CH670046A5

CH670046A5 -

Info

Publication number: CH670046A5
Application number: CH3377/86A
Authority: CH
Inventors: Abdul Gaffar; Edward J Coleman
Original assignee: Colgate Palmolive Co
Priority date: 1985-08-22
Filing date: 1986-08-22
Publication date: 1989-05-12
Also published as: SG108892G; NL8602140A; FR2586351B1; IT1196587B; SE8603486L; DK168513B1; DE3627759A1; GB2180451A; GB2180451B; SE468626B; BE905319A; DK402086A; CA1282004C; IT8648389A0; GB8620482D0; FR2586351A1; SE8603486D0; DK402086D0; HK593A

Description

BESCHREIBUNG DESCRIPTION

Endotoxine sind komplexe Makromoleküle, die Lipid, Kohlenhydrat und Protein enthalten. Sie werden hauptsächlich in der Oberfläche Gram-negativer Organismen gefunden s und werden gewöhnlich als Lipopolysaccharide bezeichnet. Diese Makromoleküle sind toxisch für den Gast und können tödlich wirken. Beispielsweise können sie schwere hypotonische Schocks hervorrufen und ferner verschiedene toxische Reaktionen einschliesslich Knochenresorption im Körper io auslösen. Im Mund sind Endotoxine als wesentlicher Faktor an Zahnfleischentzündungen und lokalem Knochenverlust wie Verlust des Alveolarknochens beteiligt. Endotoxins are complex macromolecules that contain lipid, carbohydrate and protein. They are mainly found in the surface of Gram-negative organisms and are commonly referred to as lipopolysaccharides. These macromolecules are toxic to the guest and can be fatal. For example, they can cause severe hypotonic shocks and also trigger various toxic reactions including bone resorption in the body. In the mouth, endotoxins are a major factor in inflammation of the gums and local bone loss such as loss of the alveolar bone.

Theoretisch könnten Verbindungen, die Sauerstoff freisetzen, die Endotoxine inaktivieren. Jedoch haben sie im all-15 gemeinen wegen der Geschwindigkeit, mit der viele sauerstoffbildende Verbindungen den Sauerstoff freisetzen, nur geringe Wirkung zur Kontrolle der Endotoxinentwicklung. Verbindungen, die Sauerstoff langsamer freisetzen, könnten die Endotoxinwirkung beeinflussen. Ihre Wirksamkeit ist je-20 doch im allgemeinen dadurch begrenzt, dass die Bedingungen unter denen sie Sauerstoff freisetzen nicht den im Körper vorherrschenden Bedingungen entsprechen. In theory, compounds that release oxygen could inactivate the endotoxins. However, they generally have little effect in controlling endotoxin development because of the rate at which many oxygen-forming compounds release oxygen. Compounds that release oxygen more slowly could affect endotoxin effects. However, their effectiveness is generally limited by the fact that the conditions under which they release oxygen do not correspond to the conditions prevailing in the body.

Wie in der US-Patentanmeldung Nr. 726 545 vom 24. 25 April 1985 beschrieben, haben warmblütige Säuger wie beispielsweise Nagetiere bis zu und einschliesslich Menschen in ihren Körpern alkalische und saure Phosphatasen. Peroxydi-phosphat-Verbindungen besitzen die Fähigkeit, Sauerstoff langsam freizusetzen. Die Menge des von ihnen freigesetzten 30 Sauerstoffs beträgt 1/10 der von Wasserstoffperoxid freigesetzten Menge. In Gegenwart alkalischer und saurer Phosphatasen werden bei 25 °C während 20 Stunden nur etwa 50% ihres aktiven Sauerstoffs freigesetzt. As described in U.S. Patent Application No. 726,545 dated April 24, 1985, warm-blooded mammals such as rodents up to and including humans have alkaline and acidic phosphatases in their bodies. Peroxydi-phosphate compounds have the ability to release oxygen slowly. The amount of oxygen they release is 1/10 that of hydrogen peroxide. In the presence of alkaline and acidic phosphatases, only about 50% of their active oxygen is released at 25 ° C for 20 hours.

Peroxydiphosphat-Verbindungen (PDP) setzen Wasser-35 stoffperoxid in Gegenwart von Phosphatasen langsam nach der folgenden Gleichung frei: Peroxydiphosphate compounds (PDP) slowly release hydrogen peroxide in the presence of phosphatases according to the following equation:

0 0

II II

-O-P-O-O-P-O- -O-P-O-O-P-O-

1 t 1 t

0 0

Phosphatase Phosphatase

O O

II II

-o-o-p-o- -o-o-p-o-

0- 0-

h20 h20

-> H2O2+po4 , -> H2O2 + po4,

in der X ein nicht-toxisches, pharmazeutisch akzeptables Kation oder ein Rest einer organischen Estergruppe ist. Pe-roxydiphosphat abbauende Phosphatasen sind sowohl im Speichel als auch im Plasma, der Intestinalflüssigkeit und den weissen Blutkörperchen vorhanden. in which X is a non-toxic, pharmaceutically acceptable cation or a residue of an organic ester group. Peroxydiphosphate-degrading phosphatases are present in both saliva and plasma, intestinal fluid and white blood cells.

