe pharmazeutische Zusammensetzung mit einer starken Antifungi-Aktivität wird vorzugsweise topisch aufgebracht, beispielsweise als Shampoo, Badgel, Seife, Körperlotion, Körpercreme und Detergens. Vorzugsweise wird die erfindungsgemässe pharmazeutische Zusammensetzung mit starker Antifungi-Aktivität für die Behandlung von Erkrankungen verwendet, die im Zusammenhang stehen mit Trichophyton mentagrophytes oder Pityrosporum ovale, wie z.B., ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, Tinea pedis, Tinea capitis, Tinea cruris, Tinea glabrosa, Onychomycosis, Pityriasis capitis, Pityriasis vesicolor, Pityrosporum folliculitis, seborrhoischer Dermatitis und Schuppenbildung. Insbesondere liegt die erfindungsgemässe pharmazeutische Antifungi-Zusammensetzung in Form eines Shampoos für die Verwendung zur Behandlung der Schuppenbildung vor.
Es wird angenommen, dass mit der vorstehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in einer ausreichend nacharbeitbaren Weise geoffenbart worden ist. Die folgenden spezifischen Beispiele dienen daher lediglich ihrer Erläuterung und stellen keinerlei Beschränkungen auf den Rest der Beschreibung dar.
Bestimmung der Wirkstoffe (aktiven Komponenten)
In den folgenden Beispielen wurde eine Hochleistungs-Flüssigchromatografie (abgekürzt als HPLC bezeichnet) zur Bestimmung der Wirkstoffe (aktiven Komponenten) der darin hergestellten Produkte angewendet. Die HPLC-Spektren wurden auf einem HPLC-Instrument (HPLC Shimadzu LC-10AT, Japan) unter Verwendung einer Cosmosil 5C-18-Kolonne (250 mm x 4,6 mm, gefüllt mit Teilchen mit einem Durchmesser von 5 mu m) unter Anwendung eines Elutionsverfahrens aufgezeichnet. Es wurde eine HPLC-Probe hergestellt durch Verdünnen einer geeigneten Menge eines Produkts mit einer Lösung mit mobiler Phase (Volumenverhältnis Cyanwasserstoff:Wasser = 65:35) auf 25 ml und durch eine 0,25- mu m-Membran filtriert. Das Filtrat wurde in die HPLC-Kolonne eingeführt und mit der Lösung mit mobiler Phase eluiert.
Zur Bestimmung der Absorption des Eluats bei 230 nm wurde ein UV-Detektor (Shimadzu SPD-6AV, Japan) verwendet.
Beispiel 1
2100 g frische Ingwer-Rhizome wurden zerkleinert und filtriert, wobei man ein Filtrat und einem Rückstand erhielt. 500 ml des Filtrats wurde mit 500 ml Ethylether dreimal extrahiert, die organischen Phasen-Schichten wurden von den wässrigen Phasen-Schichten abgetrennt und miteinander vereinigt. Der Ethylether wurde aus der vereinigten Extraktionslösung im Vakuum verdampft, wobei man ein konzentriertes Ethylether-Extraktionsprodukt (I-OE) erhielt. Der Ingwer-Rückstand wurde mit 3000 ml Aceton dreimal extrahiert, die Extraktionslösungen wurden durch Filtrieren abgetrennt und miteinander vereinigt. Aus der vereinigten Extraktionslösung wurde im Vakuum das Aceton verdampft, wobei man ein konzentriertes Aceton-Extraktionsprodukt (I-O) (14,5 g) erhielt.
7 g einer Mischung aus dem konzentrierten Ethylether-Extraktionsprodukt (I-O) und dem konzentrierten Aceton-Extraktionsprodukt (I-O) wurden in eine Umkehrphasenchromatografie-Kolonne (300 mm x 30 mm), die mit 180 g Diaion HP-20-Harz mit einem Teilchendurchmesser von 500 bis 800 mu m gefüllt wor den war, injiziert. Zur Durchführung der Elution wurden 1500 ml Wasser, 2500 ml Methanol, 2000 mi Aceton und 2000 ml Chloroform verwendet. Das Wassereluat, das Methanoleluat, das Acetoneluat und das Chloroformeluat wurden getrennt gesammelt und im Vakuum eingeengt, wobei man 0,27 g konzentriertes Wassereluat (I-OW), 1,45 g konzentriertes Methanoleluat (I-OM), 2,68 g konzentriertes Acetoneluat (I-OA) und 0,83 g konzentriertes Chloroformeluat (I-OC) erhielt.
Die durch HPLC bestimmten Mengen (mg) an 6-Shogaol, 6-Gingerol und 6-Dehydrogingerdion pro g I-O, I-OM und I-OA sind in der Tabelle 1 angegeben.
<tb><TABLE> Columns=4 Tabelle 1
<tb>Head Col 1: Gehalt (mg/g)
<tb>Head Col 2: I-O
<tb>Head Col 3: I-OM
<tb>Head Col 4: I-OA
<tb><SEP>6-Shogaol<SEP>1,10 +/- 0,14<SEP>1,15 +/- 0,0 (SEP)<->(TB><CEL AL=L>6-Gingerol<CEL AL=L>59,98 +/- 0,99<SEP>103,37 +/- 8,57<SEP>2,51 +/- 0,89
<tb><SEP>6-Dehydrogingerdion<SEP>7,68 +/- 0,42<SEP>8,94 +/- 0,41<CEL AL=L>-
<tb></TABLE>
Beispiel 2
500 g im Schatten getrocknete Ingwer-Rhizome wurden pulverisiert und das resultierende Pulver wurde mit 30 L Aceton dreimal eluiert (jeweils mit 10 L). Die drei Extraktionslösungen wurden nach dem Filtrieren miteinander vereinigt und dann im Vakuum eingeengt, wobei man 24 g konzentriertes Aceton-Extraktionsprodukt (II-O) erhielt. 20 g des konzentrierten Aceton-Extraktionsprodukts (II-O) wurden in eine Umkehrphasen-Chromatografie-Kolonne, die mit 600 g Diaion HP-20-Harz gefüllt war, injiziert, die dann nacheinander mit 4 L Wasser, 6,5 L Methanol, 15 L Aceton und 5 L Chloroform eluiert wurde.
