CH639102A5 - Process for the preparation of recognins, their complexes, of antirecognins and their complexes and use of the complex prepared - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Recogninen sowie eine Verwendung des hergestellten Komplexes.

Die Recognine können dazu verwendet werden, um ihre chemischen Gegenstücke herzustellen, d.h. indem man die Recognine oder die auf einem Träger befindlichen Recognine mit Körperflüssigkeiten in Kontakt bringt. Diese chemischen Gegenstücke sind für diagnostische und therapeutische Zwecke, d.h. für die Diagnose und Behandlung von Krebserkrankungen, nützlich. Die chemischen Gegenstücke bzw. Chemoreziprokale sind Substanzen, die mit einer immuno-chemisch-artigen Spezifizität mit einem Recognin in vivo oder in vitro reagieren, z.B. bei einem quantitativen Ausfällungstest, bei der Ouchterlony-Doppeldiffusion oder bei der Immunofluoreszenz.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Recogninen zeichnet sich durch den kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 aus.

Diese Recognine werden entsprechend der vorliegenden Erfindung durch wiederholtes Aufbrechen normalen oder kranken Gewebes bzw. Zellen in Anwesenheit einer neutralen Puffersubstanz hergestellt, um Proteinfraktionen herauszulösen. Die daraus erhaltenen Fraktionen werden dann chromatographisch getrennt, was ein chemisches Verfahren zum Isolieren eines Proteinanteils mit einem pK-Bereich von 1 bis 4 notwendig macht. Dies wird durch chemische und enzymatische Hydrolyse der Proteinfraktion erreicht, welche sich ergibt, wenn in zunehmendem Masse saure Lösungsmittel in der chromatographischen Säule beim Elutionsver-fahren verwendet werden. Das Recognin wird daraus als Fraktion mit einem Molekulargewicht von 3000 bis und mit 25 000 isoliert.

Eines der erfindungsgemässen Recognine ist das Astro-cytin. Astrocytin wird aus Gehirntumorgewebe, vorzugsweise Gehirngliomtumorgewebe, erzeugt. Proteinfraktionen, die den Astrocytin-Vorläufer enthalten, werden zunächst aus dem Gewebe extrahiert. Eine bevorzugte Extraktionsmethode besteht darin, das Gewebe mit einem neutralen Puffer bei Homogenisierungsbedingungen oder durch Anwendung anderer Techniken zur Zerteilung der Zellen und Gewebe zu behandeln, um Proteinfraktionen, welche den Astrocytin-Vorläufer enthalten, löslich zu machen.

Zu diesem Punkt ist der Astrocytin-Vorläufer immer noch an Substanzen mit grossem Molekulargewicht wie z.B. Proteine, Glykoproteine, Lipoproteine, Nucleinsäuren, Nucleo-proteine etc. gebunden. Die solubilisierten Proteine werden sodann von dem resultierenden Gewebeextrakt abgetrennt. Die Extraktlösung aus dem Gewebe wird sodann geklärt, um unlösliche Teilchen zu entfernen. Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht werden hierauf durch eine Vorver-dampfungs-Konzentrationstechnik aus der resultierenden Lösung entfernt. Die erhaltene Lösung wird hierauf behandelt, um den Astrocytin-Vorläufer von anderen Verunreinigungen abzutrennen, um eine Proteinfraktion zu erhalten, welche einen pK-Bereich zwischen 1 und 4 besitzt. Somit wird z.B. die Lösung auf eine chromatographische Säule gegeben und mit zunehmend sauren Lösungsmitteln eluiert. Sämtliche Fraktionen, die im neutralen oder sauren Bereich bis zu einem pK-Wert von 4 hinunter eluiert werden, werden verworfen, und diejenigen Fraktionen mit einem pK-Bereich von 1 bis 4 werden gesammelt. Das Eluat wird sodann behandelt, um ein Produkt mit einem Molekulargewicht von etwa 8000 zu erhalten. Dies geschieht z.B. in der Weise, dass man zuerst das Material filtert, um Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, d.h. solche mit einem Molekulargewicht von unterhalb 1000, zu entfernen, und dass man erneut filtert, um diejenigen Substanzen mit einem Molekulargewicht oberhalb 25 000 zu entfernen. Die Fraktion mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 25 000 wird sodann weiterbehandelt, z.B. durch eine Dünnschichtgel(TLG)-Chromato-graphie, um Astrocytin zu erhalten.

Somit kann Astrocytin in der Weise hergestellt werden, dass man Gehirngliomtumorgewebe mit einem neutralen Puffer unter wiederholter Homogenisierung und Hochge-schwindigkeitszentrifugierung extrahiert, von dem resultierenden Extrakt eine Fraktion mit einem pK-Bereich von etwa 1 bis 4 abtrennt, aus dieser Fraktion die Substanzen mit einem hohen Molekulargewicht, d.h. bis zu etwa 230 000, abtrennt und dass man daraus das Produkt Astrocytin, welches ein Molekulargewicht von etwa 8000 besitzt, isoliert.

Das nach diesem Verfahren hergestellte Astrocytin-Pro-dukt ist dadurch gekennzeichnet, dass es mit seinem spezifischen Antikörper bei quantitativen Präzipitin- bzw. Koagu-lintests und Ouchterlony-Geldiffusionstests ein Einzellinien-präzipitat bzw. einen Einzellinienniederschlag bildet, dass es in Wasser und wässrigen Lösungen mit einem sauren oder neutralen pH-Wert löslich ist und bei einem alkalischen pH-Wert unlöslich ist, dass es eine Wellenlänge des spektro-photometrischen Absorptionspeaks von 280 mji. hat und dass es schliesslich ein Molekulargewicht von etwa 8000 aufweist.

Astrocytin ist auch dadurch gekennzeichnet, dass es einen sehr hohen Prozentgehalt von Resten der Glutaminsäure und der Asparaginsäure und ein sehr hohes Verhältnis dieser Säuren zu Histidin hat. Eine nähere Analyse von Astrocytin wird weiter unten gegeben.

In ähnlicher Weise wie oben beschrieben wird ein weiteres Recognin, das als «Malignin» bezeichnet wird, aus künstlichen Krebszellen, d.h. Krebszellen, die bei einer In-vitro-Fermentierung wachsen, erzeugt wird. Malignin hat ein Molekulargewicht von etwa 10 000 und eine ähnliche, jedoch verschiedene Aminosäurerestzusammensetzung gegenüber dem Astrocytin, d.h. hohe Verhältnisse von Glutaminsäure und Asparginsäure und hohe Verhältnisse dieser Säuren zu Histin. Eine nähere Analyse von Malignin wird untenstehend angegeben.

Somit kann Malignin in der Weise hergestellt werden, dass man in einer Fermentationskultur gewachsene künstliche Krebszellen mit einem neutralen Puffer unter wiederholter Homogenisierung und Hochgeschwindigkeitszentrifugierung extrahiert, aus dem resultierenden Extrakt die Fraktion mit einem pK-Bereich von ungefähr 1 bis 4 abtrennt, aus dieser Fraktion die Substanzen mit einem hohen Molekulargewicht, d.h. bis zu etwa 230 000, abtrennt und dass man hieraus das Produkt mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 isoliert.

Die Menge an Malignin, die bei einer künstlichen Zellfermentation erzeugt wird, und die Prozentmenge des Gesamtproteins, das bei der künstlichen Zellfermentation erzeugt wird, welche Malignin ist, können dadurch erhöht werden, dass man das Wachstum der künstlichen Krebszellenkultur in grossdimensionierten Behältern durchführt.

Nach diesem Verfahren hergestelltes Malignin ist dadurch gekennzeichnet, dass es mit seinem spezifischen Antikörper bei quantitativen Präzipitintests und Ouchterlony-Geldiffusionstests ein Einzellinienpräzipitat bzw. einen Einzellinienniederschlag bildet, dass es in Waser und wässrigen Lösungen mit einem sauren oder neutralen pH-Wert löslich und bei einem alkalischen pH-Wert unlöslich ist, dass es eine Wellenlänge des spektrophotometrischen Absorptionspeaks von 280 mji hat und dass es ein Molekulargewicht von etwa 10 000 aufweist.

Recognine sind weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass sie dazu imstande sind, mit Bromaceylcellulose einen Komplex zu bilden, wobei Bromacetylcellulose-Recognin gebildet wird, und dass sie nach dem Injizieren in Säugetiere die spe5

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zifischen Antikörper Anti-Recognin bilden. Das Anti-Recognin ist spezifisch an den Recognin-Vorläufer in situ angefügt. So ist z.B. ein Anti-Recognin, nämlich Anti-Malignin, gegenüber Gehirntumorzellen in vitro toxisch.

Recognine wie Astrocytin, Malignin und ähnliche Substanzen sind als Produkte nützlich, die in ein biologisches System eingeführt werden können, um Fremdreaktionen zu vermindern, beispielsweise indem ein Material-mit einem Recognin überzogen wird. Ein weiteres Beispiel ist die Einführung eines Recognins, um in dem biologischen System das chemische Gegenstück zu erzeugen. Die Recognine können auch als Nährstoffe verwendet werden, um das Wachstum von bestimmten biologischen Systemen, von dem sie ein Teil sind, zu ermuntern. Eine weitere Einsatzmöglichkeit der Recognine ist die Erzeugung von Target-Reagentien, bzw. Ziel- oder Angriffspunktreagentien, welche die Reco-gninkomplexe mit einem Träger enthalten, um die Anwendbarkeit in biologischen Systemen zu erleichtern. So befördert z.B. der Komplex die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Recognins selbst. Der Träger sollte aus solchen ausgewählt werden, die einen Komplex mit dem Recognin bilden und die im wesentlichen biologisch inert sind.

Alle beliebigen, bekannten Substanzen, die mit Polypeptiden oder Proteinen einen stabilen Komplex bilden, können zur Komplexbildung mit dem Recognin geeignet sein. Ein Beispiel ist ein Material auf Cellulosebasis, z.B. Bromacetyl-cellulose. Abgesehen davon, dass der Träger gegenüber dem biologischen System inert sein muss, sollte der Träger so beschaffen sein, dass er die spezifischen physikalisch-chemischen Eigenschaften des Recognins, die für die oben angegebenen Zwecke nützlich sind, nicht verändert.

Die Komplexe aus Recognin und seinem Träger sind dazu geeignet, um in beliebigen biologischen Systemen, mit denen sie in Kontakt gebracht werden, die chemischen Gegenstücke bzw. chemischen Reziproken zu erzeugen, abzutrennen und zu identifizieren. Der Recognin-Trägerkomplex ist auch dazu geeignet, um die Produktion des chemischen Gegenstück-Vorläufers in einem beliebigen biologischen System zu stimulieren, in das er eingeführt wird.

Eine Klasse von chemischen Gegenstücken sind die Anti-Recognine, d.h. Anti-Astrocytin und Anti-Malignin. Diese können in der Weise hergestellt werden, dass das Recognin in ein biologisches System injiziert wird. Eine immunologisch wirksame Dosis des Recognins wird mit Körpergeweben oder -flüssigkeiten nach zur Erzeugung von Antikörpern bekannten Techniken in einer solchen Weise in Kontakt gebracht, dass eine Antikörperreaktion induziert wird. Die Anti-Recognine können zur Herstellung von Materialien wie diagnostische, Nahrungs- und Arzneimittel für spezifische Zellen oder Stellen in biologischen Systemen verwendet werden, wobei man das Mittel in Komplexform mit dem Anti-Recognin in das biologische System einführt. Die Anti-Recognine sind auch für die Diagnose des Vorhandenseins von Tumorzellen in histologischen Abschnitten geeignet, wobei man das Anti-Recognin in Kombination bzw. Konjugation mit einer Markierungssubstanz wie Farbstoffe und radioaktive Substanzen dem Abschnitt zuführt. Hierbei erfolgt eine Anfärbung oder radioaktive Markierung nur bei den Tumorzellen. Ein weiterer Anwendungszweck für Anti-Recognin ist die Erhöhung der Ausbeute von anderen einsetzbaren chemischen Vorläuferprodukten (wie z.B. TAG-Produkte, wie sie nachstehend beschrieben werden) von Säugetieren, wobei man eine immunologisch wirksame Dosis des Recognins in das Säugetier oder in ein anderes biologisches System injiziert.

Bislang sind schon Glykoproteinkomplexe aus Gehirngewebe hergestellt und entsprechende Antikörper erzeugt worden. Abgetrennte Materialien, die als 10B-Glykoproteine bekannt sind und die aus dem Gehirn der Tay-Sachs'schen Krankheit erzeugt worden waren, wurden in Kaninchen injiziert, und es wurden auf diese Weise Antikörper hergestellt. Diese Tay-Sachs-Antikörper wurden für Immunofluoreszenz-Untersuchungen von tumorhaltigen Gehirnen verwendet: Durch diese Antikörper wurden nur reaktive normale Nicht-Tumorglia, jedoch nicht Tumorglia, eingefärbt.

Im Gegensatz dazu, wenn das Astrocytin aus Tumorgewebe erzeugt worden war und Antikörper gegenüber Astrocytin (Anti-Astrocytin) hergestellt und bei Immunofluores-zenzuntersuchungen des Gehirns verwendet wurden, dann wurden nur Tumorglia, jedoch nicht normale (Nicht-Tumor)Glia durch das Anti-Astrocytin eingefärbt. Somit sind aufgrund der ursprünglichen Gewebe und aufgrund der Natur der Antikörper sowie der spezifischen Typen von eingefärbten Zellen Anti-Tay-Sachs-Antikörper und Anti-Astrocytin klar unterschiedliche Produkte.

Eine weitere Klasse von chemischen Gegenstücken sind Target-Reagentien, die mit ihren chemischen Gegenstücken in einen Komplex überführt worden sind. So wird z.B. Target (das Produkt, das erhalten wird, wenn Astrocytin mit einem Träger wie Bromacetylcellulose in einen Komplex überführt wird) in Kontakt mit Anti-Astrocytin gebracht. Dieser Verbindungstyp kann damit in einen Komplex überführt werden und zur Herstellung von diagnostischen Nähr- und Arzneimitteln für spezifische Zellen oder Stellen in biologischen Systemen verwendet werden. Diese Verbindungen können auch für Reinigungsverfahren verwendet werden. So kann z.B. Anti-Astrocytin hergestellt werden, indem man Brom-acetylcelluIose-Astrocytin-Anti-Astrocytin durch eine hydrolytische Behandlung mit einer Säure oder einem Proteinase-Enzym einer Entkomplexierungsbehandlung unterwirft. Target-Reagentien sind auch dazu geeignet, um die Menge der TAG-Produkte (wie sie unten beschrieben werden) in biologischen Systemen zu erhöhen, z.B. indem man eine immunologisch wirksame Dosis von Target in Kontakt mit Körpergewebe oder -flüssigkeiten bringt.

Weitere chemische Gegenstücke sind TAG-Reagentien (z.B. an Target haftende Globuline). Die TAG-Produkte werden in der Weise hergestellt, dass man Target-Reagentien in Kontakt mit Körperflüssigkeiten über variierende Zeitspannen bringt, um einen Komplex zu bilden, und dass man das TAG davon abspaltet.