Es hat sich gezeigt, dass bakterielle Endotoxine auch mit intakten PDP reagieren. Diese Reaktion findet unabhängig von dem Vorhegen der Phosphatasen statt; d.h., sie findet auch ausserhalb des Körpers vom Warmblütern statt. Von Bedeutung ist jedoch, dass die Reaktion auch in Gegenwart von Phosphatase stattfindet, wenn Warmblüter mit PDP behandelt werden. Dabei ist es wünschenswert, Massnahmen vorzusehen, mit denen die Behandlung so lange vorgenommen wird, bis die Endotoxine inaktiviert sind. It has been shown that bacterial endotoxins also react with intact PDP. This reaction takes place regardless of the presence of the phosphatases; i.e., it also takes place outside the body from warm-blooded animals. It is important, however, that the reaction also takes place in the presence of phosphatase when warm-blooded animals are treated with PDP. It is desirable to provide measures with which the treatment is carried out until the endotoxins are inactivated.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Mittel zum Desaktivie-ren der Endotoxine zu schaffen und damit deren toxische Wirkungen wie Entzündungsbildung, Knochenresorption und hypotonische Schocks zu inhibieren. It is an object of the invention to provide a means for deactivating the endotoxins and thus inhibiting their toxic effects such as inflammation, bone resorption and hypotonic shocks.

Zur Lösung dieser Aufgaben wird erfindungsgemäss eine 50 pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung des durch bakterielle Endotoxine hervorgerufenen hypotonischen Schocks und lokaler Knochenresorption vorgeschlagen, die als Wirkstoff eine nicht-toxische, wasserlösliche, pharmazeutisch akzeptable Peroxydiphosphat-Verbindung ss enthält und die mit dem Endotoxin in Kontakt gebracht wird, um die Inaktivierung des bakteriellen Endotoxins zu bewirken. To achieve these objects, a pharmaceutical composition for the treatment of hypotonic shock and local bone resorption caused by bacterial endotoxins is proposed according to the invention, which contains a non-toxic, water-soluble, pharmaceutically acceptable peroxydiphosphate compound ss as active ingredient and which is brought into contact with the endotoxin to cause inactivation of the bacterial endotoxin.

Ein Verfahren zum Nachweis der Inaktivierung von En-dotoxinen besteht darin, dass man die Induktion der Bildung 60 eines Faktors verhindert, der gegenüber polymorphkernigen Leukocyten, nachfolgend «PMN» genannt, chemotaktisch ist. Ein derartiger Faktor ist nach dem Boyden-Chemotaxis-Verfahren nachweisbar, bei dem weisse Blutkörperchen von Ratten von einem Endotoxin-induzierten Faktor angezogen 65 werden, der in dem Bereich gebildet wird. Wenn nach dem Boyden-Verfahren bakterielles Endotoxin-Lipopolysaccha-rid mit Säugerserum inkubiert wird, läuft die folgende Reaktion ab: One method for detecting the inactivation of en-dotoxins is to prevent the induction of the formation 60 of a factor that is chemotactic against polymorphonuclear leukocytes, hereinafter referred to as “PMN”. Such a factor is detectable by the Boyden chemotaxis method, in which rat white blood cells are attracted to an endotoxin-induced factor that is formed in the area. When bacterial endotoxin lipopolysaccharide is incubated with mammalian serum using the Boyden method, the following reaction occurs:

670 046 670 046

1 h lang inkubiert Incubated for 1 hour

Serum und Endotoxin chemotaktischer Faktor für PMN Serum and endotoxin chemotactic factor for PMN

bei Rörpertenperatur with body temperature

Das Chemotaxis-Phänomen wurde unter Verwendung von Boyden-Kammern untersucht, die von Cates et al. in «Modified Boyden Chamber Method for Measuring PMN Chemotaxis», Leukocyte Chemotaxis, Methods, Physiology and Clinical Application, Herausgeber Gallin und Quie, Raven Press, N.Y., Seiten 67—71 (1978) beschrieben sind. The chemotaxis phenomenon was examined using Boyden chambers, which were described by Cates et al. in "Modified Boyden Chamber Method for Measuring PMN Chemotaxis", Leukocyte Chemotaxis, Methods, Physiology and Clinical Application, editors Gallin and Quie, Raven Press, N.Y., pages 67-71 (1978).

Wird, wie im vorliegenden Falle, Chemotaxis durch Endotoxin induziert, so kann die prozentuale Inhibierung unter Verwendung des Boyden-Chemotaxis-Tests quantifiziert werden. If, as in the present case, chemotaxis is induced by endotoxin, the percentage inhibition can be quantified using the Boyden chemotaxis test.

Das Endotoxin enthaltende Material kann in der Oberfläche von Gram-negativen Mikroorganismen, wie Actino-bacillus actinomycetemcomitens (A.a), Escherichia coli (E. coli), Bacteroides melanenogenicus (B. mei) und Salmonella typhi (S. typhi) in den Körper eines Warmblüters eingebracht werden. The endotoxin-containing material can enter the body of a Gram-negative microorganism such as Actino-bacillus actinomycetemcomitens (Aa), Escherichia coli (E. coli), Bacteroides melanenogenicus (B. mei) and Salmonella typhi (S. typhi) Warmbloods are introduced.

