CH626377A5

CH626377A5 - Process for the preparation of 9-(beta-D-arabinofuranosyl)adenine 5'-phosphate

Info

Publication number: CH626377A5
Application number: CH1335777A
Authority: CH
Inventors: Walter Eric Behnke; William Robert Marsh; Theodore Herbert Haskell
Original assignee: Parke Davis & Co
Priority date: 1976-11-03
Filing date: 1977-11-02
Publication date: 1981-11-13
Also published as: DE2749056A1; CA1088927A; DE2749056C2; GB1559456A; NL191060C; AT358187B; ATA779577A; NL7712102A; DK151263C; HK3884A; FR2370057B1; NL191060B; ES463768A1; FR2370057A1; SE7712368L; DK151263B; JPS5356691A; SE442404B; DK487177A; CA1077030A

Description

La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un ester qui est le 5'-phosphate de 9-(ß-D-arabinofuranosyl) adénine par phosphorylation de la 9-(j3-D-arabinofuranosyl)adénine et l'hydrolyse du produit phosphorylé. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un tel procédé où on obtient l'ester qui est le produit désiré sous forme cristalline directement à partir du mélange réactionnel. The present invention relates to a process for the preparation of an ester which is the 5'-phosphate of 9- (ß-D-arabinofuranosyl) adenine by phosphorylation of 9- (j3-D-arabinofuranosyl) adenine and the hydrolysis phosphorylated product. More particularly, the subject of the invention is such a process in which the ester which is the desired product in crystalline form is obtained directly from the reaction mixture.

Selon un procédé connu de préparation de l'ester de 5'-phosphate d'un nucléoside (brevet US N° 3703507), on fait réagir le nucléoside correspondant avec l'oxychlorure de phosphore (POCl3) dans l'acide acétique en présence de pyridine. Selon un autre procédé connu (brevet US N® 3413282), on fait réagir le nucléoside correspondant avec POCl3 ou le chlorure de diphosphoryle (P203C14) en présence d'un phosphate de trialcoyle comme solvant, on hydrolyse le produit réactionnel et on le neutralise et on isole le nucléoside qui est le produit désiré par des techniques d'adsorption et d'élution en utilisant du carbone activé ou une résine échangeuse d'ions. Les procédés connus impliquent désavantageusement des manipulations et des étapes de traitement qui prennent beaucoup de temps; ils utilisent aussi des milieux d'adsorption et des solvants d'élution coûteux. According to a known process for the preparation of the 5'-phosphate ester of a nucleoside (US Pat. No. 3,703,507), the corresponding nucleoside is reacted with phosphorus oxychloride (POCl3) in acetic acid in the presence of pyridine. According to another known method (US Patent N® 3413282), the corresponding nucleoside is reacted with POCl3 or diphosphoryl chloride (P203C14) in the presence of a trialkyl phosphate as solvent, the reaction product is hydrolyzed and it is neutralized and the nucleoside which is the desired product is isolated by adsorption and elution techniques using activated carbon or an ion exchange resin. The known methods disadvantageously involve time-consuming manipulations and processing steps; they also use expensive adsorption media and elution solvents.

Le présent procédé de préparation de l'ester qui est le 5'-phosphate de 9-(fJ-D-arabinofuranosyl)adénine comprend la mise en réaction de la 9-(p-D-arabinofuranosyl)adénine avec un agent de phosphorylation en présence d'un phosphate de trialcoyle comme solvant, de faire subir une hydrolyse aqueuse au mélange réactionnel, d'ajuster le pH du mélange d'hydrolyse aqueuse vers le haut suffisamment pour causer: la séparation en des phases liquides aqueuse et non aqueuse, la séparation du phosphate de trialcoyle qui est le solvant du mélange aqueux, le maintien du mélange aqueux résiduel à un pH auquel l'ester, qui est le produit, est insoluble pour faire précipiter cet ester, qui est le produit, en une phase solide du mélange aqueux, et l'isolement de ce produit. Le présent procédé fournit avantageusement de bons rendements en produits désirés sous forme cristalline. Le procédé donne aussi un rapport favorable du volume requis pour donner un rendement en produit permettant ainsi des lots plus grands; il est simple de travailler le produit, et les besoins en main-d'œuvre et en substance sont minimisés. The present process for the preparation of the ester which is the 9'(fJ-D-arabinofuranosyl) adenine 5'-phosphate comprises reacting 9- (pD-arabinofuranosyl) adenine with a phosphorylating agent in the presence of '' a trialkyl phosphate as solvent, to subject the reaction mixture to aqueous hydrolysis, to adjust the pH of the aqueous hydrolysis mixture upwards sufficiently to cause: separation into aqueous and non-aqueous liquid phases, separation of trialkyl phosphate which is the solvent of the aqueous mixture, maintaining the residual aqueous mixture at a pH at which the ester, which is the product, is insoluble to precipitate this ester, which is the product, in a solid phase of the aqueous mixture , and the isolation of this product. The present process advantageously provides good yields of desired products in crystalline form. The process also gives a favorable ratio of the volume required to give a product yield, thus allowing larger batches; it is simple to work the product, and labor and substance requirements are minimized.

