CH661498A5 - OPTICALLY ACTIVE CHEMICAL INTERMEDIATES USEFUL FOR THE PRODUCTION OF L-CARNITINE AND PROCEDURES FOR THEIR PREPARATION. - Google Patents

OPTICALLY ACTIVE CHEMICAL INTERMEDIATES USEFUL FOR THE PRODUCTION OF L-CARNITINE AND PROCEDURES FOR THEIR PREPARATION. Download PDF

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CH661498A5
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Description

La presente invenzione riguarda nuovi intermedi chimici otticamente attivi utili per la produzione di L-carnitina e procedimenti per la loro preparazione. In particolare, l'invenzione riguarda un procedimento per ridurre microbiologicamente esteri o ammidi dell'acido acetoacetico y-sostituito nei loro rispettivi derivati dell'acido L-ß-idrossi-butirrico y-sostituito, tali derivati potendo venir facilmente convertiti in L-carnitina. The present invention relates to new optically active chemical intermediates useful for the production of L-carnitine and processes for their preparation. In particular, the invention relates to a process for microbiologically reducing esters or amides of y-substituted acetoacetic acid in their respective y-substituted L-ß-hydroxy-butyric acid derivatives, these derivatives being easily converted into L-carnitine .

È ben noto che la carnitina (acido ß-idrossi-y-trimetilammi-nobutirrico) contiene un centro di asimmetria ed esiste pertanto in due forme stereoisomere, la D-carnitina e la L-carnitina. It is well known that carnitine (ß-hydroxy-y-trimethylamine-nobutyric acid) contains an asymmetry center and therefore exists in two stereoisomeric forms, D-carnitine and L-carnitine.

La L-carnitina è normalmente presente nell'organismo ove agisce da trasportatore degli acidi grassi attivati a lunga catena attraverso la membrana mitocondriale. Poiché la membrana mitocondriale è impermeabile agli acil-CoA, gli acidi grassi a lunga catena possono penetrare nel mitocondrio soltanto quando è avvenuta la loro esterificazione con la L-carnitina. La funzione di trasporto della L-carnitina viene esercitata sia trasferendo gli acidi grassi attivati a lunga catena dai siti della loro biosintesi, per esempio i microsomi, nei mitocondri ove essi vengono ossidati, e trasferendo l'acetil-CoA dai mitocondri, ove esso viene formato, ai siti extramitocondriali ove avviene la sintesi degli acidi grassi a lunga catena, ad esempio nei microsomi, in cui l'acetil-CoA può venir utilizzato per sintetizzare colesterolo e acidi grassi. L-carnitine is normally present in the body where it acts as a transporter of activated long chain fatty acids through the mitochondrial membrane. Since the mitochondrial membrane is impermeable to acyl-CoA, long chain fatty acids can only enter the mitochondrion when their esterification with L-carnitine has occurred. The transport function of L-carnitine is exercised both by transferring the long chain activated fatty acids from the sites of their biosynthesis, for example the microsomes, to the mitochondria where they are oxidized, and by transferring the acetyl-CoA from the mitochondria, where it is formed, to extramitochondrial sites where the synthesis of long chain fatty acids takes place, for example in microsomes, where acetyl-CoA can be used to synthesize cholesterol and fatty acids.

Mentre è stato accertato che esclusivamente l'isomero lego-viro (L-carnitina) costituisce la forma biologica (la D-carnitina non è mai stata finora rilevata nei tessuti di mammiferi), da un certo numero di anni si utilizza la D,L-carnitina racemica per varie indicazioni. Per esempio la D,L-carnitina è venduta in Europa quale stimolante dell'appetito, ed è stato riportato che questa sostanza ha un effetto sulla crescita dei bambini; si veda ad esempio Borniche et al., Clinica Chemica Acta, 5, 171-176, 1960 e Alexander et al., «Protides in the Biological Fluids», 6° Simposio, Bruges, 1958, 306-310. Il Brevetto Statunitense n. 3 830 931 descrive dei miglioramenti della contrattilità miocardica e del ritmo sistolico nella insufficienza cardiaca congestizia che vengono spesso ottenuti mediante somministrazione di D,L-carnitina. Il Brevetto Statunitense n. 3 968 241 descrive l'uso di D,L-carnitina nelle aritmie cardiache. Il Brevetto Statunitense n. 3 810 994 descrive l'uso di D,L-carnitina nel trattamento dell'obesità. While it has been ascertained that only the lego-viro isomer (L-carnitine) constitutes the biological form (D-carnitine has never been detected in mammalian tissues so far), D, L has been used for a number of years racemic carnitine for various indications. For example D, L-carnitine is sold in Europe as an appetite stimulant, and this substance has been reported to have an effect on children's growth; see for example Borniche et al., Clinica Chemica Acta, 5, 171-176, 1960 and Alexander et al., «Protides in the Biological Fluids», 6th Symposium, Bruges, 1958, 306-310. The US Patent n. No. 3,830,931 describes improvements in myocardial contractility and systolic rhythm in congestive heart failure that are often achieved by administering D, L-carnitine. The US Patent n. 3 968 241 describes the use of D, L-carnitine in cardiac arrhythmias. The US Patent n. 3,810,994 describes the use of D, L-carnitine in the treatment of obesity.

Recentemente, tuttavia, si è venuta sempre più affermando l'importanza di utilizzare esclusivamente l'isomero levogiro della carnitina per almeno alcune applicazioni terapeutiche. È stato infatti dimostrato che la D-carnitina è un inibitore competitivo degli enzimi legati alla carnitina, quali ad esempio la carnitina acetiltransferasi (CAT) e la carnitina palmitoiltransferasi (PTC). Inoltre, degli studi recenti suggeriscono che la D-carnitina possa provocare la deplezione di L-carnitina dal tessuto cardiaco. Conseguentemente è essenziale che esclusivamente la L-carnitina venga somministrata a dei pazienti sottoposti a trattamento medico per disturbi cardiaci o per l'abbassamento dei lipidi ematici. Recently, however, the importance of using only the left-handed isomer of carnitine for at least some therapeutic applications has become increasingly affirmed. Indeed, D-carnitine has been shown to be a competitive inhibitor of carnitine-related enzymes, such as carnitine acetyltransferase (CAT) and carnitine palmitoyltransferase (PTC). Additionally, recent studies suggest that D-carnitine may cause L-carnitine depletion from cardiac tissue. Consequently, it is essential that only L-carnitine is administered to patients undergoing medical treatment for heart disease or for the reduction of blood lipids.

Sono stati proposti diversi procedimenti per produrre carnitina su scala industriale. La sintesi chimica della carnitina conduce tuttavia inevitabilmente alla miscela racemica degli isomeri D e L. Conseguentemente devono venir impiegati dei procedimenti di risoluzione per ottenere dalla miscela racema gli antipodi ottici separati. Questi procedimenti di risoluzione sono tuttavia complessi e costosi. Various processes have been proposed for producing carnitine on an industrial scale. However, the chemical synthesis of carnitine inevitably leads to the racemic mixture of the D and L isomers. Consequently, resolution procedures must be used to obtain the separate optical antipodes from the racemic mixture. However, these resolution procedures are complex and expensive.

È già noto che la funzione ß-chetonica in posizione 3 di derivati dell'acido acetoacetico y-sostituito può venir ridotta per idrogenazione in presenza di platino su carbone (si veda ad esempio il Brevetto Statunitense n. 3 969 406). Tuttavia, il composto ossidrilico risultante è racemico. Al contrario, impiegando l'azione fermentativa di un microorganismo in accordo al procedimento della presente invenzione, l'idrogenazione della funzione chetonica in posizione 3 può venir realizzata stereose-lettivamente fornendo dei derivati otticamente attivi dell'acido ß-idrossibutirrico y-sostituito. It is already known that the ß-ketone function in position 3 of y-substituted acetoacetic acid derivatives can be reduced by hydrogenation in the presence of platinum on coal (see for example the United States Patent No. 3 969 406). However, the resulting hydroxyl compound is racemic. On the contrary, by using the fermentative action of a microorganism according to the process of the present invention, the hydrogenation of the ketone function in position 3 can be achieved stereoseply by providing optically active derivatives of the y-substituted ß-hydroxybutyric acid.

In particolare, attraverso una opportuna selezione (come verrà descritto in seguito) del substrato da sottoporre all'azione fermentativa dei microorganismi in accordo al procedimento della presente invenzione, si ottiene la configurazione 3(R) 0 L-epimerica. Questa configurazione è quella richiesta per la conversione nella L-carnitina naturale. In particular, through a suitable selection (as will be described below) of the substrate to be subjected to the fermentative action of the microorganisms according to the process of the present invention, the 3 (R) 0 L-epimeric configuration is obtained. This configuration is the one required for conversion to natural L-carnitine.

In termini generali, la presente invenzione comprende l'uso di una riduttasi microbica, la L-ß-idrossiacil CoA deidrogenasi [EC 1.1.1.35], per catalizzare l'idrogenazione stereospecifica di derivati dell'acido acetoacetico y-sostituito come definiti in seguito. In general terms, the present invention includes the use of a microbial reductase, L-ß-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35], to catalyze the stereospecific hydrogenation of derivatives of y-substituted acetoacetic acid as defined below .

Pertanto, in accordo al suo aspetto più ampio, il procedimento della presente invenzione per preparare derivati otticamente attivi dell'acido ß-idrossibutirrico y-sostituito aventi formula in cui Therefore, according to its broader aspect, the process of the present invention for preparing optically active derivatives of y-substituted ß-hydroxybutyric acid having formula wherein

X è scelto fra Cl, Br, I e OH e X is chosen from Cl, Br, I and OH e

R è un radicale avente configurazione a catena lineare, ramificata oppure ciclica scelto nella classe consistente dei radicali alcossilici aventi da 1 a 15 atomi di carbonio; R is a radical having a straight, branched or cyclic chain configuration chosen from the class consisting of alkoxyl radicals having from 1 to 15 carbon atoms;

radicali alchilamminici aventi da 5 a 15 atomi di carbonio; radicali cicloalcossilici e radicali cicloalchilamminici aventi da 5 a 12 atomi di carbonio; alkylamine radicals having from 5 to 15 carbon atoms; cycloalkoxylic and cycloalkylamine radicals having from 5 to 12 carbon atoms;

fenossi e radicali fenilalcossilici aventi da 7 a 14 atomi di carbonio; phenoxy and phenylalkoxy radicals having from 7 to 14 carbon atoms;

fenilammino e radicali fenilalchilamminici aventi le formule phenylamino and phenylalkylamine radicals having the formulas

Y Y Z Y Y Z

I I I I I I

-N-0-A; e -N-CH-0-A -N-0-A; and -N-CH-0-A

in cui Y e Z sono scelti fra H, un gruppo alchilicò avente da 1 a 8 atomi di carbonio, fenile o benzile, e A è scelto fra H, CH3, CI e Br a partire dai corrispondenti esteri 0 ammidi dell'acido acetoacetico se consistente dei radicali alcossilici aventi da 1 a 15 atomi di carbonio; wherein Y and Z are selected from H, an alkyl group having from 1 to 8 carbon, phenyl or benzyl atoms, and A is selected from H, CH3, Cl and Br starting from the corresponding esters or amides of acetoacetic acid if consisting of alkoxyl radicals having from 1 to 15 carbon atoms;

radicali alchilamminici aventi da 5 a 15 atomi di carbonio; radicali cicloalcossilici e radicali cicloalchilamminici aventi da 5 a 12 atomi di carbonio; alkylamine radicals having from 5 to 15 carbon atoms; cycloalkoxylic and cycloalkylamine radicals having from 5 to 12 carbon atoms;

fenossi e radicali fenilalcossilici aventi da 7 a 14 atomi di carbonio; phenoxy and phenylalkoxy radicals having from 7 to 14 carbon atoms;

fenilammino e radicai fenilalchilamminici aventi le formule phenylamino and phenylalkylamine radicals having the formulas

Y Y Z Y Y Z

I I I I I I

-N-0-A; e -N-CH-0-A -N-0-A; and -N-CH-0-A

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

661 498 661 498

4 4

in cui Y e Z sono scelti fra H, un gruppo alchilico avente da 1 a circa 8 atomi di carbonio, fenile o benzile, e A è scelto fra H, CH3, CI e Br a partire dai corrispondenti esteri o ammidi dell'acido acetoacetico a 15 atomi di carbonio, all'azione enzimatica fermentativa di un microorganismo che elabora L-ß-idrossiacil CoA deidrogenasi [EC 1.1.1.35], e ricuperare i desideri derivati otticamente attivi dell'acido 3(R)-idrossibutirrico y-sostituiti dalla miscela della reazione di fermentazione. wherein Y and Z are selected from H, an alkyl group having from 1 to about 8 carbon, phenyl or benzyl atoms, and A is selected from H, CH3, Cl and Br starting from the corresponding esters or amides of acetoacetic acid to 15 carbon atoms, to the enzymatic fermentative action of a microorganism that processes L-ß-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35], and to recover the desired optically active derivatives of 3 (R) -hydroxybutyric acid y-replaced by mixture of the fermentation reaction.

