JP4042557B2 - Process for producing optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid and its ester - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＲ体あるいはＳ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を炭素源として資化増殖する能力を有する微生物を用いて、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸より光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を分取する方法、並びに該製法により得られた光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸をエステル化する光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸エステルの製法に関する。
本発明により得られる光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸及びそのエステル体は、医薬品・農薬・生理活性物質などの光学活性化合物の製造における製造中間体として極めて重要な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸の化学的製法としては、そのラセミ体を光学活性アミノ酸アミド誘導体、あるいは光学活性シス−１−アミノインダン−２−オールを分割剤として光学分割する方法などが知られている。しかしながら、これらの製法により高光学純度のテトラヒドロフラン−２−カルボン酸を得るには、高価な分割剤を必要とし、工業的に経済的な製法とは言い難い。
【０００３】
一方、生物学的製法に関しては、微生物や動物由来のエステル分解酵素をラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸エステルに作用させ、立体選択的な加水分解によりテトラヒドロフラン−２−カルボン酸とその対掌体エステルに分割する方法が知られている［特許文献１、特許文献２］。しかしながら、この製法では、高価な酵素を購入する必要があり、工業的により安価で簡便な製法が望まれている。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００２−１７１９９４号公報
【特許文献２】
国際公開 第０１/９２５５４号パンフレット
【０００５】
本発明者らは、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸からＲ体あるいはＳ体のテトラヒドロフラン−２−カルボン酸を優先的に資化分解する能力を有し、さらに該光学異性体を単一炭素源として資化増殖することのできる微生物を求め、鋭意研究した結果、目的とする微生物の単離に成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高光学純度の光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を効率よく、経済的に製造することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明はテトラヒドロフラン−２−カルボン酸の一方の光学異性体資化能を有し、すなわち本発明は、Ｒ体あるいはＳ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸資化能を有し、該光学異性体を単一炭素源として生育しうるラルストニア(Ralstonia)属またはバークホルデリア(Burkholderia)属に属する微生物もしくはその培養菌体を、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を単一炭素源とする培地中で培養し、該光学異性体を資化分解せしめ、残存する他方の光学異性体を分取することを特徴とする光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸の製法、並びに該方法により得られた光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸をエステル化することにより光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸エステルを合成する方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
まず、本発明に使用される微生物（以下本微生物と略記する。）を通常一般によく用いられる栄養培地中で予備培養して種菌体を調製する。
【０００９】
次いで、この予備培養から得られる培養物あるいは微生物菌体を、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を単一炭素源として含有する培地に接種し、培養し、培養液から残存する光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を分取する。
本培養は至適ｐＨ、至適温度の範囲内で行うのがよい。例えばｐＨを５〜９、好ましくはｐＨ７前後で、培養温度は１５〜５０℃、好ましくは２０〜３７℃の範囲で行う。なお、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸の資化反応の進行に伴い、培養液中のｐＨ が徐々に低下または上昇する場合、適当なアルカリ源または酸源を添加することにより培養液中のｐＨを至適範囲内にコントロールする必要がある。
【００１０】
例えば、アルカリ源としては炭酸カルシウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、炭酸カリウム、炭酸アンモニウなどの炭酸アルカリ塩水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ塩水溶液、アンモニア水溶液など、酸源として塩酸、燐酸など通常、酸またはアルカリを中和させることができるものを用いてｐＨを至適範囲内に制御するのがよい。
