CH619539A5

CH619539A5 -

Info

Publication number: CH619539A5
Application number: CH88573A
Authority: CH
Inventors: Anna Marie Eisentraut
Original assignee: Nuclear Med Lab
Priority date: 1972-01-24
Filing date: 1973-01-19
Publication date: 1980-09-30
Also published as: FR2169054B1; IL41205A; IT974435B; NL7300825A; US3776698A; IL41205A0; JPS4885713A; CA984746A; FR2169054A1; DE2264255A1; GB1416149A

Description

La presente invenzione si riferisce ad un metodo di prova diagnostica per determinare il livello dell'ormone tiroideo in un siero contenente detto ormone e una globulina che lega l'ormone, detto siero potendo ad esempio essere un campione di sangue o un fluido del corpo. Essa riguarda pure un apparecchio a cassetta per realizzare détto metodo.

Per la determinazione della funzione tiroidea sono note, nel campo specifico, varie prove diagnostiche. Queste prove comprendono la prova del metabolismo basale, la prova di captazione o fissazione della tiroide e vari procedimenti co-lorimetrici e chimici per determinare il livello di iodio della tiroxina o tirossina nel sangue. Fra le prove più accurate disponibili sono le prove diagnostiche che utilizzano l'ormone marcato con radioisotopo per determinare indirettamente il livello di ormoni tiroidei, tiroxina (C^H^IaNO*) e triiodo-tironina (C15H12I3N04) presente in fluidi del corpo. In particolare queste prove comprendono una prova comunemente indicata come prova T-3, che misura la capacità di legatura insatura di tiroglobulina legante e di altre proteine in un fluido del corpo come il sangue, e la prova comunemente indicata come la prova T-4, che misura la quantità totale di ormone in un campione di siero di sangue.

Sia la prova T-3 sia la prova T-4 comprendono gli stadi in cui si aggiunge l'ormone marcato con radioisotopo ad una soluzione contenente un campione dell'ormone prodotto nel corpo e della globulina che lega la tiroxina o tirolegante o tiroglobulina, la separazione della globulina tirolegante che risulta, contenente l'ormone legato, dall'ormone non legato che si forma, e il conteggio della radioattività dell'ormone legato e dell'ormone non legato. Questo procedimento di conteggio indicherà la quantità di ormone endogeno che è legato alla globulina naturale e i siti dì legatura della proteina nel sangue.

Così, tanto la prova T-3 quanto la prova T-4 dipendono, per la loro accuratezza dall'efficienza di separazione tra l'ormone tiroideo legato e non legato nel campione di prova. I metodi convenzionali per allontanare questi ormoni comprendono resine a scambio ionico come lo scambiatore di ioni che presenta gruppi amminici fortemente basici o gruppi di ammonio quaternario, come descritto nel brevetto USA no. 3 414 383. Queste resine organiche a scambio ionico possono trovarsi in forma non addensata o incorporate in spugne di poliuretano, come descritto nel brevetto USA no. 3 206 602 oppure racchiuse in sacchi porosi o simili. Altri metodi convenzionali di questo tipo comprendono un adsorbimento selettivo degli ormoni liberi con carbone vegetale, che è stato ricoperto con opportune proteine o setacci come il Sephadex.

Di recente è stata sviluppata una prova per l'ormone tiroideo perfezionata ed è esposta in una domanda in corso di rilascio Serie No. 846 289, depositata il 30 luglio 69. Questa nuova prova comprende la «sorbzione» o fissazione (sorbing) degli ormoni liberi su un materiale a reticolo cristallino inorganico, in macroparticelle, come silicato di magnesio, per esempio. Questa nuova prova non dipende nè dal tempo nè dalla temperatura, in quanto può venir condotta a qualunque temperatura ambiente opportuna, in qualunque periodo di tempo conveniente per ottenere risultati molto accurati. Il «sorbente» (sorbent) o captante legherà rapidamente ed efficientemente solo l'ormone tiroideo libero o non legato a proteina, presente nel fluido di campione. Questa prova comprende normalmente la miscelazione del materiale sorbente o captante asciutto con una conveniente soluzione, per esempio una soluzione tampone di barbital, contenente ormoni liberi e ormoni legati ai siti di legame naturale (globulina tiro-5 legante o tiroglobulina ed altre proteine), la miscelazione intima fino a sorbzione degli ormoni liberi e successivamente la separazione del sorbente dal fluido sovrastante che risulta.

Per vari fattori, che verranno discussi qui di seguito, la prova T-3 è stata impiegata generalmente più largamente delio la prova T-4. Tuttavia, per ottenere una indicazione completa dell'attività della tiroide nel corpo, è necessario generalmente mettere in correlazione i risultati della prova T-3' coi valori del contenuto di ormone tiroideo totale nel sangue. In particolare è noto che ormoni tiroidei non esistono liberi in granii de quantità nel plasma, ma sono legati con frazioni di proteine specifiche in esso. Gli ormoni vengono trasportati lungo il corpo in questa forma legata. L'intensità di legame della frazione di proteina è generalmente costante entro stretti limiti nella maggior parte degli esseri umani. Così, una misura 20 della capacità del legame insaturo di un campione usando una prova T-3 darà generalmente una indicazione della quantità di ormone tiroideo presente nel sangue. Tuttavia, la prova T-3 non determina la quantità totale dell'ormone tiroideo nel sangue e certamente non misura direttamente l'entità o la 25 quantità dei siti di legame naturale nel sangue. Così per ottenere una completa indicazione dell'attività tiroidea, è necessario correlare la misura della capacità del legame insaturo per l'ormone tiroideo con la quantità totale di ormone tiroideo presente in un campione. La prova T-4, che è una mi-30 sura della quantità totale di ormone tiroideo nel sangue può venir usata insieme con la prova T-3, per ottenere una misura fedele della funzione tiroidea.

Le prove convenzionali T-4 comprendono gli stadi di estrazione iniziale dell'ormone tiroideo da un campione di 35 siero di sangue. Questo stadio di estrazione viene effettuato solitamente con un solvente organico e serve allo scopo di isolare l'ormone tiroideo dalle proteine entro il sangue.

Dopo l'estrazione, l'estraente viene collocato normalmente in una provetta, in una zona a temperatura controllata e si 40 evapora il solvente organico da esso in modo che rimanga un residuo secco di ormone tiroideo. Successivamente l'ormone tiroideo viene solubilizzato, di solito in un tampone contenente quantità note di globulina tirolegante o tiroglobulina e una quantità tracciante di ormone tiroideo marcato con radio-45 isotopo. Successivamente si utilizza un materiale sorbente per separare l'ormone tiroideo libero dall'ormone tiroideo legato risultante entro il campione, si misura o il sorbente o il fluido sovrastante, che risulta, con opportuni mezzi, come un contatore a pozzo a scintillazione. Successivamente si deterso mina la quantità totale dell'ormone tiroideo nel campione mediante correlazione con una curva standard, che è basata su conteggi radioattivi rilevati in campioni che contengono quantità note di ormone tiroideo.