È stato trovato che qualsiasi microorganismo che produce l'enzima desiderato è capace di catalizzare la riduzione stereo-specifica. Particolarmente adatti sono i microorganismi della classe Ascomycetes, gli ordini Endomycetales, Mucorales, Mo-niliales ed Eurotiales, ed il genere Saccharomyces. Particolarmente preferito è il Saccharomyces Cerevisiae. Any microorganism that produces the desired enzyme has been found to be capable of catalyzing stereo-specific reduction. Particularly suitable are the microorganisms of the Ascomycetes class, the orders Endomycetales, Mucorales, Mo-niliales and Eurotiales, and the genus Saccharomyces. Particularly preferred is the Saccharomyces Cerevisiae.

Per preparare gli esteri otticamente attivi dell'acido 3(R)-idrossibutirrico y-sostituito contenenti da 1 a 4 atomi di carbonio, è necessario impiegare la L-ß-idrossiacil CoA deidrogenasi [EC 1.1.1.35] in forma purificata, come quella ricavata dal cuore di maiale, in quanto i microorganismi intatti possiedono delle ossido-riduttasi interferenti che determinano delle configurazione opposte. Pertanto, la riduzione microbica ad esempio degli esteri a 1-4 atomi di carbonio dell'acido 4-cloro-aceto-acetico produce dei 4-cloro-3-idrossibutirrati di purezza ottica insoddisfacente. To prepare the optically active esters of the 3 (R) -hydroxybutyric acid y-substituted containing from 1 to 4 carbon atoms, it is necessary to use L-ß-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] in purified form, such as that obtained from the pig heart, as the intact microorganisms have interfering oxide-reductases which determine opposite configurations. Therefore, the microbial reduction, for example of the 1-4 carbon atoms esters of 4-chloro-aceto-acetic acid produces 4-chloro-3-hydroxybutyrates of unsatisfactory optical purity.

Pertanto, la presente invenzione fornisce anche un procedimento per preparare derivati otticamente attivi dell'acido 3(R)-idrossibutirrico y-sostituito aventi la formula e la configurazione 3(R) Therefore, the present invention also provides a process for preparing optically active derivatives of the 3 (R) -hydroxybutyric acid y-substituted having the formula and configuration 3 (R)

in cui X è Cl, Br, I oppure OH, ed R è un radicale alcossilico avente da 1 a 4 atomi di carbonio, che comprende sottoporre composti aventi la formula wherein X is Cl, Br, I or OH, and R is an alkoxyl radical having from 1 to 4 carbon atoms, which comprises subjecting compounds having the formula

O O O O

Il II The II

XCH2-C-CH2C-R XCH2-C-CH2C-R

in cui X ed R hanno il significato precedentemente menzionato all'azione enzimatica di L-ß-idrossiacil CoA deidrogenasi [EC 1.1.1.35] in forma purificata, e ricuperare i derivati desiderati otticamente attivi dell'acido 3(R)-idrossibutirrico y-sostituito dalla miscela della reazione enzimatica. wherein X and R have the meaning previously mentioned to the enzymatic action of L-ß-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] in purified form, and recover the desired optically active derivatives of 3 (R) -hydroxybutyric acid y- replaced by the mixture of the enzymatic reaction.

La presente invenzione fornisce pertanto composti aventi la formula e la configurazione 3(R) The present invention therefore provides compounds having the formula and configuration 3 (R)

in cui in which

X è scelto fra Cl, Br, I e OH e X is chosen from Cl, Br, I and OH e

R è un radicale avente configurazione a catena lineare, ramificata o ciclica, scelto nella classe consistente dei radicali alcossilici aventi da 1 a 15 atomi di carbonio; R is a radical having a linear, branched or cyclic chain configuration, selected from the class consisting of alkoxyl radicals having from 1 to 15 carbon atoms;

radicali alchilamminici aventi da 5 a 15 atomi di carbonio; radicali cicloalcossilici e radicali cicloalchilamminici aventi da 5 a 12 atomi di carbonio; alkylamine radicals having from 5 to 15 carbon atoms; cycloalkoxylic and cycloalkylamine radicals having from 5 to 12 carbon atoms;

fenossi e radicali fenilalcossilici aventi da 7 a 14 atomi di carbo nio; phenoxy and phenylalkoxy radicals having from 7 to 14 carbon atoms;

fenilammino e radicali fenilalchilamminici aventi le formule Y Y Z phenylamino and phenylalkylamine radicals having the formulas Y Y Z

I I I I I I

-N-0-A; e -N-CH-0-A -N-0-A; and -N-CH-0-A

in cui Y e Z sono scelti fra H, un gruppo alchilico avente da 1 ; 8 atomi di carbonio, fenile o benzile e A è scelto fra H, CH3, CI e Br. wherein Y and Z are selected from H, an alkyl group having 1; 8 carbon, phenyl or benzyl atoms and A is selected from H, CH3, CI and Br.

I derivati otticamente attivi dell'acido L-ß-idrossibutirrico y-sostituito possono venir quindi fatti reagire con trimetilammi na per fornire il corrispondente derivato dell'acido y-trimetil-ammonio-L-ß-idrossiobutirrico, che può venir facilmente convertito in L-carnitina per trattamento con soluzioni acquose di acidi. Viene di seguito indicato uno schema degli stadi di reazione di questo procedimento. The optically active derivatives of the y-substituted L-ß-hydroxybutyric acid can then be reacted with trimethylamine na to provide the corresponding derivative of the y-trimethyl-ammonium-L-ß-hydroxybutyric acid, which can be easily converted into L -carnitine for treatment with aqueous solutions of acids. A diagram of the reaction stages of this process is indicated below.

i i Micro_ x0HVi i i Micro_ x0HVi

XSss^Ss,»^^v R organismo ^ XSss ^ Ss, »^^ v R organism ^

o L-ß-idrossiacil or L-ß-hydroxyacyl

T r . II T r. II

A CoA deidrogenasi A CoA dehydrogenase

L-carnitina L-carnitine

È stato trovato che la precedente reazione I—»II avviene più facilmente se X = CI. Tuttavia, poiché la successiva reazione libili decorre con rese migliori quando X = iodio o bromo, risulta preferito preparare dapprima il cloro-derivato e quindi convertirlo nel corrispondente iodio- o bromo-derivato. It has been found that the previous reaction I - II occurs more easily if X = CI. However, since the subsequent libile reaction runs with better yields when X = iodine or bromine, it is preferred to first prepare the chlorine derivative and then convert it to the corresponding iodine or bromine derivative.

La presente invenzione si riferisce inoltre ad un procedimento migliorato che comprende dapprima convertire un estere del l'acido 4-cloro-3(R)-idrossibutirrico nei corrispondenti 4-iodio-o 4-bromo-3(R)-idrossibutirrati. Per semplicità, si farà riferimento nel seguito allo iodio-derivato. La iodio-idrina (V) reagisce facilmente con trimetilammina a temperatura ambiente fornendo il composto VI che viene facilmente convertito in L-carnitina secondo il seguente schema di reazione: The present invention further relates to an improved process which first comprises converting an ester of 4-chloro-3 (R) -hydroxybutyric acid to the corresponding 4-iodine-or 4-bromo-3 (R) -hydroxybutyrates. For simplicity, reference will be made below to iodine-derivative. Iodine-hydrine (V) easily reacts with trimethylamine at room temperature to provide compound VI which is easily converted into L-carnitine according to the following reaction scheme:

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

5 5

661 498 661 498

HO, H O HO, H O

OnAA« ONAA "

ri re

R=H o estere R = H or ester

HO J 0 I J 0

■V OCX ■ V OCX

M M

MeOH MeOH

CH, CH,

i3 i3

N-CH- N-CH-

I 3 I 3

CH, CH,

Dowex-1 Dowex-1

resina forma OH OH shape resin

CH CH

CH- OH H n CH- OH H n

■KXÀ ■ KXA

3_l 3_l

I CH I CH

OR OR

L-carnitina L-carnitine

VI YOU

Al procedimento esemplificato nel precedente schema si possono apportare diverse varianti. Indipendentemente da quale forma si renda disponibile, l'estere viene fatto reagire con ioduro sodico in un opportuno solvente, quale ad esempio 2-butanone, acetone, butanolo, ecc. La reazione principale che è desiderata a questo punto nella reazione con ioduro sodico è una reazione di spostamento che conduce alla iodoidrina V senza perturbare il centro chirale sull'adiacente atomo di carbonio. Per questa reazione è richiesta una quantità di sodio ioduro almeno sufficiente a spostare tutto il cloruro dal composto II. In generale si utilizzerà un eccesso di ioduro sodico. Various variations can be made to the procedure exemplified in the previous scheme. Regardless of which form becomes available, the ester is made to react with sodium iodide in a suitable solvent, such as for example 2-butanone, acetone, butanol, etc. The main reaction that is desired at this point in the reaction with sodium iodide is a displacement reaction that leads to iodohydrin V without disturbing the chiral center on the adjacent carbon atom. For this reaction, an amount of sodium iodide at least sufficient to move all the chloride from compound II is required. In general, an excess of sodium iodide will be used.