【００１１】
培養液中の単一炭素源としてのラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸の基質濃度は０.１〜１５％(v/v)が好ましく、基質は初期に一括して加えてもよいし(バッチ培養法)、分割添加してもよい(流加培養法)。また、連続培養法を行うことも可能である。
本培養の培地には窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物および尿素、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の有機窒素化合物とそれらの混合物を挙げることができる。その他、無機塩としてリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩など、さらに必要に応じてビタミン類を加えてもよい。
培養は通常、攪拌あるいは振盪、あるいは通気撹拌培養等の方法を用いて好気的に行われる。培養時間は基質濃度ならびにその他の培養条件により異なるが２４〜１２０時間で終了するのがよい。好ましくはガスクロマトグラフィー等の分析によりラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸の残存基質量が初期基質濃度に比して５０％で培養を終了するか、あるいは目的とする光学活性体の光学純度を測定して終点を決定するのがよい。すなわち基質であるラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸中のＲ体あるいはＳ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸が全て分解資化された時点で培養を停止するのがよい。
【００１２】
このようにして培養液中に残存する光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸は一般的な方法で回収および精製できる。例えば、培養液から菌体を遠心分離で除いた後、上清に塩酸や硫酸などの酸と酢酸エチル、トルエン、ジクロロメタン、またはそれらの混合物等の溶媒とを添加し、水槽と油層とに分ける。次いで油層を分取し周知の手法を用いることによって高光学純度の光学活性体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を効率よく得ることができる。また、適当な塩化合物にし、再結晶化してもよい。
なお、本発明を実施するには、予め種菌体を調製することなく、本微生物をラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を単一炭素源とする培地に直接植菌し、上記と同様の方法で培養し、目的とする光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を回収してもよい。
上記方法により得られた光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を常法によりエステル化することにより、光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸エステルを製造することができる。
このエステル化は、好ましくは硫酸触媒下、所望のアルコールと反応させエステル化した後、酢酸エチルなどの適当な溶媒を用いて抽出し、蒸留により精製を行ってもよい。このエステル化によって、目的物の光学純度が殆ど低下することがない。
【００１３】
本微生物を予備培養するための培地組成としては通常本微生物が生育する培地ならばいずれでも使用することができる。
例えば炭素源としてラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸、グルコースやフラクトースなどの炭水化物、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸とその塩類などの有機酸、またはそれらの混合物を用いることができる。窒素源として硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物および尿素、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の有機窒素化合物とそれらの混合物を挙げることができる。その他、無機塩としてリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩など、さらに必要に応じてビタミン類を加えてもよい。
また、ペプトン培地、ブイヨン培地等の栄養培地、あるいはラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を添加したこれらの培地を用いてもよい。
培養は常法によればよく、例えばｐＨを５〜９、好ましくはｐＨ７前後で、培養温度は１５〜５０℃、好ましくは２０〜３７℃の範囲で振盪培養あるいは通気撹拌培養等の方法を用いて好気的に２０〜９６時間行なうことが好ましい。
【００１４】
本微生物は、上記の如くＲ体あるいはＳ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸の資化能を有し、該光学異性体を単一炭素源として資化増殖することのできるラルストニア属またはバークホルデリア属に属する微生物である。好ましい菌株としてはラルストニア(Ralstonia) sp. DS-SK-RT13株、バークホルデリア(Burkholderia) sp. DS-SK-ST4株、バークホルデリア(Burkholderia) sp. DS-SK-ST12株を挙げることができる。
【００１５】
上記の菌株はそれぞれ形態学的・生理性状学的試験および16SrRNA塩基配列解析からラルストニア属またはバークホルデリア属に属する微生物微生物と同定され、独立行政法人産業技術総合研究所に以下の国内寄託番号で寄託されている。
ラルストニア(Ralstonia) sp. DS-SK-RT13株：国内寄託番号FERM P−19113.
