CH654113A5 - METHODS AND REAGENTS FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION OF DIFFERENT MARKERS OF HEPATITIS. - Google Patents
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Description
La présente invention concerne un procédé pour la détection simultanée dans un échantillon d'au moins deux marqueurs différents prouvant l'exposition au virus de l'hépatite, ainsi que deux réactifs pour la mise en œuvre dudit procédé. The present invention relates to a method for the simultaneous detection in a sample of at least two different markers proving exposure to the hepatitis virus, as well as two reagents for the implementation of said method.
Il existe au moins deux types distincts d'hépatites virales. On considère que l'hépatite A est provoquée par l'antigène de l'hépatite A (HAVAg) et elle est généralement caractérisée par une période d'incubation de 2 à 6 semaines, des prodromes modérés et une atteinte clinique relativement peu importante. La maladie est généralement transmise par des aliments ou des boissons contaminés mais on a également montré qu'elle était transmise par inoculation générale. On appelle souvent l'hépatite A hépatite infectieuse, et aux Etats-Unis d'Amérique le nombre des cas signalés est supérieur à 50 000 par an. There are at least two distinct types of viral hepatitis. Hepatitis A is considered to be caused by the hepatitis A antigen (HAVAg) and is generally characterized by an incubation period of 2 to 6 weeks, moderate prodromes and relatively minor clinical impairment. The disease is usually transmitted by contaminated food or drink, but it has also been shown to be transmitted by general inoculation. Hepatitis A is often called infectious hepatitis, and in the United States of America the number of cases reported exceeds 50,000 per year.
On considère que le virus de l'hépatite B est l'agent étiologique le plus probable de l'hépatite sérique. L'hépatite B est généralement transmise par le sang et ses dérivés ou des instruments contaminés tels que des aiguilles, mais elle peut également être transmise d'une autre façon. On a indiqué autrefois que la période d'incubation de l'hépatite B était comprise entre 6 semaines et 6 mois. Cependant on a confirmé des périodes d'incubation aussi brèves que 2 semaines. La maladie peut être modérée ou asymptomatique mais lorsque des symptômes sont présents ils peuvent être particulièrement graves. Parmi les prodromes figurent les douleurs articulaires, l'arthrite, une éruption transitoire, la fièvre, l'anorexie, la fatigue et le prurit associés ou non à un ictère. The hepatitis B virus is considered to be the most likely etiological agent of serum hepatitis. Hepatitis B is usually transmitted by blood and its derivatives or contaminated instruments such as needles, but it can also be transmitted in another way. In the past, the incubation period for hepatitis B has been reported to be between 6 weeks and 6 months. However, incubation periods as short as 2 weeks have been confirmed. The disease can be moderate or asymptomatic but when symptoms are present they can be particularly severe. Prodromes include joint pain, arthritis, transient rash, fever, anorexia, fatigue, and pruritus with or without jaundice.
On peut associer au virus de l'hépatite B au moins trois systèmes antigènes-anticorps distincts: le système de surface (HBsAg: anti-HBS), le système de noyau (HBcAg: anti-HBc) et le système e (HBeAg: anti-HB,.). L'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg) est présent dans le sang sous forme de sphères de 22 nm et de tubules allongés de 22 nm de diamètre et de longueur variable et il semble représenter le revêtement protéique du virus de l'hépatite B. The hepatitis B virus can be associated with at least three distinct antigen-antibody systems: the surface system (HBsAg: anti-HBS), the nucleus system (HBcAg: anti-HBc) and the e system (HBeAg: anti -HB ,.). The hepatitis B surface antigen (HBsAg) is present in the blood in the form of 22 nm spheres and elongated 22 nm tubules of variable diameter and length and appears to represent the protein coating of the virus. Hepatitis B.