Das Wassereluat, das Methanoleluat, das Acetoneluat und das Chloroformeluat wurden getrennt gesammelt und im Vakuum eingeengt, wobei man 2,5 g konzentriertes Wassereluat (II-OW), 7,1 g konzentriertes Methanoleluat (II-OM), 6,9 g kon zentriertes Acetoneluat (II-OA) und 3,5 g konzentriertes Chloroformeluat (II-OC) erhielt. Die durch HPLC bestimmten Mengen (mg) an 6-Shogaol, 6-Gingerol und 6-Dehydrogingerdion pro g II-O, II-OM und II-OA sind in der Tabelle 2 angegeben.
<tb><TABLE> Columns=4 Tabelle 2
<tb>Head Col 1: Gehalt (mg/g)
<tb>Head Col 2: II-O
<tb>Head Col 3: II-OM
<tb>Head Col 4: II-OA
<tb><SEP>6-Shogaol<SEP>1,98 +/- 0,00<SEP>4,96 +/- 0,00 (SEP)<->(TB><CEL AL=L>6-Gingerol<CEL AL=L>43,06 +/- 0,84<SEP>70,87 +/- 1,85<SEP>2,54 +/- 0,00
<tb><SEP>6-Dehydrogingerdion<SEP>9,33 +/- 0,85<SEP>19,15 +/- 4,57<CEL AL=L>2,35 +/- 0,28
<tb></TABLE>
Beispiel 3
10 kg im Schatten getrocknete Ingwer-Rhizome wurden pulverisiert und das resultierende Pulver wurde 5 h lang einer Wasserdampf-Destillation unterworfen. Das Destillat wurde im Vakuum eingeengt, wobei man 410 g konzentriertes Destillat (III-O) erhielt. 20 g des konzentrierten Destillats (III-O) wurden in eine Umkehrphasen-Chromatografie-Kolonne, die mit 600 g Diaion HP-20-Harz gefüllt war, injiziert und dann nacheinander mit 4,5 L Wasser, 4,5 L Methanol, 3 L Aceton und 5 L Chloroform eluiert. Das Wassereluat, das Methanoleluat, das Acetoneluat und das Chloroformeluat wurden getrennt gesammelt und im Vakuum eingeengt, wobei man 0,03 g konzentriertes Wassereluat (III-OW), 14,5 g konzentriertes Methanoleluat (III-OM), 0,85 g konzentriertes Acetoneluat (III-OA) und 0,2 g konzentriertes Chloroformeluat (III-OC) erhielt.
Das konzentrierte Destillat (III-O) enthielt kein 6-Shogaol, 6-Gingerol und 6-Dehydrogingerdion, wie durch HPLC bestimmt wurde.
Beispiel 4
10 g eines Pulvers aus im Schatten getrockneten Ingwer-Rhizomen wurden mit 1000 ml Aceton von 50 DEG C 2 h lang extrahiert. Die Extraktionslösung wurde abgetrennt und im Vakuum (40 DEG C, 75 mmHg) eingeengt, wobei man ein konzentriertes Aceton-Extraktionsprodukt (IV-O) erhielt. Die Farbe und die Viskosität des Produkts (IV-O) sind zusammen mit seiner Ausbeute in der Tabelle 3 angegeben.
Beispiel 5
10 g eines Pulvers aus im Schatten getrockneten Ingwer-Rhizomen wurden einer Wasserdampf-Destillation unterworfen und das ölige Destillat wurde nach dem Abtrennen von dem wässrigen Destillat gefriergetrocknet, wobei man einen öligen Extrakt (V-O) erhielt. Die Farbe und die Viskosität des öligen Extrakts (V-O) sind zusammen mit seiner Ausbeute in der Tabelle 3 angegeben.
Beispiel 6
In 10 g eines Pulvers aus im Schatten getrockneten Ingwer-Rhizomen wurde in einer 250-ml-Extraktionskammer CO2 mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 45 L/min eingeleitet, wobei der Kammerdruck mit einer Hochdruckpumpe (Modell Nr. EK-1, LEWA Co., USA) auf 2500 bis 4000 psia eingestellt wurde und die Kammertemperatur mit einem Wärmeaustauscher (Modell Nr. H-2410, HOTEC Co., USA) und einem äusseren Zirkulationssystem bei 35 bis 60 DEG C gehalten wurde. Die Extraktion wurde gestoppt, wenn das eingeleitete CO2-Volumen 300 L erreicht hatte, und nach dem Verdampfen des CO2 wurde ein überkritisches CO2-Extraktionsprodukt (VI-O) erhalten. Die Farbe und die Viskosität des Produkts (VI-O) sind zusammen mit seiner Ausbeute in der Tabelle 3 angegeben.
Die durch HPLC bestimmten Gehalte an stechenden (scharfen) Komponenten sind in der Tabelle 4 angegeben.
<tb><TABLE> Columns=4 Tabelle 3
<tb>Head Col 2 AL=L: IV-O
<tb>Head Col 1: V-O
<tb>Head Col 2: VI-O
<tb><SEP>L*<SEP>87,6<SEP>80,4<SEP>96,3
<tb><SEP>A*<SEP>-9,1<SEP>-0,1<CEL AL=L>-9,6
<tb><SEP>B*<SEP>31,1<SEP>9,6<SEP>22,0
<tb><SEP>Viskosität (cPs)<SEP>15,6<SEP>11,8<CEL AL=L>12,1
<tb><SEP>Ausbeute (%)<SEP>3,8<SEP>2,2<SEP>3,9
<tb>
*: die Werte von L, A und B wurden bestimmt unter Verwendung eines
SIGMA 90-Farbmess-Systems (Nippon Denshoku Inc.
Co., Ltd., Japan), worin L die Helligkeit, A die Rot/Grün-Differenz und B die Gelb/Blau-Differenz darstellen.