バークホルデリア(Burkholderia) sp. DS-SK-ST4株：国内寄託番号FERM P−19114。
バークホルデリア(Burkholderia) sp. DS-SK-ST12株：国内寄託番号FERM P−19115。
【００１６】
なお、上記菌株は文献未載の新菌株であり、その形態学的・生理性状学的諸性質を以下に記載する。
（表１）
（表２）
本発明の光学的分割法において、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を単一炭素源とする完全合成培地を使用する場合には、雑菌に汚染されることが少なく、目的物の精製も容易である。
また、本発明の微生物はラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸よりＲ体あるいはＳ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を完全に資化分解するため、培養終了後の培養液には残存する光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸と生育菌体以外には残存しないため、回収工程などのダウンストリームが非常に簡便である。
【００１９】
【実施例】
以下実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、実施例中の％は特に記載のない限り％（w/v）を表す。
【００２０】
実施例１
１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌したグリセリン１０g/L、酵母エキス１０g/L、ペプトン１０g/Lからなる液体栄養培地１００ml(pH7.2)を入れた５００ml容バッフル付き三角フラスコに、予め同栄養培地プレートで生育させたラルストニア(Ralstonia) sp. DS-SK-RT13株の菌体を１白金耳分植菌し、３０℃で２４時間培養を行い、種培養液を得た。
【００２１】
硫酸アンモニウム ０.２％
リン酸第２ナトリウム ０.０２％
リン酸第２カリウム ０.０２％
リン酸第１ナトリウム ０.０４％
硫酸マグネシウム ０.０５％
硫酸鉄 ０.００１％
硫酸銅 ０.０００１％
硝酸マンガン ０.０００１％
炭酸カルシウム ０.５％
ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸 １.０％(v/v)
からなる組成の培地１００ml（pH6.9）を入れた５００ml容のバッフル付き三角フラスコを１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌し、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を単一炭素源とする完全合成培地を作製した。
上記完全合成培地に種培養液１mlを無菌的に接種し、３０℃、１３０ｒｐｍ の振盪条件で２日間培養した。
【００２２】
その結果、培地中に生育した微生物の濁度は３.０ ＯＤ（660nmでの濁度）で、その時の培養液中に残存するテトラヒドロフラン−２−カルボン酸をガスクロマトグラフィー（カラム担体：PEG 20M，60−80メッシュ）で分析した結果、その残存率は３５％であった。培養終了後、培養液を取り出し、遠心操作により菌体を除去し、上清液を得た。この上清液をエバポレーターで濃縮し、エーテルにより抽出した。続いて無水硫酸マグネシウムにより脱水後、減圧下でエーテルを除去し、テトラヒドロフラン−２−カルボン酸のシロップを得た。
【００２３】
本物質の光学純度の測定は、得られたテトラヒドロフラン−２−カルボン酸の光学異性体のシロップ５０ｍｇを３０ｍｌ容の三角フラスコに入れ、氷冷しながら４−ジメチルアミノピリジンを１０５ｍｇ、ジクロロメタンを１０ｍｌ、塩酸飽和エタノールを１００μｌ、塩酸１−エチル３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを９９ｍｇ加え、１０分ほど撹拌した後、蓋をして室温で一晩撹拌した。有機層を１Ｎ塩酸で２回洗浄した後デシケーターにて溶媒を除去し、テトラヒドロフラン−２−カルボン酸エチルへと変換した後、アステック社製のキャピラリーカラムＧ − ＴＡ（0.25 mm(ID) ｘ ３０m(Length)）を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行なった。
その結果、得られたテトラヒドロフラン−２−カルボン酸は光学純度９９％ｅｅ 以上のＲ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸であった。
光学異性体の分析条件：カラム温度，１１０℃；検出器温度，２４０℃；キャリアーガス，窒素；流速，０．５ml/min；検出器，ＦＩＤ；スプリット比，1００／１；リテンションタイム：Ｒ体，８．２分；Ｓ体，９．１分
【００２４】
実施例２および３
実施例１において用いた微生物をバークホルデリア(Burkholderia) sp. DS-SK-ST4株、またはバークホルデリア(Burkholderia) sp. DS-SK-ST12株に代えた以外は実施例１と同様の方法で行った。
結果を以下に示す。
（表３）
実施例４
硫酸アンモニウム ０.２％
リン酸第２ナトリウム ０.０２％
リン酸第２カリウム ０.０２％
リン酸第１ナトリウム ０.０４％
硫酸マグネシウム ０.０５％
硫酸鉄 ０.００１％
硫酸銅 ０.０００１％
硝酸マンガン ０.０００１％
からなる組成の無機塩溶液に、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を４％（v/v）添加した培地１.０Ｌ（pH6.9）を入れた２Ｌ容培養器（ジャーファーメンター、ミツワ理化学社製、Model KMJ5B）を１２１℃、１５分間加圧蒸気滅菌し、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を単一炭素源とする完全合成培地を作製した。