Precedentemente la maggior parte delle prove T-4 conven-55 zionali non era estremamente attendibile per l'impossibilità di ottenere risultati riproducibili e correlabili. Uno dei problemi in queste prove è costituito dal fatto che si deve calcolare-il ricupero percentuale di ormoni tiroidei isolati dallo stadio di estrazione iniziale e applicarlo ai valori misurati. La 60 percentuale isolata varia notevolmente, quando si utilizza un alcole, come etanolo o formula 3A, gli estraenti più largamente usati ed accettabili finora noti nel campo specifico, il valore di ricupero medio dell'ormone tiroideo è approssimativamente di 75%. Tuttavia il ricupero complessivo è 75% 65 ± 13,5% ossia un campo da 61,5 a 88,5%. L'ormone tiroideo isolato o ricuperato varia da giorno a giorno e certamente con ciascun siero analizzato. Per l'impossibilità di prevedere il valore del ricupero durante lo stadio di estrazione, persona

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lità autorevoli come Ekins e Coli. Clin. Biochem. 2 253,1969, ritennero indispensabile misurare la quantità isolata singolarmente in ciascun siero, per ottenere risultati accurati con la prova T-4. Questo procedimento supplementare di determinazione della quantità isolata individualmente per ciascun siero è considerato proibitivo nella maggior parte dei casi clinici.

L'impossibilità di prevedere l'efficienza di estrazione sopra descritta, insieme con le tecniche laboriose utilizzate per le prove convenzionali T-4, per cui il solvente di estrazione deve venir evaporato fino a lasciare un residuo solido dell'ormone tiroideo estratto, e successivamente le prove devono venir condotte a temperatura e tempo strettamente controllati durante gli stadi di sorbzione, hanno fatto sì che la prova T-4 non fosse largamente accettata. E ciò pur essendo stato riconosciuto che la prova T-4 è estremamente preziosa.

Perciò, costituisce uno degli scopi della presente invenzione fornire un nuovo metodo di separazione dell'ormone tiroideo da siero di sangue.

Un altro scopo della presente invenzione consiste nel fornire un metodo di prova T-4 perfezionato.

Un altro scopo ancora della presente invenzione consiste nel fornire un metodo di prova T-4 perfezionato, che dia risultati altamente riproducibili, in cui la prova non dipenda essenzialmente dal tempo nè dalla temperatura, e nel quale si elimina la necessità di riferire un valore di ricupero o di isolamento percentuale relativo all'ormone tiroideo da siero di sangue ad una serie di dati standard e si elimina anche lo stadio di evaporazione per allontanare il solvente di estrazione.

Il metodo secondo la presente invenzione è caratterizzato da ciò che comprende:

a) miscelazione del campione di siero con una prima soluzione avente un primo pH, sufficiente a separare l'ormone tiroideo dalla globulina che lega l'ormone;

b) miscelazione della prima soluzione, contenente il siero, con un materiale «sorbente» o captante che sorbirà o capterà selettivamente l'ormone tiroideo al primo pH ma desorbirà l'ormone ad un secondo pH, e separazione del sorbente contenente l'ormone tiroideo dalla prima solu- ■ zione;

c) miscelazione del sorbente contenente l'ormone tiroideo con una seconda soluzione, mantenuta al secondo pH,

così da dar luogo ad eluzione dell'ormone dal sorbente; e d) separazione del sorbente dalla seconda soluzione contenente l'ormone.

L'apparecchio a cassetta per realizzare il metodo secondo l'invenzione è caratterizzato da ciò che comprende in associazione:

— una soluzione acida avente un pH compreso tra circa 1,0 e circa 3,0, costituente detta prima soluzione indicata al comma a);

— unità compatte di un materiale sorbente o captante cristallino inorganico, in macroparticelle, scelto tra acido silicico e i carbonati, fosfati, ossidi, idrossidi, silicati, alluminati e solfati degli elementi metallici dei gruppi IA, IIA, IIIA, IIB e Vili della tabella periodica e loro sali misti per realizzare quanto specificato al comma b);

— una soluzione alcalina avente un pH compreso tra circa 10 e circa 13, costituente la seconda soluzione di cui al comma c);

— una soluzione di ormone marcato con isotopo radioattivo; e

— una soluzione di tiroglobulina o globulina tirolegante, per la separazione di cui al comma d).

Un'applicazione del metodo secondo la presente invenzione permette di fornire una nuova prova T-4. In questo caso si utilizza il metodo di separazione in oggetto per separare inizialmente l'ormone tiroideo dalla globulina che lo lega. Dopo questa separazione iniziale si aggiunge una quantità prestabilita di tiroglobulina ed una quantità di tracciante dell'ormone tiroideo marcato con radioattivo, alla soluzione contenente l'ormone tiroideo separato e si lascia che la soluzione trovi l'eequilibrio. Dopo l'equilibratura l'ormone tiroideo libero viene separato dall'ormone legato mescolando con esso il sorbente e successivamente centrifugando la miscela. In seguito si fa il conteggio o del sorbente o del fluido sovrastante in un contatore a pozzo a scintillazione e si confrontano i risultati con una curva standard per determinare la quantità dell'ormone tiroideo presente nel campione di siero.

Secondo un'altra forma di esecuzione dell'invenzione viene fornito pure un nuovo metodo per preparare un siero standard da usare in una prova per l'ormone tiroideo.

Coll'apparecchio a cassetta secondo l'invenzione viene usata di preferenza una soluzione acida per rompere inizialmente i legami tra la tiroglobulina (TBG) e l'ormone tiroideo (tiroxina). Questo stadio viene condotto mescolando inizialmente quantità convenienti di una soluzione acida con un campione di siero. La soluzione acida viene mantenuta generalmente ad un pH compreso nel campo tra 1,0 e 3,0 e, con particolare preferenza, tra 1,4 e 2,2. Qualunque soluzione acida conveniente, che non sia dannosa per l'ormone tiroideo e per il processo di sorbzione, può venir usata nell'ambito della presente invenzione.