<tb></TABLE>
<tb><TABLE> Columns=2 Tabelle 4
<tb>Head Col 1: Gehalt (mg/g)
<tb>Head Col 2: VI-O
<tb><SEP>6-Shogaol<SEP>17,30 +/- 0,00
<tb><SEP>6-Gingerol<SEP>26,29 +/- 0,00
<tb><CEL AL=L>6-Dehydrogingerdion<SEP>19,20 +/- 1,19
<tb></TABLE>
Beispiel 7: Anti-Blutplättchen-Assay
Blut, das aus der äusseren Ohrvene von Kaninchen gesammelt worden war, wurde mit EDTA (100 mM) in einem Volumenverhältnis von 14:1 gemischt und 10 min lang bei Raumtemperatur mit 90 g zentrifugiert, wobei man ein an Blutplättchen reiches Plasma erhielt. Letzteres wurde 10 min lang mit 500 g weiter zentrifugiert, die obere, an Plasma reiche Schicht wurde daraus entfernt und die zurückbleibende Bodenschicht wurde mit einer Tyrode-Lösung, die 2 mM EDTA, jedoch kein Calcium enthielt, suspendiert. Diese Suspension wurde weitere 10 min lang mit 500 g zentrifugiert und die Blutplättchen wurden mit einer Tyrode-Lösung ohne EDTA suspendiert.
Nach dem Zentrifugieren unter den gleichen Bedingungen wurden die Blutplättchen mit einer Tyrode-Lösung mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung (mM) suspendiert: NaCl (136,8), KCI (2,8), NaHCO3 (11,9), MgCl2 (1,1), NaH2PO4 (0,33), CaCl2 (1,0), Glucose (11,2) und Rinderserumalbumin (0,35%).
Die Anzahl der Blutplättchen wurde mit einem Coulter Counter (Modell ZM) bestimmt und auf 4,5 x 10<8> Blutplättchen/ml eingestellt.
<tb><TABLE> Columns=3 Tabelle 5
Inhibitor-Effekte von Ingwer-Extrakten auf die durch Arachidonsäure und Collagen induzierte Blutplättchenaggregation<a)>
<tb>Head Col 1: Ingwer-Extrakt<b)>
<tb>Head Col 2 to 3 AL=L:
Konzentration für einen 50% Inhibitoreffekt ( mu g/ml)
<tb><CEL CB=2 AL=L>Arachidonsäure<SEP>Collagen
<tb><SEP>I-O<SEP>3,8 +/- 0,8<SEP>5,5 +/- 0,4
<tb><SEP>I-OM<SEP>1,7 +/- 0,3<SEP>2,7 +/- 0,4
<tb><SEP>II-O<SEP>3,1 +/- 0,5<SEP>6,5 +/- 1,2
<tb><SEP>II-OA<SEP>10,9 +/- 3,2<CEL AL=L>21,8 +/- 2,2
<tb><SEP>II-OC<SEP>6,9 +/- 0,7<SEP>16,6 +/- 4,3
<tb><SEP>II-OM<SEP>2,0 +/- 0,2<CEL AL=L>6,9 +/- 2,4
<tb>
<a)> die Blutplättchen wurden mit Ingwer-Extrakten oder 0,5% DMSO (Kontrolle) 3 min lang bei 37 DEG C inkubiert, dann wurden Arachidonsäure (100 mu M) oder Collagen (10 mu g/ml) zugegeben, um die Aggregation auszulösen. Aspirin und lndomethacin sind positive Kontrollmittel.
Der Prozentsatz des lnhibitoreffekts wird wie folgt errechnet:
[(Grad der lnhibierung der Kontrolle) - (Grad der lnhibierung des lngwer-Extrakts)]/(Grad der lnhibierung der Kontrolle)Ü x 100%
die Werte sind angegeben als Mittelwert +/- S.E., n = 3-6
<b)> hergestellt in den Beispielen 1 und 2.
<tb>
<tb></TABLE>
Beispiel 8: Bewertung der Inhibitor-Aktivität auf das durch Carrageenin induzierte Pfotenödem
Der Test zur Bestimmung der Inhibitor-Aktivität auf das durch Carrageenin induzierte Pfotenödem wurde nach dem von C. A. Winter et al. beschriebenen Verfahren durchgeführt (C. A. Winter et al., "Proc. Soc. Exper. Biol. Med." 111: 544-547, 1962). Männlichen Wistar-Mäuse mit einem Gewicht von 150 +/- 20 g, die eine Nacht lang nicht gefüttert wurden, wurden in die linken hinteren Pfoten 0,1 ml einer 1% Carrageenin-Suspension injiziert, dann wurden Rubbing-Testproben oder ein Vehiculum als Kontrolle in die linken hinteren Pfoten gleichmässig injiziert (10 mg/Pfote). 3 h später wurden die Volumina der hinteren Pfoten unter Verwendung eines Volumen-Scanners (Cat. #7150, UGO Basil, Italien) bestimmt und die Differenz zwischen der linken hinteren Pfote und der rechten hinteren Pfote wurde als Index für das durch Carrageenin induzierte Pfotenödem verwendet.
<tb><TABLE> Columns=3 Tabelle 6
Inhibitor-Aktivität von Ingwer-Extrakten<a)> auf das durch Carrageenin induzierte Pfotenödem
<tb>Head Col 1: Behandlung<b)>
<tb>Head Col 2: Dosierung (mg/Pfote)
<tb>Head Col 3: Inhibitor-Aktivität auf das durch Carrageenin induzierte Pfotenödem (%)
<tb><SEP>I-O<SEP>10<SEP>18
<tb><SEP>I-OE<SEP>10<SEP>19
<tb><SEP>I-OM<CEL AL=L>10<SEP>29
<tb><SEP>I-OA<SEP>10<SEP>25
<tb><SEP>II-O<SEP>10<SEP>18
<tb><SEP>II-OW<CEL AL=L>10<SEP>0
<tb><SEP>II-OM<SEP>10<SEP>26
<tb><SEP>II-OA<SEP>10<SEP>25
<tb><CEL AL=L>II-OC<CEL AL=L>10<SEP>8
<tb><SEP>III-O<SEP>10<SEP>0
<tb><SEP>III-OM<SEP>10<SEP>11
<tb><CEL AL=L>III-OA<CEL AL=L>10<SEP>15
<tb><SEP>[6]-Dehydrogingerdion<SEP>5<SEP>26
<tb>
<a)> Die lnhibitor-Aktivität auf das durch Carrageenin induzierte Pfotenödem (%) wurde wie folgt errechnet:
[(durchschnittlicher Grad des \dems bei Mäusen in der Kontrollgruppe) - (durchschnittlicher Grad des \dems bei Mäusen in der Testgruppe)]/(durchschnittlicher Grad des \dems bei Mäusen in der Kontrollgruppe)] x 100%
die Werte sind angegeben als Mittelwert +/- S.E., n = 3-6.
