CH648566A5

CH648566A5 - Procedimento per la eliminazione del gruppo n-formile da peptidi n-formilati e da esteri di peptidi n-formilati.

Info

Publication number: CH648566A5
Application number: CH2642/82A
Authority: CH
Inventors: Vincenzo Giobbio; Giorgio Ornato; Livio Buracchi; Alberto Mangia
Original assignee: Pierrel Spa
Priority date: 1981-05-13
Filing date: 1982-04-30
Publication date: 1985-03-29
Also published as: ATA183082A; NO821585L; KR830010053A; US4434097A; IT1194795B; AU537275B2; KR840001342B1; PT74892B; ZA823232B; SE8202787L; PT74892A; GB2098220B; ES8302633A1; IT8121674A1; DE3216512A1; JPS616080B2; FI821412L; FR2505829B1; GB2098220A; BE893074A

Description

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RIVENDICAZIONI

1. Procedimento per l'eliminazione del gruppo N-formi-le da peptidi N-formilati oppure da esteri di peptidi N-for-milati, caratterizzato dal fatto che i peptidi N-formilati o i loro esteri vengono fatti reagire con idrazina o con idra-zine sostituite di formula I

R—C—NH—NH2 (I)

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dove R rappresenta un residuo alchilico CrC5 saturo o insaturo, a catena linera o ramificata, o un residuo cicloalchi-lico, o un residuo arilico, eventualmente recanti altri gruppi funzionali, o un amminogruppo, in condizioni di pH mantenuto costante fra 1 e 3,5 durante la reazione, sia per aggiunta di un acido inorganico, sia per aggiunta di sostanze tampone.

2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'idrazina o il composto di formula I vengono impiegati in ragione di 1-5 moli per ogni mole di pep-tide o suo estere N-formilato.

3. Procedimento secondo 1 rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che come composto di formula I si impiega acetilidrazide.

4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che come composto di formula I s'impiega benzoilidrazide.

5. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che come composto di formula I s'impiega cloruro di 2-idrazino-N,N,N-trimetil-2-ossoetanaminio.

6. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che come composto di formula I s'impiega semicarbazide.

7. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-6, caratterizzato dal fatto che la temperatura di reazione è compresa fra circa 20°C e circa 150°C.

8. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-7, caratterizzato dal fatto che si opera in solventi costituiti da alcoli recanti 1-5 atomi di C, eventualmente in presenza d'acqua.

9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che si opera in solventi scelti dal gruppo costituito da chetoni, dimetilformamide, dimetilsolfossido, acetonitrile, esteri alifatici, idrocarburi, idrocarburi clorurati, o da loro miscele, eventualmente in presenza d'acqua.

10. Procedimento secondo rivendicazioni 1-9, caratterizzato dal fatto che il composto sottoposto a N-deformilazione è l'estere metilico della N-formil-a-L-aspartil-L-fenilala-nina e che il prodotto ottenuto è l'aspartame.

Oggetto dell'invenzione è un nuovo, migliorato procedimento per l'eliminazione del gruppo N-formile da peptidi, o loro esteri, N-formilati, mediante trattamento di detti peptidi, o loro esteri, con idrazina o derivati della idrazina, in condizioni di pH ben definite.

È noto dalla letteratura chimica che il gruppo amini-co di un aminoacido può essere bloccato col residuo formile per proteggerlo nel corso di una sintesi peptidica. Ovviamente, alla fine del processo occorre liberare il gruppo aminico allontanando tale residuo. Ora, mentre la prima parte del processo, ossia la formilazione, avviene quasi sempre con facilità, non si ottengono risultati altrettanto buoni quando si procede alla deformi!azione finale secondo i metodi classici.