Le présent procédé est sujet à passablement de variations. La matière de départ, c'est-à-dire la 9-(p-D-arabinofuranosyl)adénine peut être utilisée soit sous la forme monohydratée, soit sous la forme anhydre, et on préfère le nucléoside anhydre. L'agent de phosphorylation utilisé est n'importe quel agent approprié tel qu'un oxyhalogénure de phosphore, notamment POCl3, POBr3 et P203C14. On utilise l'agent de phosphorylation en un rapport d'environ 1:5 mol et, de préférence, d'environ 1,15:2 mol pour chaque mole de 9-(p-D-arabinofuranosyl)adénine. L'oxychlorure de phosphore est un agent de phosphorylation préféré. Le phosphate de trialcoyle utilisé comme solvant est un ester d'un acide phosphorique avec un alcool aliphatique en Cj à C4, par exemple le phosphate de triméthyle ou le phosphate de triéthyle. Le phosphate de triéthyle est un solvant préféré. Le rapport molaire phosphate de trialcoyle qui est le solvant:nucléoside dans le présent procédé est d'au moins 5:1. The present process is subject to quite a few variations. The starting material, i.e. 9- (p-D-arabinofuranosyl) adenine can be used either in the monohydrate form or in the anhydrous form, and the anhydrous nucleoside is preferred. The phosphorylating agent used is any suitable agent such as a phosphorus oxyhalide, in particular POCl3, POBr3 and P203C14. The phosphorylating agent is used in a ratio of about 1: 5 mol and preferably about 1.15: 2 mol for each mole of 9- (p-D-arabinofuranosyl) adenine. Phosphorus oxychloride is a preferred phosphorylating agent. Trialkyl phosphate used as a solvent is an ester of a phosphoric acid with a C 1 -C 4 aliphatic alcohol, for example trimethyl phosphate or triethyl phosphate. Triethyl phosphate is a preferred solvent. The molar ratio of trialkyl phosphate which is the solvent: nucleoside in the present process is at least 5: 1.

Pour les meilleurs résultats, on préfère un rapport d'environ 15:1. Habituellement, on conduit la phosphorylation à des températures de — 30 à + 50°C. La gamme préférée est comprise entre —10 et + 10°C et, à ces températures, la réaction est complète en 2 à 5 h environ. A — 20° C, le temps réactionnel est d'environ 6 à 10 h et, à 30°C, d'environ 10 à 30 mn. Après la réaction, on hydrolyse le phosphorodihalidate ou le trichlorodiphosphate qui est le produit intermédiaire pour obtenir l'ester qui est le produit. On peut le faire en associant de la glace et/ou de l'eau avec le mélange réactionnel. Le pH du mélange aqueux résultant selon l'invention est réglé vers le haut en ajoutant une base telle qu'une solution d'hydroxyde de sodium en une quantité suffisante pour causer la séparation en une phase liquide aqueuse et une phase liquide non aqueuse, avantageusement à une valeur depH d'environ 1-2,5 ou plus. On extrait le mélange obtenu qui forme les deux phases liquides avec un solvant inerte non miscible à l'eau tel que le dichlorométhane ou le diéthyléther pour enlever le phosphate de trialcoyle. Du moment que le produit désiré, c'est-à-dire le 5'-phosphate de 9-(ß-D-arabinofuranosyl)adénine est soluble dans l'eau à un pH relativement bas et à un pH relativement élevé, selon l'invention, on maintient la phase aqueuse extraite, si nécessaire après un réglage ultérieur, à un pH auquel le produit est insoluble (suivant les conditions, avantageusement à un pH d'environ 1,3-2,5), et on garde le mélange de préférence au froid et avec ensemencement pour faire précipiter l'ester qui est le produit désiré en une phase solide du mélange aqueux. Le produit qu'on obtient sous forme cristalline pure est isolé sous forme d'acide libre par des moyens connus, par exemple la filtration ou la centrifugation. Si on le désire, on peut recristalliser le produit ou le convertir en un sel en solution par des moyens connus, par exemple en réglant de façon appropriée le pH. Selon un procédé facultatif, au lieu d'hydrolyser le mélange réactionnel directement dans l'eau comme il est décrit, on peut hydrolyser le précipité de phosphorodihalidate ou de trichlorodiphosphate inter5 For the best results, a ratio of about 15: 1 is preferred. Usually, phosphorylation is carried out at temperatures from -30 to + 50 ° C. The preferred range is between -10 and + 10 ° C and, at these temperatures, the reaction is complete in about 2 to 5 hours. At - 20 ° C, the reaction time is approximately 6 to 10 h and, at 30 ° C, approximately 10 to 30 min. After the reaction, the phosphorodihalidate or trichlorodiphosphate which is the intermediate product is hydrolyzed to obtain the ester which is the product. This can be done by combining ice and / or water with the reaction mixture. The pH of the resulting aqueous mixture according to the invention is adjusted upwards by adding a base such as a sodium hydroxide solution in an amount sufficient to cause separation into an aqueous liquid phase and a non-aqueous liquid phase, advantageously at a depH value of about 1-2.5 or more. The mixture obtained, which forms the two liquid phases, is extracted with an inert water-immiscible solvent such as dichloromethane or diethyl ether to remove the trialkyl phosphate. As long as the desired product, i.e., 9- (ß-D-arabinofuranosyl) adenine 5'-phosphate is soluble in water at relatively low pH and relatively high pH, depending on the invention, the extracted aqueous phase is maintained, if necessary after a subsequent adjustment, at a pH at which the product is insoluble (depending on the conditions, advantageously at a pH of approximately 1.3-2.5), and the preferably mixed with cold and seeding to precipitate the ester which is the desired product in a solid phase of the aqueous mixture. The product obtained in pure crystalline form is isolated in the form of free acid by known means, for example filtration or centrifugation. If desired, the product can be recrystallized or converted to a salt in solution by known means, for example by appropriately adjusting the pH. According to an optional process, instead of hydrolyzing the reaction mixture directly in water as described, the precipitate of phosphorodihalidate or of trichlorodiphosphate inter5 can be hydrolyzed