<b)> hergestellt in den Beispielen 1, 2 und 3.
<tb>
<tb></TABLE>
Beispiel 9:
Bewertung der Inhibitor-Aktivität gegenüber Trichophyton mentagrophytes oder Pityrospsorum ovale
Anti-Trichophyton mentagrophytes-Assay
Die minimale Inhibitor-Konzentration (MIC) eines Ingwer-Extrakts wurde bestimmt und der Versuch wurde nach dem früher beschriebenen Verfahren von J. R. Edwards et al. durchgeführt (J. R. Edwards et al., "Antimicrobial Agents Chemotherapy" 33: 215-222, 1989).
Die Testsubstanz wurde in einem Lösungsmittel (100% DMSO) gelöst und in einer Verdünnungsreihe auf die gewünschten Ausgangslösungs-Konzentrationen gebracht. Für jede getestete Konzentration wurde ein 0,01-ml-Aliquot in eine Vertiefung einer Tüpfelplatte mit 48 Vertiefungen gegeben, die 0,99 ml einer Kartoffel-Dextrosebrühe (DIFCO, USA) mit 10<3>-10<4> CFU/ml Trichophyton mentagrophytes (ATCC 9533) enthielt. Die Platten wurden 72 h lang bei 28 DEG C inkubiert und dann visuell geprüft und bewertet. Die Vehiculum-Kontrolle wurde als Blindkontrolle angewendet. Jede Konzentration wurde doppelt bewertet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 angegeben.
Anti-Pityrosporum ovale-Assay
Die minimale Inhibitor-Konzentration (MIC) eines Ingwer-Extrakts wurde bestimmt und der Versuch wurde nach dem oben genannten Verfahren durchgeführt (J. R. Edwards et al., "Antimicrobial Agents Chemotherapy" 33: 215-222, 1989). Die Testsubstanz wurde in einem Lösungsmittel (100% DMSO) gelöst und in einer Verdünnungsreihe auf die gewünschten Ausgangslösungs-Konzentrationen gebracht. Für jede getestete Konzentration wurde ein 0,01-ml-Aliquot in eine Vertiefung einer Tüpfelplatte mit 48 Vertiefungen gegeben, die 0,99 ml flüssiges Sabouraud-Medium (DIFCO, USA) mit 10<3>-10<4> CFU/ml Pityrosporum ovale (ATCC 38593) enthielt. Die Platten wurden 48 h lang bei 37 DEG C inkubiert und dann visuell geprüft und bewertet. Als Blindkontrolle wurde eine Vehiculum-Kontrolle verwendet. Jede Konzentration wurde doppelt bewertet.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 angegeben.
<tb><TABLE> Columns=3 Tabelle 7
Inhibitoreffekte von Ingwer-Extrakten auf Pityrosporum ovale (Po) und Trichophyton mentagrophytes (Tm)
<tb>Head Col 1: Ingwer-Extrakt<a)>
<tb>Head Col 2: MIC ( mu g/ml)
<tb><SEP>Po<SEP>Tm
<tb><SEP>I-O<SEP>100<SEP>30
<tb><CEL AL=L>II-OM<CEL AL=L>100<SEP>30
<tb><SEP>II-O<SEP>500<SEP>30
<tb><SEP>II-OC<SEP>100<SEP>30
<tb><CEL AL=L>II-OM<SEP>100<SEP>30
<tb><SEP>III-O<SEP>500<SEP>100
<tb><SEP>Blindkontrolle<SEP>- <b)><SEP>- <b)>
<tb>
<a)> hergestellt in den Beispielen 1, 2 und 3
<b)> es wurde kein Inhibitor-Effekt beim Wachstum festgestellt
<tb>
<tb></TABLE>
Field of application of the invention
The present invention relates to a method for producing an extract with a strong anti-inflammatory, anti-platelet aggregation and anti-fungi activity from Zingiber officinale, and pharmaceutical compositions containing this extract.
Background of the Invention
Chinese raw medicinal products or spices, e.g. Zingiber officinale, Eugenia caryophyllata, Allium sativum, are used in medicine and for seasoning food. Raw ginger is used as an anti-emetic and expectorant as an anti-tussive and digestive accelerator. Semi-dried old raw ginger is also used to relieve stomach pain, chest pain, lower back pain, cough, common cold, and as a remedy for a form of urine called "water retention". Zingeron is the main component responsible for the seasoning properties of ginger; Gingerol and Shogaol are other hot components in ginger.
Gingerol has a cardiotonic effect, suppresses the contraction of isolated portal veins in mice and modulates the contraction of the blood vessels in mice and rats induced by eicosanoid. Shogaol has an effect that increases blood pressure. Both Gingerol and Shogaol are mutagenic, while Zinger and Zingeron have been found to have antimutagenic activity. Shogaol has inhibitory activity against carrageenin-induced paw edema and platelet aggregation [US Patent No. 5,804,603, "Background of the Invention"].
So far, many publications have shown that Zingiber officinale has various physiological activities. Typical examples include a cancer metastasis suppressing agent described in Japanese Patent Publication No. 7-258,104; a synthesis promoter for the neurotropic factor which is effective in nerve damage diseases such as Alzheimer's dementia or Parkinson's disease as described in Japanese Patent Publication No. 7-25 777; an anti-rheumatic agent as described in Japanese Patent Publication No. 6-293,653 and U.S. Patent Nos. 5,494,668 and 5,683,698; an antimicrobial composition as described in Japanese Patent Publication No. 6-227,931; and an analgesic composition as described in Japanese Patent Publication No. 6-107,556.
Ginger contains 1 to 4% essential \ l (\ l resin).
During the past 45 years, many chemical studies have been carried out on the components of the ethereal oil. A total of more than 200 different volatile materials have been identified in the ethereal \ l, the pharmacological activity of which is limited. The ethereal \ l contains a mixture of different terpenes as well as some other non-terpenoid compounds. Although this is highly speculative, the experimental data and observations suggest that ginger inhibits both cyclooxygenase and lipoxygenase products, i.e. can be a dual inhibitor of eicosanoid synthesis. A total of 56 patients (28 with rheumatoid arthritis, 18 with osteoarthritis and 10 with muscle problems) used powdered ginger for their symptoms.