La reazione del composto V con trimetilammina può venire effettuata a blande temperature (ad esempio 25°C) (si veda S. G. Boots e M.R. Boots, J. Pharm. Sci., 64, 1262, 1975), in una molteplicità di soventi quali ad esempio metanolo o etanolo contenente un eccesso di trimetilammina. È interessante notare che in funzione del solvente alcoolico impiegato, si verifica una transesterificazione. Per esempio, quando si usa metanolo come solvente, si ottiene L-carnitina metil estere. Questa reazione di scambio è vantaggiosa in quanto è noto che la L-carnitina metil estere può venir trasformata direttamente in L-carnitina base libera mediante passaggio attraverso una colonna scambiatrice di ioni (OH-) si veda E. Strack e J. Lorenz, J. Physiol. Chem. (1966) 344, 276. The reaction of compound V with trimethylamine can be carried out at mild temperatures (for example 25 ° C) (see SG Boots and MR Boots, J. Pharm. Sci., 64, 1262, 1975), in a multiplicity of often such as for example methanol or ethanol containing an excess of trimethylamine. It is interesting to note that depending on the alcoholic solvent used, a transesterification occurs. For example, when using methanol as a solvent, L-carnitine methyl ester is obtained. This exchange reaction is advantageous in that it is known that L-carnitine methyl ester can be transformed directly into L-carnitine free base by passing through an ion exchange column (OH-) see E. Strack and J. Lorenz, J Physiol. Chem. (1966) 344, 276.

Si può rilevare dalla descrizione dei precedenti procedimenti che si possono ottenere molti nuovi intermedi otticamente attivi estremamente utili. Particolarmente utili sono gli esteri alchilici dell'acido 4-iodio-3(R)-idrossibutirrico in cui i gruppi alchilici hanno da 6 a 10 atomi di carbonio. L'estere ottilico è particolarmente preferito. It can be seen from the description of the previous methods that many new highly useful optically active intermediates can be obtained. Particularly useful are the alkyl esters of 4-iodine-3 (R) -hydroxybutyric acid wherein the alkyl groups have from 6 to 10 carbon atoms. The octyl ester is particularly preferred.

I microorganismi che possiedono la desiderata attività di ossido-riduzione sono ben noti nella tecnica microbiologica e uno qualsiasi di tali microorganismi può venir impiegato nel procedimento della presente invenzione (si veda K. Kieslich, «Microbial Transformations of Non-Steroid Cyclic Compounds» [Georg Thieme Publishers, Stuttgart, (1976)] ognuno dei generi di microorganismi specificatamente qui descritti essendo particolarmente utilizzabile. Si è trovato che microorganismi poco costosi e facilmente reperibili del genere Saccharomyces, ad esempio il lievito di birra, il lievito di pane e il lievito di vino (Saccharomyces vini) producono la L-ß-idrossiacil CoA Microorganisms possessing the desired oxide-reduction activity are well known in the microbiological technique and any of these microorganisms can be used in the process of the present invention (see K. Kieslich, «Microbial Transformations of Non-Steroid Cyclic Compounds» [Georg Thieme Publishers, Stuttgart, (1976)] each of the kinds of microorganisms specifically described here being particularly usable. It has been found that inexpensive and easily available microorganisms of the genus Saccharomyces, for example beer yeast, bread yeast and wine (Saccharomyces wines) produce the L-ß-hydroxyacil CoA

deidrogenasi [EC 1.1.1.35] e sono particolarmente vantaggiosi nell'effettuare il procedimento secondo l'invenzione. L'enzima 30 è stato descritto da S. J. Wakil ed E. M. Barnes Jr. in Compre-hensive Biochemistry Vo. 185 (1971), 57-104. dehydrogenase [EC 1.1.1.35] and are particularly advantageous in carrying out the process according to the invention. The enzyme 30 has been described by S. J. Wakil and E. M. Barnes Jr. in Compre-hensive Biochemistry Vo. 185 (1971), 57-104.

Il substrato costituito dal derivato dell'acido aceto-acetico 4-sostituito può venir incorporato in un mezzo nutritivo di composizione standard nel quale tali organismi vengono coltivati, e si possono impiegare le usuali condizioni di fermentazione onde effettuare la trasformazione riduttiva. Alternativamente, il principio attivo può venir rimosso dal mezzo di cultura del microorganismo, ad esempio mediante lisi delle cellule per liberare gli enzimi, o mediante sospensione delle cellule in riposo in un sistema acquoso fresco. Mediante ognuna di queste tecniche la funzione ß-chetonica verrà selettivamente ridotta, fintanto che l'enzima attivo elaborato dai microorganismi sarà presente nel mezzo. Naturalmente, le condizioni di temperatura, tempo e pressione alle quali si effettua il contatto del derivato dell'acido acetoacetico 4-sostituito con l'enzima riducente sono interdipendenti, come risulterà evidente a qualsiasi esperto di queste tecniche. Per esempio, con un blando riscaldamento ed a pressione atmosferica il tempo richiesto per effettuare la conversione riducente sarà inferiore di quanto lo sarebbe se le reazione 50 progredisse a temperatura ambiente a parità delle altre condizioni. Naturalmente, nè la temperatura nè la pressione nè il tempo devono essere così elevati da dar luogo alla degradazione del substrato. Quando si impiega una cultura di açcrescimento per gli organismi, le condizioni del procedimento dovrebbero 55 essere sufficientemente blande da non provocare la morte degli organismi prima che questi abbiano elaborato una quantità sufficiente di enzima riduttasi per consentire alla reazione di pro-eedere. Generalmente, a pressione atmosferica la temperatura può variare da 10°C a 35°C ed il tempo da 12 ore a 10 giorni. The substrate consisting of the derivative of 4-substituted aceto-acetic acid can be incorporated in a nutrient medium of standard composition in which these organisms are grown, and the usual fermentation conditions can be used to effect the reductive transformation. Alternatively, the active ingredient can be removed from the culture medium of the microorganism, for example by lysis of the cells to release the enzymes, or by suspension of the cells at rest in a fresh aqueous system. By each of these techniques the ß-ketonic function will be selectively reduced, as long as the active enzyme processed by the microorganisms is present in the medium. Of course, the conditions of temperature, time and pressure at which contact of the derivative of 4-substituted acetoacetic acid with the reducing enzyme is made are interdependent, as will be evident to any expert of these techniques. For example, with a mild heating and at atmospheric pressure the time required to carry out the reducing conversion will be less than it would be if the reaction 50 progressed to room temperature under the same conditions. Of course, neither the temperature nor the pressure nor the time must be so high as to give rise to the degradation of the substrate. When using a growth culture for organisms, the conditions of the process should be mild enough not to cause the organisms to die before they have processed a sufficient amount of the enzyme reductase to allow the reaction to proceed. Generally, at atmospheric pressure the temperature can vary from 10 ° C to 35 ° C and the time from 12 hours to 10 days.

60 60

Negli esempi non limitativi che seguono, i substrati costituiti dai derivati dell'acido y-alogeno acetoacetico da sottoporre alla riduzione microbiologica vennero preparati dal dichetene secondo il metodo generale di C.D. Hurd e H. L. Abernethy (J. Am. ss Chem. Soc., 62, 1147, 1940) per i derivati dell'acido y-cloro-acetoacetico e di F. Chick, N. T. M. Wilsmore [J. Chem. Soc., 1978 (1910)] per i derivati dell'acido y-bromo-acetoacetico mediante la seguente sequenza dì reazioni: In the following non-limiting examples, the substrates consisting of the derivatives of the acetoacetic y-halogen acid to be subjected to the microbiological reduction were prepared from dichetene according to the general method of C.D. Hurd and H. L. Abernethy (J. Am. Ss Chem. Soc., 62, 1147, 1940) for the derivatives of y-chloroacetoacetic acid and F. Chick, N. T. M. Wilsmore [J. Chem. Soc., 1978 (1910)] for derivatives of y-bromo-acetoacetic acid by the following sequence of reactions:

661 498 661 498

6 6

h2c=c-çh2 h2c = c-CH2

Grammi xchgc-chgcx oppure xchgcchgcor Grams xchgc-chgcx or xchgcchgcor

0-c=0 0-c = 0

dichetene RNH declare it RNH

I THE

^ Y ^ Y

O 0 „ " OR 0 ""

S iï Yay

xchgcchgc-nr in cui X = Cl o Br xchgcchgc-nr where X = Cl or Br

Y = H o alchile Y = H or alkyl

R = come precedentemente definito. R = as previously defined.

Alternativamente, se desiderato, i derivati dell'acido y-alogeno acetoacetico possono venir preparati dagli esteri dell'acido y-alogeno-acetico mediante una tradizionale reazione di Grignard. Per esempio, l'estere ottilico dell'acido y-cloro-acetoacetico venne facilmente preparato sottoponendo a riflusso l'estere ottilico dell'acido y-cloro-acetico con due equivalenti di magnesio in etere per 48 ore. Dopo allontanamento del solvente l'estere ottilico dell'acido acetoacetico venne ricuperato con una resa di circa il 70%. Alternatively, if desired, the derivatives of the y-halogen-acetoacetic acid can be prepared from the esters of the y-halogen-acetic acid by means of a traditional Grignard reaction. For example, the octyl ester of y-chloroacetoacetic acid was readily prepared by refluxing the octyl ester of y-chloroacetic acid with two magnesium equivalents in ether for 48 hours. After removing the solvent, the octyl ester of the acetoacetic acid was recovered with a yield of about 70%.

I derivati dell'acido y-idrossi-acetoacetico vennero preparati dai loro corrispondenti derivati dell'acido y-bromo acetoacetico mediante agitazione in una soluzione diossano-acqua (1:1) contenente CaCC>3 a 25°C per 12 ore. The y-hydroxy-acetoacetic acid derivatives were prepared from their corresponding y-bromo acetoacetic acid derivatives by stirring in a dioxane-water (1: 1) solution containing CaCC> 3 at 25 ° C for 12 hours.

La struttura di ciascuno dei prodotti preparati in accordo agli esempi che seguono venne identificata mediante risonanza magnetico-nucleare (NMR), spettri infrarossi, e dalle mobilità alla cromatografia su strato sottile. The structure of each of the products prepared according to the following examples was identified by magnetic-nuclear resonance (NMR), infrared spectra, and from the mobilities to thin layer chromatography.

La purezza ottica e la configurazione assoluta dei prodotti vennero stabilite dalla loro conversione in L-carnitina e per conversione dei loro esteri che sono facilmente analizzati mediante spettrometria NMR, e dalla rotazione ottica. The optical purity and the absolute configuration of the products were established by their conversion into L-carnitine and by conversion of their esters which are easily analyzed by NMR spectrometry, and by optical rotation.

Esempio 1 (Lieviti) Example 1 (Yeasts)

L'etere ottilico dell'acido ( + )4-cloro-3(R)-idrossibutirrico venne preparato come segue: The octyl ether of (+) 4-chloro-3 (R) -hydroxybutyric acid was prepared as follows:

OH H OH H

OCgHi? OCgHi?