Aus A.a. isoliertes orales Endotoxin ist toxisch für den Alveolarknochen. Nicht-orales, aus E. coli gereinigtes Endotoxin kann für den Gast tödlich sein. From A.a. isolated oral endotoxin is toxic to the alveolar bone. Non-oral endotoxin purified from E. coli can be fatal to the guest.

Weitere bekannte Verfahren zum Inhibieren der Endoto-xinbildung werden durchgeführt, indem man die Resorption in einem Knochenkulturmedium zum Nachweis nutzt; ferner kann auch ein Kükenembryo-Lethalitätstest angewendet werden. Other known methods for inhibiting endotoxin formation are carried out by using absorption in a bone culture medium for detection; a chick embryo lethality test can also be used.

Die toxische Reaktion wird wirksam inhibiert, indem man das Endotoxin in situ in einem warmblütigen Gast mit einer zur Inhibierung ausreichenden Menge einer nicht-toxischen, wasserlöslichen, pharmazeutisch akzeptablen Peroxy-diphosphat-Verbindung in Kontakt bringt. Das Peroxydiphosphat reagiert im Körper mit dem Endotoxin als intaktes Molekül, wobei das Endotoxin inaktiviert wird. Da das Endotoxin inaktiviert wird, ist es offensichtlich, dass das Endotoxin mit dem Peroxydiphosphat reagiert. The toxic reaction is effectively inhibited by contacting the endotoxin in situ in a warm-blooded guest with an amount of a non-toxic, water-soluble, pharmaceutically acceptable peroxydiphosphate compound sufficient to inhibit it. The peroxydiphosphate reacts with the endotoxin as an intact molecule in the body, the endotoxin being inactivated. As the endotoxin is inactivated, it is evident that the endotoxin reacts with the peroxydiphosphate.

Im allgemeinen ist eine etwa 0,1—7%-ige Peroxydiphosphat-Verbindung in einem pharmazeutischen Träger, wie einer Lösung, in einer Dosierung von etwa 0,2—14 mg/kg Körpergewicht wirksam. Der Wirkungsgrad der Inhibierung kann durch den reduzierten Endotoxineffekt nachgewiesen werden und wird auf Basis der inhibierten Chemotaxis gegenüber PMN quantifiziert. Generally, about 0.1-7% peroxydiphosphate compound in a pharmaceutical carrier, such as a solution, is effective at a dosage of about 0.2-14 mg / kg body weight. The efficiency of the inhibition can be demonstrated by the reduced endotoxin effect and is quantified based on the inhibited chemotaxis compared to PMN.

Typische nicht-toxische, wasserlösliche, pharmazeutisch akzeptable Peroxydiphosphat-Verbindungen sind Alkalimetallsalze, wie beispielsweise Lithium-, Natrium- und Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie beispielsweise Magnesium-, Calcium- und Strontiumsalze sowie Zink-, Zinn- und quater-näre Ammoniumsalze und ferner Ci-n-Alkyl-, Adenylyl-, Guanylyl-, Cytosylyl- und Thymylylester. Alkalimetalle, insbesondere das Kaliumsalz ist unter den anorganischen Kationen bevorzugt. Das Tetrakaliumperoxydiphosphat ist ein stabiler, geruchloser, feinteiliger, freifliessender, weisser und nicht-hygroskopischer kristalliner Feststoff mit einem Molekulargewicht von 346,35 und einem Gehalt an aktiven Sauerstoff von 4,6%. Typical non-toxic, water-soluble, pharmaceutically acceptable peroxydiphosphate compounds are alkali metal salts, such as, for example, lithium, sodium and potassium salts, alkaline earth metal salts, such as, for example, magnesium, calcium and strontium salts, as well as zinc, tin and quaternary ammonium salts and also Ci -n-alkyl, adenylyl, guanylyl, cytosylyl and thymylyl esters. Alkali metals, especially the potassium salt, are preferred among the inorganic cations. Tetra potassium peroxydiphosphate is a stable, odorless, finely divided, free-flowing, white and non-hygroscopic crystalline solid with a molecular weight of 346.35 and an active oxygen content of 4.6%.

Tetrakaliumperoxydiphosphat ist bei 0—61 C zu 47 — 51 % wasserlöslich, jedoch unlöslich in üblichen Lösungsmitteln wie Acetonitril, Alkoholen, Ethern, Ketonen, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und dergleichen. Eine 2%-ige wässrige Lösung hat einen pH-Wert von etwa 9,6 und eine gesättigte Lösung besitzt einen pH-Wert von etwa 10,9. Eine 10%-ige Lösung in Wasser bei 25 C zeigte nach 4 Monaten keinen Verlust an aktivem Sauerstoff; bei 50 C Tetra potassium peroxydiphosphate is 47-51% water soluble at 0-61 C, but insoluble in common solvents such as acetonitrile, alcohols, ethers, ketones, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and the like. A 2% aqueous solution has a pH of about 9.6 and a saturated solution has a pH of about 10.9. A 10% solution in water at 25 C showed no loss of active oxygen after 4 months; at 50 C.