Pain and swelling were relieved to varying degrees among arthritis patients in more than three quarters. Pain was relieved in all patients with muscle problems. None of the patients reported adverse effects during the duration of the ginger intake, which ranged from 3 months to 2.5 years (Srivastava and Mustafa, "Medical Hypotheses" 1992; 39, 342-348).
The non-steroidal anti-inflammatory (anti-inflammatory) drugs have three main effects, all of which are related to cyclooxygenase inhibition, which leads to decreased prostanoid formation. First, an anti-inflammatory effect is achieved by the reduced formation of vasodilator prostaglandins (PGE2, PGI2), which leads to less vasodilation and indirectly to a lower level. Secondly, an analgesic effect is achieved by a reduced prostaglandin formation (less sensitization of the nociceptive nerve endings to the inflammatory mediators bradykinin and 5-hydroxytryptamine). Third, an antipyretic effect is likely due to a decrease in mediator PGE2, which is formed in response to inflammatory pyrogens, such as interleukin-1.
Because ginger inhibits prostanoid synthesis and also produces 5-lipoxygenase, its amelioration effects in arthritis and muscle discomfort may be related to decreased prostanoid and leukotriene formation. Because of this possibility, a decrease in carrageenan-induced \ dem formation on the rat paw was demonstrated after administration of 3 g of ginger extract, and the effectiveness of the extract in an acute inflammation test appears to be comparable to that of acetylsalicylic acid in the same study ( N. Mascolo et al., "Journal of Ethnopharmocology" 1989, 27, 129-140).
Dermatophytes, especially Trichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes, are the usual pathogens of onychomycosis and tinea pedis [DT. Roberts, "British Journal of Dermatology", 141st Supplement 56: 1-4, Nov. 1999; YB. Roldan et al., "Mycoses", 43 (5): 181-183, 2000]. Pityrosporum ovale (Malassezia furfur) is the ethiological agent of pityriasis vesicolor, Pityrosporum folliculitis and Malassezia intertrigo. Several studies indicate a strong connection between Pityrosporum ovale and seborrheic dermatitis and dandruff, a milder form of seborrheic dermatitis [P. Nenoff et al., "Dermatology", 191 (4): 311-314, 1995; Bulmer, A.C. et al., Mycopathologia, 147 (2): 63-65, 1999].
Summary of the invention
The present invention relates to extracts from ginger rhizomes (rootstocks) which have an activity in an in vitro anti-platelet aggregation test, an inhibitory effect on paw edema induced by carrageenin and an antifungal activity against Trichophyton mentagrophytes and Pityrosporum oval. The extracts are prepared by extracting ginger rhizomes or rhizomes with an organic solvent (e.g. ethyl ether, acetone, methanol and ethanol) or supercritical CO2 or by steam distillation of ginger rhizomes to obtain a crude liquid, and carrying them out a reverse phase chromatography with the said crude liquid, whereby the extracts are obtained which contain shogaols, gingerols and / or dehydrogingerdione.
Detailed description of the invention
As stated in the "Background of the Invention", ginger is used against inflammation and for pain relief.
The present invention relates to an effective method for producing a product with a strong anti-inflammatory, anti-blood platelet aggregation and anti-fungi activity from ginger rhizomes (rhizomes). The highly effective product produced by the process according to the invention has an essentially constant composition, so that its pharmacological effects are fixed.
The effective method for producing a product with high anti-inflammatory, anti-platelet aggregation and anti-fungi activity from ginger rhizomes (rhizomes) according to the present invention comprises the following steps:
a) Preparation of a raw liquid from ginger rhizomes;
b) introducing the crude liquid into a reverse phase chromatography column and eluting the column sequentially with water, a first eluent and a second eluent, said second eluent having a polarity which is weaker than that of the first eluent but is stronger than that of chloroform, so that a first eluate when eluted with the first eluent and a second eluate when eluted with the second eluent are obtained;
c) removing the first eluent from the first eluate by evaporation, so that a first concentrated eluate is obtained which can be used as a potent product; and
d) removing the second eluent from the second eluate by evaporation, so that a second concentrated eluate is obtained which can be used as a potent product;
wherein step (a) comprises steps (i) to (iv) or step (I), step (I min) or step (I min min), said steps (i) to (iv) comprising The following are:
(i) crushing fresh ginger rhizomes and filtering the resulting mixture to form a filtrate and a residue;
(ii) extracting the filtrate with a first organic solvent, separating the resulting extraction solution of the first organic solvent and evaporating the first organic solvent from the extraction solution to form a first concentrated extraction solution;
(iii) extracting the residue with a second organic solvent, separating the resulting extraction solution of the second organic solvent and evaporating the second organic solvent from the extraction solution to form a second concentrated extraction solution; and
(iv) combining the first concentrated extraction solution with the second concentrated extraction solution to form the crude liquid;
where stage (I) is:
(I) extracting a powder of dried ginger rhizomes with an organic solvent, separating the resulting extraction solution of the organic solvent and evaporating the organic solvent from the extraction solution to form the crude liquid;
where the step (I min) mentioned is:
(i min) steam distilling a powder of dried ginger rhizomes and concentrating the resulting distillate by evaporation to form the crude liquid; and
where the step (I min) mentioned is:
(I min min) extracting a powder from dried ginger rhizomes with supercritical CO2, separating the resulting extraction solution of the supercritical CO2 and evaporating the CO2 from the extraction solution to obtain the crude liquid.
The product with a high anti-inflammatory, anti-platelet aggregation and antifungal activity produced by the process according to the invention preferably comprises 0 to 10 mg 6-shogaol per g product, 1 to 150 mg 6-gingerol per g product and 0 to 40 mg 6-dehydrogingerdione per g of product.
The present invention also relates to a pharmaceutical composition which has a strong anti-inflammation, anti-platelet aggregation or antifungal activity and a therapeutically effective amount of the crude liquid mentioned as an active ingredient in the mixture obtained in step (a) of the process according to the invention with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent for the active ingredient.