30 30

45 45

0CePn 0CePn

50 50

A. Fermentazione. Il prodotto di accrescimento superficiale di una coltura in agar a becco di clarino di una settimana di Candida keyfr. NRRL Y-329, accresciuta su agar avente la seguente composizione: A. Fermentation. The product of surface growth of a one-week clarin-beaked agar culture of Candida keyfr. NRRL Y-329, grown on agar having the following composition:

Grammi Grams

Agar 20 Agar 20

Glucosio 10 Glucose 10

Estratto di lievito 2,5 Yeast extract 2,5

K2HPO4 1 K2HPO4 1

Acqua distillata, q.b. a 1 litro (sterilizzata per 15 min a 20 p.s.i., 1,4 kg/cm2) Distilled water, to taste at 1 liter (sterilized for 15 min at 20 p.s.i., 1.4 kg / cm2)

venne sospesa in 5 mi di una soluzione fisiologica allo 0,85%. Delle porzioni da 1 mi di questa sospensione vennero usate per inoculare una beuta da 250 mi (stadio F-l) contenente 50 mi del seguente mezzo (mezzo di Vogel): in 5 ml of a physiological solution at 0.85% was suspended. 1 ml portions of this suspension were used to inoculate a 250 ml Erlenmeyer flask (stage F-1) containing 50 ml of the following medium (Vogel medium):

Estratto di lievito Yeast extract

5 5

Caseina commerciale idrolizzata in am Commercial casein hydrolyzed in am

biente acido (Casamino acids) acid biente (Casamino acids)

5 5

Destrosio Dextrose

40 40

Citrato trisodico 5V2 H2O Trisodium citrate 5V2 H2O

3 3

KH2PO4 KH2PO4

5 5

NH4NO3 NH4NO3

2 2

CaCl2 • 2H20 CaCl2 • 2H20

0,1 0.1

MgS04 • 7H20 MgS04 • 7H20

0,2 0.2

Soluzione di elementi in tracce Solution of trace elements

0,1 mi 0.1 ml

Acqua distillata, q.b. a 1 litro Distilled water, to taste to 1 liter

pH 5,6 (sterilizzata per 15 min a 30 p.s.i. pH 5.6 (sterilized for 15 min at 30 p.s.i.

,2,1 kg/cm2) , 2.1 kg / cm2)

Soluzione di elementi in tracce Solution of trace elements

. Gr/100 n . Gr / 100 n

Acido citrico IH2O Citric acid IH2O

5 5

ZnS04 - 7H20 ZnS04 - 7H20

7 7

Fe(NH4)2(S04)2 -6H20 Fe (NH4) 2 (S04) 2 -6H20

1 1

CuS04 • 5H20 CuS04 • 5H20

0,25 0.25

MnS04 • 1H20 MnS04 • 1H20

0,05 0.05

H3BO3 H3BO3

0,05 0.05

NaH2Mo04 • 2H20 NaH2Mo04 • 2H20

0,05 0.05

La beuta venne incubata a 25°C su uno scuotitore rotante (250 cicli/minuto; 5 cm di raggio) per 24 ore, dopodiché si effettuò il trasferimento del 10% in volume in un'altra beuta da 250 mi (stadio F-2) contenente 50 mi di mezzo di Vogel. Dopo 24 ore di incubazione su uno scuotitore rotante, si aggiunsero 150 mg di estere ottilico dell'acido y-cloro acetoacetico in 0,1 mi di Tween 80 al 10%. The flask was incubated at 25 ° C on a rotating shaker (250 cycles / minute; 5 cm radius) for 24 hours, after which 10% by volume was transferred to another 250 ml flask (stage F-2 ) containing 50 ml of Vogel medium. After 24 hours of incubation on a rotating shaker, 150 mg of octyl ester of y-chlorine acetoacetic acid were added in 0.1 ml of 10% Tween 80.

La beuta dello stadio F-2 venne quindi incubata per altre 24 ore alle condizioni impiegate nell'incubazione delle beute dello stadio F-l. The flask of stage F-2 was then incubated for another 24 hours under the conditions used in the incubation of the flasks of stage F-1.

B. Isolamento. 24 ore dopo l'aggiunta dell'estere ottilico dell'acido y-cloro acetoacetico, le cellule vennero allontanate per centrifugazione. Il supernatante venne estratto a esaurimento con 50 mi di etil acetato per 3 volte. La fase comprendente l'etil acetato venne essiccata su Na2SC>4 ed evaporata fornendo un residuo oleoso (186 mg). Il residuo venne disciolto in 0,5 mi della fase mobile ed aggiunto ad una colonna (1 x 25 cm) di gel di silice (MN-Kieselgel 60). La colonna venne eluita con Skelly B: acetato di etile (8:1) e vennero raccolte frazioni da 14 mi. Le frazioni 6 e 7 contenenti il prodotto desiderato vennero riunite e concentrate a secchezza, fornendo 120 mg di residuo cristallino. La ricristallizzazione da acetato di etile-esano fornì 107 mg di estere ottilico dell'acido 4-cloro-3(R)-idrossibutirrico, [a]23 +13,3° (c, 4,45) (CHC13); pmr (ÔCDCI3) 0,88 [3H, tr. di-stortional, CH3-(CH2)„-]; 1,28 [10H, s, -(CH2)5-]; 1,65 (2H, m, -CH2-CH2-CH2O-C-); 2,62 (2H,d, J = 6 Hz, -CH-ÇH2-COOR); B. Isolation. 24 hours after the addition of the octyl ester of y-chetoacetoacetic acid, the cells were removed by centrifugation. The supernatant was extracted to exhaustion with 50 ml of ethyl acetate 3 times. The phase comprising ethyl acetate was dried over Na2SC> 4 and evaporated to provide an oily residue (186 mg). The residue was dissolved in 0.5 ml of the mobile phase and added to a column (1 x 25 cm) of silica gel (MN-Kieselgel 60). The column was eluted with Skelly B: ethyl acetate (8: 1) and fractions of 14 ml were collected. Fractions 6 and 7 containing the desired product were combined and concentrated to dryness, providing 120 mg of crystalline residue. Recrystallization from ethyl hexane acetate provided 107 mg of 4-chloro-3 (R) -hydroxybutyric acid octyl ester, [a] 23 + 13.3 ° (c, 4.45) (CHC13); pmr (ÔCDCI3) 0.88 [3H, tr. di-stortional, CH3- (CH2) „-]; 1.28 [10H, s, - (CH2) 5-]; 1.65 (2H, m, -CH2-CH2-CH2O-C-); 2.62 (2H, d, J = 6 Hz, -CH-ÇH2-COOR);

II I II I

O OH OR OH

3,22 (IH, br., -OH); 3,60 (2H, d, J = 6 Hz, C1CH2-CH-R; 3.22 (1H, br., -OH); 3.60 (2H, d, J = 6 Hz, C1CH2-CH-R;

4,20 (3H, -CH2-CH-CH2 e -C-0-CH2CH2). 4.20 (3H, -CH2-CH-CH2 and -C-0-CH2CH2).

OH OH

OH OH

O OR

All'analisi calcolato per C12H23O3CI: C, 57,47; H, 9,25. At the analysis calculated for C12H23O3CI: C, 57.47; H, 9.25.

Trovato: C, 57,52; H, 9,07 [TLC Rr = 0,5, piastre di gel di silice Brinkmann, 0,25 cm EM; Skelly B: acetato di etile (5:1)]. Found: C, 57.52; H, 9.07 [TLC Rr = 0.5, Brinkmann silica gel plates, 0.25 cm EM; Skelly B: ethyl acetate (5: 1)].

Esempio 2 Example 2

Cellule in riposo. Cento grammi di lievito di pane fresco del commercio Saccharomyces cerevisiae (Stella Rossa, Red Star) vennero sospesi in 250 mi di acqua di rubinetto ai quali si ag Resting cells. One hundred grams of fresh bread yeast from the Saccharomyces cerevisiae trade (Red Star, Red Star) were suspended in 250 ml of tap water to which agitation

7 7

661 498 661 498

giunsero 10 gr di saccarosio e 3,6 gr di estere ottilico dell'acido y-cloro acetoacetico. Dopo che il contenuto fu incubato a 25°C su uno scuotitore rotante (250 cicli/minuto; 5 cm di raggio) per 24 ore, si aggiunsero altri 10 gr di saccarosio alla beuta e si lasciò che la reazione procedesse per altre 24 ore. Le cellule vennero quindi allontanate per filtrazione attraverso ad uno strato di celite. Le cellule vennero lavate con acqua e acetato di etile. Le fasi di lavaggio furono riunite con il filtrato ed estratte ad esaurimento con acetato di etile. Lo strato comprendente l'acetato di etile venne essiccato su MgS04 ed evaporato, fornendo un residuo oleoso, che venne sottoposto a cromatografia in una colonna di gel di silice, fornendo 2,52 gr di estere ottilico dell'acido 4-cloro-3(R)-idrossibutirrico, sotto forma di un solido bas-sofondente; [a]23 +13,2° (c, 4,0, CHCI3). 10 g of sucrose and 3.6 g of octyl ester of y-chlorine acetoacetic acid arrived. After the content was incubated at 25 ° C on a rotating shaker (250 cycles / minute; 5 cm radius) for 24 hours, another 10 g of sucrose was added to the flask and the reaction was left to proceed for another 24 hours. The cells were then removed by filtration through a celite layer. The cells were washed with water and ethyl acetate. The washing steps were combined with the filtrate and extracted to exhaustion with ethyl acetate. The layer comprising ethyl acetate was dried over MgSO 4 and evaporated, providing an oily residue, which was subjected to chromatography in a silica gel column, providing 2.52 g of 4-chloro-3 acid ocyl ester ( R) -hydroxybutyric acid, in the form of a bas-dissolving solid; [a] 23 + 13.2 ° (c, 4.0, CHCI3).

Esempio 3 Example 3

L'estere benzilico dell'acido (+)4-cloro-3(R)idrossibutirrico venne preparato come segue: The benzyl ester of (+) 4-chloro-3 (R) hydroxybutyric acid was prepared as follows:

OH OH

CI CI

OCH.0 OCH.0

A. Fermentazione. II prodotto di accrescimento superficiale di una coltura di agar a becco di clarino di una settimana di Gliocladium virens ATCC 13362, nutrita su agar della seguente composizione: A. Fermentation. The surface growth product of a one-week clarinet-beaked agar culture of Gliocladium virens ATCC 13362, fed on agar of the following composition:

Grammi Grams

Estratto di malto 20 Malt extract 20

Glucosio 20 Glucose 20

Peptone 1 Peptone 1

Agar 20 Agar 20

Acqua distillata, q.b. a 1 litro Distilled water, to taste to 1 liter

(sterilizzata per 15 min a 20 p.s.i.; 1,4 kg/cm2) (sterilized for 15 min at 20 p.s.i .; 1.4 kg / cm2)

venne sospesa in 5 mi di una soluzione fisiologica allo 0,85%. Delle porzioni da 1 mi di questa sospensione vennero usate per inoculare una beuta da 250 mi (Stadio F-l) contenente 50 mi del seguente mezzo (mezzo al destrosio - semi di soia): in 5 ml of a physiological solution at 0.85% was suspended. Portions of 1 ml of this suspension were used to inoculate a 250 ml Erlenmeyer flask (Stage F-1) containing 50 ml of the following medium (dextrose medium - soybeans):

Grammi Grams

Substrato di semi di soia 5 Soybean substrate 5

Destrosio 20 Dextrose 20

NaCl 5 NaCl 5

kh2hpô4 5 kh2hpô4 5

Lievito 5 Yeast 5

Acqua 1 lt pH regolato a 7,0 Water 1 lt pH adjusted to 7.0

Autoclave a 15 p.s.i., 1,05 kg/cm2, per 15 minuti). Autoclave at 15 p.s.i., 1.05 kg / cm2, for 15 minutes).