zeigte eine 10%-ige Lösung nach 6 Monaten einen Verlust an aktivem Sauerstoff von 3%. a 10% solution showed a 3% loss of active oxygen after 6 months.

io Unter den organischen Verbindungen sind solche bevorzugt, die hydrophobe Eigenschaften aufweisen, wie beispielsweise die Ci_i2-Alkylradikale sowie solche, die die schnelle Aufnahme des Peroxydiphosphatrests durch die Zelle erleichtern, wie Adenylyl-, Guanylyl-, Cytosylyl- und Thymy-iJ lylester. Among the organic compounds, preference is given to those which have hydrophobic properties, such as, for example, the Ci_i2-alkyl radicals and those which facilitate the rapid absorption of the peroxydiphosphate residue by the cell, such as adenylyl, guanylyl, cytosylyl and thymy-iJ lylester.

Die Peroxydiphosphat-Verbindung kann oral oder systemisch verabreicht werden, um die Endotoxine in der Mundhöhle oder in anderen Teilen des Körpers zu inhibieren. The peroxydiphosphate compound can be administered orally or systemically to inhibit endotoxins in the oral cavity or in other parts of the body.

Geeignete pharmazeutische Träger für die orale Aufnahme sind beschichtete Tabletten, die aus einem Material gebildet sind, das beständig gegenüber Magensäuren bei den im Magen herrschenden pH-Werten (etwa 1—3) ist, da das Peroxydiphosphat durch diese Magensäuren inaktiviert werden würde. Die Carrier mit dem darin eingeschlossenen festen Material aus tablettierten Granula des Peroxydiphosphor-säuresalzes werden demgegenüber von der Intestinalflüssigkeit aufgelöst, die einen höheren pH-Wert von etwa 5,5 bis 10 aufweist und die das Peroxydiphosphat nicht inaktiviert und es damit der enzymatischen Einwirkung der Phosphata-30 se überlässt, die in Menschen oder anderen warmblutigen Tieren vorhanden ist. Eine geeignete Lösung zum Überziehen von Tabletten ist aus typischerweise etwa 40—50 und vorzugsweise etwa 45 Gewichtsteilen, eines Fettsäureesters wie N-Butylstearat, typischerweise etwa 15 — 25 und vor-35 zugsweise etwa 20 Gewichtsteilen, eines Wachses wie Carnu-bawachs, typischerweise etwa 20 — 30 und vorzugsweise 25 Gewichtsteilen, einer Fettsäure wie Stearinsäure, und typischerweise etwa 5 — 15 und vorzugsweise etwa 10 Gewichtsteilen eines Celluloseesters wie Celluloseacetatphthalat, und 40 typischerweise etwa 400 — 900 Gewichtsteilen eines organischen Lösungsmittels zusammengesetzt. Weitere geeignete Überzugsmaterialien schliessen Schellack und Copolymere von Maleinsäureanhydrid und ethylenischen Verbindungen wie Polyvinylmethylether ein. Derartige Überzüge sind ver-45 schieden von Tabletten, die in der Mundhöhle abgebaut werden und bei denen das Tablettenmaterial im typischen Falle etwa 80 — 90 Gewichtsteile Mannit und etwa 30—40 Gewichtsteile Magnesiumstearat enthält. Suitable pharmaceutical carriers for oral ingestion are coated tablets which are formed from a material which is resistant to stomach acids at the pH values in the stomach (about 1-3), since the peroxydiphosphate would be inactivated by these stomach acids. In contrast, the carriers with the solid material of tableted granules of the peroxydiphosphoric acid salt enclosed therein are dissolved by the intestinal fluid, which has a higher pH of about 5.5 to 10 and which does not inactivate the peroxydiphosphate and thus the enzymatic action of the phosphates -30 se that is present in humans or other warm-blooded animals. A suitable solution for coating tablets is typically about 40-50 and preferably about 45 parts by weight of a fatty acid ester such as N-butyl stearate, typically about 15-25 and preferably about 20 parts by weight of a wax such as Carnu-bah wax, typically about 20-30 and preferably 25 parts by weight of a fatty acid such as stearic acid, and typically about 5-15 and preferably about 10 parts by weight of a cellulose ester such as cellulose acetate phthalate, and 40 typically about 400-900 parts by weight of an organic solvent. Other suitable coating materials include shellac and copolymers of maleic anhydride and ethylenic compounds such as polyvinyl methyl ether. Such coatings are different from tablets which are broken down in the oral cavity and in which the tablet material typically contains about 80-90 parts by weight of mannitol and about 30-40 parts by weight of magnesium stearate.