Zwei geeignete Ausführungsformen sind S-TAG und F-TAG.

Bei einem Verfahren zur Herstellung von S-TAG (langsam am Target haftendes Globulin = Slow-Target-Attaching-Globulin) geht man so vor, dass man Blutserum oder eine andere Körperflüssigkeit mit einem Target (d.h. Bromacetyl-cellulose-Malignin) ungefähr 2 Stunden oder mehr bei niedriger Temperatur, z.B. bei etwa 4°C, umsetzt und dass man das S-TAG aus dem resultierenden Material, beispielsweise mit verdünnter Säure, über einen Zeitraum von ungefähr 2 Stunden und bei einer Temperatur von etwa 37° C abspaltet. Das nach diesem Verfahren hergestellte S-TAG ist dadurch gekennzeichnet, dass es in wässrigen, gepufferten Lösungen löslich ist, dass es ein Einzellinienpräzipitat mit seinem entsprechenden Recognin bei Ouchterlony-Geldiffusionstests bildet, dass es durch Cellophanmembranen nicht dialysierbar ist, dass es durch Milliporenfilter zurückgehalten wird, welche Moleküle mit einem Molekulargewicht von über 25 000 zurückhalten, dass es Molekulargewichte in unterschiedlichen Aggregationszuständen, bestimmt durch eine Dünnschichtgelchrömatographie, von ungefähr 50 000 und Vielfachen davon im Makroglobulinbereich besitzt und dass es eine Wellenlänge des spektrophotometrischen Absorptionspeaks von 280 mji aufweist.

Bei einem Verfahren zur Herstellung von F-TAG (schnell

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am Target haftendes Globulin = Fast-Target-Attaching-Glo-bulin) geht man so vor, dass man Blutserum oder eine andere Körperflüssigkeit mit Target (d.h. Bromacetylcellulose-Malignin) ungefähr 10 Minuten bei niedriger Temperatur, z.B. etwa 4°C, umsetzt und dass man aus dem resultierenden Material F-TAG, z.B. mit verdünnter Säure, über einen Zeitraum von ungefähr 2 Stunden und bei einer Temperatur von ungefähr 37°C abspaltet. Das nach diesem Verfahren hergestellte F-TAG ist dadurch gekennzeichnet, dass es in wässrigen, gepufferten Lösungen löslich ist, dass es ein Einzelli-nienpräzipitat mit seinem entsprechenden Recognin bei Ouchterlony-Geldiffusionstests bildet, dass es durch Cello-phanmembranen nicht dialysierbar ist, dass es durch Millipo-renfilter zurückgehalten wird, welche Moleküle mit einem Molekulargewicht von über 25 000 zurückhalten, dass es Molekulargewichte in unterschiedlichen Aggregationszu-ständen, bestimmt durch Dünnschichtgelchromatographie, von ungefähr 50 000 und Vielfachen davon im Makroglobu-linbereich besitzt und dass es eine Wellenlänge des spektro-photometrischen Absorptionspeaks von 280 mji aufweist.

TAG-Produkte sind dazu geeignet, um Krebstumore in lebenden Säugetieren zu entdecken, indem man die Konzentration von S-TAG und F-TAG bestimmt, die durch ein bekanntes Volumen des Blutserums des Säugetiers oder einer anderen Körperflüssigkeit erzeugt wird, und indem man diese Konzentration mit Mengen in Beziehung setzt, die als Krebs anzeigend bestimmt worden sind. TAG-Produkte sind auch dazu geeignet, um die Anwesenheit von Tumorzellen in histologischen Schnitten zu diagnostizieren. Dabei geht man so vor, dass man TAG, das mit einer Markierungssubstanz, z.B. einem Farbstoff oder einer radioaktiven Substanz, kombiniert ist, auf den Schnitt aufbringt, wodurch ein Anfärben oder eine radioaktive Markierung nur bei den Tumorzellen erfolgt. Es hat sich weiterhin gezeigt, dass TAG-Produkte gegenüber Tumor-Zellen cytotoxisch sind. TAG-Produkte sind auch zur Herstellung von diagnostischen, Ernährungsund Arzneimitteln für spezifische Zellen oder Stellen geeignet, wobei diese Mittel in Komplexform mit dem TAG-Produkt eingeführt werden.

Die normale Zellteilung in Pflanzen oder Tieren wird eingeschränkt oder inhibiert, wenn die Zellen dazu kommen, einen jeweiligen Raum vollständig einzunehmen. Die Mechanismen (a), nach denen die normalen Zellen «erkennen»,

dass sie den für sie verfügbaren Raum ausgefüllt haben, und (b), nach denen der Ablauf dieses Erkennungsmechanismus seinerseits die Zellteilung inhibiert, sind beide unbekannt gewesen. Es wurde nun eine Gruppe von Verbindungen hergestellt, deren Vorläufer eine erhöhte Konzentration haben, wenn eine normale Erkennung und Erlernung auftreten. Diese Verbindungen stehen mit der Erkennung und Erlernung in Teilchen und Zellen und mit der Verbindung der Zellen untereinander in Beziehung. Diese Verbindungen werden als Recognine bezeichnet. Beim Versuch, diese Verbindungen aus normalen Krebszellen herzustellen, wurde festgestellt, dass sie als solche nicht vorhanden sind und dass zum gleichen Zeitpunkt, wo die Krebszellen ihre Fähigkeit verloren haben, (a) zu erkennen, dass sie ihr normales Volumen ausgefüllt haben, und/oder (b) die Teilung zu unterbrechen, wenn sie ihr normales Volumen ausgefüllt haben, Veränderungen ihrer Molekularstruktur stattgefunden haben.

Es sind neue Verbindungen sowie Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen entdeckt worden. Diese neuen Verbindungen werden als Recognine bezeichnet. Recognine sind neue Verbindungen, die physikochemische Eigenschaften haben, die diejenigen Konfigurationseigenschaften der Krebszellen hinsichtlich ihres Unvermögens, zu erkennen und die Zellteilung abzubrechen, nachahmen. Die Verwen639102

dung der Recognine geht über eine reine Einsicht in den Krebsmechanismus hinaus, da hierdurch Produkte und Verfahren zur Verfügung gestellt werden, die für die Diagnose, Behandlung und Prophylaxe von Krebs geeignet sind.

Es sind Methoden aufgefunden worden, nach denen künstlich kultivierte Zellen dazu verwendet werden können, um Malignine herzustellen. Ein Vorteil der hierin beschriebenen Methoden besteht darin, dass nun Malignine und daraus neue Produkte wirksam in praktisch unbegrenzten Mengen hergestellt werden können.

Die vorliegende Erfindung überschreitet das Gebiet der Krebsforschung, und sie ist unmittelbar auf alle beliebigen biologischen Systeme anwendbar, bei denen gewünscht wird, das Gesamtwachstum und den Metabolismus zu beeinflussen. Somit kann durch Herstellung der jeweiligen Verbindung oder der jeweiligen Verbindungen des entsprechenden Zelltyps in künstlichen Kulturen und weiterhin durch Herstellung von Produkten aus diesen Substanzen erstmals eine spezifische Beeinflussung auf alle beliebigen Gewebe, Zellen, Zellorganellen, sub-organellen Moleküle oder Molekülanhäufungen in jedem beliebigen lebenden System ausgeübt werden. Somit können erstmals spezifische Ernährungsbeeinflussungen zu kritischen Zeitpunkten der Entwicklung, spezifische diagnostische, prophylaktische und Behandlungsmethoden sowie die Konstruktion von künstlichen bioelektrischen Systemen (z.B. in Gewebe- oder Organtransplantaten) durchgeführt werden. Diese künstlichen bioelektrischen Systeme können die charakteristischen Eigenschaften des spezifischen Recognins, Malignins oder ihrer chemischen Gegenstücke des normalen Gewebes oder der Komponente, denen sie benachbart sind, tragen, und sie können somit als «fremd» «erkannt» werden, wodurch Fremdkörperreaktionen mit Einschluss der Abstossung vermieden werden können.

Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung eines verwertbaren, spezifischen, antikörperartigen Produktes (Anti-Astrocytin) gegenüber einem spezifischen Gehirnprodukt (Astrocytin), wobei es ermöglicht wird, dass dieses antikörperartige Produkt zur spezifischen Komplexbildung damit und als spezifischer Zuführungsträger für spezifische Punkte im Nervensystem aller Arten verwendet werden kann. Malignine und Astrocytin sind Recognine.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Erzeugung von neuen Produkten, nämlich an Target haftenden Globulinen (TAG) aus biologischen Flüssigkeiten. Diese Produkte werden so bezeichnet, weil sie durch zwei Reaktionen erzeugt werden, wobei die erste Reaktion die Umsetzung von biologischen Flüssigkeiten mit einem synthetischen Komplex ist, welcher physikochemische Konfigurationen enthält, die diejenigen der Malignine nachahmen, und der als Target bzw. Ziel bezeichnet wird. Bei der zweiten Reaktion wird das spezifische TAG von dem Komplex abgespalten. Durch Messung des so erzeugten TAG wird somit eine quantitative Anzeige der biologischen Flüssigkeiten der lebenden Organismen erhalten, ob in diesen Organismen ein Tumor vorhanden ist. Somit wird erfindungsgemäss ein diagnostischer Test für Tumore zur Verfügung gestellt. Da TAG-Produkte und Anti-Malignin physikochemisch gegenüber Maligninen entgegengesetzt bzw. komplementär sind,

werden sie hierin als chemische Gegenstücke bzw. Chemore-ziprokale bezeichnet.

Es wurde weiterhin gefunden, dass zwei quantitativ und qualitativ unterschiedliche TAG-Produkte je nach dem Zeitraum, den man für die Umsetzung des Serums mit dem speziellen Target-Reagens gestattet, und je nach dem Zeitraum, den man für die Abspaltung des 'Produktes, das in einen Komplex überführt worden ist, gestattet, hergestellt werden können.

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Nach Untersuchung der Mengen dieser Produkte, die aus einer Anzahl von verschiedenen Personen mit Gehirntumoren und verschiedenen anderen medizinischen Störungen sowie von solchen, die keinen augenscheinlichen Krankheits-prozess hatten, hergestellt worden waren, wurde ersichtlich, dass die Mengen dieser zwei neuen Produkte, die in einer gegebenen Person erzeugt werden können, eine Anzeige darüber geben, ob die jeweilige Person einen Gehirntumor hatte. Es ist somit ein neuer serum-diagnostischer Test für Gehirntumore entdeckt worden.

Die Eignung dieser neuen Produkte, zusätzlich zu ihrer Verwendung zur Diagnose aus dem Serum und anderen biologischen Flüssigkeiten, das Vorhandensein von Gehirn- und anderen Tumoren anzuzeigen, wird durch die Tatsache veranschaulicht, dass TAG und Anti-Recognin-Verbindungen in histologischen Schnitten von Gehirntumor vorzugsweise an den glialen Tumorzellen und dem umgebenden Gewebe, das beim chirurgischen Eingriff des Gehirntumors entfernt worden ist, haften. Diese bevorzugte Markierung der Tumorzellen durch TAG und Anti-Recognine wird durch Standard-Immunofluoreszenz-Techniken demonstriert. Somit wird durch die Erfindung auch eine neue Methode zur Verfügung gestellt, um durch eine histologische Untersuchung mit einem neuen Sicherheitsgrad zu bestimmen, ob Tumorzellen zu den Ecken bzw. Kanten des entfernten Gewebes vorangedrungen sind, was einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit abgibt, dass in dem Gehirn oder dem anderen Organ immer noch ein Tumor vorhanden ist oder dass Tumorzellen an der Peripherie des entfernten Gewebes nicht mehr vorhanden sind. Hierdurch wird eine Aussage über die Möglichkeit gegeben, dass der gesamte Tumor aus dem Gehirn oder einem anderen Organ entfernt worden ist. Es hat sich weiterhin gezeigt, dass TAG und Anti-Malignine, deren Herstellung oben beschrieben wurde, gegenüber Gliom-Gehirntumorzellen, die in vitro in einer Gewebekultur gezüchtet worden sind, cytotoxisch sind. Diese hohe Affinität für Tumorzellen in einem anderen Medium, die in diesem Fall in einer Gewebekultur gezüchtet worden sind, ist ein weiteres Beweisanzeichen für das spezifische Kupplungspotential der neuen TAG-Produkte. Hierdurch wird der Name «am Target haftende Globuline» (Target-Attaching-Globulins) (TAG) erläutert, wie es auch die Eigenschaften von TAG hinsichtlich des synthetischen Target-Produktes und den Tumorzellen in histologischen Schnitten tun.

Die Cytotoxizität von TAG und Anti-Recogninen gegenüber Tumorzellen liefert einen weiteren, neuen, diagnostischen Test für das Serum von Patienten, bei denen Tumorverdacht besteht. Somit wird z.B. das Serum oder eine andere Körperflüssigkeit dieser Patienten mit Target unter Bildung von TAG umgesetzt. Das TAG-Produkt wird in Gewebekulturen von Tumorzellen auf die Cytotoxizität getestet. Sowohl die Konzentration an TAG als auch der Grad der Cytotoxizität, der von dem TAG gezeigt wird, welches aus dem Serum einer gegebenen Person erzeugt werden kann, können nicht nur für diagnostische Zwecke geeignet sein, sondern auch von Wert sein, um den Verlauf der Krankheit präoperativ und postoperativ bei einem gegebenen Patienten zu verfolgen. Die Kupplung von radioaktiven und Farbstoff-Tra-cern an TAG liefert neue TAG-Produkte, die in vivo für die Diagnose von Tumoren und ihre exakte Lokalisierung geeignet sind. Somit gestattet die intraarterielle oder intravenöse Injektion von geeignet markiertem TAG in die cerebrospinale Flüssigkeit oder direkt in das Gehirngewebe oder seine Höhlungen das Vorhandensein eines Gehirntumors durch radioaktive Mittel oder durch Sichtbarmachung durch den gekuppelten Farbstoff anzuzeigen, da das TAG spezifisch nur an den Tumorzellen haftet. Ferner gestattet diese Methode die präzise Sichtbarmachung des Orts des Gehirntumors. Dies stellt eine Verbesserung dieser diagnostischen In-vivo-Methode unter Verwendung von in Kaninchenblut erzeugtem Anti-Astrocytin zur Markierung des Gehirntumors dar, weil die Verwendung von TAG, das aus Human-s serum erzeugt worden ist, die Möglichkeit von Fremdproteinreaktionen vermeidet. Da TAG und Anti-Recognine chemisch spezifische Eigenschaften haben, die die bevorzugte Anheftung an Astrocytin-Vorläufer enthaltende Tumorzellen sowohl in vitro als auch in vivo gestatten, io können diese Produkte sowohl therapeutisch als auch diagnostisch verwendet werden, wenn sie z.B. mit radioaktiven Mitteln, Protonen einfangenden Mitteln oder anderen toxischen physikalischen oder chemischen Mitteln gekuppelt sind, so dass diese toxischen Substanzen bevorzugt durch die 15 Spezifizität dieser Verbindungen, an Tumorzellen im Vergleich zu den benachbarten normalen Zellen zu haften, lokalisiert werden können. Diese Selektivität wird als wesentlich oder zumindest als ein wesentlicher Faktor angesehen, um eine wirksame chemische oder physikalische Therapie von 20 Tumoren zu erreichen. Ein solcher Faktor ist bislang noch nicht erreicht worden. Das TAG hat nun seine Wirksamkeit gezeigt, bevorzugt an den Tumorzellen zu haften, so dass es aus diesen Gründen eine gewisse Aussicht als neues Arzneimittel haben müsste.