La beuta venne incubata a 25° C su uno scuotitore rotante (250 cicli/minuto; 5 cm di raggio) per 24 ore, dopodiché si effettuò un trasferimento del 10% in volume in un'altra beuta da 250 mi (Stadio F-2) contenente 50 mi di mezzo al destrosio - semi di soia. Dopo 24 ore di incubazione sullo scuotitore rotante, si aggiunsero 150 mg di estere benzilico dell'acido y-cloro acetoacetico in 0,1 mi di Tween 80 al 10%. La beuta dello stadio F-2 venne quindi incubata per altre 24 ore alle condizioni impiegate per l'incubazione delle beute dello stadio F-l. The flask was incubated at 25 ° C on a rotating shaker (250 cycles / minute; 5 cm radius) for 24 hours, after which a transfer of 10% by volume was carried out in another 250 ml flask (Stage F-2 ) containing 50 ml of dextrose medium - soybeans. After 24 hours of incubation on the rotary shaker, 150 mg of benzyl ester of y-chlorine acetoacetic acid were added in 0.1 ml of 10% Tween 80. The flask of stage F-2 was then incubated for another 24 hours under the conditions used for the incubation of the flasks of stage F-1.

B. Isolamento. Ventiquattro ore dopo l'aggiunta dell'estere benzilico dell'acido y-cloro acetoacetico, i miceli furono allontanati per filtrazione. Il filtrato venne estratto a fondo con 50 mi di acetato di etile per tre volte. Lo strato comprendente l'acetato di etile venne essiccato su MgS04 e concentrato sotto vuoto, fornendo un residuo di 160 mg. Il residuo venne sottoposto a cromatografia in una colonna (1 x 25 cm) di gel di silice (MN-Kieselgel 60). La colonna venne eluita con Skelly B e acetato di etile (10:1) e forono raccolte delle frazioni da 12 mi. B. Isolation. Twenty-four hours after the addition of the benzyl ester of the acetoacetic y-chlorine acid, the mycelia were removed by filtration. The filtrate was extracted thoroughly with 50 ml of ethyl acetate three times. The layer comprising ethyl acetate was dried over MgSO 4 and concentrated in vacuo, providing a residue of 160 mg. The residue was subjected to chromatography in a column (1 x 25 cm) of silica gel (MN-Kieselgel 60). The column was eluted with Skelly B and ethyl acetate (10: 1) and collected fractions of 12 ml.

Le frazioni 11-16 contenenti il prodotto desiderato furono riunite e concentrate a secchezza, fornendo 115 mg di estere benzilico dell'acido 4-cloro-3(R)-idrossibutirrico, [a]23 +8,7° (c, 5,26; CHC13(; pmr (5 CDCI3) 2,65 (2H, d, J = 6 Hz, -CH-CH2COOR); 3,20 (IH, br, -OH); 3,54 (2H, d, J = 6 Hz, The fractions 11-16 containing the desired product were combined and concentrated to dryness, providing 115 mg of benzyl ester of 4-chloro-3 (R) -hydroxybutyric acid, [a] 23 + 8.7 ° (c, 5, 26; CHC13 (; pmr (5 CDCI3) 2.65 (2H, d, J = 6 Hz, -CH-CH2COOR); 3.20 (IH, br, -OH); 3.54 (2H, d, J = 6 Hz,

I THE

OH OH

CI-CH2CH); 4,20 (IH, m, -CH2-CH-CH2-); 5,12 (2H, s, CI-CH2CH); 4.20 (1H, m, -CH2-CH-CH2-); 5.12 (2H, s,

I I I I

OH OH OH OH

-C-O-CH2-C6H5); 7,31 (5H, s, cinque protoni aromatici). -C-O-CH2-C6H5); 7.31 (5H, s, five aromatic protons).

II II

0 0

All'analisi calcolato per C11H13O3CI: C, 57,77; H, 5,73. At the analysis calculated for C11H13O3CI: C, 57.77; H, 5.73.

Trovato: C, 57,64; H, 5,67. [TLC piastre di gel di silice EM Brinkmann, 0,25 cm, Rf = 0,43, Skelly B - acetato di etile (5:1)]. Found: C, 57.64; H, 5.67. [TLC EM Brinkmann silica gel plates, 0.25 cm, Rf = 0.43, Skelly B - ethyl acetate (5: 1)].

Esempi 4-23 Examples 4-23

La procedura dell'esempio 1 venne ripetuta con ciascuno degli organismi elencati nella tabella 1, tranne che l'estere ottilico dell'acido 4-cloro-acetoacetico venne aggiunto ad una concentrazione di 1 mg/ml. Si ottenne la conversione nel prodotto desiderato, l'estere ottilico dell'acido ( + )4-cIoro-3(R)-idrossi-butirrico. le procedure di questi esempi furono ripetute aggiungendo in continuo l'estere ai lieviti. Il rapporto ponderale estere/lievito era di circa 1:1,5. Si ottennero eccellenti conversioni nel prodotto desiderato. The procedure of Example 1 was repeated with each of the organisms listed in Table 1, except that the octyl ester of 4-chloroacetoacetic acid was added at a concentration of 1 mg / ml. The conversion to the desired product was obtained, the octyl ester of (+) 4-choro-3 (R) -hydroxy-butyric acid. the procedures of these examples were repeated by continuously adding the ester to the yeasts. The ester / yeast weight ratio was about 1: 1.5. Excellent conversions were obtained in the desired product.

Esempi 24-48 Examples 24-48

La procedura dell'esempio 3 venne ripetuta con ciascuno degli organismi elencati nella tabella 2, tranne che si impiegò l'estere ottilico dell'acido y-cloro-acetoacetico (1 mg/ml). Si ottenne la trasformazione nel composto desiderato, l'estere ottilico dell'acido ( + )4-cIoro-3(R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 3 was repeated with each of the organisms listed in Table 2, except that the y-chloroacetoacetic acid octyl ester (1 mg / ml) was used. The transformation into the desired compound was obtained, the octyl ester of (+) 4-chloro-3 (R) -hydroxybutyric acid.

Esempi 49-68 Examples 49-68

La procedura dell'esempio 1 venne ripetuta con ciascuno degli organismi elencati nella tabella 1, tranne che si impiegò quale substrato l'estere benzilico dell'acido y-cloro-acetoacetico (1 mg/ml). Si ottenne la conversione nel prodotto desiderato, l'estere benzilico dell'acido ( + )4-cloro-3(R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 1 was repeated with each of the organisms listed in Table 1, except that the benzyl ester of y-chloroacetoacetic acid (1 mg / ml) was used as the substrate. The conversion to the desired product was obtained, the benzyl ester of (+) 4-chloro-3 (R) -hydroxybutyric acid.

Esempi 69-93 Examples 69-93

La procedura dell'esempio 3 venne ripetuta con ciascuno degli organismi elencati nella tabella 2, usando quale substrato l'estere benzilico dell'acido y-cloro acetoacetico (1 mg/ml). Si ottenne la trasformazione nel composto desiderato, l'estere benzilico dell'acido ( + )4-cloro-3(R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 3 was repeated with each of the organisms listed in Table 2, using as the substrate the benzyl ester of the y-chlorine acetoacetic acid (1 mg / ml). The transformation into the desired compound was obtained, the benzyl ester of (+) 4-chloro-3 (R) -hydroxybutyric acid.

Esempio 94 Example 94

L'anidride dell'acido ( + )4-cloro-3(R)-idrossibutirrico venne preparata in accordo alla procedura dell'esempio 2, tranne che si impiegò la 4-cloro-acetoacetanilide ad una concentrazione di The (+) 4-chloro-3 (R) -hydroxybutyric acid anhydride was prepared according to the procedure of Example 2, except that 4-chloro-acetoacetanilide was used at a concentration of

1 mg/ml. 1 mg / ml.

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

661 498 661 498

8 8

ci^AAs, —>■ "30^ ci ^ AAs, -> ■ "30 ^

La 4-cloro-acetoacetanilide venne usata quale substrato per la conversione nel prodotto desiderato otticamente attivo, punto di fusione 110-111°C; [a]23 +17,5° (c, 3,0, CHC13); pmr O 4-chloroacetoacetanilide was used as a substrate for conversion to the desired optically active product, melting point 110-111 ° C; [a] 23 + 17.5 ° (c, 3.0, CHC13); pmr O

II II

(5 CD3CCD3) 2,67 (2H, d, J = 6 Hz, -HOHCH2-CONHR), 3,66 (2H, d, J = 6 Hz, ClCH2CHOH-R), 4,43 (IH, m, -CH2--CHOH-CH2-), 7,03-7,44 (3H, m, protoni aromatici, meta e para), 7,69 (2H, d, J = 6 Hz, protoni aromatici, orto), 9,24 (IH, br, -C-N-0). (5 CD3CCD3) 2.67 (2H, d, J = 6 Hz, -HOHCH2-CONHR), 3.66 (2H, d, J = 6 Hz, ClCH2CHOH-R), 4.43 (IH, m, - CH2 - CHOH-CH2-), 7.03-7.44 (3H, m, aromatic protons, meta and para), 7.69 (2H, d, J = 6 Hz, aromatic protons, garden), 9, 24 (IH, br, -CN-0).

Il The

O OR

All'analisi calcolalo per: CioHi2N02C1: C, 56,21; H, 5,66. On analysis, calculate it for: CioHi2N02C1: C, 56.21; H, 5.66.

Trovato: C, 56,17; H, 5,47. Found: C, 56.17; H, 5.47.

Esempi 95-114 Examples 95-114

La procedura dell'esempio 1 venne ripetuta con ciascuno degli organismi elencati nella tabella 1, tranne che la y-cloro-acetoacetanilide venne aggiunta ad una concentrazione di 1 mg/ml. In tutti i casi si ottenne la conversione nel prodotto desiderato, l'anidride dell'acido ( + )4-cloro-3(R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 1 was repeated with each of the organisms listed in Table 1, except that y-chloro-acetoacetanilide was added at a concentration of 1 mg / ml. In all cases the conversion to the desired product was obtained, the anhydride of (+) 4-chloro-3 (R) -hydroxybutyric acid.

Esempi 115-139 Examples 115-139

La procedura dell'esempio 3 venne ripetura con ciascuno degli organismi elencati nella tabella 2. La y-cloro-acetoacetanilide venne aggiunta ad una concentrazione di 1 mg/ml. In questi casi, si realizzò la conversione nella desiderata anilide dell'acido ( + )4-cloro-3(R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 3 was repeated with each of the organisms listed in Table 2. The y-chloro-acetoacetanilide was added at a concentration of 1 mg / ml. In these cases, conversion to the desired anilide of (+) 4-chloro-3 (R) -hydroxybutyric acid was carried out.

Esempi 140-159 Examples 140-159

La procedura dell'esempio 1 venne ripetuta con gli organismi elencati in tabella 1, tranne che si impiegò quale substrato l'estere ottilico dell'acido y-bromo-acetoacetico (1 mg/ml). Si ottenne la conversione nel prodotto desiderato, l'estere ottilico dell'acido ( + )4-bromo-3(R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 1 was repeated with the organisms listed in Table 1, except that the y-bromo-acetoacetic acid octyl ester (1 mg / ml) was used as the substrate. The conversion to the desired product was obtained, the octyl ester of (+) 4-bromo-3 (R) -hydroxybutyric acid.

Esempi 160-184 Examples 160-184

La procedura dell'esempio 3 venne ripetuta con gli organismi elencati nella tabella 2, tranne che si impiegò l'estere ottilico dell'acido y-bromo-acetoacetico (1 mg/ml). Si ottenne la conversione nel prodotto desiderato, l'estere ottilico dell'acido ( + )4-bromo-3(R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 3 was repeated with the organisms listed in Table 2, except that the y-bromo-acetoacetic acid octyl ester (1 mg / ml) was used. The conversion to the desired product was obtained, the octyl ester of (+) 4-bromo-3 (R) -hydroxybutyric acid.