Infatti, benché le condizioni di deformilazione adottate comunemente siano assai semplici, i risultati ottenuti sono spesso deludenti poiché accompagnati da alterazioni più o meno profonde del peptide, alterazioni che coinvolgono anche lo stesso legame peptidico: questo avviene quando si opera nelle comuni condizioni di deformilazione, vale a dire in soluzione idroalcolica (con alcoli recanti 1-5 atomi di carbonio), in presenza di acidi forti, quali gli acidi cloridrico, solforico, nitrico, paratoluensolfonico o trifluoroace-tico.

Le alterazioni suddette sono ancora più evidenti quando, invece di un peptide formilato, il substrato è rappresentato da un peptide formilato ed esterificato poiché, oltre agli inconvenienti citati, si verifica in modo più o meno marcato anche l'idrolisi del gruppo estere e la formazione della corrispondente dichetopiperazina.

Notizie bibliografiche relative alla deformilazione dei peptidi si trovano in: Zehra, A., Ber. 23,3625 (1890); Hill-mann-Elies, A., Nturforsch., 6 B, 340 (1951); Waley, S. G,, Chem. Ind., 1953, 107; Boissonnas, R. A., Helv. Chim.

Acta, 36, 875 (1953); Sheehan, J. C., J. Am. Chem. Soc. 80, 1154 (1958); altre dettagliate descrizioni si trovano nella chimica classica dei peptidi (J. Greenstein: Chem. of Am. Acids, II, 1244, 46, 47). Gli autori citati si sono occupati della deformilazione in ambiente acido.

Più recentemente altri ricercatori hanno operato in condizioni diverse, e hanno raggiunto migliori risultati utilizzando come agenti deformilanti altre sostanze come il cloruro d'acetile oppure l'idrossilamina o l'idrazina, dichiarando tuttavia quest'ultima non adatta alla deformilazione degli esteri in quanto conduce alla formazione delle corrispondenti idrazidi (Lefrancier, Bull. Soc. Chim. France 1965, 3668; Geiger, GB-PS 1 182 450).

Altri ancora hanno deformilato peptidi o esteri di peptidi mediante ossidazione con H202 (Losse, Am. Chem. 1960, 636, 140) oppure mediante idrogenolisi (Losse, J. Prakt. Chem. 1964, 24, 118).

L'importanza della N-deformilazione di peptidi, o loro esteri, N-formilati è evidente anche dal punto di vista industriale.

Ne è un esempio la preparazione di un noto composto a struttura peptidica avente caratteristiche dolcificanti intense, cioè la a-L-aspartil-L-fenilalanina metilestere, noto come «aspartame».

Questa sostanza è stata preparata in molti modi diversi e seguendo quasi tutti i procedimenti usati nelle sintesi classiche di peptidi, in modo particolare attraverso il blocco del gruppo aminico dell'acido aspartico, l'attivazione del suo a-carbossile come estere attivo o anidride, la reazione di condensazione con la fenilalanina metilestere, e lo sblocco del gruppo aminico del peptide esterificato così ottenuto.

I processi produttivi industriali riguardanti la preparazione dell'a-L-aspartil-L-fenilalanina metilestere urtano contro notevoli difficoltà pratiche sia per la scelta dello schema teorico da adottare sia perché molti di questi schemi comportano l'impiego di sostanze tossiche, come il fosgene o di difficile utilizzo, come il carbobenzossicloruro sia, infine, perché tali schemi conducono al prodotto voluto con rese molto basse.

II procedimento industriale relativamente più conveniente per la preparazione dell'aspartame comporta la condensazione dell'anidride dell'acido N-formil-L-aspartico con L-fenilalanina metilestere e la N-deformilazione successiva della N-formil-a-L-aspartil-L-fenilalanina metilestere così ottenuta.

La N-deformilazione viene attuata operando sia in presenza di un solvente specifico e di acidi inorganici forti (Takemoto, Ger. Offen. 2 635 948) sia con idrossilamina (Takemoto, Ger. Offen. 2 554 421), oppure per riscalda-

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nento con acqua (Takemoto, Jap. Kokai, 76 39 602), oppu-e con acido cloridrico in metanolo (Ger. Offen. 2 256 055).