次いでラルストニア(Ralstonia) sp. DS-SK-RT13株を予めペプトン、酵母エキス、グリセリン各１％ からなる栄養培地で３０℃、２４時間振盪培養し、この培養液４０ml（4％（v/v））を上記ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を単一炭素源とする完全合成培地に無菌的に接種した。そして以下の条件で３日間通気撹拌培養を行った。
温 度： ３０℃
通気量： ０．２Ｌ/min
回転数： ４００ｒｐｍ
【００２６】
なお、ｐＨの測定および制御は連動させたｐＨコントローラーを用いて行い、７.５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液あるいは２Ｎの塩酸によりｐＨ７．０〜７．５に制御した。また、本物質の定量ならび同定は実施例１と同様の方法により行った。
培養終了後の生育微生物の濁度は９．３ ＯＤ（660nmでの濁度）で、その時のテトラヒドロフラン−２−カルボン酸の残存率は４４％であった。培養液より遠心分離操作により生育した菌体を除去し、上清液を得た。上清液からのテトラヒドロフラン−２−カルボン酸の回収は実施例１と同様に行った。実施例１と同様の方法で本物質の光学純度を測定したところ、９９％ｅｅ以上のＲ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸であった。
【００２７】
実施例５および６
実施例４において用いた微生物をバークホルデリア(Burkholderia) sp. DS-SK-ST4株、あるいはバークホルデリア(Burkholderia) sp. DS-SK-ST12株に、培地中のラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を２％に、培養期間を２日間に代えた以外は実施例４と同様の方法で光学分割を行い、同様の方法で光学純度の測定を行った。
結果を以下に示す。
（表４）
実施例７および８
実施例４および５に記載の方法にて得た９９％e e 以上の光学活性体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸のシロップ１５０gに８等量のメタノールとの６ml硫酸を添加し、１１時間還流した。冷却後、水１５０mlとジクロロメタン５００mlとを加え、有機層を回収した。有機層を５％炭酸水素ナトリウム水溶液で中和、水洗した。有機層を回収し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、濃縮、蒸留を行い光学活性体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルを得た。
光学純度の測定は、得られたテトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルをアステック社製のキャピラリーカラムＧ−ＴＡ（0.25mm(ID) ｘ ３０m(Length)）を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行なった。
結果を以下に示す。この結果から明らかな通り、エステル化反応に付しても光学純度が低下することなく、高收率でエステル体が得られることが判明した。
（表５）
【００２９】
【発明の効果】
本発明によればラルストニア属またはバークホルデリア属に属する微生物、例えばラルストニア(Ralstonia) sp. DS-SK-RT13株、バークホルデリア(Burkholderia) sp. DS-SK-ST4株、バークホルデリア(Burkholderia) sp. DS-SK-ST12株を用い、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸からＲ体あるいはＳ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を優先的に資化分解させることにより、高光学的純度のＲ体あるいはＳ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を原料的に安価で、且つ工業的に簡便な方法によって製造することができ、さらに得られた光学活性体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸より光学活性体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸エステルを、光学純度を殆ど低下させずに合成することが可能である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention fractionates optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid from racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid using a microorganism having the ability to assimilate and proliferate using R-form or S-form tetrahydrofuran-2-carboxylic acid as a carbon source. And a method for producing an optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid ester obtained by esterifying the optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid obtained by the method.
The optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid and its ester obtained by the present invention are extremely important compounds as production intermediates in the production of optically active compounds such as pharmaceuticals, agricultural chemicals and physiologically active substances.
[0002]
[Prior art]
As a chemical production method of optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid, a method of optically resolving its racemate with an optically active amino acid amide derivative or optically active cis-1-aminoindan-2-ol as a resolving agent is known. ing. However, in order to obtain tetrahydrofuran-2-carboxylic acid with high optical purity by these production methods, an expensive resolving agent is required, which is not an industrially economical production method.
[0003]
On the other hand, regarding biological production methods, esterification enzymes derived from microorganisms and animals are allowed to act on racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid ester, and then tetrahydrofuran-2-carboxylic acid and its enantiomer ester are subjected to stereoselective hydrolysis. [Patent Document 1, Patent Document 2] is known. However, in this production method, it is necessary to purchase an expensive enzyme, and an industrially cheaper and simple production method is desired.
[0004]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Laid-Open No. 2002-171994 [Patent Document 2]
International Publication No. 01/92554 Pamphlet [0005]
The present inventors have the ability to preferentially assimilate R-form or S-form tetrahydrofuran-2-carboxylic acid from racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid, and further convert the optical isomer into a single carbon source. As a result of searching for microorganisms capable of assimilating and proliferating as a result of intensive studies, the present inventors have succeeded in isolating the target microorganisms and have completed the present invention.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to efficiently and economically produce an optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid having a high optical purity.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has the ability to assimilate one optical isomer of tetrahydrofuran-2-carboxylic acid, that is, the present invention has the ability to assimilate R-form or S-form tetrahydrofuran-2-carboxylic acid. A microorganism belonging to the genus Ralstonia or Burkholderia that can grow as a single carbon source or its cultured cells is cultured in a medium containing racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid as a single carbon source. A process for producing an optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid characterized in that the optical isomer is assimilated and the remaining optical isomer is fractionated, and an optically active tetrahydrofuran- The present invention relates to a method for synthesizing an optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid ester by esterifying 2-carboxylic acid.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
First, a microorganism used in the present invention (hereinafter abbreviated as “the present microorganism”) is preliminarily cultured in a commonly used nutrient medium to prepare seed cells.
[0009]
Subsequently, the culture or microbial cell obtained from this preculture is inoculated into a medium containing racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid as a single carbon source, cultured, and optically active tetrahydrofuran-2 remaining from the culture solution. -Fractionate the carboxylic acid.
The main culture is preferably performed within the optimum pH and temperature range. For example, the pH is 5 to 9, preferably around pH 7, and the culture temperature is 15 to 50 ° C, preferably 20 to 37 ° C. If the pH in the culture solution gradually decreases or rises as the assimilation reaction of racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid proceeds, the pH in the culture solution can be increased by adding an appropriate alkali source or acid source. Must be controlled within the optimum range.
[0010]
For example, alkali sources include calcium carbonate solution, sodium carbonate solution, potassium carbonate, ammonium carbonate aqueous solution such as potassium carbonate, ammonium hydroxide aqueous solution, sodium hydroxide aqueous solution, potassium hydroxide aqueous solution, calcium hydroxide aqueous solution, etc. alkali hydroxide aqueous solution, ammonia aqueous solution For example, hydrochloric acid, phosphoric acid or the like, which can usually neutralize an acid or alkali, is preferably used to control the pH within an optimum range.
[0011]
The substrate concentration of racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid as a single carbon source in the culture solution is preferably 0.1 to 15% (v / v), and the substrate may be added all at once in the initial stage (batch (Cultivation method) or divided addition (fed-batch culture method). It is also possible to perform a continuous culture method.
The culture medium should include inorganic nitrogen compounds such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, and ammonium phosphate, and organic nitrogen compounds such as urea, peptone, casein, yeast extract, meat extract, corn steep liquor and mixtures thereof as nitrogen sources. Can do. In addition, vitamins such as phosphates, magnesium salts, potassium salts, manganese salts, iron salts, zinc salts, copper salts and the like may be further added as necessary.