On considère que le virus infectieux (particules de Dane) consiste en une particule de 42 nm contenant de l'ADN et une ADN-polymé-rase. La surface de la particule de Dane est semblable ou identique à l'HBsAg. Dans les détergents, la particule de Dane se dégrade en un noyau à forte densité électronique de 27 nm constituant l'HBcAg. Cet antigène est présent dans les noyaux des hépatocytes des patients atteints d'hépatite sérique pendant le stade d'infection aiguë. The infectious virus (Dane particles) is considered to consist of a 42 nm particle containing DNA and a DNA polymerase. The surface of the Dane particle is similar or identical to HBsAg. In detergents, the Dane particle degrades into a nucleus with a high electron density of 27 nm constituting HBcAg. This antigen is present in the nuclei of hepatocytes of patients with serum hepatitis during the stage of acute infection.
Donc on peut prévoir que les patients atteints d'hépatite virale de type B produisent des anticorps dirigés contre l'antigène de surface (anti-HBs) et également contre le noyau protéique (anti-HBC). L'HBsAg du sérum s'est révélé un marqueur fidèle de la présence du virus de l'hépatite B et l'anti-HBc apparaît généralement lors de la virémie précoce, qui accompagne souvent l'antigénémie (HBsAg), à l'apogée du disfonctionnement hépatique et bien avant l'apparition de l'anti-HBs. L'anti-HBC est généralement associé à la circulation prolongée de l'HBsAg, ce qui suggère que l'anti-HBc est produit en réponse à la réplication active du virus. So we can expect that patients with type B viral hepatitis produce antibodies against the surface antigen (anti-HBs) and also against the protein nucleus (anti-HBC). Serum HBsAg has been shown to be a reliable marker for the presence of the hepatitis B virus, and anti-HBc generally appears during early viremia, which often accompanies antigenemia (HBsAg), at its peak liver dysfunction and well before the appearance of anti-HBs. Anti-HBC is generally associated with prolonged circulation of HBsAg, suggesting that anti-HBc is produced in response to active replication of the virus.
En 1972, l'antigène e de l'hépatite (HBeAg) a été détecté et caractérisé. Le marqueur e a été trouvé dans le sérum HBsAg-positif et semble être plus couramment présent dans le sérum de porteurs In 1972, the hepatitis e antigen (HBeAg) was detected and characterized. The e marker was found in HBsAg-positive serum and appears to be more commonly present in carrier serum
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chroniques de l'HBsAg ayant une atteinte hépatique active que chez les porteurs sains. Chez les patients, pendant la période d'incubation de l'hépatite B, l'antigène e apparaît juste après l'apparition de l'HBsAg et avant les manifestations cliniques de l'atteinte hépatique. Logiquement, sa présence dans de tels sérums indiquerait un mauvais pronostic et une altération hépatique en cours d'évolution. Inversement, la présence d'anticorps e (anti-HBe) indiquerait un bon pronostic. Ces corrélations ne sont pas absolues mais peuvent constituer des guides cliniques utiles. chronic HBsAg with active liver damage only in healthy carriers. In patients, during the incubation period of hepatitis B, the e antigen appears just after the appearance of HBsAg and before the clinical manifestations of liver damage. Logically, its presence in such sera would indicate a poor prognosis and liver damage during evolution. Conversely, the presence of e (anti-HBe) antibodies would indicate a good prognosis. These correlations are not absolute but can constitute useful clinical guides.
Comme les marqueurs sérologiques de l'hépatite apparaissent dans un ordre déterminé régulier au cours de l'infection, de la période aiguë et de la guérison, l'analyse de deux marqueurs ou plus peut être utile pour évaluer l'évolution de la maladie. Since the serological markers of hepatitis appear in a regular order determined during infection, the acute period and recovery, the analysis of two or more markers can be useful to assess the course of the disease.
Une détermination de plusieurs marqueurs peut également de façon importante permettre un double contrôle de l'HBsAg chez les donneurs de sang ou les patients et permettre ainsi de réduire la fréquence de l'hépatite B. Cette nécessité a été établie par Goldfield et coll., «Am. J. Med. Sci.», 270, 335-342 (1975) qui, au cours de postobservations minutieuses de receveurs de sang HBsAg négatifs, ont démontré l'exposition à l'antigène de l'hépatite chez 7 patients sur 465. Il est évident qu'un procédé pour détecter plus d'un marqueur du virus de l'hépatite B aurait réduit ou évité ces réactions faussement négatives. De même dans de nombreux cas, une réponse positive dans deux tests réduit au minimum les risques d'une réaction faussement positive dans un test. A determination of several markers can also significantly allow dual control of HBsAg in blood donors or patients and thus make it possible to reduce the frequency of hepatitis B. This need has been established by Goldfield et al., "Am. J. Med. Sci. ”, 270, 335-342 (1975) who, during careful post-observation of HBsAg negative blood recipients, demonstrated exposure to the hepatitis antigen in 7 out of 465 patients. It is evident that a method to detect more than one hepatitis B virus marker would have reduced or avoided these false negative reactions. Similarly, in many cases, a positive response in two tests minimizes the risk of a false positive reaction in one test.