Le metodiche descritte in questi documenti brevettati iresentano gli inconvenienti riscontrabili, in modo più generale, nelle reazioni di deformilazione di altri peptidi (o oro esteri) N-formilati: primo fra tutti la scarsità delle rese ittenute su quello che è il passaggio finale della sintesi, lompiuto cioè su intermedi notevolmente costosi. Come empre, inoltre, detta scarsità di rese è accompagnata dalla lotevole impurezza del prodotto, che deve essere ovvia-nente purificato con ulteriore aumento dei costi di fabbrica-ione.

Si è ora inaspettatamente trovato che l'aliminazione del esiduo formilico da peptidi (o loro esteri) N-formilati può ìssere realizzata in modo semplice, con un inatteso e cospiro aumento dei rendimenti di reazione operando la scis-ione in presenza di idrazina o di derivati dell'idrazina in in intervallo di pH critico, e precisamente compreso fra . e 3,5.

Oggetto dell'invenzione è quindi un procedimento per la iliminazione del gruppo N-formilico da peptidi, o loro esteri, 4-formilati e in particolare per l'eliminazione di tale grup->o dall'estere metilico della N-formil-a-L-aspartil-L-fenil-ilanina mediante trattamento dell'idrazina o derivati dell'i-Irazina di formula I:

R—C—NH—NH2 (I)

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love R rappresenta un residuo alchilico CrC5, saturo o in-aturo , a catena lineare o ramificata, o un residuo cicloal-hilico, o un residuo arilico, eventualmente recante altri ;ruppi funzionali, o un aminogruppo, tale trattamento es-endo effettuato a pH compresi fra 1 e 3,5.

Come già detto, nel procedimento secondo l'invenzione, I pH dev'essere compreso fra 1 e 3,5. Anche operando sol-anto con acidi, in assenza di idrazina o di suoi derivati (I), i constata infatti che se la reazione è condotta a pH infe-iore a 1, già dopo un'ora a 60°C il formilestere di parten-a è completamente scomparso, ma si è formato poco prolotto deformilato (circa 15%), mentre in TLC si nota la iresenza abbondante di un composto con carattere di di-hetopiperazina (vedi oltre).

Se invece si opera a pH superiore a 3,5, la deformila-ione avviene in modo insignificante anche prolungando noltissimo i tempi della reazione.

L'intervallo di pH entro il quale si deve operare dovrà [uindi essere mantenuto costante nel corso della reazione lato che, liberandosi la base, il pH tende a salire; questo ontrollo potrà realizzarsi aggiungendo gradualmente alla liscela di reazione una soluzione di acido inorganico, cône ad esempio una soluzione di acido cloridrico 10% o di cido solforico, oppure anche di acido p-toluensolfonico. li potrà anche fare uso di opportune soluzioni tampone.

li è già accennato al fatto che altri ricercatori hanno rite-luto l'idrazina non adatta alla deformilazione degli esteri li peptidi N-formilati a causa della possibile formazione Ielle corrispondenti idrazidi (P. Lefrancier e altri, Bull. Soc. -him. France 1965, 3668).

Si è tuttavia sorprendentemente constatato che questo iconveniente può essere minimizzato se si opera, secondo invenzione, nell'intervallo di pH compreso tra 1-3,5. Con iferimento alle condizioni sperimentali, la quantità di idra-ina può variare da 1 a 3 moli per ogni mole del peptide a suo estere) da deformilare, mentre il solvente può essere letanolo, oppure miscele di metanolo e acqua, o anche ltri solventi, benché la natura e la quantità dei solventi stessi non sia molto significativa. In ogni caso per un buon andamento della reazione, occorre — come già detto — regolare inizialmente il pH della miscela nell'intervallo di 1-3,5 e mantenere questo valore nel corso della reazione, che può essere condotta tra i 20°C e 100°C, naturalmente con tempi diversi a seconda della temperatura. L'acido da utilizzare potrà essere un acido minerale come l'acido cloridrico o solforico o nitrico, oppure anche l'acido parato-luensolfonico.