The culture is usually performed aerobically using a method such as stirring or shaking or aeration stirring culture. The culture time varies depending on the substrate concentration and other culture conditions, but the culture time is preferably 24 to 120 hours. Preferably, the culture is terminated when the residual group mass of the racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid is 50% of the initial substrate concentration by analysis such as gas chromatography, or the optical purity of the target optically active substance is measured. It is better to determine the end point. In other words, the culture is preferably stopped when the R-form or S-form tetrahydrofuran-2-carboxylic acid in the racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid as the substrate is completely decomposed.
[0012]
Thus, the optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid remaining in the culture solution can be recovered and purified by a general method. For example, after removing the cells from the culture solution by centrifugation, an acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid and a solvent such as ethyl acetate, toluene, dichloromethane, or a mixture thereof are added to the supernatant, and the water tank and the oil layer are separated. . Subsequently, an optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid with high optical purity can be efficiently obtained by separating the oil layer and using a well-known technique. Further, it may be recrystallized from an appropriate salt compound.
In order to carry out the present invention, the present microorganism is directly inoculated into a medium containing racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid as a single carbon source without preparing a seed cell in advance, and the same method as above The target optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid may be recovered.
The optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid ester can be produced by esterifying the optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid obtained by the above method by a conventional method.
This esterification may be carried out by reacting with a desired alcohol, preferably under a sulfuric acid catalyst, followed by extraction using a suitable solvent such as ethyl acetate and purification by distillation. This esterification hardly reduces the optical purity of the target product.
[0013]
As a medium composition for pre-culturing the present microorganism, any medium can be used as long as it is a medium on which the present microorganism normally grows.
For example, racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid, carbohydrates such as glucose and fructose, organic acids such as acetic acid, citric acid, malic acid, maleic acid, fumaric acid, gluconic acid and salts thereof, or a mixture thereof are used as a carbon source. be able to. Examples of the nitrogen source include inorganic nitrogen compounds such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, and ammonium phosphate, and organic nitrogen compounds such as urea, peptone, casein, yeast extract, meat extract, corn steep liquor, and mixtures thereof. In addition, vitamins such as phosphates, magnesium salts, potassium salts, manganese salts, iron salts, zinc salts, copper salts and the like may be further added as necessary.
Moreover, you may use nutrient media, such as a peptone culture medium and a bouillon culture medium, or these culture media which added racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid.
Culture may be carried out by a conventional method, for example, using a method such as shaking culture or aeration-agitation culture at a pH of 5 to 9, preferably around pH 7, and a culture temperature of 15 to 50 ° C., preferably 20 to 37 ° C. Aerobically for 20 to 96 hours.
[0014]
The microorganism has the ability to assimilate R-form or S-form tetrahydrofuran-2-carboxylic acid as described above, and can assimilate and proliferate using the optical isomer as a single carbon source. It is a microorganism belonging to Preferred strains include Ralstonia sp. DS-SK-RT13 strain, Burkholderia sp. DS-SK-ST4 strain, Burkholderia sp. DS-SK-ST12 strain. it can.
[0015]
The above strains were identified as microbial microorganisms belonging to the genus Ralstonia or Burkholderia based on morphological and physiological characterization tests and 16S rRNA nucleotide sequence analysis, and the following domestic deposit numbers were assigned to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. It has been deposited.
Ralstonia sp. DS-SK-RT13 strain: Domestic deposit number FERM P-19113.
Burkholderia sp. DS-SK-ST4 strain: Domestic deposit number FERM P-19114.
Burkholderia sp. DS-SK-ST12 strain: Domestic deposit number FERM P-19115.
[0016]
In addition, the said strain is a new strain not described in the literature, and its morphological and physiological properties are described below.