25 Im Serum von Patienten mit malignen Tumoren kann, wie aus den Beispielen ersichtlich werden wird, ein Typ von TAG, nämlich Langsam-TAG (SLOW-TAG) (S-TAG) gegenüber Schnell-TAG (FAST-TAG) (F-TAG) in relativ grösseren Mengen aus einem gegebenen Serumvolumen 30 erzeugt werden als bei Patienten ohne solche Tumoren. Dies deutet daraufhin, dass die Konzentration eines natürlich vorkommenden Vorläufers (P-TAG) für TAG erhöht ist oder dass andere Faktoren vorliegen, die die relative In-vitro-Erzeugung von S-TAG gegenüber F-TAG begünstigen. 35 Die mögliche Beziehung zwischen der Funktion der tatsächlichen synthetischen Produkte Target und TAG und ihren Vorläufern und seinerseits den Funktionen der postulierten, jedoch noch nicht gezeigten Zell-« Antigene» und der zirkulierenden «Antikörper», gegenüber denen sie in vivo 40 existieren können, ist bislang noch nicht aufgeklärt worden. So ergeben z.B. F-TAG und S-TAG in antikörperartiger Weise einzige bzw. einzelne diskrete Linien der Reaktion mit Astrocytin bei der Ouchterlony-Geldiffusion, und die Injektion von Target in Kaninchen induziert eine Zunahme der 45 Ausbeute der TAG-Produkte aus dem Kaninchenserum nach der Umsetzung mit dem Target. Die Entdeckung, dass ein normaler Gehalt eines Vorläufers vorliegen kann, der dem zirkulierenden Antikörper gegenüber einem Zell-Antigen ähnelt, welches in den nicht-teilenden Zellen verborgen ist, so wirft die Frage nach einer möglichen Funktion des Paars auf. Es wird hier vorgeschlagen, dass der TAG-Vorläufer (P-TAG) und targetähnliche Substanzen in vivo existieren, die eine Funktion der Kontrolle der Zellproliferation und des Zellabsterbens ausüben. So kann z.B. während der Zelltei-55 lung ein Zellbestandteil den Serumproteinen ausgesetzt werden, was normalerweise nicht direkt der Fall ist. Die Aussetzung dieses Zellbestandteils könnte dazu führen, dass dieser Bestandteil in eine targetartige Substanz umgewandelt wird, an dem die Anhaftung eines P-TAG-artigen Moleküls 60 aus dem Serum sodann stattfinden könnte, was die Zellteilung stimulieren oder inhibieren würde. Alternativ kann eine , nicht-teilende Zelle, die beschädigt worden ist oder die falsch funktioniert, eine targetartige Substanz freisetzen, an der die Anheftung der P-TAG-artigen Moleküle reparierend sein 65 kann. Jedoch, unter bestimmten Zellbedingungen, kann die Anhaftung der P-TAG-artigen Moleküle die Zerstörung der Zelle induzieren (so ist z.B. synthetisch hergestelltes, wie hierin beschrieben, Anti-Gliom-TAG gegenüber Gliomtu-

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morzellen, die in einer Gewebekultur wachsen, ausgeprägt cytotoxisch). Dies könnte somit das Spiegelbild eines normalen Mechanismus zur Kontrolle der Zellteilung und entweder zur Reparatur oder zur Entfernung von individuellen Zellen in dem Körper durch die Lebenszeit des Organismus hindurch darstellen. Wenn das Aussetzen der Zellbestandteile abnorm erhöht ist, so dass abnorm grosse Mengen von targetartigen Zellsubstanzen gebildet werden, was z.B. bei rasch teilenden Krebszellen wie in Gehirngliomen erfolgen kann, dann kann eine Zunahme der Konzentration von einem Typ von Serum P-TAG gegenüber einem anderen induziert werden.

Ungeachtet der tatsächlichen Funktion der Vorläufer ist die Zunahme der relativen Menge eines vorherrschenden Typs von TAG, Langsam-TAG (SLOW-TAG) (S-TAG), der in vitro nach den beschriebenen Methoden aus dem Serum von Patienten mit malignen Tumoren hergestellt werden kann, die Basis für die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen serum-diagnostischen Tests.

Beispiel 1

Herstellung einer den Astrocytin-Vorläufer enthaltenden Rohfraktion.

Menschliches Gehirngliomtumorgewebe, entfernt bei einem chirurgischen Eingriff, wird von Oberflächenblutge-fässen und normalem Gehirngewebe soweit wie möglich freigeschnitten. Für eine typische Menge von herausseziertem Tumorgewebe von 11 g wird das Gewebe in sechs 1,5 g Proben und zwei 1,0 g Proben abgewogen. Jede Probe wird wie folgt behandelt.

Jede Probe wird in einer neutralen Pufferlösung durch Beschallung oder andere mechanische Massnahmen homogenisiert. So wird z.B. jeder Teil in 100 ccm einer 0,005 M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7 pro Gramm Gewebe in einem Waringmischer homogenisiert. Die Homogenisierung sollte in der Kälte erfolgen, um eine Denaturierung der Proteine zu verhindern. So sollte z.B. der Mischer in einem kalten Raum von 0 bis 5°C vorgekühlt und nur etwa 3 Minuten lang in Betrieb genommen werden.

Das Homogenat wird sodann zur Klärung, beispielsweise mit der 80 OOOfachen Schwerkraft 30 Minuten lang in einer gekühlten Ultrazentrifuge, zentrifugiert. Das lösliche überstehende Produkt wird dekantiert und in der Kälte gehalten. Der unlösliche Rückstand wird mit weiteren 100 ccm des neutralen Puffers rehomogenisiert und wie vorstehend beschrieben zentrifugiert. Der zweite lösliche Extrakt wird mit dem ersten Extrakt kombiniert. Beste Ergebnisse werden erhalten, wenn diese Verfahrensweise der Homogenisierung und Zentrifugierung wiederholt wird, bis weniger als 50 \ig Protein/ml Lösung in dem überstehenden Produkt erhalten werden. Bei den meisten Geweben wird dies durch die fünfte Extraktion erreicht.

Die auf diese Weise erhaltenen Lösungen werden kombiniert und durch Eindampfung und nachfolgende Dialyse, z.B. Dialyse gegen einen 0,006 M Phosphatpuffer in der Kälte, konzentriert, um ein Volumen von 15 ml zu erhalten. Das Volumen dieser Lösung wird notiert und ein aliquoter Teil wird zur Analyse des Gesamtproteins entnommen. Der Rest wird fraktioniert, um eine Proteinfraktion mit einem pK-Bereich zwischen 1 und 4 zu erhalten. Die bevorzugte Fraktionierungsmethode ist eine chromatographische Methode, wie sie nachstehend beschrieben wird.

Die Lösung wird in einem kalten Raum (4°C) auf einer Säule mit DEAE-Cellulose (Cellex-D) mit den Abmessungen 2,5 x 11,0 cm fraktioniert. Die Säule ist mit einem 0,005 M Natriumphosphatpuffer ins Gleichgewicht gesetzt worden. Es werden stufenweise Veränderungen des Eluierungslö-

sungsmittels mit den folgenden Lösungsmitteln (Lösungen) durchgeführt:

Lösung (1): 4,04 g NaH2P04 und 6,50 g Na2HPÛ4 werden in 151 destilliertem Wasser (0,005 molar, pH 7) aufgelöst; Lösung (2): 8,57 g NaH2P04 werden in 2480 ml destilliertem Wasser aufgelöst;

Lösung (3): 17,1 g NaH2PÛ4 werden in 2480 ml destilliertem Wasser (0,05 molar, pH 4,7) aufgelöst;

Lösung (4): 59,65 g NaH2P04 werden in 2470 ml destilliertem Wasser (0,175 molar) aufgelöst;

Lösung (5): 101,6 g NaH:P04 werden in 2455 ml destilliertem

Wasser (0,3 molar, pH 4,3) aufgelöst;

Lösung (6): 340,1 g NaH2PÛ4 werden in 2465 ml destilliertem

Wasser (1,0 molar, pH 4,1 ) aufgelöst;

Lösung (7): 283,64 g 80%ige Phosphorsäure (H3PO4) werden in 2460 ml destilliertem Wasser (1,0 molar, pH 1,0) aufgelöst.

Es wird ein Nervengewebeextrakt mit einem Volumen von 6 bis 10 ml zugesetzt. Sodann wird durch die Säule durchlaufen gelassen. Hierauf wird mit der Lösung (1) übergelegt und es wird ein Reservoir von 30 ml der Lösung (1) angebracht, damit diese Lösung durch die Schwerkraft auf die Säule auftropft. Aliquote Teile von 3 ml des abströmenden Produkts werden mittels eines automatischen Fraktionssammlers gesammelt. Die nachfolgenden Eluierungslö-sungen werden stufenweise bei den folgenden Zahlen der Eluierungsröhrchen ausgetauscht:

Lösung (2): beim Röhrchen 88; die Lösung wird in die Säule auf die Oberseite des Harzes aufgebracht, sodann wird überlegt und ein Reservoir von 50 ml der Lösung (2) angefügt; Lösung (3): beim Röhrchen 98; die Lösung wird in die Säule auf die Oberseite des Harzes aufgebracht, sodann überlegt und es wird ein Reservoir von 75 ml der Lösung (3) angefügt; Lösung (4): beim Röhrchen 114; die Lösung wird in die Säule auf die Oberseite des Harzes aufgebracht, sodann überlegt und es wird ein Reservoir von 150 ml der Lösung (4) angefügt;

Lösung (5): beim Röhrchen 155; die Lösung wird in die Säule auf die Oberseite des Harzes aufgebracht, sodann überlegt und es wird ein Reservoir von 125 ml der Lösung (5) ange-fügt;

Lösung (6): beim Röhrchen 187; die Lösung wird in die Säule auf die Oberseite des Harzes aufgebracht, sodann überlegt und es wird ein Reservoir von 175 ml der Lösung (7) angefügt.

Die Eluierung wird bis zum Röhrchen 260 weitergeführt, wo die Eluierung vollständig ist. Es wird frisch hergestelltes Harz für jedes neue Volumen des Gewebeextrakts verwendet. Jedes Röhrchen für das abströmende Produkt wird quantitativ auf Protein untersucht. Die Eluate in den Röhrchen mit den Nummern 212 bis 230 werden kombiniert und sie enthalten die Rohpodukte, aus denen Astrocytin hergestellt wird.

Hinsichtlich dieses Rohmaterials, das als Fraktion 10B bezeichnet wird, sind zwar schon Werte veröffentlicht worden [Protein Metabolism of the Nervous System, S. 555-69 (Pleum Presse, 1970); Journal of Neurosurgery, Band 33, S. 281-286 (September 1970)], doch ist nunmehr auch die Abspaltung des spezifischen Produkts, das hierin als Astrocytin bezeichnet wird, von der Fraktion 10B gelungen. Die Rohfraktion 10B kann als Produkt in Mengen zwischen 0,1 und 10 mg/g des ursprünglichen frischen Nervensystemgewebes, aus dem es erhalten worden ist, hergestellt werden. Zusätzlich zu einem Astrocytin-Vorläufer enthält sie variierende Mengen von kovalent gebundenen Kohlenhydratre-

5

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IS

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sten mit Einschluss einer Anzahl von Hexosen, nämlich Glucose, Galatose, Mannose; Hexosaminen mit Einschluss von Glucosamin, Galatosamin und Mannosamin; und gelegentlich weiteren Zuckern, z.B. Fructose, Ribose und möglicherweise Rhamnose. Sie enthält auch Proteinprodukte mit hohem Molekulargewicht, mehrere Lipide und Nuclein-säuren.

Beispiel 2

Herstellung von gereinigtem Astrocytin aus der Rohfraktion, die den Astrocytin-Vorläufer enthält.

Die den Astrocytin-Vorläufer enthaltende Fraktion wird weiterhin von Verunreinigungen befreit. Bei bevorzugten Ausführungsformen wird das Material des Beispiels 1 auf Sephadex G-50-Harz in einer typischen Säule mit einer Länge von 40 cm, einem Durchmesser von 2,5 cm und einem Volumen von 196 ml chromatographiert. Der angewendete Druck beträgt 40 mm Hg. Die Fliessgeschwindigkeit beträgt 35 ml/h und als Puffer wird eine 0,05 molare Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 verwendet. Der erste (Durchfluss) Peak enthält den Astrocytin-Vorläufer zusammen mit Verunreinigungen, während die darauf folgenden Peaks nur Verunreinigungen enthalten.

Bei der bevorzugten Ausführungsform werden sodann die Produkte in dem ersten Durchflusspeak auf Sephadex G-l 5 konzentriert und sodann auf eine Säule von Cellex-D mit der gleichen Lösung bzw. den gleichen Lösungen (1) bis (7), wie in Beispiel 1, ausgegeben, und es werden die gleichen Eluie-rungsstufen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Das Produkt Astrocytin liegt als scharfer Peak in den gleichen Röhren (Nr. 212 bis 230) wie zuvor vor. Es hält somit sein Verhalten bei der Chromatographie auf Cellex-D ohne die Anwesenheit einer grossen Anzahl von Verunreinigungen aufrecht.

Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht können sodann nach bekannten Techniken, z.B. durch eine Filtration durch Milliporenscheiben entfernt werden. Bei der bevorzugten Methode wird das Produkt Astrocytin von Salz und anderen niedermolekularen Verunreinigungen durch Filtration durch Milliporen Pellicon-Scheiben Nr. 1000 mit 13 mm befreit. Dieser Filter hält Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 1000 zurück und gestattet den Durchgang von Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 1000. Das Produkt Astrocytin bleibt auf den Pellicon-Scheiben zurück und wird davon durch Waschen mit der Lösung (1) des Beispiels 1 gewonnen.

Astrocytin wird sodann in der Weise erhalten, dass man die Verbindung mit einem Molekulargewicht von etwa 8000 aus der obigen Lösung isoliert. Bei einer bevorzugten Methode wird die Dünnschichtgel(TLG)-Chromatographie wie folgt angewendet.