Si è inoltre constatato che la N-deformilazione decorre con rendimenti ulteriormente migliorati effettuando la reazione in presenza di sostanze del tipo

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R—C—NH—NH2

dove R ha i significati già precisati.

La reazione stessa procede con particolare semplicità, in condizioni di minima alterazione e con rese molto buone, varianti da 75% a oltre 90% a seconda del composto impiegato. Si è osservato che l'efficacia delle sostanze del tipo

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R—C—NH—NH2

come agenti di deformilazione è particolarmente accentuata nel caso dell'acetilidrazina (che è il composto più semplice), della benzoilidrazina, del cloruro di trimetilamino-acetilidrazide («Girard T», che è più complesso e che contiene altri gruppi funzionali) e della semicarbazide. Per quanto si riferisce alle condizioni sperimentali, la quantità del composto deformilante è compresa fra 1 e 5 moli rispetto a una mole del peptide (o suo estere) da deformilare; si possono impiegare anche quantità maggiori del reattivo, ma senza alcun vantaggio economico.

Il solvente sarà preferibilmente il metanolo o miscele di metanolo-acqua nel caso di peptidi, mentre nel caso di peptidi esterificati sarà costituito di preferenza dall'alcol di cui è formato l'estere del peptide. Ma anche qui la natura del solvente non è determinante, per cui potrà essere impiegato anche un altro alcol con numero di atomi di carbonio variante da 2 a 5, oppure altri solventi idrosolubili come diossano, acetone, acetonitrile, o dimetilformamide; oppure anche altri solventi non solubili in acqua come idrocarburi, idrocarburi cloruranti, eteri, chetoni, esteri o miscele di questi solventi. Tutti questi solventi possono essere impiegati in presenza o meno di acqua e quindi potranno verificarsi casi in cui è presente una sola fase oppure due fasi. Le temperature di reazione non sono determinanti, poiché in funzione delle temperature stesse differiranno solamente i tempi di reazione; per definire un ordine di grandezza si può dire che le temperature possono variare da 20 a 150°C a seconda dei solventi utilizzati, mentre i tempi di reazione possono variare da 30 minuti a 30 ore a seconda della temperatura a cui si opera.

Gli esempi che seguono illustrano il procedimento dell'invenzione nelle sue diverse varianti, senza tuttavia limitare l'invenzione stessa.

L'andamento di reazione è stato generalmente controllato molto bene in TLC, che inoltre dimostra chiaramente la scarsa alterazione che si verifica nel corso delle reazioni. Infatti si può notare con chiarezza la presenza, oltre al prodotto deformilato, solamente di piccole quantità di «diche-topiperazina».

Tale composto, cioè l'acido 2-benzil-3,6-dicheto-5-pipe-razinil-acetico, è normalmente presente nell'aspartame com5

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merciale in quantità dell'ordine del 2%, tanto che la Food and Drug Administration (Title 21, paragrafo 121.1258,

Code of Federai Régulations) prescrive un limite massimo appunto del 2% per il composto stesso. Nei saggi di purezza effettuati sulFaspartame ottenuto con il porcedimento di questa invenzione (saggi effettuati mediante HPLC), la predetta «dichetopiperazina» non ha mai superato lo 0,6-0,7%.

Analogo miglioramento rispetto ai prodotti commerciali si è ottenuto per quanto riguarda un'altra impurezza abituale dell'aspartame, cioè l'a-aspartil-fenilalanina, che negli aspartami commerciali è presente in quantità dell'ordine dell'I %, mentre in quello preparato secondo l'invenzione non supera mai lo 0,3 %.

La valutazione quantitativa del prodotto di reazione è stata invece effettuata in GLC.