The present invention also relates to a pharmaceutical composition having a strong anti-inflammatory, anti-platelet aggregation or anti-fungi activity, which contains a therapeutically effective amount of the product mentioned, which has been prepared by the process according to the invention, as an active ingredient (active ingredient) in admixture with a pharmaceutical contains acceptable carrier or diluent for the active substance. The product mentioned, which has been prepared by the process according to the invention, is preferably the first concentrated eluate produced in step (c). Alternatively, the product mentioned, which has been produced by the process according to the invention, is the second concentrated eluate produced in step (d).
Preferably said first eluent is methanol and said second eluent is preferably acetone.
Step (a) of the process according to the invention preferably comprises steps (i) to (iv).
Preferably said first organic solvent is ethyl ether.
Preferably said second organic solvent is acetone, methanol, ethanol or a combination thereof. Acetone is particularly preferred as the second organic solvent.
Step (a) of the process according to the invention preferably comprises step (I).
Step (a) of the process according to the invention preferably comprises step (I min).
Step (a) of the process according to the invention preferably comprises step (I min min).
A suitable reverse phase chromatography column for use in the process according to the invention comprises (but is not limited to the invention) a reverse phase chromatography column which is coated with a porous resin, for example Diaion HP-20 (Mitsubishi Co.), Sephadex LH -20 (Pharmicia Co.) and RP-18 (Nacalei tesque Co.).
The pharmaceutical composition according to the invention with a strong antifungal activity is preferably applied topically, for example as a shampoo, bath gel, soap, body lotion, body cream and detergent. The pharmaceutical composition according to the invention with strong antifungal activity is preferably used for the treatment of diseases which are related to Trichophyton mentagrophytes or Pityrosporum ovale, such as, but not limited to, tinea pedis, tinea capitis, tinea cruris, tinea glabrosa, onychomycosis, pityriasis capitis, pityriasis vesicolor, pityrosporum folliculitis, seborrheic dermatitis and dandruff. In particular, the pharmaceutical antifungal composition according to the invention is in the form of a shampoo for use in the treatment of dandruff formation.
It is believed that, with the foregoing description, the present invention has been disclosed in a sufficiently reworkable manner. The following specific examples are therefore only illustrative and do not limit the rest of the description.
Determination of the active substances (active components)
In the following examples, high-performance liquid chromatography (abbreviated as HPLC) was used to determine the active substances (active components) of the products produced therein. The HPLC spectra were performed on an HPLC instrument (Shimadzu LC-10AT, Japan, Japan) using a Cosmosil 5C-18 column (250 mm x 4.6 mm, filled with 5 µm diameter particles) using of an elution process. An HPLC sample was prepared by diluting an appropriate amount of a product with a mobile phase solution (hydrogen cyanide: water volume ratio = 65:35) to 25 ml and filtered through a 0.25 µm membrane. The filtrate was introduced into the HPLC column and eluted with the mobile phase solution.
A UV detector (Shimadzu SPD-6AV, Japan) was used to determine the absorption of the eluate at 230 nm.
example 1
2100 g of fresh ginger rhizomes were crushed and filtered to give a filtrate and a residue. 500 ml of the filtrate was extracted three times with 500 ml of ethyl ether, the organic phase layers were separated from the aqueous phase layers and combined with one another. The ethyl ether was evaporated from the combined extraction solution in vacuo to give a concentrated ethyl ether extraction product (I-OE). The ginger residue was extracted three times with 3000 ml of acetone, the extraction solutions were separated by filtration and combined with one another. The acetone was evaporated from the combined extraction solution in vacuo to give a concentrated acetone extraction product (I-O) (14.5 g).
7 g of a mixture of the concentrated ethyl ether extraction product (IO) and the concentrated acetone extraction product (IO) were placed in a reverse phase chromatography column (300 mm x 30 mm) containing 180 g of Diaion HP-20 resin with a particle diameter of 500 to 800 µm had been injected. 1500 ml of water, 2500 ml of methanol, 2000 ml of acetone and 2000 ml of chloroform were used to carry out the elution. The water eluate, the methanol eluate, the acetone eluate and the chloroform eluate were collected separately and concentrated in vacuo to give 0.27 g of concentrated water eluate (I-OW), 1.45 g of concentrated methanol eluate (I-OM), 2.68 g of concentrated Acetone eluate (I-OA) and 0.83 g of concentrated chloroform eluate (I-OC) was obtained.
The amounts (mg) of 6-shogaol, 6-gingerol and 6-dehydrogingerdione determined by HPLC per g of I-O, I-OM and I-OA are given in Table 1.
<tb> <TABLE> Columns = 4 Table 1
<tb> Head Col 1: content (mg / g)
<tb> Head Col 2: I-O
<tb> Head Col 3: I-OM
<tb> Head Col 4: I-OA
<tb> <SEP> 6-Shogaol <SEP> 1.10 +/- 0.14 <SEP> 1.15 +/- 0.0 (SEP) <-> (TB> <CEL AL = L> 6- Gingerol <CEL AL = L> 59.98 +/- 0.99 <SEP> 103.37 +/- 8.57 <SEP> 2.51 +/- 0.89
<tb> <SEP> 6-dehydrogingerdione <SEP> 7.68 +/- 0.42 <SEP> 8.94 +/- 0.41 <CEL AL = L> -
<Tb> </ TABLE>
Example 2
500 g of shadow-dried ginger rhizomes were pulverized and the resulting powder was eluted three times with 30 L of acetone (each with 10 L). The three extraction solutions were combined after filtering and then concentrated in vacuo to give 24 g of concentrated acetone extraction product (II-O). 20 g of the concentrated acetone extraction product (II-O) was injected into a reverse phase chromatography column filled with 600 g of Diaion HP-20 resin, which was then washed in succession with 4 L of water, 6.5 L of methanol, 15 L acetone and 5 L chloroform was eluted.
The water eluate, the methanol eluate, the acetone eluate and the chloroform eluate were collected separately and concentrated in vacuo, giving 2.5 g of concentrated water eluate (II-OW), 7.1 g of concentrated methanol eluate (II-OM), 6.9 g of con centered acetone eluate (II-OA) and 3.5 g of concentrated chloroform eluate (II-OC). The amounts (mg) of 6-shogaol, 6-gingerol and 6-dehydrogingerdione determined by HPLC per g of II-O, II-OM and II-OA are given in Table 2.