Per esempio, si possono usare nell'ambito della presente invenzione, soluzioni acquose di acidi inorganici come acido cloridrico, acido fosforico, acido solforico e simili, come pure soluzioni acquose di acidi organici come acido acetico, citrico, barbiturico e simili. La soluzione acida può contenere convenienti quantità di tamponamento di un agente tampone. Agenti tampone convenienti comprendono sali di acidi deboli. Esempi di questi agenti tampone comprendono glicina, fosfato sodico, fosfato potassico, sodio barbital e simili. Inoltre, la concentrazione ionica della soluzione acida può venir mantenuta con la presenza di opportuni materiali, come sali neutri, per esempio NaCI, KCl e simili. La quantità molare dell'acido presente nella soluzione può venir regolata a piacere così da dare il pH di lavorazione finale richiesto (un pH compreso tra 1,0 e circa 3,0 e, di preferenza, tra circa 1,4 e 2,2). Gli altri agenti che si possono aggiungere alla soluzione (l'agente di tamponamento o l'agente che mantiene la concentrazione ionica) possono venir aggiunti in quantità efficaci convenienti (generalmente comprese tra circa 0,2-5 moli per mole di acido).

Col campione di siero si può mescolare una conveniente quantità di soluzione acida, ma, generalmente si usano da circa 2 a circa 50 volumi di soluzione acida per ogni volume di siero. Il siero viene mescolato con la soluzione acida per un tempo sufficiente ad effettuare la separazione dell'ormone tiroideo e della tiroglobulina legante (in generale per un periodo non minore di circa 1 ora, per esempio di 15 secondi).

Dopo la separazione dell'ormone tiroideo dalla tiroglobulina, la soluzione risultante viene mescolata intimamente con un materiale sorbente o captante, che sorbirà o capterà selettivamente l'ormone tiroideo al pH acido, ma che desorbirà o non lo tratterà ad un pH superiore. Un materiale sorbente o di captazione di questo tipo preferito, che viene usato di preferenza nell'ambito della presente invenzione è un materiale a reticolo cristallino, inorganico, in macroparticelle.

Il materiale a reticolo cristallino, inorganico, in macroparticelle, che si può usare nell'ambito della presente invenzione, comprende i fosfati, gli ossidi, gli idrati, i silicati, carbonati, alluminati e solfati degli elementi metallici dei gruppi IA, IIA, niA, IIB e VIII della tabella periodica, come illustrato a pagina B-2 del Handbook of Chemistry and Physics, (Manuale di chimica e fisica), Chemical Rubber Publishing j

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Company (1964). Esempi di materiali adatti comprendono carbonato di calcio, fosfato di calcio, ossido di calcio, idrato di calcio, silicato di calcio, alluminato di calcio, solfato di calcio, carbonato di magnesio, fosfato di magnesio, ossido di magnesio, idrato di magnesio, silicato di magnesio, alluminato di magnesio, solfato di magnesio, carbonato di alluminio, fosfato di alluminio, ossido di alluminio, idrato di alluminio, silicato di alluminio, solfato di alluminio, carbonato potassico, fosfato potassico, ossido potassico, idrato potassico, silicato potassico, alluminato potassico, solfato potassico, carbonato di ferro, fosfato di ferro, ossido di ferro, idrato di ferro, silicato di ferro, alluminato di ferro, solfato df ferro, carbonato di bario, fosfato di bario, ossido di bario, idrato di bario, silicato di bario, alluminato di bario, solfato di bario, carbonato di zinco, fosfato di zinco, ossido di zinco, idrato di zinco, silicato di zinco, alluminato di zinco, solfato di zinco e loro sali misti.

Alcuni esempi specifici di materiali che compaiono comunemente e che si possono usare nell'ambito della presente invenzione comprendono:

opale, Si(OH)4 ± Si02;

vetro solubile, Si409Na;

caolinite, Al2(Si05)(0H)4;

dichite, A12(Sì2Ob)(OH)4;

nacrite, Al2(Si205)(0H)4;

metaalloisite, Al2(Si205)(0H)2;

alloisite, Al2(SiOa)(OH)3;

attapulgite, Mg3(Si4O10)(OH)2(OH). 2H20, Al(Si4O10)(OH)2; pirofillite, Al2(Si4O10)(OH)2;

talco, Mg3(Si4O10)(OH)2;

montmorillonite, Al2(Si4O10)(OH)2. xH20, Mg(Si4O10)(OH)2.

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montronite, Fe2(Si4O10)(OH)2. xH20, Mg(Si4O10)(OH)2.

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beidellite, Al2(Si4AlO10)(OH)2. xH20, Mg(Si4AlO10)(OH)2.

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saponite, Mgs(Si4O10)(OH)2. xH20,

illite, Ky. Al2(Si4„y)O10, Fe2. Mg. Mg3(Si4_y. Aly)O10;

muscovite, K.Al2(AlSi3O10)(OH)2;

paragonite, Na. Al2(AlSi3O10)(OH)2;

flogonite, K. Mg3(AlSi3Oao)(OH)2;

biotite, K. (Mg1Fe)3(AlSisO10)(OH)2;

margarite, Ca. A12(A12. Si3. O10)(OH)2.

I materiali sorbenti cristallini inorganici particolarmente preferiti comprendono i silicati, in particolare silicato di magnesio e silicato di alluminio. Altri materiali sorbenti preferiti sono fosfato di calcio, acido silicico, idrato di alluminio, ossido di calcio, carbonato di magnesio e ossido di magnesio.

Nel caso ideale, la dimensione del materiale sorbente cristallino dovrebbe consentire una rapida centrifugazione. Inoltre il materiale dovrebbe rimanere addensato o compresso mentre è capovolto e, inoltre, essere facilmente risospeso.

Così, il diametro preferibile è contenuto in un campo che va da IO-4 a IO"3 cm, benché le particelle di sorbente possono avere una dimensione che va da ICH a IO"1 cm.

Una qualunque quantità conveniente del materiale sorbente cristallino inorganico, in macroparticelle, può venir mescolata col tampone acido contenente il siero per effettuare una separazione da esso dell'ormone tiroideo. In generale è preferibile usare da circa 20 a 75 g di sorbente per litro della soluzione acida. In generale è necessario soltanto mescolare intimamente il materiale sorbente cristallino inorganico in macroparticelle con la soluzione acida per un tempo sufficiente a disperdere il sorbente nel tampone. Per esempio la miscela può venir scossa uniformemente per circa 15 secondi. Dopo che il sorbente e la soluzione acida sono stati mescolati intimamente, il sorbente viene separato dalla miscela tampone •con tecniche opportune come la centrifugazione. Il fluido sovrastante viene poi separato dal sorbente contenente l'ormone tiroideo.