Esempio 1

3,2 grammidi N-formil-a-L-aspartil-L-fenilalanina metilestere (10 mmoli) sono sciolti in 32 mi di metanolo. Si aggiungono 3,2 mi di acqua e poi si porta a pH 2 con 0,5 mi di HCl al 3%. Si scalda a 70°C e si mantiene a questa temperatura per 10 ore regolando continuamente il pH mediante aggiunta della soluzione di HCl al 3%, in modo da mantenerlo nell'intervallo di 1,5-3.

Controllo TLC (eluente: metiletilchetone/acido acetico/pi-

ridina/acqua, 32-4-2-6)

Rivelatore ninidrina:

1 macchia abbondante Rf 0,35 (aspartame)

1 macchia Rf 0,1 (peptide deformilato e demetilato)

1 macchia incognita Rf 0,9

Analisi GLC : a-L-aspartil-L-fenilalanina metile stere 1,91 g (Resa: 65%)

Esempio 2

3,2 grammi di N-formil-a-L-aspartil-L-fenilalanina metilestere (10 mmoli) sono sciolti in 32 mi di metanolo. A parte si sciolgono 1,5 g di idrazina monoidrato (30 mmoli) in 5 mi di acqua e si porta a pH 1,5 con HCl al 15%. Si aggiunge questa soluzione alla precedente e si porta il pH a 1,5 con HCl al 15%. Si scalda a 70° e si mantiene a questa temperatura per 7,5 ore, sempre mantenendo il pH tra 1,5-3,5 con aggiunta di HCl al 15%.

Analisi GLC: a-L-aspartil-L-fenilalanina metilestere 2 g (Resa: 70%).

Esempio 3

3,2 grammi di N-formil-a-L-aspartil-L-fenilalanina metilestere (10 mmoli) sono sciolti in 32 mi di metanolo. Si aggiungono 3,2 mi di acqua e 2,2 g di acetilidrazina (30 mmoli) e si porta a pH 2,5 con soluzione di HCl 10%. Si scalda a 54°C e si mantiene a questa temperatura per 8 ore, mantenendo il pH tra 1,5-3,5.

Controllo TLC (eluente: metiletilchetone/acido acetico/pi-

ridina/acqua 32-4-2-6)

Rivelatore ninidrina: Rf 0,35 (aspartame)

1 macchia Rf 0,1 (peptide deformilato e demetilato)

1 macchia molto debole a-L-aspartil-L-fenilalanina metil-Analisi GLC : estere 2,65 g (Resa: 90%).

Esempio 4

3,2 grammi di N-formil-a-L-aspartil-L-fenilalanina metilestere (10 mmoli) sono sciolti in 32 mi di metanolo. Si aggiungono 3,2 mi di acqua e g 5 di «Girard T» (30 mmoli)

e si porta a pH 2,5 con soluzione di HCl 10%. Si scalda a 70°C e si mantiene a questa temperatura per 7 ore, mantenendo il pH tra 1,5-3,5.

Controllo TLC (eluente: metiletilchetone/acido acetico/piri-

dina/acqua 32-4-2-6)

Rivelatore ninidrina:

1 macchia Rf 0,35 (aspartame)

1 piccola macchia Rf 0,1 (peptide deformilato e demetilato)

Analisi GLC : a-L-aspartil-L-fenilalanina metil estere 2,2 g (Resa: 76%).

Esempio 5

3,2 grammi di N-formil-a-L-aspartil-L-fenilalanina metilestere (10 mmoli) sono sciolti in 32 mi di metanolo. Si aggiungono 3,2 mi di acqua e 3,33 g di semicarbazide clori-drato (30 mmoli). Il pH è 2 e quindi non occorre correggerlo. Si riscalda a 70°C e si mantiene a questa temperatura per 8 ore, mantenendo il pH tra 1,5-3,5.

Analisi GLG : a-L-aspartil-L-fenilalanina metil estere 2,4 g (Resa: 83 %).