so Tablettierte Granula des Peroxydiphosphatsalzes werden durch Mischen von etwa 30—50 Gewichtsteilen des Peroxydiphosphatsalzes mit etwa 45 — 65 Gewichtsteilen eines festen Polyhydroxyzuckers wie Mannit und Befeuchten mit etwa 20—35 Gewichtsteilen einer flüssigen Polyhydroxyzuk-55 ker-Lösung wie Sorbit, Sieben zum Dimensionieren, Vermischen mit etwa 20—35 Gewichtsteilen eines Bindemittels wie Magnesiumstearat und Verpressen der Granula zu Tabletten auf einer Tablettiermaschine hergestellt. Die tablettierten Granula werden durch Aufsprühen eines Schaums einer Lö-60 sung des Überzugmaterials beschichtet und zum Entfernen des Lösungsmittels getrocknet. Derartige Tabletten sind verschieden von Dentaltabletten, die normalerweise aus tablettierten Granula ohne einen speziellen Schutzüberzug bestehen. Tableted granules of the peroxydiphosphate salt are mixed by mixing about 30-50 parts by weight of the peroxydiphosphate salt with about 45-65 parts by weight of a solid polyhydroxy sugar such as mannitol and moistening with about 20-35 parts by weight of a liquid polyhydroxy sugar solution such as sorbitol. Mix with about 20-35 parts by weight of a binder such as magnesium stearate and compress the granules into tablets produced on a tabletting machine. The tableted granules are coated by spraying a foam of a solution of the coating material and dried to remove the solvent. Such tablets are different from dental tablets, which normally consist of tableted granules without a special protective coating.

65 Eine wirksame Verabreichungsdosis von Peroxydiphosphat mit vorgeschriebenem Einnahmeschema beträgt bei oraler Applikation etwa 0,1 — 6 g/kg Körpergewicht täglich; bei systemischer Applikation wie intramuskulärer, intraperi- 65 An effective administration dose of peroxydiphosphate with prescribed regimen is approximately 0.1 - 6 g / kg body weight per day with oral administration; with systemic application such as intramuscular, intraperial

670 046 670 046

4 4th

tonealer oder intravenöser Injektion beträgt die Dosis etwa 0,1—2 g/'kg Körpergewicht täglich. tonal or intravenous injection, the dose is about 0.1-2 g / 'kg body weight daily.

Physiologisch akzeptable, pyrogenfreie Lösungsmittel sind geeignete Träger zur systemischen Verabreichung in an sich bekannter Weise. Salzlösung, mit Phosphat auf einen physiologischen pH-Wert von etwa 7 — 7,4 gepuffert, ist der bevorzugte Träger für die systemische Verabreichung. Derartige Lösungsmittel sind verschieden von Wasser-Netzmit-tel-Vehikeln die typischerweise in Zahnpflegemitteln verwendet werden. Eine derartige Lösung wird typischerweise hergestellt, indem man entionisiertes, destilliertes Wasser sterilisiert, es unter Verwendung des Limulus-Amebocyt-Lysat-(LAL)-Tests, beschrieben von Tsuji et al in «Pharmaceutical Manufacturing», Seiten 35—41 (1984) auf fehlende Pyroge-nität untersucht, anschliessend einen Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von beispielsweise etwa 8,5 —10, hergestellt aus pyrogenfreiem sterilen Wasser, 1 — 100 mg Peroxydiphos-phat-Derivat und Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von etwa 0,5—1,5 Gew.% hinzufügt. Die Lösung kann zur Verwendung in Ampullen abgefüllt werden, nachdem sie durch Passage durch einen Mikroporenfilter resterilisiert wurde. Physiologically acceptable, pyrogen-free solvents are suitable carriers for systemic administration in a manner known per se. Saline, buffered with phosphate to a physiological pH of about 7-7.4, is the preferred vehicle for systemic administration. Such solvents are different from water wetting agents typically used in dentifrices. Such a solution is typically prepared by sterilizing deionized, distilled water, using the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test described by Tsuji et al in "Pharmaceutical Manufacturing", pp. 35-41 (1984) Lack of pyrogensity examined, then a phosphate buffer with a pH value of about 8.5-10, for example, made from pyrogen-free sterile water, 1 - 100 mg of peroxydiphosphate derivative and sodium chloride to a concentration of about 0.5 - 1.5% by weight added. The solution can be filled into ampoules for use after being resterilized by passage through a micropore filter.

Alternativ können Lösungen wie Ringer-Lösung mit einem Gehalt an 0,86 Gew.% Natriumchlorid, 0,03 Gew.% Alternatively, solutions such as Ringer's solution containing 0.86% by weight sodium chloride, 0.03% by weight

Kaliumchlorid und 0,033 Gew.% Calciumchlorid verwendet werden. Potassium chloride and 0.033% by weight calcium chloride can be used.

Die nachfolgenden Beispiele zeigen, dass Peroxydiphosphat-Verbindungen Chemotaxis, die durch einen von Endo-s toxin gebildeten Faktor im Serum induziert wurde und die Endotoxin-Toxizität für Knochen inhibieren. The following examples show that peroxydiphosphate compounds chemotaxis, which was induced in the serum by a factor formed by Endo-s toxin and inhibit endotoxin toxicity for bones.