Successivamente, l'ormone tiroideo viene allontanato dal materiale sorbente con un procedimento di miscelazione in-5 tima di quest'ultimo con una soluzione alcalina. La soluzione alcalina viene generalmente mantenuta ad un pH compreso nel campo tra circa 10 e 13 e di preferenza, entro il campo da circa 11,5 a 12,5. Qualunque soluzione basica conveniente che non sia dannosa per l'ormone tiroideo e per il sorto bente può venir usata nell'ambito della presente invenzione. Per esempio, si possono usare, nell'ambito della presente invenzione, soluzioni acquose di idrati come idrati alcalini, per esempio idrato sodico, idrato potassico o altre basi come idrato ammonico. Questi materiali possono venir tamponati con 15 convenienti agenti tampone, per esempio sali di acidi deboli. Esempi di agenti tampone convenienti comprendono bicarbonato sodico, fosfato sodico, sodio barbital e simili. Inoltre la concentrazione ionica della soluzione alcalina può venir mantenuta con la presenza di convenienti materiali come sali 20 neutri, per esempio NaCl, KCl e simili.

Nell'acqua si può combinare una conveniente quantità molare della base per dare il pH di lavorazione del sistema desiderato (un pH generalmente compreso nel campo tra circa 10 a circa 13 e, con particolare preferenza, tra circa 11,5 e 25 12,5). L'agente di tamponamento o di concentrazione ionica può venir aggiunto alla soluzione in una quantità efficace conveniente (generalmente da circa 0,2 a 5 moli per mole della base).

Generalmente la quantità della soluzione alcalina che si 30 aggiunge al materiale sorbente cristallino inorganico può corrispondere alla quantità della soluzione acida che è stata utilizzata nello stadio precedente. Il sorbente viene mescolato intimamente con la soluzione alcalina per un tempo sufficiente a consentire che l'ormone tiroideo venga eluito da essa nel 35 tampone. L'eluzione è praticamente completa in pochi secondi (per esempio circa 15 secondi). La miscela risultante può ora venir centrifugata e il fluido sovrastante, contenente l'ormone tiroideo può ora venir separato dal materiale sorbente cristallino inorganico e usato come si desidera. Per esempio, 40 l'ormone tiroideo può venir utilizzato nella produzione di tiroxina pura o in una prova T-4 come esposto in una forma di esecuzione preferita della presente invenzione.

Così, secondo una forma preferita della presente invenzione, il procedimento sopra descritto per la separazione del-45 l'ormone tiroideo dalla globulina tirolegante (tiroglobulina) può venir usato direttamente in una nuova prova T-4. Il procedimento di prova che ne risulta è vantaggioso rispetto ai procedimenti noti in quanto è un procedimento di prova molto più rapido e che tuttavia fornisce risultati altamente 50 riproducibili. Così, usando la tecnica di separazione sopra descritta, si elimina completamente la necessità di utilizzare un procedimento di estrazione per precipitare la tiroglobulina dall'ormone tiroideo ed evaporare successivamente il solvente di estrazione per ottenere un residuo di ormone tiroideo secco. 55 Inoltre, si ovvia anche alla necessità di calcolare la quantità totale isolata dell'ormone tiroideo estratto e di applicarla ai risultati della prova.

Il nuovo procedimento di prova T-4 può venir effettuato con la nuova cassetta per analisi dell'invenzione in oggetto e 60 un apparecchio di laboratoio standard. La cassetta per analisi dell'invenzione in oggetto comprende normalmente una soluzione acida contenuta in convenienti fiale. La soluzione acida generalmente ha un pH compreso tra 1,0 e 3,0 e, di preferenza tra 1,4 e 2,2. Inoltre si fornisce materiale sorbente 65 cristallino, inorganico, in macroparticelle, in unità compresse. Il materiale sorbente cristallino inorganico in macroparticelle viene fornito o in polvere o in forma di pastiglie o disperso nella soluzione acida. Inoltre si fornisce una soluzione

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alcalina che ha un pH tra circa 10,0 e circa 13. Altri costituenti della cassetta comprendono quantità note di una tiro-globulina standard, quantità traccianti di un ormone tiroideo marcato con radioisotopo e sieri standard.

Un procedimento tipico per realizzare il procedimento della nuova prova T-4, che forma oggetto dell'invenzione, consiste nell'impiegare inizialmente 37,5 g di un materiale sorbente cristallino inorganico in macroparticelle, conveniente, come silicato di magnesio, formato da particelle di dimensione compresa tra circa 10~7 e IO"1 cm, come materiale sorbente o captante. Di preferenza, il materiale sorbente o captante per ciascun campione di prova si trova in una forma sciolta e dispersa in un conveniente volume, per esempio di 2 millilitri di una soluzione acida acquosa di KC1-HC1. La soluzione acida può comprendere KCl 0,05M e HCl 0,05M ed avere un pH di 1,5. La soluzione acida acquosa e il materiale sorbente cristallino, inorganico, in macroparticelle, non compatto, vengono aggiunti in una fiale, per esempio in una provetta. Successivamente si aggiunge 0,1 mi di siero campione alla soluzione acida.

Va notato che si possono impiegare altri volumi di siero. Il volume di 0,1 mi di siero viene usato nella forma di esecuzione preferita, perché una misura riproducibile dei volumi minori è più difficile. Volumi maggiori di siero possono venir usati con un proporzionale aumento del volume della soluzione acida e della quantità di sorbente.

Dopo che il siero è stato aggiunto alla soluzione acida, la fiala viene scossa per pochi secondi (circa 15 secondi bastano) cosi da mescolare intimamente il siero e la soluzione acida e il materiale sorbente cristallino inorganico in macroparticelle. Ciò fornirà un tempo sufficiente perché l'acido rompa i legami tra l'ormone tiroideo (tiroxina) e la tiroglabu-lina, e perché l'ormone tiroideo libero venga ad essere sorbito o captato dal materiale sorbente cristallino, inorganico, in macroparticelle. E' preferibile generalmente non consentire che la soluzione acida e il siero rimangano a contatto per più di un'ora. Durante questo procedimento, il materiale sorbente cristallino inorganico in macroparticelle assume o capta circa 80% dell'ormone tiroideo dal campione. Successivamente il materiale sorbente cristallino inorganico in macroparticelle viene separato dalla soluzione acida con mezzi convenienti, come la centrifugazione, e la parte sovrastante che risulta viene separata dal sorbente.