Als Vorrichtung wird eine handelsübliche Vorrichtung von Boehringer Mannheim GmbH; Pharmacia Fine Chemicals and CAMAG (Schweiz) verwendet. Das Harz, nämlich 2,5 g Sephadex G-200 superfein, wird in 85 ml 0,5 M NaCl in 0,02 M Na:HPOjKHzPO-i-Phosphatpuffer, pH 6,8 (6,6 bis 7,0) vorbereitet. Es wird 2 oder 3 Tage bei Raumtemperatur unter gelegentlichem, behutsamem Vermischen quellen gelassen. (Es sollten keine Magnetrührer oder andere Rührer verwendet werden.) Das gequollene Gel wird 3 Wochen bei Kühlschranktemperatur stabilisiert, wobei jedoch ein Bakterien- und Pilzwachstum das gequollene Gel stören können. Wenn das Gel über längere Zeiträume gehalten werden soll, dann sollte eine geringe Menge eines bakteriostatischen Mittels (z.B. 0,02% Natriumazid) zugesetzt werden. 2,5 g trok-kenes Gel werden dazu verwendet, um zwei Glasplatten mit den Abmessungen 20x20 cm und einer Dicke von 0,5 mm zu beschichten. Die Platten werden entweder bei Raumtemperatur 10 Minuten lang trocknen gelassen und in eine feuchte

Kammer überführt, wo sie etwa 2 Wochen lang gelagert werden können, oder sie werden sofort nach einer geeigneten Vor-Ins-Gleichgewicht-Setzung verwendet (gewöhnlich während der Nacht über einen Minimalzeitraum von 12 Stunden). Die Hauptfunktion der Ins-Gleichgewicht-Setzung ist die Normalisierung des Volumenverhältnisses zwischen der stationären und der mobilen Phase. Bei einer horizontalen Stellung der ins Vor-Gleichgewicht gesetzten Platten werden die zu erfassenden Substanzen mit Mikropipetten als Flecken oder als Streifen an der Startlinie aufgebracht. 10 bis 20 ml der 0,2- bis 2%igen Proteinlösung werden auf die Kante einer mikroskopischen Objektplatte ( 18 x 18 mm) aufgebracht und gegen die Geloberfläche gehalten. Innerhalb von wenigen Sekunden dringt die Lösung in das Gel ein. Alle Proben werden zuerst auf den Deckplättchen hergestellt und sodann rasch aufgebracht. Wenn nicht genügend Material verwendet wird, dann ist es schwierig, nach der Trennung einzelne Flecken zu lokalisieren. Wenn zuviel Material aufgebracht wird, dann erfolgt keine definierte Trennung. Die Proben werden mit Puffer zur leichteren Handhabung verdünnt und die Auftrennung der Proben erfolgt nach der absteigenden Technik, wobei die Platte mit einem Winkel von 22° angeordnet ist. Eine Fliessgeschwindigkeit von etwa 1 bis 2 cm/h ist am besten geeignet. Markierungssubstanzen (z.B. Cytochrom C, Hämoglobin, Myoglobin oder mit Bromphenolblau markiertes Albumin) werden an verschiedenen Stellen über die Platte aufgebracht und sie dienen als Referenzproteine zur Errechnung des relativen Abstands (Mobilität) der unbekannten Substanzen. Nach Aufbringung der Proben werden die Platten in der Vorrichtung ersetzt und der Papiertampon wird leicht nach unten gedrückt, um einen guten Kontakt mit der Gelschicht zu gewährleisten. Der Papiertampon darf nicht tropfen. Überschüssige Feuchtigkeit wird abgewischt. Das flüssige Lösungsmittel im Reservoir wird konstant bei 1 cm vom oberen Ende des Gefässes gehalten. Die einzelnen Durchgänge sind gewöhnlich je nach dem Fortschritt der Trennung in 4 bis 7 Stunden beendigt. Bei gefärbten Substanzen kann die Auftrennung direkt verfolgt werden. Die aufgetrennten Flecken des Proteins werden leicht sichtbar gemacht, indem man sie auf eine Papierblattkopie der TLG-Platte überführt, nachdem die chromatographische Auftrennung vervollständigt worden ist, und indem man sie 48 Stunden auf dem System vorgewaschenes Methanol + H2O + Essigsäure - 90:5:5 anfärbt. Als Papierblatt wird ein 3 mm Filterpapier verwendet. Ein Papierblatt mit den Dimensionen 20 — 18 cm wird über die Gelschicht gelegt und gerade genügend aufgepresst (gewalzt), dass ein Kontakt mit dem Gel gewährleistet wird. Es wurde darauf geachtet, dass keine Luft unter dem Papier (der Kopie) eingefangen wird und dass die Gelschicht nicht gestört wird. Die flüssige Phase wird von der Gelschicht durch das Papier abgesaugt, und dieses wird nach etwa 1 Minute entfernt, sofort 15 Minuten in einem Ofen bei 60°C getrocknet und in normaler Weise nach beliebigen, routinemässigen Einfärbungsver-fahren eingefärbt. Die Einfärbung erfolgt, indem man das Kopiepapier mit 0,03% diazotierter Sulfanilsäure in 10% Natriumcarbonat (Pauley's Reagens) besprüht wird. Das Einfärben kann auch mit einer gesättigten Lösung von Ami-doschwarz in Methanol-Essigsäure (es werden 90:10 Vol/Vol verwendet) durchgeführt werden. Die Färbezeit beträgt 5 bis 10 Minuten. Zum Entfärben wird mit 2 Vol. einer Lösung aus 90:10 Methanol und Essigsäure, gemischt mit 1 Vol. H2O, gespült. Es ist schwierig, eine niedrige Hintergrundfärbung zu erhalten, ohne dass sehr ausgedehnt gewaschen wird. Die Platten selbst können auch bei etwa 60°C (in einem Ofen mit Luftzirkulierung) getrocknet werden, doch nur dann, wenn das Astrocytin angefärbt werden soll. Zum Zwecke der Isolierung sollte die Platte nur bei Raumtemperatur an der Luft s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

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60

65

9

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getrocknet werden. Ein Überhitzen kann zu einer Rissbildung führen, was aber gewöhnlich bei einer Temperatur von 50 bis 60°C vermieden werden kann, bei welcher eine Sephadex G-200-Platte in 15 bis 30 Minuten trocknet. Die trok-kenen Platten werden 10 Minuten in einem Gemisch aus Methanol + H2O + Essigsäure (75:20:5) quellen gelassen und mit gesättigtem Amidoschwarz in dem gleichen Lösungsmittelsystem 5 Stunden lang angefärbt und sodann gewaschen, indem sie 2 Stunden in dem gleichen Lösungsmittel gebadet werden. Dann werden sie getrocknet. Zur Bestimmung des Molekulargewichts wird der Abstand von der Startlinie bis zum Mittel jeder Zone mit einer Genauigkeit von 0,05 mm entweder direkt auf dem Druck (Kopie) oder auf dem Densi-togramm gemessen. Das Ergebnis wird als Rm-Wert ausgedrückt, welcher als Verhältnis der Wanderungsstrecke des getesteten Proteins (dp) zu derjenigen des Cytochroms C oder Myoglobins (dm), welches als Referenzprotein verwendet wird, definiert. Die Beziehung der Wanderungsstrecke der getesteten Substanz zu dem Standard ergibt die Formel

(-R _ dP

v m — •

Tabelle (Fortsetzung)

Asparaginsäure

Threonin

Serin

Glutaminsäure Prolin

Ungefähre Anzahl der Reste

9

5

6 13

4

Glycin

6

Alanin

9

Valin

4

l/2Cystein

2

Methionin

1

Isoleucin

2

Leucin

8

Tyrosin

2

Phenylalanin

3

Lysin

8

Histidin

2

Arginin

4

ungefähre Gesamtzahl 88

15

Es wird eine Eichgerade erhalten, wenn man den Logarithmus des Molekulargewichts der verwendeten Standardproben gegen Rm aufträgt. Aus dieser Gerade kann das Molekulargewicht des unbekannten Proteins erhalten werden. Zur Erzielung exaktester Werte werden gleiche Teile der Proteinprobenlösung mit dem Standard, in diesem Fall Cytochrom C, vor dem Aufbringen auf die Platte vermischt. Durch die obige TLG-Verfahrensweise wird das Produkt Astrocytin als getrennter Flecken bei einem Abstand von ungefähr 0,83 ±0,02, bezogen auf die Standardsubstanz Cytochrom C, festgestellt, woraus sich ein ungefähres Molekulargewicht von 8000 für das Astrocytin ergibt. Es werden mehrere verschiedene Produkte von dem Astrocytin auf der Grundlage geringer Unterschiede des Molekulargewichts abgetrennt. Somit sind drei Produkte, die als Verunreinigungen bis zu diesem Punkt getragen worden sind, mit einem Molekulargewicht von ungefähr 64 000, 148 000 und 230 000 und gelegentlich ein Produkt mit einem Molekulargewicht von 32 000 festgestellt und durch die oben beschriebenen TLG-Methoden entfernt worden. Das Produkt Astrocytin wird mit dem Gel, in dem es enthalten ist, in trockener Form abgesaugt, in der Lösung (1) aufgelöst und durch Zentrifugierung oder ähnliche Massnahmen von dem Harz befreit.

Das Produkt Astrocytin, das in dieser Stufe erzeugt worden ist, ist in destillertem Wasser löslich, bei neutralem und saurem pH-Wert löslich und bei alkalischem pH-Wert unlöslich. Es hat bei einer Wellenlänge von 280 m|i einen spektrophotometrischen Absorptionspeak. Es handelt sich um ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 8000, wie oben angegeben. Die Hydrolyse mit 6n HCl gibt die kovalent verbundenen Aminosäuren an. Die quantitative automatische Untersuchung liefert die folgende durchschnittliche Zusammensetzung an Aminosäuren:

25

30

Cysteinsäure, Hydroxyprolin, Norleucin, Ammoniak, Iso-desmosin, Desmosin, Hydroxylysin, Lysinonorleucin, und y-Aminobuttersäure sind alle in erfassbaren Mengen nicht 20 vorhanden, doch kann eine Spur von Glucosamin vorhanden sein.

Aus 11 g des Ausgangsgehirntumorgewebes des Beispiels 1 werden nach den obigen Methoden ungefähr 3 mg gereinigtes Astrocytin erzeugt.

Beispiel 2A

Herstellung des «Taumel- bzw. Schwindel»-Recognins Die Taumel- bzw. Schwindelkrankheit ist eine genetische Störung, bei der Tiere nicht dazu imstande sind, eine stabile, koordinierte, motorische Aktivität zu erreichen, und bei der aufgrund des Fehlvermögens bestimmter Nervenzellen, zu einem besonderen Platz in dem Kleinhirn, dem Cerebellum, bei einer besonderen Entwicklungszeit zu wandern, ein Taumel- bzw. Schwindelzustand erzeugt wird. Bei elektronenmikroskopischen Untersuchungen sind besondere Glial-zellen gezeigt worden, welche vertikale, polartige Achsen ergeben, entlang derer die Nervenzellen im normalen Zustand zu ihren neuen Stellungen wandern. Das Fehlvermögen der Nervenzellen, diese Glialfasern bei der Taumelbzw. Schwindelkrankheit zu erklettern, ist vermutlich auf Störungen in den Nervenzellen oder den Glia oder beiden zurückzuführen.

Nach den Methoden der Beispiele 1 und 2 wurde Recognin aus dem Gehirn einer Maus, die mit der Taumel- bzw. Schwindelkrankheit behaftet war, hergestellt und mit Recognin verglichen, das aus dem Gehirn einer normalen Maus hergestellt worden war. Das Molekulargewicht des Recognins, das aus allen Gegenden des normalen Mäusegehirns hergestellt worden war, betrug 8000. Das Molekulargewicht des Taumel- bzw. Schwindel-Recognins betrug 3600 bis 5000. Das Taumel- bzw. Schwindel-Recognin ist abnormal, wie es durch das erheblich geringere Molekulargewicht angezeigt wird. Weiterhin ist die Recognin-Menge, die aus dem Kleinhirn des Taumel- bzw. Schwindel-Mausgehirns erzeugt wird, im Vergleich zum Normalfall erheblich vermindert. Dies wird in Tabelle I gezeigt.

Tabelle I

Recognin-Konzentration im Mäusegehirn, mg/g

40

45

50

60

Normal

Taumel- bzw. Schwindelkrankheit

65 Kleinhirn (16 Tage alte Maus) 2,50 0,71

Rinde (16 Tage alte Maus) 0,60 0,96

Rinde (4 Tage alte Maus) 0,29 0,53

Hirnstamm (16 Tage alte Maus) 0,90 1,64

639 102

Tabelle II (Fortsetzung)

Normal

Taumel- bzw.

Schwindel-

krankheit

Ganzhirn (17 Tage alte Maus)

1,27

1,53

Ganzhirn (1 Tag alte Maus)

5,00

5,86

Die Tabelle I zeigt, dass, obgleich eine ausgeprägte Abnahme der Konzentration von Recognin im Kleinhirn der Taumel- bzw. Schwindel-Maus vorliegt, doch in anderen Gegenden des Gehirns die gleichen oder grössere Mengen von Recogninen sind. Das Recognin kann sich nicht von den anderen Stellen des Gehirns in das Kleinhirn bewegen oder die geringfügige Zunahme in anderen Stellen des Gehirns der Taumel- bzw. Schwindel-Maus kann eine gewisse kompensatorische Wirkung widerspiegeln.

Dieses pathologische Recognin im Gehirn der Taumelbzw. Schwindel-Maus steht mit dem Unvermögen in Beziehung, dass die Hirnzellen wandern, um die Kontakte herzustellen, die erforderlich sind, um eine richtige Placierung zu erhalten, wodurch die Rolle der Recognine beim Erkennen und Erlernen in den Zellen bestätigt wird.

Analog können die Anti-Recognine gegenüber dem vom Gehirn von Taumel- bzw. Schwindel-Mäusen erzeugten Recognin hergestellt werden und in ähnlicher Weise wie das oben beschriebene Anti-Astrocytin und Anti-Malignin verwendet werden.

Beispiel 3

Herstellung des Malignin-Vorläufers in Kulturen von künstlichen Krebszellen.

Dabei wird sorgfältig darauf geachtet, dass eine sterile Arbeitsweise angewendet wird.

Alle Lösungen (z.B. Hank's Ausgleichssalz = Hank's Balanced Salt (BSS), F-10 Nährmedium, Serum von Kalbföten, Trypsinlösung) werden bei etwa 35°C in einem Wasserbad ungefähr 20 Minuten oder länger vor der Verwendung inkubiert.

Zellen werden von dem Tumorgewebe entfernt und in vitro über viele Generationen gezüchtet, wozu ein geeignetes Medium verwendet wird, wie es unten beschrieben wird. Die zu verwendenden Kolben werden mit einer Sterilisierungslö-sung, z.B. 12-Propanol plus Amphyl oder Creolinlösung, vorgespült.