10 10

J5 D5

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

3 3

626377 626377

médiaire obtenu en ajoutant le mélange réactionnel à un liquide non aqueux (par exemple tel que le dichlorométhane ou le diéthyléther) dans lequel le composé intermédiaire est insoluble. medium obtained by adding the reaction mixture to a non-aqueous liquid (for example such as dichloromethane or diethyl ether) in which the intermediate compound is insoluble.

Le produit, c'est-à-dire le 5'-phosphate de 9-(ß-D-arabino-furanosyl)adénine est utile comme agent pharmacologique, notamment comme agent antiviral, car il est actif contre le virus herpès simplex, comme on le décrit dans le brevet US N° 3703507 précité dont la description est incorporée ici par référence. The product, i.e. 9'(ß-D-arabino-furanosyl) adenine 5'-phosphate is useful as a pharmacological agent, in particular as an antiviral agent, since it is active against the herpes simplex virus, such as it is described in the aforementioned US Pat. No. 3,703,507, the description of which is incorporated here by reference.

Les exemples suivants illustrent l'invention. The following examples illustrate the invention.

Exemple 1: Example 1:

On a refroidi un mélange agité de 10,69 g (0,04 mol) de 9-(ß-D-arabinofuranosyl)adénine anhydre dans 100 ml (0,586 mol) de phosphate de triéthyle jusqu'à 0-2°C dans un bain de glace. On a alors ajouté à cette suspension agitée 7,05 g (0,046 mol) d'oxychlo-rure de phosphore goutte à goutte au cours de 2 h tout en maintenant le bain de glace en refroidissant. On a alors agité à froid le mélange pendant encore 1 h pour obtenir une solution limpide à légèrement trouble qu'on a versée sur 70 g de glace. On a rincé le ballon réactionnel avec 10 ml d'eau glacée et on a ajouté cela au mélange d'hydrolyse qu'on "a alors agité dans un bain de glace pendant environ 15 mn. On a agité le mélange avec refroidissement tandis qu'on ajustait le pH de 0,6-2 en utilisant une solution d'hydroxyde de sodium à 50%. Une deuxième phase liquide s'est séparée et la température est montée jusqu'à environ 10°C pendant cette étape. On a agité le mélange pendant encore 15 mn tandis qu'on maintenait le pH à 2 en ajoutant une nouvelle quantité de base. A stirred mixture of 10.69 g (0.04 mol) of anhydrous 9- (ß-D-arabinofuranosyl) adenine in 100 ml (0.586 mol) of triethyl phosphate was cooled to 0-2 ° C in a ice bath. To this stirred suspension was then added 7.05 g (0.046 mol) of phosphorus oxychloride dropwise over 2 h while maintaining the ice bath while cooling. The mixture was then stirred cold for another 1 h to obtain a clear to slightly cloudy solution which was poured onto 70 g of ice. The reaction flask was rinsed with 10 ml of ice water and added to the hydrolysis mixture which was then "stirred in an ice bath for about 15 min. The mixture was stirred with cooling while the pH was adjusted from 0.6-2 using 50% sodium hydroxide solution, a second liquid phase separated and the temperature rose to about 10 ° C during this step. the mixture for another 15 min while maintaining the pH at 2 by adding a new amount of base.