Successivamente secondo un modo preferito di operazione, si aggiunge una soluzione alcalina al materiale sorbente cristallino inorganico in macroparticelle, per eluire da esso l'ormone tiroideo sorbito o captato. Per esempio si aggiungono nella fiala, contenente il sorbente addensato al fondo, KCl 0,05 M ed NaOH 0,02M, avente un pH di circa 12,2. Dopo l'aggiunta della soluzione alcalina al sorbente, presente nella fiala, la fiala viene scossa così da disperdere in essa il sorbente. Ciò consentirà alla porzione alcalina di eluire l'ormone tiroideo dal materiale sorbente. L'eluzione è completa in pochi secondi (circa 15 secondi sono sufficienti). A questo punto la fiala viene centrifugata per addensare il sorbente cristallino, inorganico, in macroparticelle al fondo della fiale e la soluzione alcalina risultante, contenente l'ormone tiroideo eluito è pronta per ricevere una sorgente di tiroglobulina ed una quantità di tracciante di ormone tiroideo marcato con radioisotopo.

Come sorgenti di tiroglobulina si possono usare sieri completamente umani o parzialmente animali oppure una frazione di alfa-globulina umana preparata, del commercio, liofilizzata. E' preferibile che la tiroglobulina sia contenuta in una soluzione avente un pH sufficiente a dare un pH risultante di 7,5 - 8,5 delle soluzioni riunite, ciò che fornirà le condizioni ottime per un legame competitivo di ormone tiroideo con tiroglobulina. Per esempio 2 millilitri di una soluzione acquosa contenente sodio barbital 0,035 M e HCl 0,027 M, avente un pH di 7,4 e contenente 0,01 - 0,08% in peso dell'alfa globulina umana vengono aggiunti al tampone alcalino contenente l'ormone tiroideo eluito. Tuttavia, se lo si desidera, i sieri umani completi possono venir diluiti da 1 - 50 a circa 1 - 200 volte con la soluzione di barbital-HCl e usati a questo punto come sorgente di tiroglobulina. Inoltre in questa soluzione è contenuta una quantità tracciante di ormone tiroideo marcato con radioisotopo.

Si può usare qualunque isotopo radioattivo dello iodio, del tritio o del carbonio. E' preferibile utilizzare un ormone marcato con I131 oppure I125 radioattivo. Le due soluzioni vengono riunite e mescolate tra loro intimamente agitando a -vortice così da favorire la legatura competitiva tra l'ormone tiroideo marcato e non marcato e la globulina tirolegante.

E' desiderabile generalmente introdurre nella soluzione alcalina un indicatore del pH che non danneggi la reazione. L'indicatore assicurerà che le soluzioni acida e basica non vengano confuse durante la prova. Un indicatore conveniente, che si può usare nell'ambito della presente invenzione, è la timolftaleina. In generale circa 0,0001% nella soluzione alcalina assicurerà che la soluzione alcalina rimanga di color azzurro al disopra di pH 10, ma una volta che il pH della soluzione alcalina comincia a scendere, con l'aggiunta della soluzione contenente la globulina tirolegante e l'ormone tiroideo marcato con un radioattivo, la soluzione diventerà incolore.

Dopo questo stadio di solubilizzazione ed equilibratura (circa 5 minuti dopo la miscelazione), la fiala viene scossa per consentire che il materiale sorbente cristallino inorganico venga posto intimamente in contatto con la soluzione. E' preferibile scuotere la fiala circa 15 secondi per effettuare questa miscelazione. Il solvente non compatto e la soluzione vengono fatti rimanere a contatto per un tempo sufficiente da consentire che il materiale sorbente leghi l'ormone tiroideo marcato e non marcato libero. Si preferisce generalmente lasciare che il sorbente rimanga a contatto con la soluzione per circa 30 minuti. Dopo questo stadio di legatura, la fiala viene centrifugata e il liquido sovrastante viene separato dal sorbente mediante decantazione e si fa il conteggio o sul fluido sovrastante che risulta o sul sorbente, di preferenza su quest'ultimo, in un contatore a pozzo a scintillazione. La lettura del contatore a scintillazione viene confrontato col numero totale di conteggi (la quantità totale di ormone tiroideo marcato con radioisotopo del tracciante) che vernerò aggiunti inizialmente per ottenere i valori di captazione o fissazione percentuale.

I conteggi totali per minuto vengono determinati, per esempio, misurando i conteggi totali della quantità di tracciante dell'ormone tiroideo marcato con radioisotopo entro una quantità di materiale tampone di volume uguale alla quantità di materiale (sia materiale sorbente sia materiale liquido) che viene conteggiata nel contatore a scintillazione a pozzo per ciascun campione di prova. Si effettua ciò in modo conveniente misurando una aliquota di liquido come la soluzione di tampone di barbital, uguale in volume alla quantità di materiale sorbente, e aggiungendo la quantità normale o standard dell'ormone tiroideo marcato con radioisotopo e conteggiando in un contatore a scintillazione a pozzo. I valori percentuali di captazione o fissazione vengono poi posti in correlazione con valori normali ottenuti misurando la captazione percentuale di campioni normali, contenenti quantità note di ormone tiroideo, così da determinare in tal modo l'aliquota di ormone tiroideo presente nel campione.

La preparazione dei campioni normali o standard e le tecniche di conteggio vengono condotte di preferenza secondo lo stesso procedimento fondamentale descritto sopra per quelli non noti. Il campione standard viene associato a sieri

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normali che sono stati analizzati con metodo indipendenti, accuratamente controllati. Successivamente si aggiunge al siero tiroxina pura cristallina, diluita in albumina bovina 0,25 % in acqua, così da ottenere la concentrazione finale desiderata. Di preferenza ciascuna delle cassette per analisi della presente invenzione è provvista di tre sieri standard contenenti quantità misurate di tiroxina, che sarebbero equivalenti a percentuali di siero di 6,12 e 18 microgrammi, come pure un siero di prova standard zero senza tiroxina.

Dopo che ciascuno dei sieri standard è stato preparato, viene trattato come sopra descritto a partire dagli stadi di separazione standard, attraverso lo stadio di conteggio nel contatore a scintillazione. Quando i campioni standard sono stati trattati in questo modo, viene eliminato ogni possibile errore, come variazioni giornaliere che spesso si notano nell'isolamento della tiroxina nello stadio di separazione della tiroxina iniziale. La separazione iniziale della tiroxina nei sieri standard annulla automaticamente queste differenze. Inoltre, non è necessario applicare ai calcoli finali la perdita di estrazione come sopra descritto, in quanto il ricupero percentuale o la quantità isolata percentuale nei sieri standard è quasi esattamente identico al valore percentuale ottenuto nei campioni e non varia come fanno i valori della perdita di estrazione convenzionali.