Bei der bevorzugten Ausführungsform werden die künstlichen Krebszellen (d.h. Zellen, die in vitro über viele Generationen gewachsen sind) in 250 ml- Kolben wachsen gelassen. Das flüssige Medium, in dem die Zellen gezüchtet werden, wird in vorgespülte Bechergläser eingetragen. Die Zellen werden sodann mässig mit 5 bis 10 ml einer Hank'schen Ausgleichlösung BSS oder einer ähnlichen, anderen Lösung etwa 30 Sekunden lang gewaschen. Rühren ist zu vermeiden. Alle Wände und Oberflächen werden gewaschen. Die Lösung wird von Zellen durch Zentrifugierung in der Kälte über einen Zeitraum von 10 Minuten bei 3000 U/min geklärt. Das Medium wird in ein Becherglas wie oben gegossen. Es wird eine geringe Menge gepufferter Proteinase-Enzymlösung zugesetzt und es wird rasch gespült, um einen Abbau der Zellen zu vermeiden. Bei der bevorzugten Methode werden 1 bis 2 ml Trypsinlösung (EDTA) zugesetzt und es wird nur 10 Sekunden lang gespült. Die Trypsinlösung wird abgegossen.

Es wird ein ähnliches Volumen einer frischen Trypsinlösung zugesetzt und es wird inkubiert, bis durch mikroskopische Beobachtungen ersichtlich wird, dass sich die Zellen von den Wänden der Kammer abtrennen. Dies erfordert gewöhnlich 5 bis 10 Minuten. Es wird ein geeignetes Wachstumsmedium, z.B. 50 ml einer Lösung einer 7- bis 10%igen Lösung von Serum von Kalbföten in 100 ml F-10-Nährme-dium, zugesetzt.

25 ml des frischen Mediums mit den Zellen werden in eine neue Wachstumskammer für die Fortpflanzung überführt. Beide Kammern werden ungefähr 7 Tage lang in einen Inkubator von 35°C gegeben. Nach der Arbeitsweise dieses Beispiels bis zu diesem Punkt wird eine Kultur der künstlichen Krebszellen in zwei frische Kulturen ungefähr alle 7 Tage aufgeteilt. Diese gesamte Verfahrensweise kann so oft wie gewünscht in ungefähr 7tägigen Intervallen für jede Wachstumskammer wiederholt werden. Somit kann die Anzahl der in vitro wachsenden Zellen ungefähr alle 7 Tage verdoppelt werden.

Die Zellen können zur Erzeugung von Malignin ungefähr nach 7 Tagen des Wachstums exrahiert werden. So können z.B. folgendermassen Zellen, die in den einzelnen 250 ml-Wachstumskammern gezüchtet werden, gewonnen werden.

Das Medium wird in ein Zentrifugenrohr überführt und in der Kälte 10 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Das Medium wird verworfen. Die in der Wachstumskammer zurückbleibenden Zellen werden von den Kammerwänden abgekratzt und mit einer neutralen Pufferlösung in die Zentrifugenrohre hineingewaschen. Die Zellen werden zweimal mit einer neutralen Pufferlösung gewaschen, erneut in der Kälte bei 3000 U/min zentrifugiert und das Medium wird verworfen. Die gewaschenen Zellen werden in 10 ml neutralem Phosphatpuffer suspendiert, bis sie für die Extraktion der Fraktion, die den rohen Malignin-Vorläufer enthält, bereit sind.

Beispiel 4

Herstellung der Rohfraktion, die den Malignin-Vorläufer enthält.

Gewaschene Zellen, suspendiert in dem neutralen Puffer des Beispiels 3, werden mechanisch bei Bedingungen zerbrochen, bei denen eine Denaturierung der meisten Proteine vermieden wird. Bei der bevorzugten Methode werden die gewaschenen Zellen in der Kälte 20 Sekunden lang mit einer Schallvorrichtung behandelt.

Nach der Beschallung werden die Zellreste 30 Minuten bei 30 000 U/min zentrifugiert und das überstehende Produkt wird dekantiert. 10 ml aliquote Teile der Pufferlösung werden zum Waschen der zurückgebliebenen Zellreste verwendet. Es wird, wie oben beschrieben, beschallt und zentrifugiert, und die überstehenden Produkte werden kombiniert. Dieses Verfahren wird ein Mal wiederholt.

Das kombinierte überstehende Produkt wird vorverdampft, um das Volumen von ungefähr 30 ml auf etwa 6 bis 7 ml zu vermindern. Ein aliquoter Teil wird zur Gesamtpro-tein-Analyse abgenommen und der Rest wird entsprechend den Methoden des Beispiels 1 zur Herstellung des Astrocytin-Vorläufers fraktioniert.

Beispiel 5

Herstellung des gereinigten Malignin-Produktes von der Rohfraktion, die das Malignin enthält.

Das Produkt Malignin wird nach den Methoden des Beispiels 2 zur Herstellung von Astrocytin von Verunreinigungen weiter isoliert.

Bei der TLG-Stufe der bevorzugten Ausführungsform wird das Produkt Malignin als ausgeprägter Flecken in einem Abstand von ungefähr 0,91 +/— 0,02, bezogen auf den Stan-dard-Cytochrom C, beobachtet, was ein ungefähres Molekulargewicht von 10 000 für das Malignin ergibt.

Das in dieser Stufe hergestellte Malignin ist in destilliertem Wasser löslich, bei neutralem oder saurem pH-Wert löslich

10

s

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

639102

und bei alkalischem pH-Wert unlöslich. Es hat einen spektro-photometrischen Absorptionspeak von 280 mu. Es handelte sich um ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10000.

In Tabelle II sind die Molekulargewichte von Malignin, bestimmt durch die Dünnschichtgelchromatographie, dargestellt. Das Malignin war in stabilisierten Fermentationskulturen in aufeinanderfolgenden Generationen der Kulturen erzeugt worden. Die Reproduzierbarkeit der Molekulargewichtsbestimmungen ist angesichts der inhärenten Beschränkungen der TLG-Chromatographie beachtlich.

Tabellen

Reproduzierbarkeit des Molekulargewichts des gebildeten Malignins

Versuch

Mol.Gew.

Versuch

Mol.Gew.

Versuch

Mol.Gew.

Nr.

Nr.

Nr.

1

9 500

9

10 100

17

10180

2

8 900

10

10180

18

10190

3

10000

11

10180

19

10190

4

10 500

12

10180

20

10180

5

10100

13

10180

21

10 000

6

10 000

14

10 050

22

9 500

7

10150

15

10180

23

10180

8

12 500

16

10190

Die Hydrolyse mit 6 n HCl zeigt die kovalent verbundenen Aminosäuren des Malignins. Die quantitative Analyse ergibt die folgende durchschnittliche Zusammensetzung an Aminosäuren:

Ungefähre Anzahl der Reste

Asparaginsäure

9

Threonin

5

Serin

5

Glutaminsäure

13

Prolin

4

Glycin

6

Alanin

9

Valin

6

1/2 Cystein

1

Methionin

2

Isoleucin

4

Tabelle (Fortsetzung)

Leucin 8

Tyrosin 3

Phenylalanin 3

s Lysin 6

Histidin 2

Arginin _5

ungefähre Gesamtzahl 89

Die Aminosäuren Cysteinsäure, Hydroxyprolin, Nor-leucin, Ammoniak, Isodesmosin, Desmosin, Hydroxylysin, Lysinorleucin und y-Aminobuttersäure sind in erfassbaren 15 Mengen nicht vorhanden.

Eine typische Ausbeute an reinem Malignin aus zwölf 250 ml-Reaktionskammern des Beispiels 3 insgesamt ist ungefähr 1 mg Malignin.

Die einzigartigen Strukturen von Malignin und Astrocytin 20 wurden durch ausgedehnte Computeruntersuchungen bestätigt, wobei ihre Zusammensetzungen mit praktisch allen bekannten Proteinsubstanzen verglichen wurden.

Die Aminosäure-Zusammensetzung von Malignin und Astrocytin, die absoluten und relativen Mengen von jeder 25 Aminosäure-Komponente, ausgedrückt als Gesamtzahl der Aminosäurereste/Mol, und die absoluten und relativen Mengen jeder Aminosäure-Komponente, ausgedrückt als Molekulargewicht des Moleküls, wurden einer Matrizen-Computeranalyse gegen die grösste bekannte Aufzählung 30 von Proteinstrukturen in der Welt, nämlich der National Biomedicai Research Foundation, Washington, D.C., unterworfen. Beim Matrizen-Analysevergleich mit mehreren hunderttausend Proteinen und Proteinfragmenten wurde keine Struktur ermittelt, die mit derjenigen von Astrocytin oder 35 Malignin identisch war oder ihr sehr nahekam.

Die einzigen Proteine, die in irgendeiner Weise strukturell verwandt waren, sind in Tabelle III zum Vergleich zusammen mit ihren einzelnen Aminosäure-Zusammensetzungen und Molekulargewichten zusammengestellt. Der 40 Computer war so programmiert, dass er aus mehreren hunderttausend Möglichkeiten jeden beliebigen Grad der Strukturähnlichkeit identifizierte. So passen z.B. Proteine mit einem Molekulargewicht, das erheblich grösser oder kleiner ist, bei der Computeranalyse nicht. Auch solche Proteine mit 45 weniger als 85 oder mehr als 95 Resten, noch solche mit weniger als 12 oder mehr als 15 Glutaminsäureresten noch solche mit weniger als 6 oder mehr als 11 Asparaginsäurere-sten usw. für jede der betreffenden zwanzig Aminosäuren ergeben bei der Computeranalyse keine Passung.

Tabelle III

Vergleich der Strukturen von Astrocytin und Malignin mit den nächstkommenden Strukturen durch eine Computeranalyse

Astrocytin Malignin Cytochrom Ferredoxin Acylträger Rinder- Schweine- Gonadotropin b s ï m . ., E. coli neurophysin neurophysin freisetzendes

Luc. Gl. Alf. v ' y Hormon

Asparaginsäure

9

9

9

10

8

7

2

3

0

Threonin

5

5

6

4

6

6

2

2

0

Serin

6

5

5

7

8

3

6

7

1

Glutaminsäure

13

13

14

13

13

14

9

9

0

Prolin

4

4

3

5

3

1

8

7

1

Glycin

6

6

6

7

7

4

16

14

2

Alanin

9

7

4

6

9

7

6

7

0

Valin

4

6

4

6

9

7

4

2

0

Vi Cystein

2

1

0

5

5

0

14

14

0

Methionin

1

2

1

0

0

1

1

1

0

Isoleucin

2

4

4

4

4

7

2

2

0

Leucin

8

8

7

10

6

5

6

7

1

639102 12

Tabelle HI (Fortsetzung)

Astrocytin

Malignin

Cytochrom Ferredoxin bs Luc. Gl.

Alf.

Acylträger E. coli

Rinder-neurophysin

Schweine-neurophysin

Gonadotropin freisetzendes

Hormon

Tyrosin

2

3

3

3

4

1

1

1

1

Phenylalanin

3

3

3

3

2

2

3

3

0

Lysin

8

6

7

5

5

4

2

2

0

Histidin

2

2

7

1

2

1

0

0

1

Arginin

4

5

3

2

1

1

7

5

l

Asparagin

0

0

0

0

1

2

3

2

0

Tryptophan

0

0

1

1

1

0

0

0

1

Glutamin

0

0

0

4

3

4

5

4

0

Gesamtzahl der Reste

Molekulargew.

88 8000

89 10 000

87 10 035

96 10493

97 8509

77

97

92

10

Bei dieser «Fingerabdruckanalyse» müssen somit 22 einzelne Variablen passen bzw. übereinstimmen. Es zeigt sich, dass zwar einige Substanzen hinsichtlich eines, vier oder fünf Variabler passen, dass aber keine hinsichtlich aller 22 Variablen passen bzw. übereinstimmen. Tatsächlich findet keine bessere Übereinstimmung als mit 14 Variablen statt, wobei somit Unterschiede an 8 Variablen zurückbleiben.

Die nächstkommende Substanz ist daher Cytochrom bs (vom Menschen). Wie aus Tabelle III ersichtlich wird, unterscheiden sich die Alanin-, Arginin-, Asparagin-, Asparaginsäure-, Cystein-, Glutamin-, Histidin-, Methionin-, Tyrosin-und Tryptophan-Restzahlen alle erheblich bis ausgeprägt von denjenigen des Astrocytins und Malignins. Da Cytochrom bs 7 Histidinreste enthält, während Astrocytin und Malignin nur 2 Reste enthalten, können sie nicht die gleiche chemische Struktur haben.

Die unerwartetste Feststellung hinsichtlich der Zusammen setzung des Astrocytins und Malignins ist die hohe Konzentration an Glutaminsäure. Man würde erwarten, unter 89 nur 5 oder 6 solche Reste zu finden.

Weitere, nächstkommende Substanzen sind die Ferrodo-xine von Leucaene glauca und von alfalfa. Diese Substanzen unterscheiden sich jedoch ausgeprägt hinsichtlich vier bzw. sechs Aminosäuren und nennenswert hinsichtlich zwei anderer und schliesslich dadurch, dass sie 96 bzw. 97 Reste besitzen. Die am nächsten kommende Substanz ist das Acyl-trägerprotein von E. coli 26, doch unterscheidet sich diese Substanz ausgeprägt hinsichtlich elf Aminosäuren vom Malignin und Astrocytin und sie hat nur 77 Reste.

In Tabelle III sind schliesslich noch weitere Gehirnproteine (Neurophysin, vom Rind und vom Schwein, sowie das Gonadotropin freisetzende Hormon) zusammengestellt, um zu zeigen, wieviel schlechter die Übereinstimmung in der Computergedächtnisbank für die restlichen mehreren hunderttausend Proteinfragmente war.

Atmungsproteine können Metalle und/oder Hämkompo-nenten in ihrem In-situ-Zustand enthalten, doch enthält das isolierte Proteinfragment, z.B. für Apocytochrom bs, keines davon. Eine weitere Mikroanalyse von Astrocytin und Malignin hat gezeigt, dass diese Substanzen von Eisen, Schwefel, Phosphor und Magnesium frei sind (d.h. sie liegen in geringeren Mengen als 0,01% vor), und die Spektraleigenschaften zeigen eine typische Absorption bei 280 m,u. Nach Wiederkombination von Häm mit Apoprotein werden die typischen Absorptionsspektren zwischen 400 und 450 ma wiederhergestellt.

Trotz der strukturellen Einzigartigkeit von Astrocytin und Malignin gegenüber allen anderen Proteinen und Proteinfragmenten ist es erwähnenswert und möglicherweise von grosser Wichtigkeit, dass die engsten Strukturen diejenigen der Atmungsproteine sind. Es ist bekannt, dass viele wichtige Beziehungen sowohl vom entwicklungsgenetischen Gesichtspunkt als auch vom funktionellen Gesichtspunkt hinsichtlich des Typs der repräsentierten Struktur gezogen werden 2s können. Wenn Astrocytin und Malignin neue Proteinprodukte sind, deren In-situ-Strukturäquivalente respiratorische bzw. Atmungsfunktionen darstellen, und wenn diese Proteine, wie nun gezeigt wird, eine Beziehung zur Malignität haben, dann ist eine Möglichkeit aufgefunden worden, um 30 eines der grössten Rätsel des Krebses zu lösen - d.h. wie die energetischen Verhältnisse sind, denen bei diesen unersättlichen, rasch reproduzierenden malignen Zellen genüge getan wird.