Esempi 185-204 Examples 185-204

La procedura dell'esempio 1 venne ripetuta con gli organismi elencati nella tabella 1, tranne che si impiegò quale substrato l'estere benzilico dell'acido y-bromo-acetoacetico (1 mg/ml). Si ottenne la conversione nel prodotto desiderato, l'estere benzilico dell'acido ( + )4-bromo-3(R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 1 was repeated with the organisms listed in Table 1, except that the benzyl ester of y-bromo-acetoacetic acid (1 mg / ml) was used as the substrate. The conversion to the desired product was obtained, the benzyl ester of (+) 4-bromo-3 (R) -hydroxybutyric acid.

Esempi 205-229 Examples 205-229

La procedura dell'esempio 3 venne ripetuta con gli organismi elencati nella tabella 2, tranne che si impiegò l'estere benzilico dell'acido y-bromo-acetoacetico (1 mg/ml). Si ottenne la conversione nel prodotto desiderato, l'estere benzilico dell'acido ( + )4-bromo-3(R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 3 was repeated with the organisms listed in Table 2, except that benzyl ester of y-bromo-acetoacetic acid (1 mg / ml) was used. The conversion to the desired product was obtained, the benzyl ester of (+) 4-bromo-3 (R) -hydroxybutyric acid.

Esempi 230-249 Examples 230-249

La procedura dell'esempio 1 venne ripetuta con gli organismi elencati nella tabella 1, tranne che si impiegò quale substrato la y-bromo-acetanilide (1 mg/ml). Si ottenne la conversione nel prodotto desiderato, l'anilide dell'acido (+)4-bromo-3(R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 1 was repeated with the organisms listed in Table 1, except that y-bromo-acetanilide (1 mg / ml) was used as the substrate. The conversion to the desired product was obtained, the anilide of (+) 4-bromo-3 (R) -hydroxybutyric acid.

Esempi 250-274 Examples 250-274

La procedura dell'esempio 3 venne ripetuta con gli organismi elencati nella tabella 2, tranne che si impiegò quale sunstra-to la y-bromo-acetanilide (1 mg/ml). Si ottenne la conversione nel prodotto desiderato, l'anilide dell'acido (+)4-bromo-3(R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 3 was repeated with the organisms listed in Table 2, except that y-bromo-acetanilide (1 mg / ml) was used as the solution. The conversion to the desired product was obtained, the anilide of (+) 4-bromo-3 (R) -hydroxybutyric acid.

Esempi 275-294 Examples 275-294

La procedura dell'esempio 1 venne ripetuta con gli organismi elencati in tabella 1, tranne che si impiegò quale substrato l'estere ottilico dell'acido y-idrossi-acetoacetico (1 mg/ml). Si ottenne la conversione nel prodotto desiderato, l'estere ottilico dell'acido 4-idrossi-3(R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 1 was repeated with the organisms listed in Table 1, except that the y-hydroxy-acetoacetic acid octyl ester (1 mg / ml) was used as the substrate. Conversion to the desired product was obtained, the octyl ester of 4-hydroxy-3 (R) -hydroxybutyric acid.

Esempi 295-319 Examples 295-319

La procedura dell'esempio 3 venne ripetuta con gli organismi elencati in tabella 2, tranne che si impiegò quale substrato l'estere ottilico dell'acido y-idrossi-acetoacetico (1 mg/ml). Si ottenne la conversione nel prodotto desiderato, l'estere ottilico dell' acido 4-idrossi- 3 (R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 3 was repeated with the organisms listed in Table 2, except that the y-hydroxy-acetoacetic acid octyl ester (1 mg / ml) was used as the substrate. The conversion to the desired product was obtained, the octyl ester of 4-hydroxy-3 (R) -hydroxybutyric acid.

Esempi 320-339 Examples 320-339

La procedura dell'esempio 1 venne ripetuta con gli organismi elencati in tabella 1, tranne che si impiegò quale substrato la y-idrossi-acetoacetanilide (1 mg/ml). Si ottenne la conversione nel prodotto desiderato, l'anilide dell'acido 4-idrossi-3(R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 1 was repeated with the organisms listed in Table 1, except that y-hydroxy-acetoacetanilide (1 mg / ml) was used as the substrate. The conversion to the desired product was obtained, the anilide of 4-hydroxy-3 (R) -hydroxybutyric acid.

Esempi 340-364 Examples 340-364

La procedura dell'esempio 3 venne ripetuta con gli organismi elencati in tabella 2, tranne che si impiegò quale substrato la y-idrossi-acetoacetanilide (1 mg/ml). Si ottenne la conversione nel prodotto desiderato, l'anilide dell'acido 4-idrossi-3(R)-idrossibutirrico. The procedure of Example 3 was repeated with the organisms listed in Table 2, except that y-hydroxy-acetoacetanilide (1 mg / ml) was used as the substrate. The conversion to the desired product was obtained, the anilide of 4-hydroxy-3 (R) -hydroxybutyric acid.

Esempio 365 Metil-4-cloro-3(R)-idrossibutirrato (Vili) Example 365 Methyl-4-chlorine-3 (R) -hydroxybutyrate (VIII)

VII Vili VII Cowardly

Del metil-4-cloro-acetoacetato (VII) (100 mg) venne incubato con 29 unità di y-idrossiacil CoA deidrogenasi (EC 1.1.1.35) estratta da cuore di maiale (Sigma, H4626), e 1,36 gr di NADH (Sigma, 90%) in 30 mi di un tampone al fosfato sodico 0,1 molare, pH 6,5. Methyl-4-chloroacetoacetate (VII) (100 mg) was incubated with 29 units of y-hydroxyacyl CoA dehydrogenase (EC 1.1.1.35) extracted from pig heart (Sigma, H4626), and 1.36 g of NADH (Sigma, 90%) in 30 ml of a 0.1 molar sodium phosphate buffer, pH 6.5.

Dopo 30 ore a 25°C, la miscela di reazione venne estratta 4 volte con 30 mi di acetato di etile. Lo strato organico venne essiccato su solfato sodico ed evaporato a secchezza a pressione ridotta. II residuo (90 mg) venne cromatografato in una colonna (1, 3 x 34 cm) di gel di silice (12 gr). La colonna venne elui- After 30 hours at 25 ° C, the reaction mixture was extracted 4 times with 30 ml of ethyl acetate. The organic layer was dried over sodium sulphate and evaporated to dryness under reduced pressure. The residue (90 mg) was chromatographed in a column (1.3 x 34 cm) of silica gel (12 g). The column was eluted

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

9 9

661 498 661 498

ta con un sistema solvente consistente di Skelly B - acetato di etile (8:1) e furono raccolte delle frazioni da 20 mi. Vennero riunite le frazioni 9-11, contenenti il desiderato metil-4-cloro--3(R)-idrossibutirrato (Vili) come mostrato mediante TLC, [a]23 +23,5] (c, 5,2 CHCI3). ta with a solvent system consisting of Skelly B - ethyl acetate (8: 1) and fractions of 20 ml were collected. Fractions 9-11 were combined, containing the desired methyl-4-chlorine-3 (R) -hydroxybutyrate (VIII) as shown by TLC, [a] 23 +23.5] (c, 5.2 CHCI3).

Esempio 366 Example 366

La procedura dell'esempio 365 venne ripetuta usando quale substrato etil-4-cloro-acetoacetato, con ottenimento dell'etil--4-cloro-3(R)-idrossibutirrato, [a]" +22,7° (c, 4,7 CHCI3). The procedure of Example 365 was repeated using ethyl-4-chloroacetoacetate as substrate, obtaining ethyl-4-chloro-3 (R) -hydroxybutyrate, [a] "+ 22.7 ° (c, 4 , 7 CHCI3).

Esempio 367 Example 367

La procedura dell'esempio 365 venne ripetuta usando quale substrato n-propil-4-cloro-acetoacetato, con ottenimento di n-propil-4-cloro-3(R)-idrossibutirrato, [a]" + 21,5° (c, 5,0, CHCI3). The procedure of Example 365 was repeated using n-propyl-4-chloroacetoacetate as substrate, obtaining n-propyl-4-chloro-3 (R) -hydroxybutyrate, [a] "+ 21.5 ° (c , 5.0, CHCI3).

Esempio 368 Example 368

La procedura dell'esempio 365 venne ripetuta usando quale substrato n-butil-4-cloro-acetoacetato, con ottenimento di n-butiI-4-cloro-3(R)-idrossibutirrato, [a]è3 +20,1° (c, 3,1, CHCI3). The procedure of Example 365 was repeated using n-butyl-4-chloroacetoacetate as substrate, obtaining n-butiI-4-chloro-3 (R) -hydroxybutyrate, [a] is 3 + 20.1 ° (c , 3.1, CHCI3).

80-90°C in una soluzione di acido cloridrico al 10% (7 mi) per un'ora e mezza. Dopo evaporazione dei solventi a pressione ridotta, il prodotto grezzo venne estratto due volte con etanolo assoluto (10 mi) e l'etanolo venne evaporato sotto vuoto. Il re-5 siduo cristallino venne disciolto in una piccola quantità di etanolo e la L-carnitina cloruro venne precipitata per aggiunta di etere con buona resa (320 mg), punto di fusione 142° (dee.); [a] -23,7° (c, 4,5, H20). 80-90 ° C in a 10% hydrochloric acid solution (7 ml) for one and a half hours. After evaporation of the solvents under reduced pressure, the crude product was extracted twice with absolute ethanol (10 ml) and the ethanol was evaporated under vacuum. The crystalline residue was dissolved in a small amount of ethanol and L-carnitine chloride was precipitated by adding ether with good yield (320 mg), melting point 142 ° (dee.); [a] -23.7 ° (c, 4.5, H20).

La L-carnitina cloruro può venir facilmente convertita in L-10 carnitina sale interno che è preferita da un punto di vista farmaceutico, mediante mezzi di scambio ionico come è ben noto nella tecnica. L-carnitine chloride can easily be converted into L-10 carnitine internal salt which is preferred from a pharmaceutical point of view, by means of ion exchange means as is well known in the art.