Bien que le réactif et le procédé décrits et revendiqués soient semblables aux produits et aux procédés connus du commerce pour la détection de divers marqueurs de l'hépatite virale, on ne connaissait pas avant l'invention de description ou de suggestion concernant des techniques pour détecter simultanément ces marqueurs. Although the reagent and method described and claimed are similar to known commercial products and methods for the detection of various markers of viral hepatitis, no description or suggestion of techniques for detecting was known before the invention. simultaneously these markers.
L'invention concerne un procédé et des réactifs pour détecter simultanément dans un échantillon au moins deux marqueurs différents prouvant l'exposition au virus de l'hépatite. The invention relates to a method and reagents for simultaneously detecting in a sample at least two different markers demonstrating exposure to the hepatitis virus.
Le procédé consiste à mettre l'échantillon en contact avec une phase solide que l'on a revêtue d'au moins deux composés immunoréagissants non complémentaires, différents, qui sont complémentaires des marqueurs inconnus de l'hépatite, à incuber l'échantillon avec la phase solide revêtue pendant une période de 1 à 24 h, à séparer la phase solide revêtue de l'échantillon, à laver la phase solide revêtue, à mettre la phase solide lavée en contact avec un réactif liquide constitué d'au moins deux composés immunoréagissants différents ou d'au moins deux marqueurs de l'hépatite différents, choisis chacun de façon à réagir ou à entrer en compétition avec un des marqueurs inconnus de l'hépatite et marqués chacun avec des marques pouvant être détectées de façon distincte, à séparer la phase solide du réactif liquide et à déterminer la présence des marqueurs de l'hépatite marqués ou des composés immunoréagissants marqués sur la phase solide par détection de chaque marque distincte. The method consists in bringing the sample into contact with a solid phase which has been coated with at least two different non-complementary immunoreactive compounds, which are complementary to the unknown markers of hepatitis, in incubating the sample with the coated solid phase for a period of 1 to 24 h, to separate the coated solid phase from the sample, to wash the coated solid phase, to put the washed solid phase in contact with a liquid reagent consisting of at least two immunoreactive compounds different or at least two different markers of hepatitis, each chosen to react or to compete with one of the unknown markers of hepatitis and each marked with marks that can be detected separately, to separate the solid phase of the liquid reagent and to determine the presence of the marked hepatitis markers or of the marked immunoreactive compounds on the solid phase by detection of each distinct mark.
Les exemples non limitatifs suivants illustrent la préparation et l'emploi du réactif selon l'invention. Le premier exemple décrit le procédé de préparation d'un support solide revêtu de deux composés immunoréagissants non complémentaires différents, qui sont complémentaires de marqueurs prouvant l'exposition au virus de l'hépatite. The following nonlimiting examples illustrate the preparation and use of the reagent according to the invention. The first example describes the process for preparing a solid support coated with two different non-complementary immunoreactive compounds, which are complementary to markers proving exposure to the hepatitis virus.
Plus particulièrement, on revêt un support solide (perles) de deux composés immunoréagissants différents non complémentaires de telle sorte que ces deux composés conservent leur réactivité et soient capables de se combiner à des marqueurs de l'hépatite complémentaires dans un échantillon inconnu. More particularly, a solid support (pearls) is coated with two different non-complementary immunoreactive compounds so that these two compounds retain their reactivity and are able to combine with complementary hepatitis markers in an unknown sample.