Abgesehen von der theoretischen Wichtigkeit dieser Ent-35 deckung ergänzen sich die obigen Werte hinsichtlich der Zunahme der Prozentmenge des Malignins in stärker malignen Zellen mit den unten angegebenen Werten, welche anzeigen, dass Anti-Malignin nicht nur an mäligninartigen chemischen Gruppierungen der Krebszelle haftet, sondern 40 dass dieses angehaftete Produkt gegenüber den Zellen cytoto-xisch ist. Wenn die maligninartigen In-situ-Verbindungen in den Krebszellen Atmungsproteine sind, weil sich die erfin-dungsgemässen Anti-Maligninprodukte bevorzugt an diese In-situ-Verbindungen anheften, dann ist es, wenn funktio-45 nelle respiratorische Gruppen bei dieser Anheftung eine Rolle spielen, leicht zu verstehen, wie dies zum Absterben der Krebszellen führt.

Die therapeutischen Möglichkeiten für die Anti-Malignine und andere ähnliche chemische Gegenstücke werden durch so diese Strukturinformation über Malignin und Astrocytin sowie durch die gezeigte Beziehung zwischen der Malignin-Menge und dem Malignitätsgrad stark erhöht.

Beispiel 5A

55 Dieses Beispiel zeigt, dass eine erhöhte Ausbeute und erhöhter Malignitätsgrad sowie erhöhter Malignin-Anteil erhalten werden können, wenn man während der Fermentation ein grösseres Volumen und eine grössere Oberfläche vorsieht.

60 Die Beispiele 3 bis 5 wurden wiederholt, wobei anstelle der 250 ccm-Kolben 1000 ccm-Kolben verwendet wurden. Alle Reagensmengen wurden dreifach erhöht.

Die Ausbeute des Produkts Malignin nach einem 7tägigen Wachstum des Inokulums war fast zweifach gesteigert, indem 65 der für das Wachstum der malignen Zellen verfügbare Raum von 250 ccm auf 1000 ccm erhöht wurde. Die Tabelle IV zeigt die Ausbeute an Gesamtprotein in mg und das gebildete Malignin als Prozentsatz des Gesamtproteins bei aufeinan

13

639102

derfolgenden Generationen von Fermentationskulturen in den Kolben jeder Grösse. Unter Verwendung von 250 ccm-Kolben war das durchschnittlich erzeugte Gesamtprotein 17,5 mg. Unter Verwendung von 1000 ccm-Kolben war das durchschnittlich erzeugte Gesamtprotein 40,4 mg.

Überraschenderweise wurde, als das Ausmass des Wachstums der malignen Zellen (Malignitätsgrad) über eine 7tägige Wachstumsperiode durch Zurverfügungstellung eines grösseren Raums und einer grösseren Oberfläche für das Zellwachstum erhöht wurde, die Gesamtmenge an gebildetem Malignin, ausgedrückt als Prozentsatz des gesamten Proteins, signifikant erhöht. Der Prozentsatz von Gesamtprotein, der aus Malignin besteht, wurde von einem Mittelwert von 10,7% bei Verwendung von 250 ccm-Kolben auf einen Mittelwert von 28,3% bei Verwendung von 1000 ccm-Kolben bei einer konstanten Wachstumsperiode von 7 Tagen erhöht.

Die Beziehung zwischen dem Verhältnis des gebildeten Malignins und dem Malignitätsgrad (d.h. als Funktion des Ausmasses des malignen Zellwachstums in vitro über 7 Tage, gemessen als gebildetes Gesamtprotein) wird in der Figur dargestellt.

Tabelle IV

Verbesserte Ausbeuten bei aufeinanderfolgenden Generationen von Fermentationsproduktionskulturen von Malignin

Kolbengrösse

Malignin

Gesamtprotein

% Malig ccm mg mg

250

0,33

6,4

5,1

250

0,16

6,7

2,4

250

0,21

8,9

2,4

250

1,3

26,3

4,8

250

1,4

21,6

6,4

250

2,6

17,9

14,4

250

1,8

16,4

10,7

250

1,3

13,4

9,8

250

2,0

17,8

11,3

250

2,3

18,9

12,0

250

2,1

19,4

10,8

250

1,6

13,8

11,6

250

2,2

15,1

14,6

250

4,4

21,6

20,4

250

3,3

14,0

23,2

250

2,2

23,0

9,7

250

2,1

23,2

9,0

250

2,8

22,3

12,5

250

2,4

18,9

12,7

250

2,4

24,5

9,8

Mittelwert

17,5 mg

10,7%

1000

9,8

41,3

23,6

1000

7,2

25,4

28,4

1000

5,9

24,9

23,6

1000

11,7

37,5

31,2

1000

13,3

44,8

29,8

1000

16,5

56,5

29,4

1000

9,5

41,3

22,9

1000

10,7

38,8

27,5

1000

12,5

41,6

29,9

1000

13,3

46,7

29,4

1000

11,6

45,2

25,7

Mittelwert

40,4 mg

28,3%

Das Beispiel 5 A zeigt, dass das Wachstum von künstlichen Krebszellkulturen in grossdimensionierten Wachstumsbehältern überraschenderweise eine erhöhte Verhältnismenge des erzeugten Malignins bewirkt, d.h. eine Zunahme der Prozentmenge des gebildeten Gesamtproteins, die aus Malignin besteht. Hierin soll unter einem «grossdimensionierten Wachstumsbehälter» ein solcher verstanden werden, bei dem das Verhältnis von Behältervolumen zu dem Volumen des Gesamtmediums mit den gemäss den Methoden des Beispiels 3 verwendeten Zellen grösser als etwa 8:1, z.B. 7:1 bis 10:1, ist. Das Beispiel 5 A beschreibt ein Verhältnis von etwa 8:1.

Beispiel 6

Herstellung von Target-Reagentien aus Recogninen.

Astrocytin, hergestellt wie in Beispiel 2 oben, oder Malignin, hergestellt wie in Beispiel 5 oben, wird mit einem Träger unter Bildung eines Target-Reagens in einen Komplex überführt.

Bei der bevorzugten Ausführungsform wird Astrocytin oder Malignin in einem 0,15 M NaH2P04-Citratpuffer mit einem pH-Wert von 4,0 aufgelöst. Ein Bromacetylharz, z.B. Bromacetylcellulose (BAC), mit 1,0 bis 1,5 mÄquiv. Brom/g Cellulose, gelagert in der Kälte, wird in 0,15 M NaH2P04-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 vorbereitet. Der Puffer wird auf einen pH-Wert von 4 eingestellt, indem die Pufferlösung mit dem pH-Wert von 7,2 abgegossen und indem 0,15 M NaH2P03-Citratpuffer mit einem pH-Wert von 4,0 zugefügt wird. Die Astrocytin- oder Malignin-Lösung und die BAC-Lösung werden miteinander (Verhältnis BAC zu Recognin 10:1) 30 Stunden bei Raumtemperatur verrührt und dann zentrifugiert.

Es wird bevorzugt, dass alle Stellen auf dem BAC, die für eine Bindung mit dem Recognin verfügbar sind, gebunden werden. Dies kann wie folgt erreicht werden. Das überstehende Produkt von der unmittelbar vorhergehenden Stufe wird lyophilisiert und der Proteingehalt wird bestimmt, um die Menge von Astrocytin oder Malignin, die nicht mit dem BAC in einen Komplex überführt worden ist, zu ermitteln. Das komplexierte BAC-Astrocytin (oder BAC-Malignin) wird in einem 0,1 M Bicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 8,9 wieder suspendiert und 24 Stunden bei 4°C gerührt, um die Bildung von chemischen Bindungen zwischen dem BAC und dem Astrocytin oder Malignin zu gestatten. Nach den 24 Stunden wird die Suspension zentrifugiert und das überstehende Produkt wird auf Protein analysiert. Das komplexierte BAC-Astrocytin oder BAC-Malignin wird nun in 0,05 M Aminoäthanol - 0,1 M Bicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 8,9 resuspendiert, um gegebenenfalls nichtum-gesetztes Brom zu blockieren. Die Suspension wird zentrifugiert und das überstehende Produkt wird aufbewahrt, jedoch aufgrund des Vorhandenseins von Aminoäthanol nicht analysiert. Die Entfernung des gesamten, ungebundenen Astrocytins oder Malignins wird sodann durch Zentrifugierung und Resuspendierung für drei Waschstufen in 0,15 M NaCl, bis in einem Spektrophotometer bei 266 mji. keine Absorption mehr gemessen wird, bewerkstelligt. Der BAC-Astrocytin-oder BAC-Malignin-Komplex wird nun in 8 M Harnstofflösung 2 Stunden bei 38°C verrührt, zentrifugiert, sodann mit 8 M Harnstoffiösung gewaschen (normalerweise reicht ein dreimaliges Waschen aus), bis in der Waschflüssigkeit bei 266 mu keine Absorption mehr gezeigt wird. Sodann wird der Komplex zweimal mit 0,15 M NaCl gewaschen, um den Harnstoff zu entfernen. Der Komplex wird hierauf bei 37°C in 0,25 M Essigsäure 2 Stunden lang gerührt, um seine Stabilität zu demonstrieren. Es wird zentrifugiert und das überste-hene Produkt wir bei 266 mji. untersucht, wobei keine Absorption vorhanden sein sollte. Dieses chemisch komplexierte BAC-Astrocytin oder BAC-Malignin ist daher stabil, und es kann nunmehr als Reagens bei den unten beschriebenen Methoden verwendet werden. In dieser Form eines sta5

10

IS

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

639 102

14

bilen Reagens wird es als synthetisch hergestellter Komplex bezeichnet, dessen physikalische und chemische Eigenschaften den stabilen, zellgebundenen Vorläufer von Astrocytin oder Malignin nachahmen, wenn er sich in einem reaktiven Potentialzustand mit den Serumkomponenten befindet. 5 Zur Lagerung wird das Target-Reagens zentrifugiert und mit 0,15 M NaH2P04-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 neutral gewaschen.

Target-Reagentien können aus anderen bromacetyl-ligan-dierten Trägern, ausser Cellulose, z.B. bromacetylierten 10 Harzen oder sogar Filterpapier, hergestellt werden.

Beispiel 7

Herstellung von Antiseren gegenüber Astrocytin, Malignin und Target. 15

Antiseren gegenüber Astrocytin, Malignin oder Target-Reagentien können hergestellt werden, wenn man in einem Säugetier eine Antikörper-Reaktion gegen diese induziert. Hierzu hat sich folgende Arbeitsweise als zufriedenstellend erwiesen. 20

1 mg Recognin (Astrocytin oder Malignin) wird zusammen mit Standard-Freund-Adjuvans in die Zehenkissen von männlichen weissen Kaninchen injiziert. Sodann erfolgt die gleiche Injektion intraperitoneal eine Woche später, erneut intraperitoneal 10 Tage und, erforderlichenfalls, 3 Wochen 25 später. Spezifische Antikörper können in dem Blutserum dieser Kaninchen schon eine Woche bis 10 Tage nach der ersten Injektion entdeckt werden. Dieselbe Verfahrensweise wird bei dem Target-Antigen angewendet, wobei man diejenige Menge an Target injiziert, die 1 mg Astrocytin oder 30 Malignin, bestimmt durch die Folin-Lowry-Proteinbestim-mung, enthält.

Der spezifische Antikörper gegenüber Astrocytin wird als Anti-Astrocytin bezeichnet. Der spezifische Antikörper gegenüber Malignin wird als Anti-Malignin bezeichnet. 35 Gleichermassen wird der spezifische Antikörper gegenüber Target-Reagens als Anti-Target bezeichnet.

Diese Antikörper zeigen eindeutig bei Standard-Ouchter-lony-Geldiffusionstests für Antigen-Antikörper Reaktionen mit spezifischen, einzigen, scharfen Reaktionslinien, die mit 40 ihrem spezifischen Antigen gebildet werden.

Das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern im Serum kann auch durch den quantitativen Standard-Präzipi-tintest für Antigen-Antikörper-Reaktionen getestet werden. Gute, quantitative Präzipitin-Kurven werden erhalten und 45 daraus können die Mikrogramme des spezifischen Antikörpers errechnet werden.

Ein weiterer Beweis für das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern in dem Serum kann durch Absorption des spezifischen Antikörpers Anti-Astrocytin auf Bromacetylcel- so lulose-Astrocytin (BAC-Astrocytin), wie es oben hergestellt wurde, erhalten werden. Das Antiserum, das spezifisches Anti-Astrocytin enthält, kann mit BAC-Astrocytin umgesetzt werden. Wenn das Serum über BAC-Astrocytin geleitet wird, dann binden sich nur die spezifischen Antikörper gegenüber ss Astrocytin an ihr spezifisches Antigen Astrocytin. Da Astrocytin kovalent an Bromacetylcellulose gebunden ist, ist nunmehr der spezifische Antikörper, Anti-Astrocytin, an das BAC-Astrocytin gebunden, um BAC-Astrocytin-Anti-Astro-cytin (BACA-Anti-Astrocytin) herzustellen. Dies wird 60

dadurch bewiesen, dass man den Rest des Serums testet,

welches von BAC-Astrocytin freigewaschen worden ist. Bei der Standard-Ouchterlony-Diffusion bleiben nun keine Antikörper in dem Serum zurück, die sich mit dem Astrocytin umsetzen könnten. Es wird daher die Schlussfolgerung 6s gezogen, dass alle spezifischen Antikörper (Anti-Astrocytin), von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie in dem Serum vorhanden waren, nun von dem BAC-Astrocytin absorbiert worden sind. Weiterhin, wenn das Anti-Astrocytin von seiner Bindung an BAC-Astrocytin freigesetzt ist, dann ist es hierdurch von allen verunreinigenden Antikörpern frei isoliert worden. Diese Freigabe von Anti-Astrocytin kann in der Weise erzielt werden, dass man das gekuppelte BACA-Anti-Astrocytin mit 0,25 M Essigsäure (4°C, 2 Stunden) wäscht, wobei, wie oben gezeigt wurde, die BAC-Astrocytin-Bindung nicht aufgebrochen wird.