<tb> <TABLE> Columns = 4 Table 2
<tb> Head Col 1: content (mg / g)
<tb> Head Col 2: II-O
<tb> Head Col 3: II-OM
<tb> Head Col 4: II-OA
<tb> <SEP> 6-Shogaol <SEP> 1.98 +/- 0.00 <SEP> 4.96 +/- 0.00 (SEP) <-> (TB> <CEL AL = L> 6- Gingerol <CEL AL = L> 43.06 +/- 0.84 <SEP> 70.87 +/- 1.85 <SEP> 2.54 +/- 0.00
<tb> <SEP> 6-dehydrogingerdione <SEP> 9.33 +/- 0.85 <SEP> 19.15 +/- 4.57 <CEL AL = L> 2.35 +/- 0.28
<Tb> </ TABLE>
Example 3
10 kg of shadow-dried ginger rhizomes were pulverized and the resulting powder was subjected to steam distillation for 5 hours. The distillate was concentrated in vacuo to give 410 g of concentrated distillate (III-O). 20 g of the concentrated distillate (III-O) were injected into a reverse phase chromatography column filled with 600 g of Diaion HP-20 resin and then successively with 4.5 L of water, 4.5 L of methanol, 3 L of acetone and 5 L of chloroform eluted. The water eluate, the methanol eluate, the acetone eluate and the chloroform eluate were collected separately and concentrated in vacuo to give 0.03 g of concentrated water eluate (III-OW), 14.5 g of concentrated methanol eluate (III-OM), 0.85 g Acetone eluate (III-OA) and 0.2 g of concentrated chloroform eluate (III-OC) was obtained.
The concentrated distillate (III-O) did not contain 6-shogaol, 6-gingerol and 6-dehydrogingerdione as determined by HPLC.
Example 4
10 g of a powder of shadow-dried ginger rhizomes were extracted with 1000 ml of acetone at 50 ° C. for 2 hours. The extraction solution was separated and concentrated in vacuo (40 ° C., 75 mmHg), giving a concentrated acetone extraction product (IV-O). The color and viscosity of the product (IV-O) together with its yield are given in Table 3.
Example 5
10 g of a powder of shadow-dried ginger rhizomes were subjected to steam distillation, and the oily distillate was freeze-dried after being separated from the aqueous distillate to obtain an oily extract (V-O). The color and viscosity of the oily extract (V-O) together with its yield are given in Table 3.
Example 6
In 10 g of a powder of shadow-dried ginger rhizomes, CO2 was introduced in a 250 ml extraction chamber at a flow rate of 45 l / min, the chamber pressure being controlled by a high-pressure pump (Model No. EK-1, LEWA Co., USA ) was set to 2500 to 4000 psia and the chamber temperature was kept at 35 to 60 ° C. using a heat exchanger (model no. H-2410, HOTEC Co., USA) and an external circulation system. The extraction was stopped when the introduced CO2 volume reached 300 L, and after the CO2 was evaporated, a supercritical CO2 extraction product (VI-O) was obtained. The color and viscosity of the product (VI-O) together with its yield are given in Table 3.
The levels of piercing (sharp) components determined by HPLC are given in Table 4.
<tb> <TABLE> Columns = 4 Table 3
<tb> Head Col 2 AL = L: IV-O
<tb> Head Col 1: V-O
<tb> Head Col 2: VI-O
<Tb> <September> L * <September> 87.6 <September> 80.4 <September> 96.3
<tb> <SEP> A * <SEP> -9.1 <SEP> -0.1 <CEL AL = L> -9.6
<Tb> <September> B * <September> 31.1 <September> 9.6 <September> 22.0
<tb> <SEP> Viscosity (cPs) <SEP> 15.6 <SEP> 11.8 <CEL AL = L> 12.1
<tb> <SEP> Yield (%) <SEP> 3.8 <SEP> 2.2 <SEP> 3.9
<Tb>
*: the values of L, A and B were determined using a
SIGMA 90 color measurement system (Nippon Denshoku Inc.
Co., Ltd., Japan), wherein L represents the brightness, A the red / green difference and B the yellow / blue difference.
<Tb> </ TABLE>
<tb> <TABLE> Columns = 2 Table 4
<tb> Head Col 1: content (mg / g)
<tb> Head Col 2: VI-O
<tb> <SEP> 6-Shogaol <SEP> 17.30 +/- 0.00
<tb> <SEP> 6-gingerol <SEP> 26.29 +/- 0.00
<tb> <CEL AL = L> 6-dehydrogingerdione <SEP> 19.20 +/- 1.19
<Tb> </ TABLE>
Example 7: Anti-Platelet Assay
Blood collected from the outer ear vein of rabbits was mixed with EDTA (100 mM) in a volume ratio of 14: 1 and centrifuged at 90 g for 10 minutes at room temperature to obtain a platelet-rich plasma. The latter was further centrifuged at 500 g for 10 minutes, the upper, plasma-rich layer was removed therefrom and the remaining bottom layer was suspended with a Tyrode solution which contained 2 mM EDTA but no calcium. This suspension was centrifuged at 500 g for a further 10 minutes and the platelets were suspended with a Tyrode solution without EDTA.
After centrifuging under the same conditions, the platelets were suspended with a Tyrode solution with the following composition (mM): NaCl (136.8), KCI (2.8), NaHCO3 (11.9), MgCl2 (1, 1), NaH2PO4 (0.33), CaCl2 (1.0), glucose (11.2) and bovine serum albumin (0.35%).
The number of blood platelets was determined using a Coulter Counter (model ZM) and set to 4.5 × 10 8 blood platelets / ml.