(Table 1)
(Table 2)
In the optical resolution method of the present invention, when a completely synthetic medium using racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid as a single carbon source is used, it is less likely to be contaminated by various bacteria, and purification of the target product is easy. is there.
In addition, since the microorganism of the present invention completely assimilates the R-form or S-form tetrahydrofuran-2-carboxylic acid from the racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid, the optically active tetrahydrofuran- remaining in the culture broth after the culture is completed. Since it does not remain other than 2-carboxylic acid and growing cells, the downstream of the recovery process is very simple.
[0019]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. In the examples,% indicates% (w / v) unless otherwise specified.
[0020]
Example 1
Into a 500 ml baffled Erlenmeyer flask containing a liquid nutrient medium 100 ml (pH 7.2) consisting of glycerin 10 g / L, yeast extract 10 g / L, and peptone 10 g / L autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. One platinum loop of Ralstonia sp. DS-SK-RT13 strain grown on a nutrient medium plate was inoculated and cultured at 30 ° C. for 24 hours to obtain a seed culture solution.
[0021]
Ammonium sulfate 0.2%
Disodium phosphate 0.02%
Dibasic potassium phosphate 0.02%
Monobasic sodium phosphate 0.04%
Magnesium sulfate 0.05%
Iron sulfate 0.001%
Copper sulfate 0.0001%
Manganese nitrate 0.0001%
Calcium carbonate 0.5%
Racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid 1.0% (v / v)
A 500 ml baffled Erlenmeyer flask containing 100 ml (pH 6.9) of the composition consisting of the following is autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes to complete the racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid as a single carbon source. A synthetic medium was prepared.
The completely synthetic medium was aseptically inoculated with 1 ml of the seed culture and cultured for 2 days under shaking at 30 ° C. and 130 rpm.
[0022]
As a result, the turbidity of the microorganisms grown in the medium was 3.0 OD (turbidity at 660 nm), and the tetrahydrofuran-2-carboxylic acid remaining in the culture medium at that time was subjected to gas chromatography (column carrier: PEG 20M , 60-80 mesh), the residual ratio was 35%. After completion of the culture, the culture broth was taken out and the cells were removed by centrifugation to obtain a supernatant. The supernatant was concentrated with an evaporator and extracted with ether. Subsequently, after dehydration with anhydrous magnesium sulfate, ether was removed under reduced pressure to obtain a tetrahydrofuran-2-carboxylic acid syrup.
[0023]
The optical purity of this substance was measured by placing 50 mg of the obtained tetrahydrofuran-2-carboxylic acid optical isomer syrup in a 30 ml Erlenmeyer flask, cooling with ice, 105 mg of 4-dimethylaminopyridine, 10 ml of dichloromethane, After adding 100 μl of hydrochloric acid saturated ethanol and 99 mg of 1-ethyl 3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, the mixture was stirred for about 10 minutes, then capped and stirred overnight at room temperature. The organic layer was washed twice with 1N hydrochloric acid, the solvent was removed with a desiccator and converted into ethyl tetrahydrofuran-2-carboxylate, and then capillary column G-TA (0.25 mm (ID) x 30 m (Length The optical isomers were analyzed by gas chromatography using)).
As a result, the obtained tetrahydrofuran-2-carboxylic acid was R-form tetrahydrofuran-2-carboxylic acid having an optical purity of 99% ee or higher.
Optical isomer analysis conditions: column temperature, 110 ° C .; detector temperature, 240 ° C .; carrier gas, nitrogen; flow rate, 0.5 ml / min; detector, FID; split ratio, 100/1; , 8.2 minutes; S body, 9.1 minutes
Examples 2 and 3
The same method as in Example 1 except that the microorganism used in Example 1 was replaced with Burkholderia sp. DS-SK-ST4 strain or Burkholderia sp. DS-SK-ST12 strain I went there.
The results are shown below.