Beispiel 1 example 1

PMN wurden aus der Peritonealcavität von erwachsenen io weissen Neuseeland-Kaninchen 12 Stunden nach intraperitonealer Injektion von 200 ml einer Lösung erhalten, die 0,2% Glycogen in steriler isotoner Salzlösung (0,85% NaCl) enthielt. Die Zellen (PMN) wurden von dem aus der Kanin-chenperitonealcavität gewonnenen Exudat befreit und nach i5 Teichmann et al (Arch. Oral Biol. 21p. 257 (1976)) gereinigt. Aus E. coli isoliertes bakterielles Endotoxin, erhalten von Associates of Cape Cod Inc. Woods Hole, Maine, wurde mit verschiedenen Konzentrationen von PDP (Tetrakaliumsalz) bei 37 °C 1 Stunde lang vorbehandelt. Die Chemotaxisbe-20 Stimmung wurde dann mit behandelten und unbehandelten Endotoxinen unter Verwendung der Boyden-Kammer wie oben beschrieben durchgeführt. Die Daten sind in den Tabellen 1 und 2 wiedergegeben. PMN were obtained from the peritoneal cavity of adult io white New Zealand rabbits 12 hours after intraperitoneal injection of 200 ml of a solution containing 0.2% glycogen in sterile isotonic saline (0.85% NaCl). The cells (PMN) were freed from the exudate obtained from the rabbit peritoneal cavity and purified according to i5 Teichmann et al (Arch. Oral Biol. 21p. 257 (1976)). Bacterial endotoxin isolated from E. coli, obtained from Associates of Cape Cod Inc. Woods Hole, Maine, was pretreated with various concentrations of PDP (tetrapotassium salt) at 37 ° C for 1 hour. Chemotaxis-20 tuning was then performed on treated and untreated endotoxins using the Boyden chamber as described above. The data are shown in Tables 1 and 2.

Tabelle 1 Table 1

Behandlung treatment

Chemotaxis durchschnittliche Chemotaxis average

Prozent Reduktion der Percent reduction in

Anzahl von wandernden Number of migrants

Chemotaxis Chemotaxis

PMN + S.D.+ PMN + S.D. +

1. Kontrolle"1"1" 1. Control "1" 1 "

139 + 4,2 139 + 4.2

2. Serum"1"+ + und 1 ng/ml Endoxin 2. Serum "1" + + and 1 ng / ml endoxin

343,0 + 36,7 343.0 + 36.7

3. 0,5% PDP und Serum+ + + 3. 0.5% PDP and serum +++

142,5 ± 12,0 142.5 ± 12.0

4. Endotoxin (1 ng/ml) vorbehandelt mit 0,5% 4. Endotoxin (1 ng / ml) pretreated with 0.5%

PDP und Serum + + PDP and Serum + +

188,0 ± 18,4 188.0 ± 18.4

-44% im Vergi, zu 2 -44% in Vergi, for 2

5. Endotoxin (0,5 ng/ml) vorbehandelt mit 0,5% 5. Endotoxin (0.5 ng / ml) pretreated with 0.5%

PDP und Serum+ + PDP and Serum + +

154,0 ± 2,8 154.0 ± 2.8

-56% im Vergi, zu 2 -56% in Vergi, for 2

6. Endotoxin (0,25 ng/ml) vorbehandelt mit 0,5% 6. Endotoxin (0.25 ng / ml) pretreated with 0.5%

PDP und Serum"1*+ PDP and serum "1 * +

138,5 ± 2,8 138.5 ± 2.8

-60% im Vergi, zu 2 -60% in Vergi, for 2

+ S.D = Standardabweichung + S.D = standard deviation

+ + medium = Earls Lösung enthaltend 10% Rinderserumalbumin + + + Serum = Humanserum (normal) + + medium = Earl's solution containing 10% bovine serum albumin + + + Serum = human serum (normal)

Die in Tabelle 1 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, dass Endotoxin wie vermutet in grossem Umfang die Freisetzung eines Faktors induziert, der die Chemotaxis von PMN steigerte (Nr. 2 unter «Behandlung»); PDP (0,5%) hat keine Wirkung auf PMN (Nr. 3 unter «Behandlung»); mit PDP vorbehandelte Endotoxine zeigen eine chemotaktische Aktivität des Toxins die signifikant reduziert ist (Nr. 4, 5 und 6 The results shown in Table 1 show that, as suspected, endotoxin to a large extent induces the release of a factor which increased the chemotaxis of PMN (No. 2 under “Treatment”); PDP (0.5%) has no effect on PMN (No. 3 under “Treatment”); Endotoxins pretreated with PDP show a chemotactic activity of the toxin that is significantly reduced (No. 4, 5 and 6

45 unter «Behandlung»), Diese Daten zeigen, dass die Behandlung von Endotoxin mit PDP den biologischen Effekt des Toxins desaktiviert. 45 under “Treatment”), These data show that treatment of endotoxin with PDP deactivates the biological effect of the toxin.

Beispiel 2 Example 2

Die in Tabelle 2 wiedergegebenen Daten wurden mit wei-50 teren Boyden-Kammer-Tests wie in Beispiel 1 erhalten, wobei PDP als Tetrakaliumsalz verwendet wurde. The data presented in Table 2 were obtained with further Boyden chamber tests as in Example 1, using PDP as the tetrapotassium salt.

Tabelle 2 Table 2

Behandlung Chemotaxis durchschnittliche Prozent Reduktion der Treatment chemotaxis average percent reduction in

Anzahl von wanderden Chemotaxis Number of migrating chemotaxis

PMN + S.D. PMN + S.D.

1. 1.