Ein weiterer Beweis für das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern in dem Serum kann durch Adsorption des spezifischen Antikörpers Anti-Malignin auf dem oben hergestellten Bromacetylcellulose-Malignin (BAC-Malignin) erhalten werden. Das das spezifische Anti-Malignin enthaltende Antiserum kann mit BAC-Malignin umgesetzt werden. Wenn das Serum über BAC-Malignin geleitet wird, dann binden sich nur die spezifischen Antikörper für das Malignin an ihr spezifisches Antigen Malignin. Da Malignin kovalent an Bromacetylcellulose gebunden ist, ist nunmehr der spezifische Antikörper Anti-Malignin an das BAC-Malignin gebunden, um BAC-Malignin-Anti-Malignin (BACM-Anti-Malignin) herzustellen. Dies wird dadurch bewiesen, dass man den Rest des Serums, welches von BAC-Malignin freigewaschen worden ist, testet. Bei der Standard-Ouchterlony-Diffusin bleiben keine Antikörper in dem Serum zurück, die sich mit dem Malignin umsetzen. Es wird daher die Schlussfolgerung gezogen, dass alle spezifischen Antikörper (Anti-Malignin), von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie in dem Serum vorhanden sind, von dem BAC-Malignin absorbiert worden sind. Wenn weiterhin das Anti-Malignin von seiner Bindung an BAC-Malignin freigesetzt wird, dann ist es hierdurch frei von allen verunreinigenden Antikörpern isoliert worden. Diese Freisetzung von Anti-Malignin kann erreicht werden, indem man den BACM-Anti-Malignin-Komplex mit 0,25 M Essigsäure (4°C, 2 Stunden) wäscht, wobei, wie oben gezeigt wurde, die BAC-Malignin-Bindung nicht aufbricht.

Die Antikörper gegenüber Target zeigen klar bei Standard-Ouchterlony-Geldiffusionstests für Antigen-Antikörper Reaktionen mit spezifischen einzigen Reaktionslinien, die mit Target gebildet werden, welche eine Identitätslinie mit der Linie der Reaktion gegenüber Anti-Astrocytin- oder Anti-Malignin-Antiseren (d.h. diejenigen, die zu der Injektion von Astrocytin oder Malignin selbst gebildet worden sind) zeigen. Einige Kaninchen, so wurde festgestellt, haben vor der Injizierung mit Target schon Gehalte an Anti-Target in ihrem Blut. Diese Anti-Target-Substanzen führen, wenn sie spezifisch mit dem Target-Reagens, wie es bei Tests mit Humanseren beschrieben wird, umgesetzt werden, zu der Bildung von ungefähr äquivalenten Mengen der zwei Typen von TAG, S-TAG und F-TAG, (vergi, die folgenden Beispiele).

Beispiel 8

Entdeckung von malignen Tumoren durch in vitro erfolgende quantitative Bildung von an Target haftenden Globulinen (Target-Attaching-Globulins) (TAG) von biologischen Flüssigkeiten.

Gemäss Beispiel 6 hergestelltes Target-Reagens wird gewaschen, um ungebundenes Recognin, das aufgrund von Zersetzungen vorhanden sein kann, zu entfernen. Die folgende Verfahrensweise ist hierbei zufriedenstellend. Das Target-Reagens wird 2 Stunden bei 37°C mit Essigsäure gerührt, zentrifugiert und das überstehende Produkt wird dekantiert. Die optische Dichte des überstehenden Produktes wird bei 266 mjx abgelesen. Wenn irgendeine Absorption vorliegt, dann wird das Waschen wiederholt, bis kein weiteres Material solubilisiert wird. Das Target wird sodann in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,2 resuspendiert. (Standard-S-TAG und F-TAG, gereinigt von vor

15

639 102

hergehenden Reaktionen von Humanserum durch die untenstehende Verfahrensweise, können, wenn verfügbar, als Referenzstandardproben bei dem Test des Target-Reagens verwendet werden sowie Kaninchengesamtserum, bei dem bestimmt wurde, dass es S-TAG und F-TAG durch andere Target-Zubereitungen enthält.)

Die Bestimmung der Langsam-Bindung (S-TAG) wird wie folgt durchgeführt. Es sollte kein gefrorenes Serum verwendet werden, das mehr als einige wenige Tage gelagert worden ist. Das Serum wird sorgfältig aus frischerhaltenem Gesamtblut oder einer anderen Körperflüssigkeit nach bekannten Standardverfahrensweisen hergestellt. Die folgende Verfahrensweise hat sich als zufriedenstellend erwiesen. Blut wird durch 2stündiges Stehenlassen bei Raumtemperatur in einem Glasreagenzglas gerinnen gelassen. Die Gerinnsel werden von den Wänden mit einem Glasrührstab abgetrennt und das Blut wird eine Minimalzeit von 2 Stunden (oder über Nacht) bei 4°C stehengelasen. Die Gerinnsel werden von dem Serum durch 45minütiges Zentrifugieren bei 20 000 U/min und 4°C abgetrennt. Das Serum wird in ein Zentrifugenrohr dekantiert und es wird erneut 45 Minuten bei 2000 U/min und 4°C zentrifugiert. Das Serum wird dekantiert und eine 1 %ige Lösung von Methiolat (1 g in 95 ml Wasser und 5 ml 0,2 M Bicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 10) wird bis zu einem Ausmass von 1% des Volumens des Serums zugesetzt.

Die Serumproben, die nach den obigen oder anderen Verfahrensweisen hergestellt worden sind, werden jeweils in einer Menge von 0,2 ml zu jeweils 0,25 ml aliquoten Teilen eines Target-Suspensionsreagens gegeben, welches pro 0,25 ml Target-Reagens 100 bis 200 (ig Recognin enthält. Es wird eine doppelte Bestimmung durchgeführt. Die Suspension wird bei 4°C so gemischt, dass eine Klumpenbildung vermieden wird. So kann z.B. eine kleine Kautschukkappe, die rasch geschüttelt wird, 1 bis 2 Sekunden lang verwendet werden, worauf die Röhrchen leicht schräggestellt in einem Thomas-Schüttler etwa 2 Stunden lang oder mehr geschüttelt werden können. Das Target-Reagens und das daran gebundene Protein werden von dem Serum abgetrennt. Eine Verfahrensweise, die sich als zufriedenstellend erwiesen hat, ist die folgende. Die Rohre werden sodann 20 Minuten bei 4°C und 2000 U/min zentrifugiert und das überstehende Produkt wird dekantiert. Der Klumpen, der durch die Zentrifugierung gebildet wird, wird dreimal durch Wiedervermischen und Schütteln bei Raumtemperatur mit 0,2 bis 0,3 ml 0,15 M Kochsalzlösung gewaschen. Es wird zentrifugiert und die überstehenden Produkte werden verworfen.

Das Protein, das an das Target angeheftet bleibt, wird davon abgespalten und quantitativ bestimmt. So werden z.B. 0,2 ml 0,25 M Essigsäure zugegeben und die Suspension wird 1 bis 2 Stunden in einem Inkubator von 37°C geschüttelt. Die Rohre werden 30 Minuten bei 2000 U/min und 4°C zentrifugiert. Das überstehende Produkt wird sorgfältig dekantiert, um eine Übertragung von Teilchen zu vermeiden, und die optische Dichte des überstehenden Produktes wird bei 280 mu abgelesen. Der Wert der optischen Dichte wird durch einen Faktor von 1,46 dividiert, wodurch die Mikrogramme pro ml Serumprotein (S-TAG) erhalten werden. Doppelbestimmungen sollten nicht mehr als 5% variieren. Jede beliebige, andere Verfahrensweise, die zur Bestimmung des Proteingehalts geeignet ist, kann verwendet werden, z.B. die Bestimmung nach Folin-Lowry. Die Standards müssen jedoch spezifiziert werden, um den Bereich der Kontroll- und Tumorwerte von S-TAG- minus F-TAG-Konzentration zu bestimmen.

Die Bestimmung der Schnell-Bindung (F-TAG) wird wie folgt durchgeführt. Es sollte kein gefrorenes Serum verwendet werden, das länger als einige wenige Tage gelagert ist.

Das Serum wird sorgfältig aus frischerhaltenem Gesamtblut oder einer anderen Körperflüssigkeit nach Standardverfahrensweisen hergestellt. Die in diesem Beispiel für die Serumherstellung angegebene Verfahrensweise ist zufriedenstellend.

Serumproben, die nach dem obigen oder anderen Verfahren hergestellt worden sind, werden bei 4°C 10 Minuten weniger als die Gesamtzeit stehengelassen, über die die S-TAG-Serumbestimmungen in Kontakt mit dem obigen Target-Reagens gelassen wurden (z.B. 1 Stunde 50 Minuten, wenn eine «2 Stunden»-S-TAG-Bestimmung gemacht wurde). Diese Verfahrensweise gleicht die Temperaturvorgeschichte der S-TAG- und F-TAG-Bestimmungen aus.

Es werden 0,2 ml-Proben des hinsichtlich der Temperatur ins Gleichgewicht gebrachten Serums zu jeweils 0,25 ml aliquoten Teilen des Target-Suspensionsreagens gegeben, welches 100 bis 200 |ig Recognin pro 0,25 ml Target-Reagens enthält. Es wird eine doppelte Bestimmung durchgeführt. Die Suspension wird sodann bei 4°C ungefähr 10 Minuten lang in einer Weise vermischt, dass eine Pelletbildung vermieden wird. So kann z.B. eine kleine Kautschukkappe, die rasch geschüttelt wird, 1 bis 2 Sekunden lang verwendet werden, worauf die leicht schräg angeordneten Rohre in einem Thomas-Schüttler ungefähr 10 Minuten lang geschüttelt werden. Das Target-Reagens und das daran gebundene Protein werden von dem Serum abgetrennt. Eine Verfahrensweise, die sich als zufriedenstellend erwiesen hat, ist die folgende. Die Rohre werden sodann bei 2000 U/min und 4°C 20 Minuten lang zentrifugiert und das überstehende Produkt wird dekantiert. Der durch das Zentrifugieren gebildete Klumpen wird dreimal gewaschen, indem er mit 0,2 bis 0,3 ml 0,15 M Kochsalzlösung bei Raumtemperatur wieder vermischt und geschüttelt wird. Sodann wird zentrifugiert und die überstehenden Produkte werden verworfen.

Das Protein, das an das Target angeheftet bleibt, wird davon abgespalten und quantitativ bestimmt. Die oben in diesem Beispiel zur Bestimmung der S-TAG-Konzentration beschriebene Verfahrensweise ist zufriedenstellend. Es kann auch jede andere Verfahrensweise verwendet werden, die zur Bestimmung des Proteingehalts geeignet ist, z.B. die Folin-Lowry-Bestimmung. Die Standards müssen jedoch so spezifiziert sein, dass sie den Bereich der Kontroll- und Tumorwerte der S-TAG- minus F-TAG-Konzentration erfassen.

Die Endergebnisse werden als (ig TAG/ml Serum ausgedrückt und sie sind gleich S-TAG minus F-TAG. Die TAG-Werte bei Patienten ohne Gehirntumor und anderen Kontrollproben erstrecken sich derzeit von Null (oder einer negativen Zahl) bis zu 135 ug/ml Serum. Bei allen Ergebnissen mit mehr als 100 jig/ml ist eine wiederholte Bestimmung angezeigt. Einige andere Tumoren können hohe TAG-Werte ergeben, insbesondere wenn sekundäre (metastatische) Tumore in dem Gehirn vorhanden sind. Die TAG-Werte von Patienten mit Gehirntumor erstrecken sich derzeit von 136 bis 500 p.g oder mehr/ml Serum. Bei der ersten «Blind»-Untersuchung von 50 Blutproben nach den Verfahrensweisen dieses Beispiels unter Verwendung eines aus Astrocytin und Bromacetylcellulose hergestellten Target-Reagens wurden 11 von 11 Gehirntumoren und 28 von 32 Normalen korrekt identifiziert. Einer der vier angenommenen Normalen (d.h. eine Kontrollperson ohne Gehirntumor) hatte einen Krebs der Schilddrüse gehabt, der, offensichtlich einige Jahre zuvor erfolgreich behandelt worden war. Die drei restlichen Normalen waren Personen im Alter von 60 bis 70, die einen schlechten Gesundheitszustand hatten und die möglicherweise einen noch nicht erkannten Krebs hatten. Von den restlichen sieben Proben wurde drei von drei Fällen, Hodgkin'scher Krankheit richtig identifiziert. Eine Probe im Tumorbereich (136 bis 500 (ig TAG/ml) entsprach einem

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

639102

16

Patienten mit einer schweren Gliose, und drei Proben im heftetes TAG zu entfernen. Drei Waschungen mit phosphat-

Nicht-Tumorbereich (0 bis 135 [ig TAG/ml) entsprachen gepufferter Kochsalzlösung haben sich als zufriedenstellend

Patienten, die eine ungewisse intercraniale Massendiagnose, erwiesen. Sodann wird eine IConjugatinhibierung mit einem jedoch keinen Tumor, ein Osteosarkom (einen Nicht-Gehirn- fluorescin-markierten Konjugat, gefolgt von Wäschen durch-

tumor) und ein melanotisches Sarkom (einen Nicht-Gehirn- s geführt, woran sich eine mikroskopische Untersuchung tumor) hatten. anschliesst. Normale Zellen und ihre Prozesse werden nicht

Nach den Verfahrensweisen dieses Beispiels wurde eine sowohl in den Tumorschnitten als auch in den Kontrollnachfolgende Untersuchung unter Verwendung eines Target- schnitten von normalen Nicht-Tumorgehirnen angefärbt. Reagens, hergestellt aus Malignin, bei den malignen Gehirn- Eine Fluoreszenz ist hell in Tumorglialzellen und ihren Protumoren und allen Normalen durchgeführt. io zessen vorhanden.

Eine weitere, nach den Verfahrensweisen dieses Beispiels durchgeführte Untersuchung erstreckte die Gesamtzahl der Beispiel 10

untersuchten Humanserumproben von 50 auf 114. Die Eig- Beschreibung der cytotoxischen Wirkung von Anti-Astro-

nung dieser Produkte und Verfahrensweisen ist in Tabelle V Cytin, Anti-Malignin und S-TAG gegenüber Tumorzellen,

gezeigt, die die Ergebnisse dieser Tests angibt. i5 die in einer Gewebekultur wachsen.