Dans le premier exemple, on revêt des perles de polystyrène d'un anticorps dirigé contre l'HBsAg et de l'antigène de noyau HBcAg. L'anticorps conserve son affinité et réagit avec tout HBsAg de l'échantillon inconnu et l'antigène de noyau fixé conserve son antigé-nicité et réagit avec tout anticorps dirigé contre le noyau (anti-HBc) de l'échantillon inconnu. La base de l'invention est que les deux réactions immunologiques s'effectuent simultanément avec un seul réactif en phase solide. In the first example, polystyrene beads are coated with an antibody directed against HBsAg and with the core antigen HBcAg. The antibody retains its affinity and reacts with any HBsAg from the unknown sample and the attached nucleus antigen retains its antigenicity and reacts with any antibody directed against the nucleus (anti-HBc) of the unknown sample. The basis of the invention is that the two immunological reactions are carried out simultaneously with a single solid phase reagent.
Exemple 1 : Example 1:
Préparation d'un support revêtu Preparation of a coated support
Pour préparer une composition de HBcAg, on met des particules de Dane en contact avec une solution à 2% de mercapto-2 éthanol (2-ME) et 5% de Tween 80 dans du tampon salé au Tris-EDTA (TSE) à 37° C pendant 2 h. On dilue cette solution au Vio dans du 2-ME à 5% dans le TSE et on laisse reposer pendant une nuit avant de diluer à la concentration finale de Vbooo dans du TSE. Séparé-0 ment, on revêt des perles de polystyrène (6,35 mm) avec une dilution au Vzoao de sérum de cobaye anti-HBs dans du tampon salé phosphaté (PBS) par trempage pendant 2 h. On retire les perles, on les lave et on les sèche. On verse ensuite la préparation de noyau sur les perles revêtues et on laisse l'antigène de noyau adhérer aux perles ls pendant 2 d à la température ordinaire. On retire les perles de la solution tampon, on lave, on revêt d'une solution à 10% de saccharose pour stabiliser les composés adhérents et on sèche à l'air. To prepare an HBcAg composition, Dane particles are brought into contact with a 2% solution of 2-mercapto-ethanol (2-ME) and 5% of Tween 80 in 37 Tris-EDTA salt buffer (TSE) ° C for 2 h. This solution is diluted with Vio in 5% 2-ME in TSE and left to stand overnight before diluting to the final concentration of Vbooo in TSE. Separately, polystyrene beads (6.35 mm) are coated with a Vzoao dilution of anti-HBs guinea pig serum in phosphate buffered saline (PBS) by soaking for 2 h. The pearls are removed, washed and dried. The core preparation is then poured onto the coated beads and the core antigen is allowed to adhere to the ls beads for 2 d at room temperature. The beads are removed from the buffer solution, washed, coated with a 10% sucrose solution to stabilize the adherent compounds and air dried.
Bien que l'on préfère des perles de polystyrène car elles sont faciles à revêtir et à manipuler, on peut utiliser dans la pratique de 20 l'invention tout support solide de dimensions macroscopiques ou microscopiques fait en diverses matières plastiques, en métal ou en verre pouvant être facilement revêtu et utilisé. Although polystyrene beads are preferred because they are easy to coat and handle, any solid support of macroscopic or microscopic dimensions made of various plastics, metal or glass can be used in the practice of the invention. can be easily coated and used.
Bien que l'on puisse revêtir d'abord les perles de l'antigène de noyau puis les revêtir ensuite de l'anti-HBs, on a constaté que lors-2S qu'on revêt d'abord les perles du sérum de cobaye anti-HBs, l'adhérence de l'antigène de noyau est fortement accrue. Although the beads can be coated first with the core antigen and then coated with the anti-HBs, it has been found that when the beads are first coated with the anti guinea pig serum -HBs, the adhesion of the nucleus antigen is greatly increased.
Il est également important de noter que l'on peut également utiliser d'autres combinaisons de composés immunoréagissants non complémentaires relatifs au virus de l'hépatite. Bien entendu les 30 composés immunoréagissants doivent être non complémentaires car une attraction complémentaire réduirait l'antigénicité et l'affinité du réactif. It is also important to note that other combinations of non-complementary immunoreactive compounds relating to the hepatitis virus can also be used. Of course, the immunoreactive compounds must be non-complementary since a complementary attraction would reduce the antigenicity and the affinity of the reagent.