Kontrollmedium (wie in Beispiel 1) Control medium (as in example 1)

136,5 136.5

+ 6,3 + 6.3

2. 2nd

Endotoxin 1 ng/ml und Serum4" Endotoxin 1 ng / ml and Serum4 "

329,0 329.0

+ 39,5 + 39.5

3. 3rd

PDP 0,5% und Serum"1" PDP 0.5% and serum "1"

139,5 139.5

± 4,9 ± 4.9

4. 4th

Endotoxin (1 ng/ml) vorbehandelt mit 0,5% Endotoxin (1 ng / ml) pretreated with 0.5%

PDP und Serum+ PDP and Serum +

188,0 188.0

± 9,8 ± 9.8

-43,0% -43.0%

5. 5.

Endotoxin (1 ng/ml) vorbehandelt mit 0,25% Endotoxin (1 ng / ml) pretreated with 0.25%

PDP und Serum"1" PDP and serum "1"

206,5 206.5

± 17,6 ± 17.6

-37% -37%

6. 6.

Endotoxin (1 ng/ml) vorbehandelt mit 0,1% Endotoxin (1 ng / ml) pretreated with 0.1%

PDP und Serum"1" PDP and serum "1"

231,0 231.0

± 17,6 ± 17.6

-30% -30%

Serum wie in Beispiel 1 Serum as in example 1

5 5

670 046 670 046

Die in der obigen Tabelle wiedergegebenen Daten zeigen, dass eine PDP-Konzentration von mindestens einem so geringen Wert wie 0,1% zum Desaktivieren der biologischen Aktivität von Endotoxin wirksam ist. The data presented in the table above show that a PDP concentration of at least as low as 0.1% is effective in deactivating the biological activity of endotoxin.

Beispiel 3 Example 3

Wirkungen von PDP auf die Endotoxinaktivität in Knochenkulturen Der Test, bei dem ein Endotoxin-Isolat aus Actinobacil-lus actinomycetemcomitans Y4 (AAY4) die Resorption von Knochen in einer Knochenkultur induziert (Kiley und Holt, Infect. Immun. 30, Seiten 362-373 (1980)) wurde verwendet, um festzustellen, ob PDP die Aktivität des Endotoxins aus Y4 bei der Resorption von Knochen desaktiviert. Knochenkulturen von Rattenfoeten wurden wie von Raisz, in J. Clin. Invest. 44, Seiten 103 — 116 (1965) beschrieben, hergestellt, indem man Ratten am 18. Tag der Trächtigkeit 45CaCl2 injizierte. Die Ratten wurden am 19. Tag getötet und Radii und Ulnae der Embryonen mit Knorpelenden entnommen und zum Kultivieren in BGJ-Medium (Gibco, Buffalo, NY) bei 37 C mit 5% CO2 gebracht. Das Medium wurde mit 5% erwärmtem (3 Stunden lang bei 57 C) fötalem Kalbsserum ergänzt. Jeweils 4 Knochen wurden in eine Vertiefung eines Tabletts mit 24 Vertiefungen (Nunc, Gibco) 5 eingebracht, wobei jede Vertiefung 0,5 ml Medium enthielt. Die Freisetzung von 45Ca in das Kulturmedium aus Knochen, die in Gegenwart einer Testsubstanz inkubiert waren, wurden verglichen mit der Freisetzung aus Knochen, die in Kontrollmedium inkubiert waren; die Ergebnisse der Kno-10 chenresorption wurden als Relation ausgedrückt. Effects of PDP on endotoxin activity in bone cultures The test in which an endotoxin isolate from Actinobacil-lus actinomycetemcomitans Y4 (AAY4) induces bone resorption in a bone culture (Kiley and Holt, Infect. Immun. 30, pages 362-373 ( 1980)) was used to determine whether PDP deactivates the activity of Y4 endotoxin in bone resorption. Bone cultures of rat fetuses were as described by Raisz in J. Clin. Invest. 44, pages 103-116 (1965), by injecting rats on the 18th day of pregnancy 45CaCl2. The rats were sacrificed on day 19 and the radii and ulnae of the embryos with cartilage ends removed and brought to cultivation in BGJ medium (Gibco, Buffalo, NY) at 37 C with 5% CO2. The medium was supplemented with 5% warmed fetal calf serum (3 hours at 57 ° C). 4 bones were placed in each well of a tray with 24 wells (Nunc, Gibco) 5, each well containing 0.5 ml of medium. The release of 45Ca into the culture medium from bones incubated in the presence of a test substance was compared to the release from bones incubated in control medium; the results of bone resorption were expressed as a relation.

Endotoxin aus AAY4 wurde von der Universität von Pennsylvania, School of Dentistry erhalten. AAY4 Endotoxin wurde mit verschiedenen Konzentrationen von PDP als Tetrakaliumsalz bei 37 C behandelt. Das überschüssige 15 PDP wurde durch Membrandialyse (maximales Molekulargewicht 3500) entfernt. Auf diese Weise konnte nicht-umge-setztes PDP nach aussen diffundieren während das Endotoxin mit einem Molekulargewicht von mehr als 3500 in dem Beutel zurückgehalten wurde. Endotoxin from AAY4 was obtained from the University of Pennsylvania, School of Dentistry. AAY4 endotoxin was treated with various concentrations of PDP as the tetrapotassium salt at 37C. The excess 15 PDP was removed by membrane dialysis (maximum molecular weight 3500). In this way, unreacted PDP was able to diffuse outside while the endotoxin with a molecular weight of more than 3500 was retained in the bag.