On a alors transféré le mélange dans un entonnoir à décantation et on l'a extrait avec 100 ml de dichlorométhane. On a enlevé la phase inférieure (non aqueuse, environ 200 ml) et on a extrait de, nouveau la couche aqueuse en utilisant 50 ml de dichlorométhane. On a de nouveau séparé les couches et on a réajusté la phase supérieure (aqueuse) à pH 2 en utilisant quelques gouttes d'une base. On a ensemencé cette solution avec quelques cristaux de 5'-phosphate de 9-$-D-arabinofuranosyl)adénine, et on a gité à la température ordinaire jusqu'à ce que la précipitation soit bien en route (environ 10 mn). On a alors interrompu l'agitation et on a laissé reposer le mélange au froid pendant une nuit. On a brisé la masse cristalline blanche obtenue en l'agitant et on l'a laissée de nouveau reposer une nuit au froid. On a alors filtré le mélange à la trompe et on a lavé le produit cristallin, c'est-à-dire le 5'-phosphate de 9-(ß-D-arabinofuranosyl)adénine successivement avec 22 ml d'eau glacée, 35 ml d'éthanol aqueux à 50% froid et 25 ml d'éthanol absolu froid. Après avoir séché à 40°C sous vide pendant 16 h, le produit pesait 10,59 g (76,2% de la valeur théorique) et donnait les résultats d'essai suivants: The mixture was then transferred to a separatory funnel and extracted with 100 ml of dichloromethane. The lower phase was removed (non-aqueous, about 200 ml) and the aqueous layer was extracted from it again using 50 ml of dichloromethane. The layers were again separated and the upper (aqueous) phase readjusted to pH 2 using a few drops of a base. This solution was seeded with some 5'-phosphate crystals of 9 - $ - D-arabinofuranosyl) adenine, and stirred at room temperature until precipitation was well underway (about 10 min). Stirring was then stopped and the mixture was allowed to stand in the cold overnight. The white crystalline mass obtained by breaking was broken up and allowed to stand overnight in the cold. The mixture was then filtered with suction and the crystalline product, that is to say 9'(β-D-arabinofuranosyl) adenine 5'-phosphate was washed successively with 22 ml of ice water, 35 ml of cold 50% aqueous ethanol and 25 ml of cold absolute ethanol. After drying at 40 ° C under vacuum for 16 h, the product weighed 10.59 g (76.2% of the theoretical value) and gave the following test results:

Chromatographie sur colonne êchangeuse d'ions—Essai UV Ion exchange column chromatography — UV test

Fraction I (nucléoside n'ayant pas réagi 4- adénine): 1,57% Fraction I (unreacted nucleoside 4-adenine): 1.57%

Fraction II (5'-phosphate qui est le produit désiré): 91,2 % Fraction II (5'-phosphate which is the desired product): 91.2%

Fraction III (diphosphates): 1,98% Fraction III (diphosphates): 1.98%

Eau de K. Fisher: 5,62% Water by K. Fisher: 5.62%

Total: 100,37% Total: 100.37%

Le rendement corrigé en 5'-phosphate de 9-(ß-D-arabinofuranosyl)adénine était donc 69,5% du rendement théorique. The corrected yield of 5'-phosphate of 9- (ß-D-arabinofuranosyl) adenine was therefore 69.5% of the theoretical yield.