L'exemple suivant illustre la préparation d'un réactif en phase liquide contenant comme composé immunoréagissant de ranti-HBs, 3J marqué avec un marqueur radioactif (12SI) et un marqueur de l'hépatite, l'anti-HBc, marqué par une enzyme réactive (peroxydase de raifort). The following example illustrates the preparation of a liquid phase reagent containing, as immunoreactive compound, ranti-HBs, 3J labeled with a radioactive marker (12SI) and a hepatitis marker, the anti-HBc, labeled with an enzyme reactive (horseradish peroxidase).
Bien que les termes marqueur de l'hépatite et composé immunoréagissant puissent être utilisés l'un pour l'autre, on préfère utiliser le 40 terme marqueur de l'hépatite pour désigner l'antigène ou l'anticorps et leurs équivalents que l'on désire détecter dans l'échantillon inconnu. On utilise le terme composé immunoréagissant pour désigner l'antigène ou l'anticorps complémentaires des marqueurs de l'hépatite à détecter. Although the terms hepatitis marker and immunoreactive compound can be used interchangeably, it is preferred to use the term hepatitis marker to denote the antigen or antibody and their equivalents as wants to detect in the unknown sample. The term immunoreactive compound is used to denote the antigen or antibody complementary to the hepatitis markers to be detected.
45 Par conséquent, dans les exemples suivants, l'antigène et l'anticorps utilisés sur le support solide sont toujours complémentaires d'un des marqueurs inconnus de l'hépatite et par conséquent on les appelle composés immunoréagissants. 45 Consequently, in the following examples, the antigen and the antibody used on the solid support are always complementary to one of the unknown markers of hepatitis and therefore they are called immunoreactive compounds.
Dans le réactif en phase liquide, l'anticorps de surface marqué 50 est complémentaire du marqueur inconnu de l'hépatite (HBsAg) et on l'appelle donc composé immunoréagissant marqué. Cependant, l'anticorps de noyau marqué est identique au marqueur de l'hépatite à détecter et par conséquent on l'appelle marqueur de l'hépatite marqué. In the liquid phase reagent, the labeled surface antibody 50 is complementary to the unknown hepatitis marker (HBsAg) and is therefore called the labeled immunoreactive compound. However, the labeled nucleus antibody is identical to the hepatitis marker to be detected and therefore is called the labeled hepatitis marker.
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Exemple 2: Example 2:
Anticorps marqué réactif Reactive labeled antibody
Pour ioder par le 12SI l'anticorps dirigé contre l'HBsAg (anti-60 HBS), on introduit dans un flacon de 4 ml environ 0,1 ml de tampon phosphate 0,5M à pH 7,5, un petit volume correspondant à 5-6 mCi de Na12SI, et 100,mg d'anti-Hbs purifié, on ajuste le pH à 7,5-8,0 et on mélange tous les ingrédients. On ajoute à ce mélange 50 p.1 d'une solution fraîchement préparée de chloramine T (35 mg dans 10 ml de 65 tampon phosphate 0,05M à pH 7,5). On mélange à nouveau puis on laisse la réaction s'effectuer à la température ordinaire pendant 60 s. On ajoute à la réaction 50 ni d'une solution fraîchement préparée de métasulfite de sodium (35 mg dans 10 ml de tampon phosphate To iodine the antibody directed against HBsAg (anti-60 HBS) with 12SI, about 0.1 ml of 0.5M phosphate buffer at pH 7.5 is introduced into a 4 ml flask, a small volume corresponding to 5-6 mCi of Na12SI, and 100 mg of purified anti-Hbs, the pH is adjusted to 7.5-8.0 and all the ingredients are mixed. 50 p.1 of a freshly prepared solution of chloramine T (35 mg in 10 ml of 65 0.05 M phosphate buffer at pH 7.5) are added to this mixture. The mixture is again mixed and then the reaction is allowed to take place at room temperature for 60 s. 50 μl of a freshly prepared solution of sodium metasulfite (35 mg in 10 ml of phosphate buffer is added to the reaction.