Secondo una delle forme di esecuzione della presente invenzione viene fornito un nuovo procedimento per produrre il siero di controllo standard zero. La preparazione del siero di controllo standard, che non contiene tiroxina, è necessaria per ottenere il punto zero per la curva normale nel procedimento sopra esposto. Inoltre, l'uso del siero di controllo normale zero è pure necessario per ottenere letture accurate dei sieri ipertiroidei. Così, quando si ottiene un siero di controllo standard zero, i sieri ipertiroidei possono venir diluiti con un fattore noto col siero di controllo standard zero. Le prove T-4 vengono allora condotte nel modo sopra descritto e confrontate coi valori normali ottenuti dalla curva. Quando si è ottenuta la lettura dalla curva standard, si applica il fattore di diluizione alla lettura. Per esempio, se il siero ipertiroideo viene diluito con un volume uguale di siero standard zero, i risultati ottenuti dalla curva standard vengono semplicemente moltiplicati per due per ottenere la lettura vera col siero ipertiroideo. Il siero standard zero viene preparato secondo una delle forme di esecuzione della presente invenzione ponendo a contatto una certa quantità di siero acidificato col materiale sorbente cristallino, inorganico, in macroparticelle, come sopra indicato, per separare da esso l'ormone tiroideo. Successivamente il materiale sorbente, contenente l'ormone tiroideo, viene separato, per esempio per centrifugazione, dal fluido sovrastante e viene scartato. Questo procedimento viene ripetuto sul fluido sovrastante da una a circa 5 volte, finché tutto l'ormone tiroideo è stato allontanato da esso. La tecnica preferita per produrre il siero di controllo zero da un siero normale avente un pH di circa 8 e contenente circa 8 microgrammi percento di tiroxina, comprende la regolazione iniziale del pH del siero normale a circa 4 (generalmente ad un valore di circa 3-6) con HCl 2N. Dopo questa regolazione iniziale del pH, una parte in peso del materiale sorbente cristallino inorganico in macroparticelle viene mescolata intimamente con 4 parti in peso del siero. Il rapporto tra siero e sorbente può aggirarsi tra 1:1 e 1:10. La miscela sorbente-siero viene mescolata costantemente per circa 5 ore (generalmente da 2 a circa 8 ore) con un miscelatore a motorino elettrico oppure con un miscelatore magnetico o simile. Dopo questo periodo di 5 ore, il sorbente viene separato dal siero con un metodo conveniente, per esempio per centrifugazione. Usando il siero normale, sopra descritto, il primo trattamento con sorbente allontanerà circa 6 microgrammi percento dell'ormone tiroideo da esso.

Successivamente si aggiunge una parte in peso fresca di sorbente alla parte sovrastante e il materiale viene mescolato di nuovo per circa 5 ore. Questo procedimento può venir ripetuto una o più volte, per allontanare tutta la tiroxina dal siero.

Gli stadi di contatto con sorbente successivi daranno un campione di siero che non contiene tiroxina e presenta un pH di circa 3-6. Perciò è desiderabile successivamente regolare il pH dello standard o campione normale zero risultante ad un pH tra 8 e 8,5 per aggiunta ad esso di un materiale alcalino. Così, dopo che la tiroxina è stata allontanata dal siero, il pH del siero, che rimane, viene regolato a circa 8, per aggiunta di NaOH 2N. Va notato a questo punto che, se il pH iniziale durante la separazione viene regolato ad un valore praticamente inferiore a circa 3, la regolazione finale del pH a circa 8 farà precipitare da esso la maggior parte delle proteine.

Dopo che il pH del siero di controllo zero è stato regolato a circa 8, è preferibile aggiungere ad esso un preservativo del siero. Per esempio, si può aggiungere al siero 0,1% in peso di sodio azide.

Va tenuto presente che i procedimenti sopra esposti sono riportati soltanto a scopo illustrativo e che si possono impiegare, nell'ambito della presente invenzione, varie concentrazioni di altri reattivi. Inoltre, si possono impiegare procedimenti differenti per efettuare la prova T-4 come sopra descritta secondo la presente invenzione. Per esempio, negli stadi iniziali, dopo che gli ormoni tiroidei liberi sono stati fissati dal materiale sorbente o di captazione cristallino, inorganico, si può condurre lo stadio di eluzione dell'ormone tiroideo dal sorbente contemporaneamente con lo stadio di fissaggio competitivo. In questo caso lo stadio di separazione di eluzione dell'ormone tiroideo dal sorbente con la soluzione alcalina viene omesso e si può aggiungere direttamente al sorbente una soluzione alcalina avente un pH da 7,5 a 9,2, di preferenza intorno a 8,6 e contenente la quantità nota di globulina tirolegante e l'ormone tiroideo marcato con radioisotopo. La soluzione tampone non solo eluirà l'ormone tiroideo presente nel sorbente, ma la presenza della globulina tirolegante e dell'ormone tiroideo marcato con radioisotopo darà luogo contemporaneamente ad un legame competitivo tra l'ormone tiroideo eluito e l'ormone tiroideo marcato con radioisotopo con la globulina tirolegante. Così, l'ormone tiroideo viene eluito dal sorbente e immediatamente entra in competizione per la tiroglobulina. Questa variante del procedimento può venir utilizzata quando si desidera effettuare analisi dell'ormone tiroideo molto rapide. Tuttavia questa variante del procedimento non è preferita in quanto si notano una certa perdita di sensibilità e variazioni nella legatura quando si introducono nelle prove insoliti intervalli di tempo.

Inoltre, il nuovo procedimento di prova T-4 può venir condotto in un sistema a colonna. In questo caso il materiale sorbente o captante cristallino, inorganico viene diluito con un diluente inerte, come cellulosa avente particelle di dimensioni da circa 10 a 200 micron. Il rapporto in peso tra materiale sorbente cristallino inorganico in macroparticelle e il diluente inerte può variare da circa 1: 30 a circa 1: 40 e, di preferenza, è intorno a 1: 20. Dopo che è stata effettuata la miscela tra il diluente inerte e il materiale sorbente inorganico in macroparticelle, il materiale può venir introdotto nella colonna, che può comprendere una colonna cilindrica avente un'entrata porosa e un'uscita atta a trattenere il sorbente e il diluente entro la colonna. Se si utilizza la colonna, la prova può venir effettuata come precedentemente descritto, con la diferenza che le soluzioni vengono semplicemente fatte passare attraverso la colonna. Per esempio, nello stadio di separazione dell'ormone tiroideo dalla tiroglobulina presente nel campione, il siero viene aggiunto inizialmente alla soluzione acida, mescolato e successivamente versato attraverso

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la colonna e l'ormone tiroideo liberato verrà sorbito o captato dal materiale sorbente inorganico in macroparticelle, contenutovi.