20 Die Daten sind in Tabelle 3 wiedergegeben. 20 The data are shown in Table 3.

Tabelle 3 Table 3

Behandlung treatment

Anzahl 45ca % freigesetzt Test/Kontrolle Number 45ca% released test / control

Sig. Sig.

Ratten Rats

+ S.D. + S.D.

1. 1.

Kontrolle control

6 6

30,11 + 30.11 +

1,98 1.98

_ _

2. 2nd

10 (ig/ml Endotoxin AAY4 10 (ig / ml endotoxin AAY4

6 6

85,46 ± 85.46 ±

4,71 4.71

2,87 2.87

± ±

0,16 0.16

97% im Vergi, zu 1 97% in Vergi, 1

3. 3rd

10 ng/ml Endotoxin 10 ng / ml endotoxin

vorbehandelt mit 100 mcg PDP pretreated with 100 mcg PDP

6 6

78,47 ± 78.47 ±

2,9 2.9

2,61 2.61

+ +

0,1 0.1

nicht signifikant not significant

4. 4th

10 ng/ml Endotoxin 10 ng / ml endotoxin

vorbehandelt mit 1000 mcg PDP pretreated with 1000 mcg PDP

6 6

31,98 ± 31.98 ±

4,27 4.27

1,06 1.06

± ±

0,14 0.14

97% im Vergi, zu 2 97% in Vergi, for 2

Die Daten zeigen, dass Endotoxin aus AAY4 signifikant Knochenresorption induziert (Vergleich der Nr. 1 mit 2), während eine Vorbehandlung des Endotoxins mit 1000 mcg/ ml PDP (0,1%) die Aktivität des Endotoxins bezüglich der Knochenresorption wirksam inhibiert. The data show that endotoxin from AAY4 significantly induces bone resorption (comparison of No. 1 with 2), while pretreatment of the endotoxin with 1000 mcg / ml PDP (0.1%) effectively inhibits the activity of the endotoxin with respect to bone resorption.

Die oben wiedergegebenen Ergebnisse der Beispiele 1 bis 3 sind repräsentativ für die Wirkungen von PDP Tetrakaliumsalz und anderer nicht-toxischer, wasserlöslicher, pharmazeutisch akzeptabler PDP-Salze wie anderer Alkalimetall- The results of Examples 1 to 3 presented above are representative of the effects of PDP tetrapotassium salt and other non-toxic, water-soluble, pharmaceutically acceptable PDP salts such as other alkali metal salts.

35 salzen, Zinksalz und Zinnsalz sowie für Ci_i2-Alkyl-PDP-Salze und andere organische PDP-Verbindungen, insbesondere einschliesslich der Adenylyl-, Guanylyl, Cytosylyl- und Thymylylester und quaternären Ammonium-PDP-Salze zum Inhibieren der von einem durch Endotoxin im Serum gebil-40 deten Faktor induzierten Chemotaxis und zum Inhibieren der Endotoxintoxizität für Knochen bei Ratten, Kaninchen und Säugern im allgemeinen. 35 salts, zinc salt and tin salt as well as for Ci_i2-alkyl-PDP salts and other organic PDP compounds, in particular including the adenylyl, guanylyl, cytosylyl and thymylyl esters and quaternary ammonium PDP salts for the inhibition of one by endotoxin in serum was found to induce chemotaxis and inhibit endotoxin toxicity to bone in rats, rabbits and mammals in general.

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

S S

Claims

670 046

PATENT CLAIMS

1. Pharmaceutical composition for the treatment of hypotonic shock and local bone resorption, which are caused by bacterial endotoxins, characterized in that it contains a non-toxic, water-soluble, pharmaceutically acceptable peroxydiphosphate compound as active ingredient.

2. Composition according to claim 1, characterized in that the peroxydiphosphate compound is present in an amount of 0.1-7% in a pharmaceutical carrier.

3. Composition according to one of claims 1 to 2, characterized in that the peroxydiphosphate compound is in the form of tableted granules which are provided with a coating which is not degraded during passage through the stomach of the warm-blooded animal, and which is dissolved by the intestinal fluid with a pH of 5-10.

4. Composition according to one of claims 1 to 2, characterized in that the peroxydiphosphate compound is present in a solution of non-pyrogenic distilled water and phosphate buffered sodium chloride.

5. Composition according to one of claims 1 to 4, characterized in that the peroxydiphosphate compound as a salt of an alkali metal, zinc, tin or quaternary ammonium or as Ci_i2-alkyl, adenylyl, guanylyl, cytosylyl or thymylyl ester is present.

6. The composition according to claim 5, characterized in that the peroxydiphosphate compound is present as the potassium salt.

7. The composition according to claim 5, characterized in that the peroxydiphosphate compound is present as Ci_i2 ester.

8. The composition according to claim 5, characterized in that the peroxydiphosphate compound is present as adenylyl, guanylyl, cytosylyl or thymylyl ester.

2nd