On conduit l'analyse du produit par le procédé suivant qui est typique: The analysis of the product is carried out by the following process which is typical:

Chromatographie sur colonne êchangeuse d'ions — Essai UV Ion exchange column chromatography - UV test

On remplit une colonne chromatographique (9 mm x 15 cm) avec 0,5 g de résine êchangeuse d'anions (QAE-Séphadex A-25, Cl-) qu'on a mise en suspension dans de l'eau distillée pendant une nuit. On pèse avec précision approximativement 20 mg d'échantillon et on les dissout dans 1,0 ml de NaOH 0,1N, puis on transfère cette solution dans la colonne. On élue alors la colonne avec de l'eau jusqu'à ce qu'on ait récolté 25 ml au total dans un ballon volumétri-que. Cette fraction contient de la 9-([3-D-arabinofuranosyl)adénine n'ayant pas réagi et de l'adénine. On élue alors la colonne avec un tampon au phosphate 0,1M (pH=7,0) jusqu'à ce qu'on ait récolté 50 ml. Cette deuxième fraction contient le 5'-phosphate qui est le produit désiré. On obtient une troisième fraction contenant les esters de diphosphate en éluant avec un tampon au phosphate 0,4M (pH=7,0) jusqu'à ce qu'on ait récolté 50 ml au total. A chromatographic column (9 mm x 15 cm) is filled with 0.5 g of anion exchange resin (QAE-Sephadex A-25, Cl-) which is suspended in distilled water overnight . Approximately 20 mg of sample is precisely weighed and dissolved in 1.0 ml of 0.1N NaOH, then this solution is transferred to the column. The column is then eluted with water until a total of 25 ml has been collected in a volumetric flask. This fraction contains unreacted 9 - ([3-D-arabinofuranosyl) adenine and adenine. The column is then eluted with 0.1M phosphate buffer (pH = 7.0) until 50 ml are collected. This second fraction contains the 5'-phosphate which is the desired product. A third fraction is obtained containing the diphosphate esters, eluting with a 0.4M phosphate buffer (pH = 7.0) until a total of 50 ml has been collected.

On effectue le spectre UV de chaque fraction à 320-220 mn. (Les fractions I et III sans dilution et la fraction II après une dilution de 20 fois.) D'après l'adsorption à 260 nm (A X0260), on calcule le contenu de chaque fraction comme suit: The UV spectrum of each fraction is carried out at 320-220 min. (Fractions I and III without dilution and fraction II after a 20-fold dilution.) Based on the adsorption at 260 nm (A X0260), the content of each fraction is calculated as follows:

où or

V = volume (ml) de chaque fraction D = dilution a (1%, 1 cm)X26o = 569 pour 9-^-D-arabinofuranosyl)adénine (fraction I) V = volume (ml) of each fraction D = dilution a (1%, 1 cm) X26o = 569 for 9 - ^ - D-arabinofuranosyl) adenine (fraction I)

= 437 pour le 5'-phosphate (produit) (fraction II) = 437 for 5'-phosphate (product) (fraction II)

= 361 pour les diphosphates (fraction III) = 361 for diphosphates (fraction III)

D'après la quantité de chaque composant, on calcule alors le pour-cent de chacun d'eux. Based on the quantity of each component, the percent of each is then calculated.

Exemple 2: Example 2:

A 100 ml de phosphate de triéthyle froid (2°C) agité, on a ajouté 9,20 g (0,06 mol) d'oxychlorure de phosphore au cours de 2 mn. On a alors ajouté à cette solution agitée 10,69 g (0,04 mol) de 9-(ß-D-arabinofuranosyl)adénine anhydre en une fois et, à la suite, la température réactionnelle monte jusqu'à environ 4°C. On a agité le mélange dans le bain de glace pendant 2 h et 10 mn pour obtenir une solution limpide environ 1 h 50 mn après l'addition. On a alors versé la solution réactionnelle dans 800 ml de diéthyléther froid et on l'a agitée pendant 1 h dans un bain de glace. On a filtré cette suspension blanche à froid et on a lavé la substance solide hygroscopique deux fois avec des portions de 100 ml de solvant froid, puis on l'a dissoute dans 80 ml d'eau. Après séparation d'une couche éthérique, on a ajusté le pH de la solution aqueuse à 2 en utilisant une solution d'hydroxyde de sodium à 50%, puis on l'a ensemencée avec du 5'-phosphate de 9-^-D-arabinofuranosyl)adénine pure et placée au réfrigérateur pour la refroidir pendant 2 j en agitant de temps en temps. On a alors filtré le précipité, on l'a lavé à son tour avec 35 ml d'éthanol à 50% froid et 25 ml d'éthanol absolu froid et, finalement, on l'a séché sous vide à 40°C pour obtenir 8,88 g (63,9% de la valeur théorique) de 5'-phosphate de 9-^-D-arabinofuranosyl)adénine en conduisant les essais suivants: To 100 ml of cold triethyl phosphate (2 ° C) stirred, 9.20 g (0.06 mol) of phosphorus oxychloride was added over 2 min. To this stirred solution was then added 10.69 g (0.04 mol) of anhydrous 9- (ß-D-arabinofuranosyl) adenine at one time and, thereafter, the reaction temperature rose to about 4 ° C . The mixture was stirred in the ice bath for 2 h and 10 min to obtain a clear solution about 1 h 50 min after the addition. The reaction solution was then poured into 800 ml of cold diethyl ether and stirred for 1 h in an ice bath. This cold white suspension was filtered and the hygroscopic solid was washed twice with 100 ml portions of cold solvent, then dissolved in 80 ml of water. After separation of an etheric layer, the pH of the aqueous solution was adjusted to 2 using a 50% sodium hydroxide solution, then it was seeded with 5'-phosphate of 9 - ^ - D -arabinofuranosyl) pure adenine and placed in the refrigerator to cool it for 2 days, shaking from time to time. The precipitate was then filtered, washed in turn with 35 ml of cold 50% ethanol and 25 ml of cold absolute ethanol and, finally, it was dried under vacuum at 40 ° C to obtain 8.88 g (63.9% of the theoretical value) of 5'-phosphate of 9 - ^ - D-arabinofuranosyl) adenine by carrying out the following tests:

Fraction I (nucléoside n'ayant pas réagi + adénine): 0,38% Fraction I (unreacted nucleoside + adenine): 0.38%

Fraction II (5'-phosphate qui est le produit désiré): 92,8 % Fraction II (5'-phosphate which is the desired product): 92.8%

Fraction III (diphosphates) : 4,03 % Fraction III (diphosphates): 4.03%

Le rendement corrigé en 5'-phosphate de 9-(ß-D-arabinofuranosyl)adénine était donc 59,3% du rendement théorique. The corrected yield of 5'-phosphate of 9- (ß-D-arabinofuranosyl) adenine was therefore 59.3% of the theoretical yield.

Exemple 3: Example 3:

A 100 ml de phosphate de triéthyle, on a ajouté 10,69 g (0,04 mol) de 9-(p-D-arabinofuranosyl)adénine anhydre en une fois en agitant. On a refroidi ce mélange dans un bain de glace jusqu'à 2°C puis on a ajouté 9,20 g (0,06 mol) d'oxychlorure de phosphore au cours de 3 mn, et la température montait à environ 4°C. On a agité le mélange réactionnel à froid pendant 2 'Ah puis on a versé la solution limpide dans 80 g de glace. On a agité ce mélange dans un bain de glace pour maintenir une température en dessous de 10°C, tandis qu'on ajustait le pH à 2 en utilisant une solution d'hydroxyde de sodium à 50%. Le mélange trouble obtenu était extrait deux fois en utilisant des portions de 100 ml et 50 ml de dichlorométhane, puis on a ajusté de nouveau la couche aqueuse à pH = 2 en utilisant une nouvelle To 100 ml of triethyl phosphate was added 10.69 g (0.04 mol) of anhydrous 9- (p-D-arabinofuranosyl) adenine all at once with stirring. This mixture was cooled in an ice bath to 2 ° C and then 9.20 g (0.06 mol) of phosphorus oxychloride was added over 3 min, and the temperature rose to about 4 ° C . The reaction mixture was stirred cold for 2 'Ah and then the clear solution was poured into 80 g of ice. This mixture was stirred in an ice bath to maintain a temperature below 10 ° C, while the pH was adjusted to 2 using a 50% sodium hydroxide solution. The cloudy mixture obtained was extracted twice using 100 ml and 50 ml portions of dichloromethane, then the aqueous layer was adjusted again to pH = 2 using a new

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

626377 626377

4 4

quantité d'hydroxyde de sodium. Après ensemencement, on a placé cette solution dans le réfrigérateur pendant une nuit pour obtenir un précipité blanc dense. On a agité celui-ci avec une baguette de verre puis on l'a de nouveau laissé reposer pendant une nuit au froid. On a filtré le produit blanc et on l'a lavé en utilisant 22 ml d'eau glacée, 35 ml d'éthanol à 50% froid et 25 ml d'éthanol absolu froid. Après séchage sous vide à 40°C, on a obtenu 9,60 g (69,1% de la valeur théorique) du produit, c'est-à-dire le 5'-phosphate de 9-(ß-D-arabinofuranosyl)adénine qui donnait les résultats d'essai suivants: amount of sodium hydroxide. After seeding, this solution was placed in the refrigerator overnight to obtain a dense white precipitate. This was stirred with a glass rod and then allowed to stand overnight in the cold. The white product was filtered and washed using 22 ml of ice water, 35 ml of cold 50% ethanol and 25 ml of cold absolute ethanol. After drying under vacuum at 40 ° C., 9.60 g (69.1% of the theoretical value) of the product were obtained, that is to say the 5'-phosphate of 9- (ß-D-arabinofuranosyl ) adenine which gave the following test results:

Fraction I (nucléoside n'ayant pas réagi + adénine): 0,17% Fraction I (unreacted nucleoside + adenine): 0.17%

Fraction II (5'-phosphate, c'est-à-dire le produit désiré): 89,9 % Fraction III (diphosphates): 4,54% Fraction II (5'-phosphate, i.e. the desired product): 89.9% Fraction III (diphosphates): 4.54%

Le rendement corrigé en 5'-phosphate de 9-(ß-D-arabinofuranosyl)adénine était donc 62,1% du rendement théorique. The corrected yield of 5'-phosphate of 9- (ß-D-arabinofuranosyl) adenine was therefore 62.1% of the theoretical yield.

Exemple 4: Example 4:

A une solution de 0,72 ml (0,04 mol) d'eau dans 100 ml de phosphate de triéthyle refroidi dans un bain de glace, on a lentement ajouté 12,27 g (0,08 mol) d'oxychlorure de phosphore à 0-5° C. On a alors ajouté 10,69 g (0,04 mol) de 9-(p-D-arabinofuranosyl)adénine anhydre en une fois en agitant pour obtenir une augmentation immédiate de la température de 1 à 9°C. Le mélange réactionnel était limpide après 30 mn et après 2 'A h; on l'a versé sur 100 g de glace et on a ajusté le pH à 2 en utilisant une solution d'hydroxyde de sodium à 50%. Après deux extractions en utilisant des portions de 200 ml et 100 ml de diéthyléther, on a ajusté de nouveau le pH en utilisant une nouvelle quantité de base. On a alors ensemencé la solution aqueuse avec des cristaux de 5'-phosphate de 9-(ß-D-arabinofuranosyl) adénine et on a refroidi dans le réfrigérateur pour précipiter le produit, c'est-à-dire le 5'-phosphate de 9-(ß-D-arabinofuranosyl) adénine, comme décrit dans les exemples précédents. Après filtration, lavage et séchage, le produit blanc pesait 10,12 g (72,9% de la théorie) et donnait les résultats d'essai suivants: To a solution of 0.72 ml (0.04 mol) of water in 100 ml of triethyl phosphate cooled in an ice bath, 12.27 g (0.08 mol) of phosphorus oxychloride was slowly added at 0-5 ° C. 10.69 g (0.04 mol) of anhydrous 9- (pD-arabinofuranosyl) adenine were then added all at once with stirring to obtain an immediate increase in temperature from 1 to 9 ° C. . The reaction mixture was clear after 30 min and after 2 hrs; it was poured onto 100 g of ice and the pH was adjusted to 2 using a 50% sodium hydroxide solution. After two extractions using 200 ml and 100 ml diethyl ether portions, the pH was adjusted again using a new amount of base. The aqueous solution was then seeded with 5'-phosphate crystals of 9- (ß-D-arabinofuranosyl) adenine and cooled in the refrigerator to precipitate the product, i.e. 5'-phosphate of 9- (ß-D-arabinofuranosyl) adenine, as described in the previous examples. After filtration, washing and drying, the white product weighed 10.12 g (72.9% of theory) and gave the following test results:

Chromatographie sur colonne êchangeuse d'ions ■— Essai UV Chromatography on an ion exchange column ■ - UV test

Fraction I (nucléoside n'ayant pas réagi + adénine) : 4,08 % Fraction I (unreacted nucleoside + adenine): 4.08%

Fraction II (5'-phosphate qui est le produit désiré): 81,1 % Fraction II (5'-phosphate which is the desired product): 81.1%

Fraction III (diphosphates) : 1,51% Fraction III (diphosphates): 1.51%

5 5

Le rendement corrigé en 5'-phosphate de 9-(ß-D-arabinofuranosyl)adénine était de 59,1%. The corrected yield of 5'-phosphate of 9- (ß-D-arabinofuranosyl) adenine was 59.1%.