Successivamente, è preferibile che la modificazione sopra discussa venga utilizzata per eluire e contemporaneamente legare con legame competitivo l'ormone tiroideo presente nella colonna. Così, in questo caso, la quantità prestabilita di tiro-globulina insieme con l'ormone tiroideo marcato con radioisotopo vengono aggiunti alla soluzione alcalina avente un pH di circa 8,6 e la soluzione risultante viene fatta passare attraverso la colonna così da produrre l'eluzione dell'ormone tiroideo dal materiale sorbente e la legatura competitiva dell'ormone tiroideo eluito e dell'ormone tiroideo marcato con radioisotopo con la tiroglobulina. Successivamente si fa il conteggio, in un contatore a scintillazione, o della colonna o della parte sovragaJleggiante che passa attraverso la colonna.

Gli esempi che seguono vengono riportati per facilitare meglio la comprensione della presente invenzione e non vanno considerati come limitativi del suo ambito.

Esempio 1

Allo scopo di illustrare l'efficienza della separazione tra ormone tiroideo e tiroglobulina, si effettuarono diverse separazioni secondo la presente invenzione. Si prepararono parecchie soluzioni acide. Ciascuno conteneva 37,5 g per litro (0,075 g) di materiale sorbente, a reticolo cristallino di silicato di magnesio, in forma di talco cosmetico in aerosol, tipo U.S.P., che era stato sospeso in esse mediante agitazione.

Alle singole fiale si aggiunsero due millilitri per ciascuna della sospensione omogenea. Successivamente si mescolarono 0,1 millilitri di un campione di siero di sangue normale, contenente una traccia di T-41125, nella soluzione acida, in ciascuna fiala, e si agitò vorticosamente per pochi secondi. Le fiale vennero scosse per circa 15 secondi, per disperdere il sorbente nel tampone, e si centrifugò. Il fluido sovrastante venne decantato. Quindi si analizzò l'ormone in ciascuna fiala per determinare la quantità percentuale media isolata di tiroxina. I risultati delle prove sono esposti nella tabella I, che segue:

TABELLA I

Tampone

Molarità

PH

%tuale media di tiroxina isolata glicina-HCl

©

0

1

1,7

83,3

glicina-HCl

0,05, 0,04

2,1

79,8

acido citrico Na2HP04

0,089, 0,02

2,6

79,1

Kd-HCl

0,025, 0,01

2,1

80,1

KC1-HC1

0,05, 0,10

1,3

82,9

KCl-Ha

0,05, 0,05

1,6

83,5

Così, le marce su riportate indicano che le quantità di tiroxina isolata, accettabile dal siero di sangue, si ottiene impiegando varie soluzioni acide di varie concentrazioni come mezzo di estrazione. E' consigliabile soltanto utilizzare la stessa soluzione acida quando si opera con campioni standard e quando si opera con campioni sconosciuti.

Esempio 2

Successivamente, parecchie prove T-4 vennero effettuate su associazioni o masse comuni a basso ed elevato tenore di siero utilizzando soluzioni di eluzione alcaline differenti. In ciascun caso la tiroxina del campione di siero venne sorbita o captata sul materiale sorbente cristallino inorganico in macroparticelle col procedimento esposto nell'esempio 1 e utilizzando una soluzione acquosa acida, avente un pH di 1,5 e contenente KCl 0,05M e HCl 0,05M. In ciascun caso, dopo che l'ormone tiroideo era stato ottenuto sul materiale sorbente, si aggiunsero 2 mm di soluzione alcalina nella fiala e si scosse la miscela in modo da disperdere il sorbente entro la soluzione alcalina di eluzione e successivamente si centrifugò. Si introdussero poi in ciascuna fiala 2 mi di un tampone di barbital acido, acquoso a pH 7,4 contenente sodio barbital 0,035M e acido cloridrico 0,027M e 0,04% in peso di globulina tirolegante (TBG) come pure una quantità di tracciante di ormone tiroideo marcato con radioisotopo. Dopo di ciò si agitò vorticosamente il fluido sovrastante e lo si lasciò equilibrare per circa 5 minuti e successivamente si scossero le fiale per circa 15 secondi, per disperdere in esse il sorbente. Dopo di che ciascuna fiala venne lasciata riposare per 30 minuti, e si centrifugò, si decantò il liquido sovrastante e si conteggiò il sorbente addensato in un contatore a pozzo a scintillazione, così da ottenere la percentuale captata. Si costruirono grafici delle percentuali captate con elevato e basso tenore di siero per ciascuna soluzione portando la percentuale captata sull'ordinata e la tiroxina totale (microgrammi per 100 mi di siero) in ascisse. Si determinò quindi l'estensione percentuale tra campioni a basso e alto siero. Generalmente è desiderabile avere l'estensione percentuale maggiore possibile tra i campioni a basso e ad alto siero per ottenere le letture grafiche più accurate. I risultati della prova sono esposti nella tabella II che segue:

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9

TABELLA II

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Tampone alcalino acquoso

Molarità

pH

TBG

barbital-

pH

pH finale

Gruppo a basso siero (ixg%)

Gruppo ad alto siero (Hg%)

Estensione percentuale

NaHCOe-NaOH

0,0125, 0,005

10,0

7,4

8,1

2,3

20

29,7

NaJHPO4-Na0H

0,50,

0,007

11,0

7,4

8,0

2,3

20

28,8

Na2HP04-Na0H

0,05,

0,1

12,1

7,4

8,4

0

20

31,8

KCl-NaOH

0,05,

0,01

11,9

7,4

7,6

0

20

33,1

KCl-NaOH

0,05,

0,02

12,1

7,4

8,05

0

20

35,3

KCl-NaOH

0,05,

0,02

12,1

7,4

8,05

2,3

20

32,9

Come si può vedere dalla tabella II su riportata, si possono impiegare varie soluzioni alcaline per ottenere l'eluzio- 20 ne massima dell'ormone tiroideo dal sorbente o captante, ottenendo, tuttavia un pH finale, dopo aggiunta della tiroglobulina e dell'ormone marcato con radioisotopo nella sua soluzione tampone, che è ottima per il legame di competizione. E' desiderabile che il pH finale (dopo aggiunta della globu- 25 lina tirolegante e dell'ormone marcato con radioisotopo) sia compreso nel campo tra circa 7,5 e circa 8,5.