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0,05M à pH 7,5) pour réduire la chloramine T et arrêter ainsi la réaction. 0.05M at pH 7.5) to reduce chloramine T and thus stop the reaction.
Pour évaluer le rendement de la réaction, on applique 5 ni du mélange réactionnel à une bande de papier Whatman N° 1 et on Chromatographie le mélange dans du méthanol à 70%. La protéine iodée demeure à l'origine tandis que le 12SI libre migre avec le solvant. On considère que le pourcentage de 125I dans la protéine constitue le pourcentage de rendement de la réaction. To evaluate the reaction yield, 5 µl of the reaction mixture is applied to a Whatman # 1 paper strip and the mixture is chromatographed in 70% methanol. The iodine protein remains at the origin while the free 12SI migrates with the solvent. The percentage of 125I in the protein is considered to constitute the percentage yield of the reaction.
On purifie l'anticorps iodé brut avec une colonne de gel de Se-phadex G-50 et du tampon Tris 0,1M contenant 0,9% de chlorure de sodium à pH 7,8. On traite au préalable la colonne avec un petit volume d'une solution aqueuse à 30% de sérum albumine bovine puis avec un volume additionnel égal de tampon Tris 0,1 M contenant 0,9% de chlorure de sodium à pH 7,8. On place l'anticorps iodé au sommet de la colonne et on lave avec le tampon Tris salé. L'anticorps marqué consitue le premier éluat que l'on recueille en bas de la colonne. The crude iodinated antibody is purified with a column of Se-phadex G-50 gel and 0.1 M Tris buffer containing 0.9% sodium chloride at pH 7.8. The column is treated beforehand with a small volume of a 30% aqueous solution of bovine serum albumin and then with an equal additional volume of 0.1 M Tris buffer containing 0.9% sodium chloride at pH 7.8. The iodized antibody is placed at the top of the column and washed with salty Tris buffer. The labeled antibody constitutes the first eluate which is collected at the bottom of the column.
Pour conjuguer l'anticorps dirigé contre le noyau de l'hépatite B à la peroxydase de raifort, on active la peroxydase avec du métaper-iodate de sodium. On sépare l'excès de periodate et les sous-produits de la peroxydase active par filtration sur une colonne de gel de Se-phadex G-25. On fait ensuite réagir la peroxydase activée avec l'anticorps (anti-HBc). La réaction est spontanée. On ajoute ensuite du borohydrure de sodium pour stabiliser la liaison formée entre la peroxydase et l'anticorps et on ajoute de l'acétone pour détruire le borohydrure de sodium résiduel. To conjugate the antibody against the hepatitis B nucleus with horseradish peroxidase, peroxidase is activated with sodium metaper-iodate. The excess periodate and the by-products of the active peroxidase are separated by filtration on a column of Se-phadex G-25 gel. The activated peroxidase is then reacted with the antibody (anti-HBc). The reaction is spontaneous. Sodium borohydride is then added to stabilize the bond formed between the peroxidase and the antibody and acetone is added to destroy the residual sodium borohydride.
Lorsqu'on les utilise selon l'invention, on dilue les deux anticorps marqués dans un diluant ayant la composition suivante: When they are used according to the invention, the two labeled antibodies are diluted in a diluent having the following composition:
sérum fœtal de veau 50% calf fetal serum 50%
sérum humain normal 15% normal human serum 15%
EDTA 0,005M Tween-20 0,1% EDTA 0.005M Tween-20 0.1%
Thiomersal dans le PBS 0,01 % Thiomersal in PBS 0.01%
Il est évident que l'on peut utiliser diverses marques détectables. La seule condition est naturellement que ces marques puissent être détectées de façon distincte. On peut utiliser divers isotopes tout aussi aisément que le 12SI. Il n'est pas nécessaire qu'un des marqueurs de l'hépatite ou composé immunoréagissant ait un marquage radioactif et que l'autre ait un marquage enzymatique ou fluorescent car des isotopes différents peuvent être détectés de façon distincte. De même, tous les composants marqués du réactif peuvent aussi bien être marqués par des enzymes différents nécessitant des subs-5 trats différents pour former des produits réactionnels pouvant être détectés de façon distincte. It is obvious that various detectable marks can be used. The only condition, of course, is that these marks can be detected separately. Various isotopes can be used just as easily as 12SI. One of the hepatitis markers or immunoreactive compounds does not have to have radioactive labeling and the other does not have enzymatic or fluorescent labeling because different isotopes can be detected separately. Likewise, all of the labeled components of the reagent may as well be labeled with different enzymes requiring different substrates to form reaction products which can be detected separately.