Es können Standardtests zur Bestimmung der Cytotoxi-

Beispiel 9 zität verwendet werden. Im allgemeinen wird die Anzahl der

Diagnose von Tumorzellen durch Immunofluoreszenz. Zellen in einer festen Zellkammer, die gewöhnlich so

Es ist gezeigt worden, dass die Verbindungen Anti-Astro- angeordnet ist, dass sie etwa 100 lebende Zellen enthält,

cytin, Anti-Malignin und S-TAG sich bevorzugt an Tumor- 20 gezählt. Diese Zellen werden sodann mit dem zu testenden zellen anheften. Diese Spezifizität gestattet die Verwendung Mittel behandelt und die Anzahl der Zellen, die noch am dieser Verbindungen zur Diagnose von Tumorzellen in histo- Leben sind, wird gezählt.

logischen Schnitten, indem man Farbstoffe oder radioaktive Bei einem Standard-Cytotoxizitätstest der gemäss Beispiel Substanzen mit Anti-Astrocytin, Anti-Malignin oder S-TAG 8 erhaltenen S-TAG-Lösung gegenüber Zellen in einer Gewe-kombiniert. Es können Standard-Markierungstechniken 25 bekultur, die von einem Patienten mit einem Glioblastom hierzu verwendet werden. Eine geeignete Verfahrensweise vom 3. bis 4. Grad erhalten worden waren, die als glialer Herunter Verwendung von S-TAG ist z.B. die folgende. kunft gut charakterisiert waren, ergab S-TAG das Absterben

Eine Verfahrensweise, die sich als zufriedenstellend aller Zellen in der Zellkammer selbst in hoher Verdünnung erwiesen hat, ist ein modifiziertes St.-Marie-Verfahren. von 1:100 und 1:1000, was nur 0,2 und 0,02 (ig S-TAG/ml

Proben von menschlichem Gehirntumor werden eingefroren 30 Lösung entspricht. Ähnliche Ergebnisse werden mit hohen und 5 [x dicke Abschnitte werden herausgeschnitten. Diese Verdünnungen von Anti-Astrocytin und Anti-Malignin werden in einem feuchten Behälter 4 bis 8 Wochen bei -70°C erhalten.

gelagert, bevor sie angefärbt werden. Das Konjugat kann ein Sowohl die in Beisiel 9 gezeigte Spezifizität als auch die in

Standard-Antiserum, z.B. Ziegen-Anti-Kaninchen-Konjugat Beispiel 10 gezeigte Cytotoxizität sind für die therapeutischen sein. Das Konjugat wird durch bekannte Techniken mit fluo- 35 Möglichkeiten von Anti-Astrocytin, Anti-Malignin und reszierenden oder anderen Markierungssubstanzen markiert. S-TAG für menschliche Gehirntumoren hoch relevant. Diese

Fluorescin-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-Konjugat, therapeutischen Anwendungszwecke kommen zu den prakti-

wie es im Handel erhältlich ist, kann hierzu verwendet sehen Diagnosemöglichkeiten von beiden dieser Erschei-

werden. Als Fluoreszenz-Technik wurde eine Standard- nungen für Tumorgewebe hinzu, das bei Operationen ent-

technik angewendet, bei der eine 1:200 bis 1:400 Lösung von 40 fernt worden ist, das jedoch eine Diagnose durch histolo-

TAG etwa 30 Minuten oder mehr auf dem Tumorschnitt gische Untersuchungen erfordert, wie es hierin bereits gezeigt inkubiert wurde. Sodann wurde gewaschen, um nichtange- wurde.

Tabelle V

Normale*

Maligne

Gehirntumoren primär

Andere maligne Tumoren, Gehirnsekundärerscheinungen

Andere maligne Tumoren, keine Gehirnsekundärerscheinungen

Unbestimmte Cerebraldiagnose

Serum

Serum

Serum

Serum

Serum

Serum

Serum

Serum

TAG

TAG

TAG

TAG

TAG

TAG

TAG

TAG

ug/ml

Ug/ml p.g/ml jig/ml

Ug/ml

Hg/ml

Hg/ml jig/ml

124

19

54

65

459

270

36"

1658

113

55

27

113

397

257

315

1449

105

51

41

130

236

188

44214

139

130

82

21

79

137

205

28814

20910

127

44

27

61

298

1577

75'"

38

127

21

123

397

184"

100

31

0

14

241

27"

125

0

14

20

241

1101J

30

125

62

41

217

19215

250'

118

38

34

147

39

89

93

93

127

363'

99«

21

48

185

4

132

0

20

253

31

2703

120

82

253

42

7

16

20

565

17

639 102

Tabelle V (Fortsetzung)

Normale*

Maligne

Gehirntumoren primiir

Andere maligne Tumoren.

Gehirn sekundär-erscheinungen

Andere maligne Tumoren, keine Gehirnsekundärerscheinungen

Unbestimmte Cerebraldiagnose

34 76 48 85

58 24 62 89 89

20 113 72

55 0

277

137 7813

138 650 160

* Unter diese Bezeichnung fallen Normale, nicht-tumorbedingte medizinische und chirurgische Störungen; 1-sehr krank, nichtdiagnostiziert; 2-extra-intercraniale Gehirnmasse, nichtdiagnostiziert; 3-ausgeprägte Gliose; 4-malignes Melanom; 5-Osteosarkom; 6-Gehirnzystenfliissigkeit; 7-Adeno-carcinom des Kolons; 8-Gast-rectomie; 9-Kopfschmerzen; 10-Emphysem; 11-Polymyalgie; 12-Kolonkrebs; 13-Konvulsionen; 14-Prostatakrebs, Sekundärerscheinungen in den Knochen; 15-klinisch normal, 18 Monate früher, als dieses abnormale Serum TAG erhalten wurde: nunmehr haben sich schwere Kopfschmerzen sowie ein Verlust des Geschmacks und des Geruchs entwickelt.

Beispiel 11 20

Hydrolytische Abspaltung der Recognine.

Eine Lösung von Recognin, in diesem Falle entweder Astrocytin oder Malignin, mit einem pH-Wert zwischen 1 und 2 wird in der Kälte stehengelassen. Nach 7 bis 14 Tagen zeigt die TLG-Chromatographie, dass das Molekulargewicht 2s des Produkts um ungefähr 200 vermindert worden ist. Wenn die Lösung länger stehengelassen wird, dann werden weitere Einheiten mit einem Molekulargewicht von ungefähr 200 alle 7 bis 10 Tage abgespalten. Somit wird das Molekulargewicht des Astrocytins von 8000 und das Molekulargewicht des 30 Malignins von 10 000 in jedem Fall aufeinanderfolgend um ungefähr 200 Einheiten vermindert.

Die physikochemischen Eigenschaften des Astrocytins werden von jedem Produkt bis auf ein Molekulargewicht von ungefähr 4000 hinunter beibehalten. Die physikochemischen 35 Eigenschaften des Malignins werden von jedem Produkt bis zu einem Molekulargewicht von ungefähr 5000 hinunter beibehalten. Dies wird durch Ouchterlony-Geldiffusionstest gegen Anti-Astrocytin und Anti-Malignin gezeigt.

Diese Spaltung kann auch enzymatisch, beispielsweise mit 40 Trypsin oder anderen Proteinasen, unter Erzielung ähnlicher Ergebnisse durchgeführt werden.

Die Molekulargewichte dieser Verbindungen, die durch hydrolytische Abspaltung der Recognine hergestellt worden sind, können ungefähr durch die folgenden Formeln defi- 45 niert werden:

Für Produkte mit den physikochemischen Eigenschaften von Astrocytin; 400 + 200 X = Y.

Für Produkte mit den physikochemischen Eigenschaften von Malignin; 5000 + 200 X = Y. so

Darin bedeutet Y das Molekulargewicht des Produkts und X eine ganze Zahl von 0 bis 19.

Beispiel 12

Herstellung eines künstlichen Gewebes oder Organs mit ss Recogninen.

Ein Rohr aus Kunststoff, Metall oder einem anderen geeigneten starren Material mit starrer Wand wird in eine hochkonzentrierte (d.h. 10 mg/ml) viskose Recogninlösung, in diesem Falle entweder von Astrocytin oder Malignin, eingetaucht oder damit imprägniert, bis alle Oberflächen vollständig mit dem Recognin beschichtet sind. Alternativ kann die Recogninlösung auch durch und um das Rohr herum unter Druck geleitet werden, bis alle Oberflächen vollständig beschichtet sind. Das Rohr wird sodann in Luft oder im Vakuum getrocknet oder lyophilisiert. Der Beschichtungs-prozess wird mehrfach wiederholt, um mehrfache molekulare Schichten des Recognin-Überzugs aufzubauen.

Das Rohr ist nun bereit, um in eine Höhlung oder in ein Gewebe eingebracht zu werden, die oder das Astrocytin- oder Malignin-artige Vorläufer in dem benachbarten Gewebe oder Flüssigkeit eines lebenden Säugetiers enthält. Dieses künstliche Gewebe oder Organ kann dazu verwendet werden, um eine Reaktion mit Fremdsubstanzen, die ohne einen Recognin-Überzug stattfinden würde, zu minimalisieren oder zu eliminieren.

Künstliche Gewebe oder Organe mit anderen geometrischen Formen können in gleicher Weise hergestellt werden.

Die Figur zeigt, dass die erhöhte Kolbengrösse zu ungefähr der verdreifachten Verhältnismenge des Malignin-Produktes führt.

Die Figur zeigt auch die Beziehung zwischen Malignin und der Malignität. Die unterbrochen gezeichnete Linie stellt eine ideale lineare Beziehung dar. Diese gezeigte Beziehung ist sicherlich nicht trivial, da die Verhältnismenge des vorhandenen Malignins zunimmt, wenn die Zeilen in ihrem Wachstum weniger beschränkt (pathologisch) werden. Die normale In-situ-Recognin-Funktion steht, wie zuvor angegeben wurde, mit der Kontaktinhibierung des Zellwachstums in Beziehung. Je pathologischer das Wachstum der malignen Zellen ist, eine desto geringere Kontaktinhibierung findet statt und um so mehr wird das Malignin das vorherrschende Protein.

B

1 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

639 102

1. Verfahren zur Herstellung von Recogninen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) normales oder erkranktes Gewebe oder Zellen mit einem neutralen Puffer unter wiederholter Aufbrechung des Gewebes oder der Zellen extrahiert, um Proteinfraktionen herauszulösen,

b) aus dem resultierenden Extrakt eine Proteinfraktion mit einem pK-Bereich von 1 bis und mit 4 mittels einer chromatographischen Trennmethode abtrennt, wobei man die herausgelösten Proteinfraktionen in eine chromatographische Säule gibt und mit steigend sauren Lösungsmitteln eluiert,

c) daraus das Recognin als eine Fraktion mit einem Molekulargewicht zwischen 3000 bis und mit 25 000 isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Gewebe oder die Zellen durch wiederholte Homogenisierung und Zentrifugierung aufbricht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Isolierung des Recognins in der Weise durchführt, dass man die mittels chromatographischer Trennung abgetrennte Fraktion filtriert und das Recognin daraus durch eine Dünnschicht-Gelchromatographie isoliert.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als erkranktes Gewebe Gehirngliomtumorgewebe benützt, und dass man aus der Fraktion mit einem pK-Bereich von 1 bis und mit 4 eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von ungefähr 8000 isoliert, um ein als Astrocytin bezeichnetes Recognin zu erhalten.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Zellen künstliche Krebszellen benützt und aus der Fraktion mit dem pK-Bereich von 1 bis und mit 4 eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10 000 isoliert, um ein als Malignin bezeichnetes Recognin zu erhalten.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man aus der Fraktion mit einem pK-Bereich von 1 bis und mit 4 ein Recognin isoliert, dessen ungefähres Molekulargewicht durch die Formel

4000 + 200X = Y

gegeben ist, worin Y das Molekulargewicht des Recognins und X eine ganze Zahl von 0 bis 19 bedeutet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man aus der Fraktion mit dem pK-Bereich von 1 bis und mit 4 ein Recognin isoliert, dessen ungefähres Molekulargewicht durch die Formel

5000 + 200 X = Y

gegeben ist, worin Y das Molekulargewicht des Recognins und X eine ganze Zahl zwischen 0 und 19 bedeuten.

8. Verfahren zur Herstellung von Recogninkomplexen, dadurch gekennzeichnet, dass man nach einem der Ansprüche 1 bis 7 das Recognin erstellt, dann mit mindestens einem Trägerstoff zur Bildung eines Recognin-Träger-Komplexes komplexiert.

9. Verfahren nach Anspruch 8, zur Herstellung von Recognin-Träger-Antirecognin-Komplexen, dadurch gekennzeichnet, dass man den entstandenen Recognin-Träger-Komplex mit Antirecognin komplexiert.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man das Recognin mit mindestens einem Trägerstoff, welcher bezüglich des Recognins weitgehend biologisch inert ist und die physikalisch/chemischen Eigenschaften des Recognins mindestens weitgehend nicht verändert, komplexiert, um Recognin-Trägerstoff-Komplexe zu bilden, welche die physikalisch/chemischen Eigenschaften des Recognins s aufzeigen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man als Trägerstoff Bromacetylcellulose verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 8, zur Herstellung von io Recognin-Träger-Globulin-Komplexen, dadurch gekennzeichnet, dass man den entstandenen Recognin-Träger-Kom-plex mit einer globulinhaltigen Körperflüssigkeit in Kontakt bringt, für eine vorgegebene Zeitspanne, dort Komplexe bilden lässt, und diese dann isoliert.

15 13. Verfahrennach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man den Recognin-Träger-Komplex für 2 Stunden oder mehr bei tiefer Temperatur mit der Körperflüssigkeit, wie Blutserum, reagieren lässt und daraus einen Recognin-Träger-Globulin-Komplex mit einem langsam mit 20 Recognin-Träger-Komplexen lcomplexierenden Globulin abtrennt.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man den Recognin-Träger-Komplex für etwa 10 Minuten bei tiefer Temperatur mit einer Körperflüssig-

25 keit, wie Blutserum, reagieren lässt, und daraus einen Recognin-Träger-Globulin-Komplex mit einem schnell mit Recognin-Träger-Komplexen lcomplexierenden Globulin abtrennt.

15. Verfahren zur Herstellung von Antirecognin, dadurch 30 gekennzeichnet, dass man das Recognin nach einem der

Ansprüche 1 bis 7 herstellt, davon eine immunologisch wirksame Dosis mit Körpergewebe oder Körperflüssigkeit eines Säugers in Kontakt bringt, derart, dass eine Antikörperreaktion einsetzt, und dem Säuger das Antirecognin entzieht. 35 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Antirecognin mit einem Recognin-Träger-Komplex komplexiert und anschliessend wieder dekomplexiert, durch eine hydrolytische Behandlung mit einer Säure oder einer Proteinase.

40 17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Antirecognin mit einer Anzeigesubstanz, wie mit einem Farbstoff oder einer radioaktiven Substanz, verbindet.

18. Verfahren zur Herstellung eines Antirecognin-Diagno-45 sticum-Komplexes, dadurch gekennzeichnet, dass man das

Recognin nach einem der Ansprüche 1 bis 7 herstellt, davon eine immunologisch wirksame Dosis mit Körpergewebe oder Körperflüssigkeit eines Säugers in Kontakt bringt, derart, dass eine Antikörper-Reaktion einsetzt, und dem Säuger das so Antirecognin entzieht, dann das Antirecognin mit einem Diagnosticum komplexiert.

19. Verwendung des nach einem der Ansprüche 12 bis 14 hergestellten Recognin-Träger-Globulin-Komplexes in der In-vitro-Krebsdiagnose.

55 20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass man in vitro in einem bekannten Volumen von Blut oder einer andern Körperflüssigkeit eines Säugers hergestellte Recognin-Träger-Globulin-Komplexe mit schnell-komplexierenden Globulinen und langsamkomplexierenden 60 Globulinen als Indikator für Vorliegen von Krebs am lebenden Säuger verwendet.

21. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass man den Recognin-Träger-Globulin-Komplex zusammen mit einer Anzeigesubstanz, wie einem Farbstoff 65 oder einer radioaktiven Substanz, einem histologischen Schnitt zuführt, wobei das Einfärben oder die radioaktive Anzeige nur bei Vorliegen von Krebszellen einsetzt.

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PATENTANSPRÜCHE

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