Benché l'invenzione sia stata descritta con riferimento alle forme di esecuzione preferite, si intende che varie modificazioni della stessa risulteranno evidenti agli esperti del 30 campo dopo la lettura della presente invenzione e si intende proteggere tali modificazioni in quanto rientrino nell'ambito delle rivendicazioni allegate.

v

Claims

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1. Metodo di prova diagnostica per determinare il livello dell'ormone tiroideo in un campione di siero contenente detto ormone e una globulina che lega l'ormone, caratterizzato da ciò che comprende:

b) miscelazione della prima soluzione, contenente il siero, con un materiale «sorbente» o captante che sorbirà o capterà selettivamente l'ormone tiroideo al primo pH ma desorbirà l'ormone ad un secondo pH, e separazione del sorbente contenente l'ormone tiroideo dalla prima soluzione;

2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato da ciò che il sorbente o captante è un materiale sorbente cristallino, inorganico, in macroparticelle, scelto tra acido silicico e carbonati, fosfati, ossidi, idrossidi, silicati, alluminati e solfati degli elementi metallici dei gruppi IA, IIA, III A, IIB, e VIII della tabella periodica e loro sali misti.

2

RIVENDICAZIONI

3

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3. Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato da ciò che il primo pH varia nel campo da circa 1,2 a circa 2,6

e il secondo pH nel campo da circa 10 a circa 13.

4. Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato da ciò che il «sorbente» è silicato di magnesio.

5

5. Metodo di separazione dell'ormone tiroideo da un campione di siero contenente l'ormone e una globulina legante l'ormone secondo la rivendicazione 1, comprendente:

a) miscelazione con il campione di siero di una quantità di acido sufficiente a separare l'ormone tiroideo dalla globulina che lega l'ormone;

b) miscelazione del siero acidificato risultante con un materiale sorbente cristallino, inorganico, in macroparticelle, scelto tra acido cilicico e carbonati, fosfati, ossidi, idrossidi, silicati, alluminati e solfati degli elementi metallici dei gruppi IA, IIA, IIIA, IIB e VIII della tabella periodica e loro sali misti così da captare o sorbire su di essi l'ormone tiroideo; e c) separazione del sorbente contenente l'ormone dal resto del siero.

6. Metodo secondo la rivendicazione 5, caratterizzato da ciò che si aggiunge a detto siero una quantità di acido sufficiente a portare il suo pH ad un valore tra circa 3 e circa 6.

7. Metodo secondo la rivendicazione 6, caratterizzato da ciò che comprende, inoltre, il porre a contatto la parte rimanente del siero con una nuova porzione del materiale sorbente così da sorbire o captare altre aliquote di ormone tiroideo e successivamente la separazione del sorbente dalla seconda parte rimanente del siero.

8. Metodo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato da ciò che il sorbente è silicato di magnesio.

9. Metodo secondo la rivendicazione 7, caratterizzato da ciò che comprende ulteriormente la ripetizione dell'operazione di porre a contatto col nuovo materiale sorbente o captante il siero, una o più volte, fino a che il siero non contiene ormone tiroideo.

10

10. Metodo per la separazione e misurazione dell'ormone tiroideo in un campione di siero contenente l'ormone tiroideo e globulina legante l'ormone, secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere:

a) miscelazione del campione di siero con una aliquota efficace di una soluzione acida sufficiente a separare l'ormone tiroideo dalla globulina che lega l'ormone;

b) miscelazione della soluzione acida contenente il siero con un materiale sorbente o captante cristallino, inorganico, in macroparticelle, scelto tra acido silicico e carbonati, fosfati, ossidi, idrossidi, silicati, alluminati e solfati degli elementi metallici dei gruppi IA, IIA, IIIA, IIB e Vili della tabella periodica e loro sali misti;

c) separazione del sorbente contenente l'ormone tiroideo legato dalla soluzione acida;

d) miscelazione del sorbente con una quantità efficace di una soluzione alcalina così da dar luogo ad eluzione dell'ormone tiroideo nella soluzione alcalina;

e) equilibratura della soluzione alcalina contenente l'ormone tiroideo con globulina tirolegante e con un ormone tiroideo marcato con isotopo radioattivo;

f) miscelazione intima della soluzione equilibrata col materiale sorbente o captante cristallino inorganico in macroparticelle così da allontanare da esso la tiroxina; e g) conteggio con un contatore a scintillazione di (1) tiroxina marcata libera allontanata dal sorbente e (2) tiroxina marcata che rimane nella soluzione.

11. Metodo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato da ciò che la soluzione acida ha un pH compreso tra circa 1,2 e circa 2,6.

12. Metodo secondo la rivendicazione 11, caratterizzato da ciò che la soluzione alcalina viene mantenuta ad un pH tra circa 7,5 e 9,2 e che la globulina tirolegante e la tiroxina marcata con isotopo radioattivo vengono addizionate con la soluzione alcalina al sorbente contenente l'ormone tiroideo.

13. Metodo secondo la rivendicazione 11, caratterizzato da ciò che la soluzione alcalina ha un pH compreso tra circa 10 e circa 13.

14. Metodo secondo la rivendicazione 13, caratterizzato da ciò che la globulina tirolegante e la tiroxina marcata con isotopo radioattivo sono contenute in una terza soluzione e vengono aggiunte alla soluzione tampone alcalina dopo la eluzione e da ciò che la terza soluzione ha un pH tale che la soluzione risultante della soluzione alcalina e della terza soluzione viene mantenuta ad un pH che va da circa 7,5 a circa 8,6.

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15. Metodo secondo la rivendicazione 10, caratterizzato da ciò che il sorbente è silicato di magnesio.

16. Apparecchio a cassetta per realizzare il metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato da ciò che comprende, in associazione:

— ima soluzione acida avente un pH compreso tra circa 1,0 e circa 3,0, costituente detta prima soluzione indicata al comma a;

— una soluzione di ormone marcato con isotopo radioattivo;

— ed una soluzione di tiroglobulina o globulina tirolegante per la separazione di cui al comma d).

17. Apparecchio secondo la rivendicazione 16, caratterizzato da ciò che comprende ulteriormente soluzioni di sieri standard o normali contenenti quantità note di globulina e quantità note di tiroxina.

18. Apparecchio secondo la rivendicazione 17, caratterizzato da ciò che comprende ulteriormente una soluzione di siero standard che non contiene tiroxina.

19. Apparecchio secondo la rivendicazione 18, caratterizzato da ciò che la soluzione standard viene preparata col metodo della rivendicazione 9.

20. Apparecchio secondo la rivendicazione 16, caratterizzato da ciò che il sorbente è silicato di magnesio. -