<tb> <TABLE> Columns = 3 Table 5
Inhibitor effects of ginger extracts on platelet aggregation induced by arachidonic acid and collagen <a)>
<tb> Head Col 1: ginger extract <b)>
<tb> Head Col 2 to 3 AL = L:
Concentration for a 50% inhibitor effect (mu g / ml)
<tb> <CEL CB = 2 AL = L> arachidonic acid <SEP> collagen
<tb> <SEP> I-O <SEP> 3.8 +/- 0.8 <SEP> 5.5 +/- 0.4
<tb> <SEP> I-OM <SEP> 1.7 +/- 0.3 <SEP> 2.7 +/- 0.4
<tb> <SEP> II-O <SEP> 3.1 +/- 0.5 <SEP> 6.5 +/- 1.2
<tb> <SEP> II-OA <SEP> 10.9 +/- 3.2 <CEL AL = L> 21.8 +/- 2.2
<tb> <SEP> II-OC <SEP> 6.9 +/- 0.7 <SEP> 16.6 +/- 4.3
<tb> <SEP> II-OM <SEP> 2.0 +/- 0.2 <CEL AL = L> 6.9 +/- 2.4
<Tb>
<a)> the platelets were incubated with ginger extracts or 0.5% DMSO (control) for 3 min at 37 ° C., then arachidonic acid (100 mu M) or collagen (10 mu g / ml) were added to make up the Trigger aggregation. Aspirin and indomethacin are positive control agents.
The percentage of inhibitor effect is calculated as follows:
[(Degree of inhibition of control) - (Degree of inhibition of ginger extract)] / (Degree of inhibition of control) x 100%
the values are given as mean +/- S.E., n = 3-6
<b)> produced in Examples 1 and 2.
<Tb>
<Tb> </ TABLE>
Example 8: Evaluation of inhibitor activity on paw edema induced by carrageenin
The test for determining the inhibitor activity for paw edema induced by carrageenin was carried out according to the method described by C.A. Winter et al. described procedures (C.A. Winter et al., "Proc. Soc. Exper. Biol. Med." 111: 544-547, 1962). Male Wistar mice weighing 150 +/- 20 g, which were not fed for one night, were injected into the left hind paws with 0.1 ml of a 1% carrageenin suspension, then rubbing test samples or a vehicle were used Control injected evenly into the left rear paws (10 mg / paw). 3 hours later, the volumes of the rear paws were determined using a volume scanner (Cat. # 7150, UGO Basil, Italy) and the difference between the left rear paw and the right rear paw was used as an index for the paw edema induced by carrageenin ,
<tb> <TABLE> Columns = 3 Table 6
Inhibitor activity of ginger extracts <a)> on paw edema induced by carrageenin
<tb> Head Col 1: treatment <b)>
<tb> Head Col 2: dosage (mg / paw)
<tb> Head Col 3: inhibitor activity on paw edema induced by carrageenin (%)
<Tb> <September> I-O <September> 10 <September> 18
<Tb> <September> I-OE <September> 10 <September> 19
<tb> <SEP> I-OM <CEL AL = L> 10 <SEP> 29
<Tb> <September> I OA <September> 10 <September> 25
<Tb> <September> II-O <September> 10 <September> 18
<tb> <SEP> II-OW <CEL AL = L> 10 <SEP> 0
<Tb> <September> II-OM <September> 10 <September> 26
<Tb> <September> II-OA <September> 10 <September> 25
<tb> <CEL AL = L> II-OC <CEL AL = L> 10 <SEP> 8
<Tb> <September> III-O <September> 10 <September> 0
<Tb> <September> III-OM <September> 10 <September> 11
<tb> <CEL AL = L> III-OA <CEL AL = L> 10 <SEP> 15
<Tb> <September> [6] -Dehydrogingerdion <September> 5 <September> 26
<Tb>
<a)> The inhibitor activity on the paw edema induced by carrageenin (%) was calculated as follows:
[(average degree of mice in the control group) - (average degree of mice in the test group)] / (average degree of mice in the control group)] x 100%
the values are given as mean +/- S.E., n = 3-6.
<b)> produced in Examples 1, 2 and 3.
<Tb>
<Tb> </ TABLE>
Example 9:
Evaluation of inhibitor activity against Trichophyton mentagrophytes or Pityrospsorum ovale
Anti-Trichophyton mentagrophytes assay
The minimum inhibitor concentration (MIC) of a ginger extract was determined and the experiment was carried out according to the method previously described by J. R. Edwards et al. (J. R. Edwards et al., "Antimicrobial Agents Chemotherapy" 33: 215-222, 1989).
The test substance was dissolved in a solvent (100% DMSO) and brought to the desired starting solution concentrations in a dilution series. For each concentration tested, a 0.01 ml aliquot was placed in a well of a 48-well spotting plate, the 0.99 ml of a potato dextrose broth (DIFCO, USA) at 10 3 -10 4 CFU / ml Trichophyton mentagrophytes (ATCC 9533). The plates were incubated at 28 ° C. for 72 hours and then visually checked and evaluated. The vehicle control was used as a blind control. Each concentration was rated twice. The results are shown in Table 7.
Anti-Pityrosporum oval assay
The minimum inhibitor concentration (MIC) of a ginger extract was determined and the experiment was carried out according to the above-mentioned method (J.R. Edwards et al., "Antimicrobial Agents Chemotherapy" 33: 215-222, 1989). The test substance was dissolved in a solvent (100% DMSO) and brought to the desired starting solution concentrations in a dilution series. For each concentration tested, a 0.01 ml aliquot was placed in a well of a 48-well spotting plate containing 0.99 ml of liquid Sabouraud medium (DIFCO, USA) with 10 3 -10 4 CFU / ml Pityrosporum ovale (ATCC 38593) contained. The plates were incubated at 37 ° C. for 48 hours and then visually checked and evaluated. A vehicle control was used as a blind control. Each concentration was rated twice.
The results are shown in Table 7.
<tb> <TABLE> Columns = 3 Table 7
Inhibitor effects of ginger extracts on Pityrosporum oval (Po) and Trichophyton mentagrophytes (Tm)
<tb> Head Col 1: ginger extract <a)>
<tb> Head Col 2: MIC (mu g / ml)
<Tb> <September> Po <September> Tm
<Tb> <September> I-O <September> 100 <September> 30
<tb> <CEL AL = L> II-OM <CEL AL = L> 100 <SEP> 30
<Tb> <September> II-O <September> 500 <September> 30
<Tb> <September> II OC <September> 100 <September> 30
<tb> <CEL AL = L> II-OM <SEP> 100 <SEP> 30
<Tb> <September> III-O <September> 500 <September> 100
<tb> <SEP> Blind control <SEP> - <b)> <SEP> - <b)>
<Tb>
<a)> produced in Examples 1, 2 and 3
<b)> No growth inhibitor effect was observed
<Tb>
<Tb> </ TABLE>