10 Exemple 5: 10 Example 5:

A une suspension agitée de 10,69 g (0,04 mol) de 9-(ß-D-arabinofuranosyl)adénine dans 100 ml de phosphate de triéthyle refroidi à 2°C dans un bain de glace, on a ajouté, au cours de 2 h, 11,58 g (0,046 mol) de chlorure de diphosphoryle (P203C14). On a 15 agité le mélange réactionnel blanc au froid pendant encore 1 h et, pendant ce temps, il devenait une solution limpide. On a alors versé cette solution sur 80 g de glace et on a ajouté une solution d'hydroxyde de sodium à 50% à ce mélange agité et refroidi au bain de glace pour ajuster le pH à 2. Après extraction au dichloromé-20 thane, nouvel ajustage du pH et ensemencement, on a refroidi la solution aqueuse. Le produit qui se séparait sous forme d'une substance solide cristalline blanche, et qui est le 5'-phosphate de 9-fô-D-arabinofuranosyl)adénine, était récolté par filtration et lavé et séché comme décrit dans les exemples précédents pour obtenir 8,26 g 25 (59,5% de la théorie), et donnait les résultats d'essai suivants: To a stirred suspension of 10.69 g (0.04 mol) of 9- (ß-D-arabinofuranosyl) adenine in 100 ml of triethyl phosphate cooled to 2 ° C in an ice bath, the following was added during 2 h, 11.58 g (0.046 mol) of diphosphoryl chloride (P203C14). The white reaction mixture was stirred in the cold for another 1 h and, during this time, it became a clear solution. This solution was then poured onto 80 g of ice and a 50% sodium hydroxide solution was added to this stirred mixture and cooled in an ice bath to adjust the pH to 2. After extraction with 20 dichlorome-thane, re-adjusting the pH and seeding, the aqueous solution was cooled. The product which separated in the form of a white crystalline solid substance, and which is 9-fo-D-arabinofuranosyl) adenine 5'-phosphate, was collected by filtration and washed and dried as described in the preceding examples to obtain 8.26 g 25 (59.5% of theory), and gave the following test results:

Fraction I (nucléoside n'ayant pas réagi + adénine) : 0,24% Fraction I (unreacted nucleoside + adenine): 0.24%

30 Fraction II (5'-phosphate qui est le produit désiré) : 94,3 % 30 Fraction II (5'-phosphate which is the desired product): 94.3%

Fraction III (diphosphates): 2,0% Fraction III (diphosphates): 2.0%

Eau de K.Fisher: 5,77% K. Fisher's water: 5.77%

Total: 102,3 % Total: 102.3%

35 Le rendement corrigé en 5'-phosphate de 9-(ß-D-arabinofuranosyl)adénine était donc 56,1 % du rendement théorique. The corrected yield of 5'-phosphate of 9- (β-D-arabinofuranosyl) adenine was therefore 56.1% of the theoretical yield.

R R

Claims

626377

1. Process for the preparation of 9- (ß-D-arabinofuranosyl) adenine 5'-phosphate, characterized in that the 9- (3-D-arabinofuranosyl) adenine is converted into a 5'-monophosphorylated intermediate product in the presence of a trialkyl phosphate as solvent, in that the reaction mixture is subjected to aqueous hydrolysis, in that the pH of the aqueous mixture of hydrolysis is adjusted upwards sufficiently to cause separation into aqueous liquid phases and nonaqueous, in that the trialkyl phosphate which is the solvent of the aqueous mixture is removed, in that the residual aqueous mixture is maintained at a pH at which the ester is insoluble to precipitate it from the aqueous mixture and in that we isolate the ester.

2. Process for the preparation of 9- (ß-D-arabinofuranosyl) adenine 5'-phosphate, characterized in that 9- (ß-D-arabinofuranosyI) adenine is converted into a 5'-monophosphorylated intermediate product in the presence of a trialkyl phosphate as solvent, in that the reaction mixture is treated with a nonaqueous diluting agent in which the intermediate product is insoluble so that the intermediate product separates in the form of a solid substance, in that the solid is isolated and subjected to aqueous hydrolysis, in that the aqueous hydrolysis mixture is kept at a pH at which the ester is insoluble to cause it to precipitate from the aqueous mixture and in that the l 'ester.

2

3. Method according to claim 1, characterized in that the phosphorylating agent is used in a ratio of 1.15: 2 mol for each mole of 9- (p-D-arabinofuranosyl) adenine.

4. Method according to claim 1, characterized in that the phosphorylating agent is phosphorus oxychloride.

5. Method according to claim 1, characterized in that the solvent is triethyl phosphate.

6. Method according to claim 1, characterized in that the molar ratio of trialkyl phosphate: 9- (ß-D-arabinofuranosyl) adenine is 15: 1.

7. Method according to claim 1, characterized in that the phosphorylation is carried out at temperatures between —10 and + 10 ° C.

8. Method according to claim 1, characterized in that the pH of the aqueous hydrolysis mixture is adjusted to 1-2.5.

9. Method according to claim 1, characterized in that the residual aqueous mixture is maintained at a pH of 1.3-2.5.

10. Method according to claim 2, characterized in that the phosphorylating agent is used in a ratio of 1.15: 2 mol for each mole of 9- (fJ-D-arabinofuranosyl) adenine.