(Table 3)
Example 4
Ammonium sulfate 0.2%
Disodium phosphate 0.02%
Dibasic potassium phosphate 0.02%
Monobasic sodium phosphate 0.04%
Magnesium sulfate 0.05%
Iron sulfate 0.001%
Copper sulfate 0.0001%
Manganese nitrate 0.0001%
A 2 L incubator (jar fermenter, Mitsuwa Riken) containing 1.0 L (pH 6.9) of a medium supplemented with 4% (v / v) racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid in an inorganic salt solution having the following composition: Model KMJ5B) manufactured by the company was autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes to prepare a completely synthetic medium using racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid as a single carbon source.
Next, Ralstonia sp. DS-SK-RT13 strain was shaken and cultured in a nutrient medium consisting of 1% each of peptone, yeast extract and glycerin at 30 ° C. for 24 hours, and 40 ml of this culture solution (4% (v / v) ) Was aseptically inoculated into a complete synthetic medium containing the racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid as a single carbon source. Then, aeration and agitation culture was performed for 3 days under the following conditions.
Temperature: 30 ° C
Aeration rate: 0.2L / min
Rotation speed: 400rpm
[0026]
The pH was measured and controlled using an interlocked pH controller, and the pH was controlled to 7.0 to 7.5 with a 7.5N aqueous sodium hydroxide solution or 2N hydrochloric acid. In addition, the substance was quantitatively identified and identified by the same method as in Example 1.
The turbidity of the growing microorganism after completion of the culture was 9.3 OD (turbidity at 660 nm), and the residual ratio of tetrahydrofuran-2-carboxylic acid at that time was 44%. The cells grown by centrifugation were removed from the culture solution to obtain a supernatant. Recovery of tetrahydrofuran-2-carboxylic acid from the supernatant was carried out in the same manner as in Example 1. When the optical purity of this substance was measured in the same manner as in Example 1, it was 99% ee or more of R-form tetrahydrofuran-2-carboxylic acid.
[0027]
Examples 5 and 6
The microorganism used in Example 4 was added to Burkholderia sp. DS-SK-ST4 strain or Burkholderia sp. DS-SK-ST12 strain to racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid in the medium. Optical resolution was performed in the same manner as in Example 4 except that the acid was changed to 2% and the culture period was changed to 2 days, and optical purity was measured in the same manner.
The results are shown below.
(Table 4)
Examples 7 and 8
6 ml sulfuric acid with 8 equivalents of methanol was added to 150 g of syrup of 99% ee or higher optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid obtained by the method described in Examples 4 and 5, and refluxed for 11 hours. After cooling, 150 ml of water and 500 ml of dichloromethane were added to recover the organic layer. The organic layer was neutralized with 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution and washed with water. The organic layer was collected, dehydrated with anhydrous sodium sulfate, concentrated and distilled to obtain optically active methyltetrahydrofuran-2-carboxylate.
Optical purity is measured by analyzing optical isomers by gas chromatography using Astech's capillary column G-TA (0.25 mm (ID) x 30 m (Length)). I did it.
The results are shown below. As is clear from this result, it was found that the ester body can be obtained at a high yield without deteriorating the optical purity even when subjected to the esterification reaction.
(Table 5)
【The invention's effect】
According to the present invention, microorganisms belonging to the genus Ralstonia or Burkholderia, such as Ralstonia sp. DS-SK-RT13 strain, Burkholderia sp. DS-SK-ST4 strain, Burkholderia (Burkholderia) ) Highly optically pure R form by preferentially assimilating R form or S form tetrahydrofuran-2-carboxylic acid from racemic tetrahydrofuran-2-carboxylic acid using sp. DS-SK-ST12 strain Alternatively, S-form tetrahydrofuran-2-carboxylic acid can be produced by a raw material at an inexpensive and industrially simple method, and optically active tetrahydrofuran-2 from the obtained optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid. -Carboxylic acid esters can be synthesized with almost no reduction in optical purity.
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