Esempio 3 70 Example 3 70

15 15

Ottil-4-iodio-3(R)-diidrossibutirrato (IX) Octyl-4-iodine-3 (R) -dihydroxybutyrate (IX)

ÇH o ÇH o

Mal Mal

Jt jt

XI XI

IX IX

Procedura generale per la conversione in L-carnitina di esteri e ammidi dell'acido 4-alogeno-3(R)-idrossibutirrico General procedure for the conversion to L-carnitine of esters and amides of 4-halogen-3 (R) -hydroxybutyric acid

Esempio 369 Example 369

Una miscela di estere ottilico dell'acido 4-cloro-3(R)-idrossi-butirrico (1,5 gr), etanolo (3 mi) e trimetilammina (soluzione al 25% in peso) in acqua (3 mi) venne riscaldata a 80-90°C per circa 2 ore. I solventi e l'eccesso di trimetilammina vennero evaporati a secchezza sotto vuoto, fornendo 1,8 gr di un residuo grezzo. Il prodotto grezzo (1 gr) venne riscaldato a A mixture of 4-chloro-3 (R) -hydroxy-butyric acid octyl ester (1.5 g), ethanol (3 ml) and trimethylamine (25% by weight solution) in water (3 ml) was heated at 80-90 ° C for about 2 hours. The solvents and excess trimethylamine were evaporated to dryness under vacuum, providing 1.8 g of a crude residue. The crude product (1 gr) was heated to

25 Una miscela di ottil-4-cloro-3(R)-idrossibutirrato (II) (1,426 gr), e NAI anidro (1,2 gr) in 15 mi di metil etil chetone venne sottoposta a riflusso per 24 ore. La miscela venne evaporata in evaporatore rotativo e fatta reagire con etere (100 mi) e acqua (50 mi). La fase organica venne separata e lavata con una solu-30 zione di tiosolfato sodico al 10% (150 mi), salamoia (150 mi) e essiccata su solfato sodico anidro. Il solvente venne evaporato a pressione ridotta, fornendo 1,762 gr del composto IX sotto forma di un olio giallo pallido: IR (film sottile) 3460 cm 1 (OH) e 1730 cm'1 (estere C = 0); PMR (CDCI3) - 3,93-4,27 (m, 3H), 35 3,17 (d, 2H), 2,30 (2H), 1,50-1,87 (m, 2H), 1,30 (bs, 12H), 0,93 (m, 3H). 25 A mixture of octyl-4-chloro-3 (R) -hydroxybutyrate (II) (1.426 gr), and anhydrous NAI (1.2 gr) in 15 ml of methyl ethyl ketone was refluxed for 24 hours. The mixture was evaporated in a rotary evaporator and reacted with ether (100 ml) and water (50 ml). The organic phase was separated and washed with a solution of 10% sodium thiosulfate (150 ml), brine (150 ml) and dried over anhydrous sodium sulphate. The solvent was evaporated under reduced pressure, providing 1,762 g of compound IX in the form of a pale yellow oil: IR (thin film) 3460 cm 1 (OH) and 1730 cm'1 (ester C = 0); PMR (CDCI3) - 3.93-4.27 (m, 3H), 35 3.17 (d, 2H), 2.30 (2H), 1.50-1.87 (m, 2H), 1, 30 (bs, 12H), 0.93 (m, 3H).

Conversione deil'ottil-4-iodio-3(R)-idrossibutirrato (IX) in L-carnitina f3 Conversion of octyl-4-iodine-3 (R) -hydroxybutyrate (IX) to L-carnitine f3

r3 F3 OH 0 r3 F3 OH 0

• - • -

I" CH, °( I "CH, ° (

CH CH3OH - _ ^ CH CH3OH - _ ^

»17 3 I-Œ, »17 3 I-Œ,

IX X IX X

¥*3 2H 0 ¥ * 3 2H 0

L-carnitina L-carnitine

661 498 661 498

10 10

A una soluzione del composto IX (1,593 gr) in metanolo (15 mi) si aggiunse una soluzione acquosa al 25% di trimetilammina (8 mi). La miscela venne agitata a 27°C per 20 ore. I solventi e l'eccesso di trimetilammina vennero allontanati per evaporazione a pressione ridotta, fornendo un solido semicristallino, X. Questo residuo venne lavato con piccole quantità di etere per allontanare l'ottanolo e quindi disciolto in acqua e fatto passare in una colonna (2,5 X 15 cm) di Dowex l-x4 [forma OH"] di 50-100 mesh. La colonna venne lavata con acqua distillata. L'allontanamento del solvente sotto vuoto dai primi 200 ml dell'eluito fornì L-carnitina sotto forma di un solido bianco cristallino (490 mg, resa 65% [a]^3-29,2° (c, 6,5 H2O). A solution of compound IX (1.593 g) in methanol (15 ml) was added with a 25% aqueous solution of trimethylamine (8 ml). The mixture was stirred at 27 ° C for 20 hours. The solvents and excess trimethylamine were removed by evaporation under reduced pressure, providing a semicrystalline solid, X. This residue was washed with small quantities of ether to remove the octanol and then dissolved in water and passed in a column (2 , 5 X 15 cm) of 50-100 mesh Dowex l-x4 [OH form]. The column was washed with distilled water. The removal of the solvent under vacuum from the first 200 ml of the eluate provided L-carnitine in the form of a white crystalline solid (490 mg, yield 65% [a] ^ 3-29.2 ° (c, 6.5 H2O).

Esempio 371 Example 371

La procedura dell'esempio 370 venne ripetuta usando esil-4-cloro-3(R)-idrossibutirrato, con ottenimento di esil-4--iodio-3(R)-idrossibutirrato, che venne quindi convertito in L-carnitina. The procedure of Example 370 was repeated using hexyl-4-chloro-3 (R) -hydroxybutyrate, obtaining hexyl-4-iodine-3 (R) -hydroxybutyrate, which was then converted into L-carnitine.

Esempio 372 Example 372

La procedura dell'esempio 370 venne ripetuta usando eptil--4-cloro-3(R)-idrossibutirrato, con ottenimento di eptil-4-iodio--3(R)-idrossibutirrato, che venne quindi convertito in L-carnitina. The procedure of Example 370 was repeated using heptyl-4-chloro-3 (R) -hydroxybutyrate, obtaining heptyl-4-iodine - 3 (R) -hydroxybutyrate, which was then converted into L-carnitine.

Esempio 373 Example 373

La procedura dell'esempio 370 venne ripetuta usando decil-4-cloro-3(R)-idrossibutirrato, con ottenimento di decil-4-iodio-3(R)-idrossibutirrato, che venne quindi convertito in L-carnitina. The procedure of Example 370 was repeated using decyl-4-chlorine-3 (R) -hydroxybutyrate, obtaining decyl-4-iodine-3 (R) -hydroxybutyrate, which was then converted into L-carnitine.

Esempio 374 Example 374

La procedura dell'esempio 370 venne ripetuta usando metil-4-cloro-3(R)-idrossibutirrato (Vili), con ottenimento di metil-4-iodio-3(R)-idrossibutirrato, che venne quindi convertito in L-carnitina. The procedure of Example 370 was repeated using methyl-4-chloro-3 (R) -hydroxybutyrate (VIII), obtaining methyl-4-iodine-3 (R) -hydroxybutyrate, which was then converted into L-carnitine.

Esempio 375 Example 375

La procedura dell'esempio 370 venne ripetuta usando etil-4-cloro-3(R)-idrossibutirrato, con ottenimento di etil-4--iodio-3(R)-idrossibutirrato, che venne quindi convertito in L-carnitina. The procedure of Example 370 was repeated using ethyl-4-chloro-3 (R) -hydroxybutyrate, obtaining ethyl-4-iodine-3 (R) -hydroxybutyrate, which was then converted into L-carnitine.

Esempio 376 Example 376

La procedura dell'esempio 370 venne ripetuta usando n-pro-pil-4-cloro-3(R)-idrossibutirrato, con ottenimento di n-propil--4-iodio-3(R)-idrossibutirrato, che venne quindi convertito in L-carnitina. The procedure of Example 370 was repeated using n-pro-pil-4-chloro-3 (R) -hydroxybutyrate, obtaining n-propyl-4-iodine-3 (R) -hydroxybutyrate, which was then converted into L-carnitine.

Esempio 377 Example 377

La procedura dell'esempio 370 venne ripetuta usando n-bu-til-4-cloro-3(R)-idrossibutirrato, con ottenimento di n-butil-4--iodio-3(R)-idrossibutirrato, che venne quindi convertito in L-carnitina. The procedure of Example 370 was repeated using n-bu-tyl-4-chloro-3 (R) -hydroxybutyrate, obtaining n-butyl-4 - iodine-3 (R) -hydroxybutyrate, which was then converted into L-carnitine.

Esempi rappresentativi di lieviti che producono l'enzima desiderato sono elencati nella tabella 1, mentre esempi di funghi rappresentativi sono elencati nella tabella 2. Representative examples of yeasts that produce the desired enzyme are listed in Table 1, while examples of representative mushrooms are listed in Table 2.

TABELLA 1 (lieviti) TABLE 1 (yeasts)

1. Candida lipolytica NRRL Y-1095 1. Candida lipolytica NRRL Y-1095

2. Candida pseudotropicalis NRRL Y-1264 2. Candida pseudotropicalis NRRL Y-1264

3. Mycoderma cerevisiae NRRL Y-1615 3. Mycoderma cerevisiae NRRL Y-1615

4. Tonila lactosa NRRL Y-329 4. Tonila lactosa NRRL Y-329

5. Geotrichum candidum NRRL Y-552 5. Geotrichum candidum NRRL Y-552

6. Hansenula anomala NRRL Y-366 6. Hansenula anomala NRRL Y-366

7. Hansenula subpelliculosa NRRL Y-1683 7. Hansenula subpelliculosa NRRL Y-1683

8. Pichia alcoholophila NRRL Y-2026 8. Pichia alcoholophila NRRL Y-2026

9. Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12,632 9. Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-12,632

10. Saccharomyces lactis NRRL Y-1140 10. Saccharomyces lactis NRRL Y-1140

11. Zygosaccharomyces priorianus NRRL Y-12, 624 12 Saccharomyces acidifaciens NRRL Y-7253 11. Zygosaccharomyces priorianus NRRL Y-12, 624 12 Saccharomyces acidifaciens NRRL Y-7253

13. Kloeckera corticis ATCC 20109 13. Kloeckera corticis ATCC 20109

14. Cryptococus mascerans ATCC 24194 14. Cryptococus mascerans ATCC 24194

15. Rhodotorula sp. ATCC 20254 15. Rhodotorula sp. ATCC 20254

16. Candida albicans ATCC 752 16. Candida albicans ATCC 752

17. Dipodascus albidus ATCC 12934 17. Dipodascus albidus ATCC 12934

18. Saccharomyces cerevisiae (stella rossa del commercio) 18. Saccharomyces cerevisiae (red trade star)

19. Rhodotorula rubra NRRL Y-l 592 19. Rhodotorula rubra NRRL Y-l 592

20. Oospora lactis ATCC 14318 20. Oospora lactis ATCC 14318

NRRL - Northern Regional Research Lab. a Peoria, Illinois. ATCC - American Type Culture Collection a Rockville, Maryland. NRRL - Northern Regional Research Lab. In Peoria, Illinois. ATCC - American Type Culture Collection in Rockville, Maryland.