Esempio 6

3,2 grammi di N-formil-a-L-aspartil-L-fenilalanina metilestere (10 mmoli) sono sciolti in 32 mi di metanolo. Si aggiungono 3,2 mi di acqua e 4 g di benzoilidrazide (30 mmoli). Si porta il pH a 1,5-3,5. Si scalda a 70°C e si mantiene a questa temperatura per 4 ore, mantenendo il pH nell'intervallo prescritto.

Si evapora a secco a temperatura inferiore a 40°C, si riprende con 10 mi d'acqua, si corregge il pH al punto isoelettrico (pH = 5,2), si raffredda a 0°C e sì filtra alla pompa. Si ottengono 2,5 g di aspartame analiticamente puro. (Resa 85,4%).

Esempio 7

Kg 12,825 di N-formil-a-L-aspartirl-L-fenilalanina metilestere sono sciolti in 1 30 di dicloroetano a cui si aggiungono 1 10 di acido acetico glaciale, 1 10 di metanolo, e kg 14 di acetilidrazina. Si porta a 64° e si regola il pH portandolo a 2,2-2,3 per addizione di una soluzione di acido cloridrico concentrato. Sempre mantenendo il pH nell'intervallo di 2,2-2,3 si scalda a 64°C; in queste condizioni la reazione di deformilazione si completa nel tempo di cinque ore. Il volume finale è di 1 80.

Sulla soluzione di reazione si determina, mediante analisi HPLC, il contenuto di a-L-aspartil-L-fenilalanina metilestere: 132 mg/ml.

Le condizioni analitiche sono le seguenti:

Colonna: RP8 10 [i, temperatura della colonna 45°C, flusso 2 mi/min., rivelatore UV a 215 nm. Eluente: tampone fosfato a pH 7,5 0,01 M/acetonitrile lichrosolv = 9/1.

Tempo di ritenzione dell'a-L-aspartil-L-fenilalanina metilestere (aspartame) 5,2 min.

La resa di a-L-aspartil-L-fenilalanina metilestere è di chilogrammi 10,55 (90% sul teorico).

Si allontanano sotto vuoto il dicloroetano e il metanolo, si aggiungono 50 litri di acqua e si porta a pH 5,2, punto isoelettrico di precipitazione dell'aspartame. Si raffredda con salamoia a —5°C per 10 ore e si centrifuga l'aspartame così ottenuto, lavando bene il panello di prodotto. Dopo essiccamento a 45°C in corrente d'aria si ottengono 9 kg di aspartame con le seguenti caratteristiche qualitative:

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Titolo (HPLC): 99,3 sul secco

Dichetopiperazina (acido 2-benzil-3,6-dicheto-5-piperazi-

nil-acetico): 0,5%

N-L-a-Aspartil-L-fenilalanina (aspartame demetilato): 0,1%.

Le acque madri contenenti 1,5 kg circa di aspartame sono riciclate nella lavorazione successiva, permettendo in pratica un recupero quasi quantitativo dell'aspartame prodotto.

Due campioni commerciali di provenienza diversa hanno dato i seguenti risultati analitici:

Campione «A» Titolo (HPLC) 98,4%; «dichetopiperazina» 0,7%; aspartame demetilato 2,1%; Campione «B» Titolo (HPLC) 97,0%; «dichetopiperazina» 2,74%; aspartame demetilato 0,45%.

Sul prodotto finito le condizioni analitiche HPLC sono le seguenti:

Colonna: lichrosorb RP18, 10 (i, lunghezza 25 cm, diame-

5 Eluente:

Flusso: Rivelatore:

tro interno 4 mm.

tampone fosfato pH 4/metanolo: 60/40 per titolo aspartame; 75/25 per determinazione impurezze.

2 ml/min.

UV a 210 nm.

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Tempi di ritenzione:

Aspartame: 12,8 min. (3,6 min. nella determinazione del titolo)

«Dichetopiperazina»: 5,1 min.

aspartame demetilato: 3,3 min.

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