Il convient de noter que l'on pourrait marquer l'un quelconque des anticorps et antigènes de l'hépatite A et B dans la pratique de l'invention. Les seules conditions immunochimiques sont que les 10 composants marqués ne soient pas complémentaires entre eux ou avec les marqueurs de l'hépatite à déterminer. It should be noted that any of the hepatitis A and B antibodies and antigens could be labeled in the practice of the invention. The only immunochemical conditions are that the labeled components are not complementary to each other or to the hepatitis markers to be determined.
Exemple 3: Example 3:
15 Détection simultanée de l'HBsAg et de l'anti-HBc 15 Simultaneous detection of HBsAg and anti-HBc
On introduit des échantillons de sérum contenant les marqueurs inconnus de l'hépatite dans des godets différents d'une plaque de mi-crotitration, on ajoute à chaque échantillon de sérum une perle de polystyrène revêtue comme dans l'exemple 1 et on laisse incuber pendant 2 h à 45° C. On retire les perles des godets, on lave à l'eau pour éliminer tout excès de réactif et on les introduit dans 0,2 ml du réactif en phase liquide préparé comme dans l'exemple 2. On incube la phase solide et la phase liquide pendant 1 h à 45° C. On sépare ensuite la phase solide de l'anticorps réactif et on lave 4 fois avec de 25 l'eau pour éliminer l'excès de réactif. On place les perles lavées dans des tubes à essai contenant 30 mg d'o-phénylènediamine dans 10 ml de tampon citrate 0,1 M à pH 5,5 et on laisse incuber pendant 30 min. Après cette période, on arrête la réaction enzymatique par addition de 1 ml d'acide chlorhydrique 1M et on examine les tubes à 3° l'œil nu pour rechercher la présence ou l'absence d'une coloration due à la réaction de l'enzyme de marquage et du substrat. L'absence de coloration, ou une coloration faible, indique que l'anti-HBc était présent dans l'échantillon inconnu et est entré en compétition avec le marqueur marqué de l'hépatite vis-à-vis des sites réactionnels du 35 support revêtu. Ensuite on compte la radioactivité des perles dans un compteur y et on note la valeur en cpm. La radioactivité des perles indique la présence d'HBsAg dans l'échantillon inconnu qui a adhéré à l'anticorps fixé et formé un site de fixation pour l'anticorps à marquage radioactif. Serum samples containing the unknown hepatitis markers are introduced into different wells of a mid-crotitration plate, a coated polystyrene bead is added to each serum sample as in Example 1 and the mixture is left to incubate for 2 h at 45 ° C. The pearls are removed from the cups, washed with water to remove any excess of reagent and they are introduced into 0.2 ml of the reagent in the liquid phase prepared as in example 2. It is incubated the solid phase and the liquid phase for 1 hour at 45 ° C. The solid phase is then separated from the reactive antibody and washed 4 times with water to remove the excess reagent. The washed beads are placed in test tubes containing 30 mg of o-phenylenediamine in 10 ml of 0.1 M citrate buffer at pH 5.5 and allowed to incubate for 30 min. After this period, the enzymatic reaction is stopped by adding 1 ml of 1M hydrochloric acid and the tubes are examined at 3 ° with the naked eye to find the presence or absence of a coloration due to the reaction of the labeling enzyme and substrate. Lack of staining, or weak staining, indicates that anti-HBc was present in the unknown sample and competed with the labeled marker for hepatitis vis-a-vis the reaction sites of the coated support . Then the radioactivity of the beads is counted in a counter y and the value in cpm is noted. The radioactivity of the beads indicates the presence of HBsAg in the unknown sample which has adhered to the bound antibody and formed a binding site for the radioactive labeled antibody.
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