TABELLA 2 (funghi) TABLE 2 (mushrooms)

1. Gliocladium virens ATCC 13362 1. Gliocladium virens ATCC 13362

2. Caldariomyces fumago ATCC 16373 2. Caldariomyces fumago ATCC 16373

3. Linderina pennisopora ATCC 12442 3. Linderina pennisopora ATCC 12442

4. Aspergillus ochraceus NRRL 405 4. Aspergillus ochraceus NRRL 405

5. Trichoderma lignorum ATCC 8678 5. Trichoderma lignorum ATCC 8678

6. Heterocephalum autantiacum ATCC 16328 6. Heterocephalum autantiacum ATCC 16328

7. Entomophthora coronata NRRL 1912 7. Entomophthora coronata NRRL 1912

8. Scopulariopsis constantini NRRL 1860 8. Scopulariopsis constantini NRRL 1860

9. Zygorhynchus heterogamus ATCC 6743 9. Zygorhynchus heterogamus ATCC 6743

10. Scopulariopsis brevicaulis NRRL 2157 10. Scopulariopsis brevicaulis NRRL 2157

11. Rhizopus arrhizus NRRL 2286 11. Rhizopus arrhizus NRRL 2286

12. Pénicillium thomii NRRL 2077 12. Pénicillium thomii NRRL 2077

13. Mucor hiemalis (-) NRRL 4088 13. Mucor hiemalis (-) NRRL 4088

14. Byssochlamys nivea ATCC 12550 14. Byssochlamys nivea ATCC 12550

15. Pénicillium patulum NRRL 1952 15. Pénicillium patulum NRRL 1952

16. Metarrhizium anisopliae ATCC 24942 16. Metarrhizium anisopliae ATCC 24942

17. Pénicillium islandicum ATCC 10127 17. Pénicillium islandicum ATCC 10127

18. Cunninghamella elegans ATCC 10028a 18. Cunninghamella elegans ATCC 10028a

19. Cunninghamella echinulata ATCC 11585a 19. Cunninghamella echinulata ATCC 11585a

20. Aspergillus fumigatus ATCC 16907 20. Aspergillus fumigatus ATCC 16907

21. Aspergillus amstelodami NRRL 90 21. Aspergillus amstelodami NRRL 90

22. Gliocladium roseum ATCC 10521 22. Gliocladium roseum ATCC 10521

23. Aspergillus giganteus ATCC 10059 23. Aspergillus giganteus ATCC 10059

24. Absidia blakeleeana ATCC 10148b 24. Absidia blakeleeana ATCC 10148b

25. Pénicillium roqueforti NRRL 849a 25. Pénicillium roqueforti NRRL 849a

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

V V

Claims (22)

661 498 661 498 2. Composto secondo la rivendicazione 1, in cui R è un radicale alcossilico a catena lineare avente da 1 a 10 atomi di carbonio. A compound according to claim 1, wherein R is a linear chain alkoxy radical having from 1 to 10 carbon atoms. 2 2 RIVENDICAZIONI 1. Composti aventi la formula e la configurazione 3(R) CLAIMS 1. Compounds having the formula and configuration 3 (R) in cui in which X è scelto fra Cl, Br, I e OH e X is chosen from Cl, Br, I and OH e R è un radicale avente configurazione a catena lineare, ramificata oppure ciclica scelto nella classe consistente di radicali alcossilici aventi da 1 a 15 atomi di carbonio; R is a radical having a linear, branched or cyclic chain configuration selected from the class consisting of alkoxyl radicals having from 1 to 15 carbon atoms; radicali alchilamminici aventi da 5 a 15 atomi di carbonio; radicali cicloalcossilici e radicali cicloalchilamminici aventi da 5 a 12 atomi di carbonio; alkylamine radicals having from 5 to 15 carbon atoms; cycloalkoxylic and cycloalkylamine radicals having from 5 to 12 carbon atoms; fenossi e radicali fenilalcossilici aventi da 7 a 14 atomi de carbonio; phenoxy and phenylalkoxy radicals having from 7 to 14 carbon atoms; fenilammino e radicali fenilalchilamminici aventi le formule Y YZ phenylamino and phenylalkylamine radicals having the formulas Y YZ I I I I I I -N-0-A; e -N-CH-0-A -N-0-A; and -N-CH-0-A in cui Y e Z sono scelti fra H, un gruppo alchilico avente da 1 a 8 atomi di carbonio, fenile o benzile e A è scelto fra H, CH3, CI e Br. wherein Y and Z are selected from H, an alkyl group having from 1 to 8 carbon, phenyl or benzyl atoms and A is selected from H, CH3, Cl and Br. 3 3 661 498 661 498 O O O O Il II The II XCH2-C-CH2C-R XCH2-C-CH2C-R in cui X e R hanno il significato precedentemente menzionato all'azione enzimatica della L-ß-idrossiacil CoA deidrogenasi [EC 1.1.1.35] in forma purificata. wherein X and R have the meaning previously mentioned to the enzymatic action of L-ß-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] in purified form. 3. Composto secondo la rivendicazione 2, in cui R è OC10H21. 3. Compound according to claim 2, wherein R is OC10H21. 4. Composto secondo la rivendicazione 2, in cui R è OCsHn- A compound according to claim 2, wherein R is OCsHn- 5 5 5. Composto secondo la rivendicazione 2, in cui R è OC7H15. 5. A compound according to claim 2, wherein R is OC7H15. 6. Composto secondo la rivendicazione 2, in cui R è A compound according to claim 2, wherein R is oc6hi3. oc6hi3. 7. Composto secondo la rivendicazione 2, in cui R è un radicale alcossilico inferiore avente da 1 a 4 atomi di carbonio. A compound according to claim 2, wherein R is a lower alkoxyl radical having from 1 to 4 carbon atoms. 8. Composto secondo la rivendicazione 1, in cui R è scelto fra fenossi e fenilalcossi sostituito con alchile inferiore, alogeno o nitrogruppo. 8. A compound according to claim 1, wherein R is selected from phenoxy and phenylalkoxy substituted with lower alkyl, halogen or nitrogroup. 9. Composto secondo la rivendicazione 8, in cui R è benzil-ossi e X è scelto fra CI e Br. A compound according to claim 8, wherein R is benzyloxy and X is selected from Cl and Br. 10 10 10. Composto secondo la rivendicazione 1, in cui R è fenilammino e X è scelto fra CI e Br. 10. A compound according to claim 1, wherein R is phenylamino and X is selected from Cl and Br. 11. Procedimento per preparare derivati dell'acido ß-idrossibutirrico "/-sostituito aventi la formula 11. Process for preparing ß-hydroxybutyric acid "/ -substituted derivatives having the formula OH OH in cui in which X è scelto fra CI, Br, I e OH e X is selected from CI, Br, I and OH e R è un radicale avente configurazione a catena lineare, ramificata oppure ciclica scelto dalla classe consistente di radicali alcossilici aventi da 1 a 15 atomi di carbonio; R is a radical having a linear, branched or cyclic chain configuration chosen from the class consisting of alkoxyl radicals having from 1 to 15 carbon atoms; radicali alchilamminici aventi da 5 a 15 atomi di carbonio; radicali cicloalcossilici e radicali cicloalchilamminici aventi da 5 a 12 atomi di carbonio; alkylamine radicals having from 5 to 15 carbon atoms; cycloalkoxylic and cycloalkylamine radicals having from 5 to 12 carbon atoms; fenossi e radicali fenilalcossilici aventi da 7 a 14 atomi di carbonio; phenoxy and phenylalkoxy radicals having from 7 to 14 carbon atoms; fenilammino e radicali fenilalchilamminici aventi le formule phenylamino and phenylalkylamine radicals having the formulas Y Y Z Y Y Z I I I I I I -N-0-A; e -N-CH-0-A -N-0-A; and -N-CH-0-A in cui Y e Z sono scelti fra H, un gruppo alchilico avente da 1 a 8 atomi di carbonio, fenile o benzile e A è scelto fra H, CH3, CI e Br da corrispondenti esteri o ammidi dell'acido acetoaceti-co y-sostituito, caratterizzato dallo stadio di: sottoporre detti esteri o ammidi dell'acido acetoacetico y-sostituito all'azione enzimatica fermentativa di un microorganismo che elabora L-ß-idrossiacil CoA deidrogenasi [EC 1.1.1.35]. wherein Y and Z are selected from H, an alkyl group having from 1 to 8 carbon, phenyl or benzyl atoms and A is selected from H, CH3, Cl and Br from corresponding esters or amides of the acetoaceti-co y- acid substituted, characterized by the stage of: subjecting said esters or amides of y-substituted acetoacetic acid to the fermentative enzymatic action of a microorganism which processes L-ß-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35]. 12. Procedimento secondo la rivendicazione 11 per preparare derivati otticamente attivi dell'acido 3(R)-idrossibutirrico y-sostituito aventi la formula e la configurazione 3(R) 12. Process according to claim 11 for preparing optically active derivatives of the 3 (R) -hydroxybutyric acid substituted with the formula and configuration 3 (R) OH OH in cui X e R hanno i significati precedentemente menzionati, purché, se R è un radicale alcossilico, esso abbia da 5 a 15 atomi di carbonio, caratterizzato dallo stato di: sottoporre composti aventi formula wherein X and R have the above mentioned meanings, provided that, if R is an alkoxyl radical, it has from 5 to 15 carbon atoms, characterized by the state of: subjecting compounds having formula O O O O Il II The II XCH2-C-CH2CR XCH2-C-CH2CR in cui X e R hanno i significati precedentemente menzionati all'azione enzimatica fermentativa di un microorganismo che elabora L-ß-idrossiacil CoA deidrogenasi [EC 1.1.1.35]. wherein X and R have the meanings previously mentioned to the enzymatic fermentative action of a microorganism that processes L-ß-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35]. 13. Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui il mi croorganismo è scelto dalla classe Ascomycetes. 13. The method of claim 12 wherein the microorganism is selected from the Ascomycetes class. 14. Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui il mi croorgasnismo è scelto dagli ordini Endomycetales, Mucorales, Moniliales o Eurotiales. 14. A process according to claim 12, in which mi croorgasnism is chosen from the orders Endomycetales, Mucorales, Moniliales or Eurotiales. 15 15 15. Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui il mi croorganismo è scelto dal genere Saccharomyces. 15. The process of claim 12 wherein the microorganism is selected from the genus Saccharomyces. 16. Procedimento secondo la rivendicazione 15, in cui il mi croorganismo è il Saccharomyces cerevisiae. 16. The method of claim 15 wherein the microorganism is Saccharomyces cerevisiae. 17. Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui il derivato dell'acido acetoacetico y-sostituito sottoposto all'azione enzimatica fermentativa è l'estere ottilico dell'acido y-cloro-acetoacetico. 17. The process of claim 12 wherein the y-substituted acetoacetic acid derivative subjected to the fermentative enzymatic action is the y-chloroacetoacetic acid octyl ester. 18. Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui il derivato dell'acido acetoacetico y-sostituito sottoposto all'azione enzimatica fermentativa è l'estere benzilico dell'acido y-cloro-acetoacetico. 18. The process of claim 12 wherein the y-substituted acetoacetic acid derivative subjected to the enzymatic fermentative action is the benzyl ester of y-chloroacetoacetic acid. 19. Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui il derivato dell'acido acetoacetico y-sostituito sottoposto all'azione enzimatica fermentativa è la y-cloro-acetoacetanflide. 19. The process of claim 12 wherein the y-substituted acetoacetic acid derivative subjected to the enzymatic fermentative action is y-chloroacetoacetanflide. 20 20 25 25 30 30 35 35 40 40 45 45 50 50 55 55 60 60 65 65 20. Procedimento secondo le rivendicazioni 17, 18 o 19, in cui il microorganismo è il Saccharomyces cerevisiae. 20. Process according to claims 17, 18 or 19, wherein the microorganism is Saccharomyces cerevisiae. 21. Procedimento per preparare derivati otticamente attivi dell'acido 3(R) idrossibutirrico y-sostituito aventi la formula e la configurazione 3(R) 21. Method for preparing optically active derivatives of y-substituted hydroxybutyric acid 3 (R) having the formula and configuration 3 (R) OH OH in cui X è scelto fra CI, Br, I e OH e R è un radicale alcossilico avente da 1 a 4 atomi di carbonio, caratterizzato dallo stadio di: sottoporre composti aventi formula wherein X is selected from Cl, Br, I and OH and R is an alkoxy radical having from 1 to 4 carbon atoms, characterized by the stage of: subjecting compounds having formula 22. Procedimento secondo la rivendicazione 21, in cui detta L-ß-idrossiacil CoA deidrogenasi [EC 1.1.1.35] in forma purificata è quella isolata dal cuore di maiale. 22. The process of claim 21 wherein said L-ß-hydroxyacyl CoA dehydrogenase [EC 1.1.1.35] in purified form is that isolated from the pig heart.
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